無纖維素酶的酶組合物及用於生產其的宿主細胞的製作方法

2023-09-10 05:51:45 2

專利名稱：無纖維素酶的酶組合物及用於生產其的宿主細胞的製作方法
技術領域：
本發明提供用於生產洗滌劑添加劑蛋白質的重組細菌細胞。在一些實施方案 中，該細胞為芽孢桿菌(Bacillus)屬細胞。在另一些實施方案中，所述細胞包含含有失活 的bglC基因的基因組、以及用於產生至少一種分泌型洗滌劑添加劑蛋白質的重組核酸。 在一些優選的實施方案中，所述分泌型洗滌劑添加劑蛋白質為蛋白酶。本發明還提供使 用所述細菌細胞來產生至少一種洗滌劑添加劑蛋白質的方法、以及含有至少一種洗滌劑 添加劑蛋白質的無纖維素酶組合物。
背景技術：
外源多肽的表達和重組產生是廣泛使用的技術。人們熟知，可以用編碼目的外 源多肽的核酸轉化細胞，用於表達和產生大量的所需多肽。在一些應用中，該方法用於 產生比來源生物中天然產生的量更多的多肽。事實上，外源核酸序列的表達以及內源序 列的過表達已經在現代生物技術中廣泛使用。在一些情況下，不期望的產物隨目的蛋白質一起產生。例如，在產生重組酶 (例如蛋白酶、澱粉酶等)時，可能還產生其他不期望的酶(如纖維素酶)。儘管分子生物學和蛋白質工程已取得進展，但仍需要可以用於減少(如果不是 消除的話)這些不期望活性的方法和組合物。發明概述本發明提供用於產生洗滌劑添加劑蛋白質的重組細菌細胞。在一些實施方案 中，該細胞為芽孢桿菌屬細胞。在另一些實施方案中，所述細胞包含含有失活的bglC基 因的基因組，以及用於產生至少一種分泌型洗滌劑添加劑蛋白質的重組核酸。在一些優 選的實施方案中，所述分泌型洗滌劑添加劑蛋白質為蛋白酶。本發明還提供使用所述細 菌細胞來產生至少一種洗滌劑添加劑蛋白質的方法以及含有至少一種洗滌劑添加劑蛋白 質的無纖維素酶組合物。本發明提供重組的芽孢桿菌屬物種宿主細胞，其包含含有失活的bglC基因的基 因組，其中該細胞還包含用於產生分泌型洗滌劑添加劑蛋白質的重組核酸。在一些優選 的實施方案中，所述失活的bglC基因含有缺失、插入、替換或重排。在另一些優選的 實施方案中，所述芽孢桿菌屬物種細胞為地衣芽孢桿菌(B.licheniformis)、枯草芽孢桿菌 (B.subtilis)、克勞氏芽孢桿菌(B.clausii)、嗜鹼芽孢桿菌(B.alkalophilus)或耐鹽芽孢桿菌 (B.halodurans)的細胞。在另一些優選的實施方案中，所述分泌型洗滌劑添加劑蛋白質 是選自蛋白酶、澱粉酶、果膠酸裂合酶和脂肪酶的酶。在一些特別優選的實施方案中， 該酶為蛋白酶。在一些更特別優選的實施方案中，所述蛋白酶是枯草桿菌蛋白酶。在另 一些優選的實施方案中，所述bglC基因編碼與SEQIDN0 2具有至少80%同一性的多 肽。本發明還提供包含培養基和重組芽孢桿菌屬物種宿主細胞的細胞培養物，所述 宿主細胞包含含有失活的bglC基因的基因組，其中所述細胞還包含用於產生分泌型洗滌劑添加劑蛋白質的重組核酸。在一些優選的實施方案中，所述失活的bgic基因含有缺 失、插入、替換或重排。在另一些優選的實施方案中，所述芽孢桿菌屬物種細胞為地衣 芽孢桿菌(B.Iicheniformis)、枯草芽孢桿菌(B.subtilis)、克勞氏芽孢桿菌(B.clausii)、嗜 鹼芽孢桿菌(B.alkalophilus)或耐鹽芽孢桿菌(B.halodurans)的細胞。在另一些優選的實
施方案中，所述分泌型洗滌劑添加劑蛋白質是選自蛋白酶、澱粉酶、果膠酸裂合酶、醯 基轉移酶、芳基酯酶和脂肪酶的酶。在一些特別優選的實施方案中，該酶為蛋白酶。在 一些更特別優選的實施方案中，所述蛋白酶是枯草桿菌蛋白酶。在另一些優選的實施方 案中，所述bglC基因編碼與SEQ ID NO: 2具有至少80%同一性的多肽。本發明還提供包括在適於產生所述分泌型洗滌劑添加劑蛋白質的條件下維持細 胞培養物的方法。在一些實施方案中，該方法還包括從培養基中回收所述分泌型洗滌劑 添加劑蛋白質。在另一些實施方案中，該方法還包括將所述分泌型洗滌劑添加劑蛋白質 與洗衣洗滌劑(laundry detergent)組合。在另一些優選的實施方案中，所述洗滌劑添加劑 蛋白質是枯草桿菌蛋白酶。 本發明還提供通過本文所述方法產生的無纖維素酶的蛋白質或酶組合物。在一 些優選的實施方案中，所述組合物包含由芽孢桿菌屬物種產生的分泌型洗滌劑添加劑蛋 白質，並且其特徵在於該組合物不具有可檢測的纖維素酶活性。本發明還提供包含通過本文所述方法產生的分泌型洗滌劑添加劑蛋白質的無纖 維素酶洗衣洗滌劑。在一些實施方案中，所述無纖維素酶的洗衣洗滌劑包含纖維素性聚 合物(cellulosic polymer)。本發明還提供用於生產宿主細胞的方法，其包括將第一重組核酸引入芽孢桿菌 屬物種細胞中，以使該重組核酸與該細胞的bglC基因重組；以及向該細胞中引入第二重 組核酸，以提供分泌型洗滌劑添加劑蛋白質的表達。在一些優選的實施方案中，所述核 酸插入bglC基因中。在另一些優選實施方案中，所述核酸造成bglC基因的至少一個部 分的缺失。在另一些優選的實施方案中，所述分泌型洗滌劑添加劑蛋白質為枯草桿菌蛋 白酶。附圖
簡述在結合附圖閱讀後將能夠充分理解以下詳細描述的某些方面。需要強調的是， 根據一般實踐，附圖的多個特徵未按比例繪製。相反，多個特徵的尺寸為清楚起見而主 觀地進行了放大或縮小。附圖中包括以下各圖圖IA-B提供了用於構建含有失活的bglC基因的芽孢桿菌宿主細胞的策略。圖2顯示在兩種具有失活的blgC基因的枯草芽孢桿菌菌株(即「宿主A」和 「宿主B」)及兩種具有失活的bglS基因的枯草芽孢桿菌菌株(即「宿主C」和「宿主
D」 )的培養物上清液上進行的粘度測定試驗的結果。流體粘度以釐泊(即cP)來衡量。圖3顯示在兩種產生重組枯草桿菌蛋白酶的枯草芽孢桿菌菌株的培養物上清 液上進行的粘度測定試驗的結果。菌株MDT-05-28具有失活的bglC基因，而菌株 MTD-04-250含有野生型bglC基因。發明詳述本發明提供用於產生洗滌劑添加劑蛋白質的重組細菌細胞。在一些實施方案 中，所述細胞為芽孢桿菌屬細胞。在另一些實施方案中，所述細胞含有包含失活的bglC基因的基因組以及用於產生至少一種分泌型洗滌劑添加劑蛋白質的重組核酸。在一些優 選的實施方案中，所述分泌型洗滌劑添加劑蛋白質是蛋白酶。本發明還提供使用該細菌 細胞來產生至少一種洗滌劑添加劑蛋白質的方法以及含有至少一種洗滌劑添加劑蛋白質 的無纖維素酶組合物。除非另外指明，否則本發明的實施涉及分子生物學、微生物學、蛋白質純化、 蛋白質工程、蛋白質及DNA測序及重組DNA領域中通常使用的常規技術，這些技術 均屬於本領域的 技術範疇。這些技術為本領域技術人員已知，並描述於大量教科書及 參考文獻中(參閱如 Sambrook 等，「Molecular Cloning A Laboratory Manual 「， 第二版(Cold Spring Harbor)，[1989])；以及 Ausubel 等， 「Current Protocols in MolecularBiology" [1987])。本文的上文和下文中提到的所有專利、專利申請、文章和出 版物均明確地以參考方式併入本文。此外，本文中提供的標題不構成對本發明的各個方面或實施方式的限制，所述 方面和實施方式可以通過參考說明書整體而得。因此，緊接下面定義的術語將基於整個 說明書作更全面地定義。然而，為了便於理解本發明，下文定義了多個術語。定義除非本文中另外指明，否則本文使用的所有科技術語均具有本發明所屬領域的 普通技術人員通常理解的含義。例如，Singleton和Sainsbury，Dictionary of Microbiology and Molecular Biology,第二版，John Wileyand Sons，NY (1994)以及 Hale 禾Π Marham， The Harper Collins Dictionaryof Biology, Harper Perennial, NY (1991)為本領域技術人員 提供了許多本文所用術語的一般詞典。儘管與本文所述方法和材料相似或等同的任何方 法和材料均可用於實施本發明，但本文描述了優選的方法和材料。因此，下文定義的術 語將參考說明書整體得以更完整的描述。同時，本文使用的名詞均包括複數含義，除非 其上下文明確表示不是這樣。因此，例如，提到「宿主細胞」時包括多個這樣的宿主細 胞。同樣，提到「基因」時包括多個這樣的候選試劑，提到「細胞」時包括對一個或 多個細胞及本領域技術人員已知的其等同方案的提及，依此類推。數值範圍包含定義該範圍的數值。事實上，本說明書全文中給出的每個最高 數值界限均旨在包括每個較低的數值界限，如同本文中明確寫出了這些較低數值界限那 樣。本說明書全文中給出的每個最低數值界限將包括每個較高的數值界限，如同本文中 明確寫出了這些較高數值界限那樣。本說明書全文中給出的每個數值範圍均包括落入這 些較寬數值範圍內的每個較窄的數值範圍，如同這些較窄的數值範圍均在本文中明確寫 出那樣。當給出數值範圍時，應該理解，也具體地公開了該範圍的上限與下限之間間隔 下限單位之十分之一的每個中間值，除非其上下文明確指明不是這樣。這些較小範圍的 上限及下限可獨立地包括或不包括在該範圍中，並且這些包括一個、兩個端點或不包括 端點的較小範圍也包含在本發明中，並排除所述範圍中任何具體排除的界限。當所述範 圍包括一個或兩個端點時，排除一個或兩個包含在內的端點的範圍也包括在本發明中。引用的所有文獻均通過參考併入本文的相關部分中，對任何文獻的引用都不應 理解為承認它是本發明的現有技術。本文中的任何內容都不應理解為承認本發明沒有資 格作為在先發明而先於這些出版物。本文提及的所有專利和出版物(包括這些專利和出 版物中公開的所有序列)均通過引用方式明確併入本文中。
儘管與本文所述相似或等同的任何適宜的方法和材料均可用於實施或測試本發 明，但現將描述示例性和優選的方法和材料。除非另外指明，否則核酸以5』至3』的方向從左向右書寫，而胺基酸序列則以 氨基至羧基的方向從左向右書寫。本文中提供的標題不構成對本發明的各個方面或實施 方式的限制，所述方面和實施方式可以通過參考說明書整體而得。應該理解，本發明不 受限於所描述的具體方法、方案和試劑，它們可根據本領域技術人員使用它們的情況而 改變。因此，下文定義的術語應參考說明書整體作更完整地定義。本文使用的術語「重組」指在宿主細胞中不天然存在的多核苷酸或多肽。重組 分子可含有通過以非天然方式連接在一起的兩個或更多個天然序列。重組細胞含有重組 多核苷酸或多肽。本文使用的術語「異源」指天然彼此不相關的元件。例如，如果宿主細胞產生 異源蛋白，則該蛋白不是該宿主細胞天然產生的蛋白質。類似地，與異源編碼序列有效 連接的啟動子是指與在野生型宿主細胞中通常不與其有效連接的編碼序列有效連接的啟 動子。當用於多核苷酸或蛋白質時，本文使用的術語「同源」指宿主細胞中天然存在 的多核苷酸或蛋白質。術語「蛋白質」和「多肽」在本文中可互換使用。本文使用的「信號序列」是蛋白質N端部分存在的胺基酸序列，其有利於將該 蛋白質的成熟形式分泌到細胞之外。信號序列的定義是功能性定義。成熟形式的胞外蛋 白質缺少信號序列，該信號序列在分泌過程中被切除。本文使用的「編碼序列」是編碼多肽的DNA區段。本文使用的「失活的基因」是基因組中的基因座，其在失活前能夠產生蛋白質 (即能夠轉錄成可翻譯產生全長多肽的RNA)。對於編碼酶的基因而言，當其不能轉錄及 翻譯成全長的催化活性蛋白質時，是失活的。可通過改變基因轉錄所需的序列而失活基 因，例如改變RNA加工(如polyA尾添加)所需的序列，或改變翻譯所需的序列。失 活的基因的實例包括但不僅限於缺失的基因、含有缺失區域的基因、含有重排區域的基 因、含有失活點突變或移碼的基因，以及含有插入的基因。此外，還可以使用反義或任 何其他可以消除基因表達的方法來失活基因。本文使用的術語「核酸」包括單鏈或雙鏈的DNA、RNA,並包括經化學修飾的 DNA或RNA。術語「核酸」和「多核苷酸」在本文中可互換使用。本文使用的術語「載體」指設計用於將核酸引入一種或多種宿主細胞的多核苷 酸。在一些優選的實施方案中，載體在不同宿主細胞中自主複製。該術語旨在包括但不 僅限於克隆載體、表達載體、穿梭載體、質粒、噬菌體顆粒、盒等。本文使用的「表達載體」指包含與適宜的控制序列有效連接的蛋白質編碼區的 DNA構建體，所述控制序列能在合適的宿主細胞中實現該蛋白的表達。在一些實施方案 中，這樣的控制序列包括實現轉錄的啟動子、控制轉錄產生mRNA的任選的操縱基因序 列、編碼mRNA上的適宜核糖體結合位點的序列、增強子以及控制轉錄和翻譯終止的序 列。本文使用的術語「啟動子」指起始 下遊核酸轉錄的調節序列。
本文使用的術語「有效連接」指以允許元件在功能上相關的方式排列元件。例 如，如果啟動子控制編碼序列的轉錄，則啟動子與該編碼序列有效連接。本文使用的術語「選擇標記」指這樣的蛋白質，其能在宿主中表達從而便於選 擇含有引入的核酸或載體的宿主。選擇標記的實例包括但不僅限於抗微生物劑(如潮黴 素、博來黴素或氯黴素)和/或賦予宿主細胞代謝優勢(如營養優勢)的基因。本文使用的術語「來自」涵蓋術語「源於」、「得自」或者「可得自」以及 「分離自」。本文使用的「非病原性」生物是對人和/或其他動物無致病性的生物。本文使 用的術語「回收」、「分離」和「分開」指將蛋白質、細胞、核酸或胺基酸從至少一種 與其天然相關的組分中移出。當用於細胞時，本文使用的術語「轉化」、「穩定轉化」和「轉基因」指該細 胞具有非天然(例如異源的)核酸序列，所述非天然核酸序列整合進其基因組中或以附加 型質粒的形式存在，並歷經多代而維持。
本文使用的術語「表達」指基於基因的核酸序列產生多肽的過程。該過程包括 轉錄和翻譯。在將核酸序列插入細胞的上下文中，本文使用的術語「引入」指「轉染」、 「轉化」或「轉導」，並包括將核酸序列整合進真核或原核細胞中，其中核酸可整合進
細胞基因組(例如染色體、質粒、質體或線粒體DNA)中、轉化成自主複製子或者瞬時表 達(如轉染的mRNA)。本文使用的術語「雜交」指核酸鏈通過本領域已知的鹼基配對與互補鏈結合 的過程。如果一個核酸與參照核酸序列在中等至高嚴格雜交及洗滌條件下彼此特異地 雜交，則認為該核酸能與參照核酸序列「選擇性地雜交」。中等和高嚴格雜交條件為 本領域技術人員已知(參閱如Ausubel等，ShortProtocols in Molecular Biology.第三版， Wiley&Sons, Hoboken, NJ[1995]；以及 Sambrook 等，Molecular Cloning A Laboratory Manual,第三版，Cold Spring Harbor，NY[2001])。高嚴格條件的一個實例包括在約42°C 在 50% 甲醯胺、5XSSC、5XDenhardt 氏液、0.5 % SDS 和 100 μ g/ml 變性載體 DNA 中 雜交，其後在室溫以2XSSC和0.5% SDS洗滌兩次，其後42°C以0.1 XSSC和0.5% SDS 再洗滌兩次。本文使用的術語「纖維素性聚合物」指包含至少一個1，4-i3-D糖苷鍵的纖維 素、半纖維素或者改性的纖維素或半纖維素聚合物。本文使用的術語「纖維素」指包含通過β-1，4鍵連接的葡萄糖殘基的多糖聚 合物。本文使用的術語「半纖維素」指包含至少一個通過β-(1-4)鍵連接的非葡萄糖 糖殘基(如木糖、半乳糖、阿拉伯糖、鼠李糖、甘露糖、糖醛酸或半乳糖醛酸或木聚糖) 的多糖聚合物。半纖維素包括木聚糖、葡糖醛酸木聚糖、阿拉伯木聚糖、阿拉伯半乳聚 糖、葡甘露聚糖、木葡聚糖和半乳甘露聚糖。本文使用的「纖維素酶」指水解纖維素、地衣及穀物β-D-葡聚糖中的1， 4-β -D-糖苷鍵的酶。本文所述的纖維素酶具有據IUMBM酶命名法描述為EC 3.2.1.4的 活性。本文所述纖維素酶的系統名為1，4-(1，3 1，4)-β-D-葡聚糖4-葡聚糖水解酶。 本文使用的術語「芽孢桿菌屬物種」(或芽孢桿菌)(例如芽孢桿菌宿主細 胞)指任何芽孢桿菌屬物種，包括但不僅限於枯草芽孢桿菌(B.subtilis)、地衣芽孢 桿菌(B.licheniformis)、遲緩芽孢桿菌(B.lentus)、短芽孢桿菌(B.brevis)、嗜熱脂肪 芽孢桿菌(B.stearothermophilus)、嗜鹼芽孢桿菌(B.alkalophilus)、解澱粉芽孢桿菌 (B.amyloliquefaciens)、克勞氏芽孢桿菌(B.clausii)、而 鹽芽孢桿菌(B.halodurans)、巨大 芽孢桿菌(B.megaterium) > 疑結芽孢桿菌(B.coagulans)、環狀芽孢桿菌(B.circulans) > B.lautus和蘇雲金芽孢桿菌(B.thuringiensis)，以及它們的亞種。本文使用的「無纖維素酶的芽孢桿菌」指經遺傳改造的芽孢桿菌宿主細胞，其 不分泌可檢測量的纖維素酶。如下文將詳細討論的，在某些實施方案中，無纖維素酶的 芽孢桿菌菌株可含有失活的bglC基因。本文使用的「等同的未改變的芽孢桿菌菌株」指這樣的宿主菌株，其除了 bglC 基因未改變(即為野生型)外在其他方面與無纖維素酶的芽孢桿菌菌株相同。本文使用的「培養」指在適宜條件下在液體或固體培養基中培養微生物細胞 群。在一些實施方案中，培養指發酵性重組生產目的外源蛋白或其他期望的終產物(一 般在容器或反應器中生產)。本文使用的「洗滌劑添加劑蛋白質」指待加入洗衣洗滌劑中的蛋白質。洗滌劑 添加劑蛋白質可以是酶(如蛋白酶、澱粉酶、果膠酸裂合酶、脂肪酶、醯基轉移酶、芳 基酯酶或不具有酶活性的蛋白質)。在一些特別優選的實施方案中，葡聚糖水解酶 (即具有據 IUMBM 酶命名法描述為 EC3.2.1.8、EC 3.2.1.32、EC 3.2.1.72、EC 3.2.1.136 的活性的酶)被特別排除在術語「洗滌劑添加劑蛋白質」之外。在另一些特別優選的實 施方案中，木聚糖酶(即具有據IUMBM酶命名法描述為EC 3.2.1.75的活性的酶)也被特 別排除在術語「洗滌劑添加劑蛋白質」之外。說明書全文中還可出現其他術語定義。在詳細描述示例性實施方案之前，應該理解，本發明不受限於描述的具體實施 方案，因為它們當然是可以變化的。還應該理解，本文使用的術語僅用於描述具體實施 方案的目的，並不旨在限制。宿主細胞如上述，本發明提供了產生降低(如不可檢測的)水平的纖維素酶的芽孢桿菌 宿主細胞。一般而言，本發明的芽孢桿菌宿主細胞一般產生少於等同的野生型芽孢桿菌 宿主細胞的纖維素酶的約50% (例如少於約40%、少於約30%、少於約20%或少於約 10%)的纖維素酶。在一些實施方案中，本發明細胞產生的纖維素酶少於等同的芽孢杆 菌宿主細胞的纖維素酶的約5%。在一些特別優選的實施方案中，纖維素酶是檢測不到 的(即，該芽孢桿菌宿主細胞是無纖維素酶的芽孢桿菌宿主細胞)。纖維素酶活性旨在 通過任何適宜的已知方法來測定，例如通過用剛果紅染色含有纖維素的LP瓊脂平板(參 閱如 Wolf 等，Microbiol.，141 281-290[1995]；以及 Carder，Anal.Biochem., 153 75-9[1986])和/或使用粘度測定試驗(如下文更為詳細的描述)來測定。在一些實施方案中，通過減少細胞的bglC基因產物表達來產生纖維素酶生產量 減少的芽孢桿菌宿主細胞。在這樣的實施方案中，可以使用任何適宜方法減少芽孢桿菌宿主細胞中的bgic表達，上述方法包括但不僅限於例如使用反義分子或核酶的方法。在 一些優選的實施方案中，通過失活細胞中的bgic基因來減少bgic的表達。幾種芽孢桿菌bgic基因的DNA序列以及這些基因所編碼的蛋白質已經測定，並 保存於NCBI的Genbank資料庫中。以下提供該序列ATGAAACGGTCAATCTCTATTTTTATTACGTGTTTATTGATTACGTTATTGACA ATGGGCGGCATGATAGCTTCGCCGGCATCAGCAGCAGGGACAAAAACGCCAGTAGCC AAGAATGGCCAGCTTAATAAAAGGTACACAGCTCGTTAACCGAGACGGTAAAGCGGT ACAGCTGAAGGGGATCAGTTCACACGGATTGCAATGGTATGGAGAATATGTCAATAAA GACAGCTTAAAATGGCTGAGAGATGATGGGTATCACCGTTTTCCGTGCAGCGATGTAT ACGGCAGATGGCGGTTATATTGACAACCCGTCCGTGAAAAATAAAGTAAAAGAAGCG GTTGAAGCGGCAAAAGAGCTTGGGATATATGTCATCATGATGGCATATCTTAAATGAC GGTAATCCAAACCAAAATAAAGAGAAGGCAAAAGAATTCTTCAAGGAAATGTCAAG CCTTTACGGAAACACGCCAAACGTCATTTATGAAATTGCAAACGAACCAACGGGATG TGAACTGGAAGCGTGATATTAAACCATATGCGGAAGAAGTGATTTCAGTTATCCGCAA AAATGATCCAGACAACATCATCATTGTCGGAACCGGTACATGGAGCCAGGATGTGAAT GATCTGCGATGAC CAGCTAAAAGATGCAAACGTTATGTACGCACTTCATTTTTATGCCG GCACGCACGGCCAATTTTTACGGGATAAAGCAAACTATGCACTCAGCAAAGGAGCAC CTATTTTTTGTGACGAGTGGGAACAAGCGACGCGTCTGGCAATGGCGGTGTATTCCTT GATCAATCGAGGGAATGGCTGAAATATCTCGACAGCAAGACCATTAGCTGGGTGAAC TGGAATCTTTCTGATAAGCAGGAATATCCTCGCTTTAAAGCCGGGGGCATCTAAAACA GGCGGCTGGCGGTTGTCAGATTTATCTGCTTCAGGAACATTCGTTAGAGAAAACATTC TCGGCACCAAAGATTCGACGAAGGACATTCCTGAACGCCATCAAAGATAAACCCACA CAGGAAAATGGTATTTCTGTACAGTACAGAGCAGGGGATGGGAGTATGAACAGCAAC CAAATCCGTCCGCAGCTTCAAATAAAAAATAACGGCAATACCACGGTGATTTAAAGAT GTCACTGCCCGTTACTGGTATAAAGCGAAAAACAAAGGCCAAAACTTTGACTGTGAC TACGCGCAGATTGGATGCGGCAATGTGACACACAAGTTTGTGACGTTGCATAAACCA AGCAAGGTGCGATACCTATCTGGAACTTGGATTTAAAAACGGAACGTTGGCACCGGG AGCAAGCACAGGGAATATTCAGCTCCGTCTTCACAATGATGACTGGAGCAATTATGCA CAAAGCGGCGATATTCCTTTTTAAATCAAATACGTTTAAAACAACGAAAAAAATCACA TTATATGATCAAGGAAAACTGATTTGGGGAACAGAACCAAATTAG (SEQ ID NO 1)以下為SEQ ID NO: 1編碼的胺基酸序列。MKRSISIFITCLLITLLTMGGMIASPASAAGTKTPVAKNGQLSIKGTQLVNRDGK AVQLKGISSHGLQWYGEYVNKDSLKWLRDDWGITVFRAAMYTADGGYIDNPSVKNKV KEAVEAAKELGIYVIWHILNDGNPNQNKEKAKEFFKEMSSLYGNTPNVIYEIANEPNGD VNWKRDIKPYAEEVISVIRKNDPDNIIIVGTGTWSQDVNDAADDQLKDANVMYALHFYA GTHGQFLRDKANYALSKGAPIFVEGTSDASGNGGVFLDQSREWLKYLDSKTISWVNWN LSDKQESSSALKPGASKTGGWRLSDLSASGTFVRENILGTKDSTKDIPETPSKDKPTQEN GISVQYRAGDGSMNSNQIRPQLQIKNNGNTTDLDVTARYWYKAKNKGQNFDCDYAQIG CGNVTHKFVTLHKPKQGADTYLELGFKNGTLAPGASTGNIQLRLHNDDWSNYAQSGDYSFFKSNTFKTTKKITLYDQGKLIWGTEPN(SEQ ID NO 2)此外，已經鑑定了纖維素酶的幾個保守性結構域以及大量保守性胺基酸，這使得人們可以通過生物信息學方法鑑定其他芽孢桿菌bgic基因及蛋白。在一些實施方案中，芽孢桿菌bglC基因包含與上文提供的保存於NCBI Genbank 資料庫中的bglC序列(SEQ ID NO: 1)至少70% (例如至少80%、至少90%、至少 95%,至少97%或至少98%)的序列同一性。在再一些實施方案中，芽孢桿菌bglC基因 在嚴格條件下與保存於NCBIGenbank資料庫的bglC序列或SEQ ID NO 1雜交。在另 一些實施方案中，芽孢桿菌bglC基因編碼與保存於NCBI Genbank資料庫的bglC序列或 SEQ ID NO 2具有至少70%的序列同一性(例如至少80%、至少90%、至少93%、至 少95%、至少97%或至少98%的序列同一性)的多肽。保存於NCBI Genbank資料庫的 示例性bglC蛋白及核苷酸序列包括GID 3100136(地衣芽孢桿菌)、GID 52348343(地 衣芽孢桿菌)、GID 42491106 (解澱粉芽孢桿菌)和GID 50812243 (枯草芽孢桿菌)。 上述Genbank登錄號(包括其中的核酸及蛋白質序列以及這些序列的注釋)均通過參考整 體併入本文中。在一些優選實施方案中，芽孢桿菌宿主細胞為任何以下物種地衣芽孢桿菌、 遲緩芽孢桿菌、枯草芽孢桿菌、解澱粉芽孢桿菌、短芽孢桿菌、嗜熱脂肪芽孢桿菌、 嗜鹼芽孢桿菌、凝結芽孢桿菌、環狀芽孢桿菌、短小芽孢桿菌(B.pumilus)，蘇雲金芽 孢桿菌、克勞氏芽孢桿菌或巨大芽孢桿菌。枯草芽孢桿菌宿主細胞包括但不僅限於 美國專禾 IJ 5,264,366 和 4,760,025 (RE 34,606)中所述的那些，以及 1A6 (ATCC 39085)、 168(1A01)、SB19、W23、Ts85、B637、PB1753 至 PB1758、PB3360、JH642、 1A243 (ATCC 39,087)、ATCC 21332、ATCC 6051、MI113、DEIOO (ATCC39,094)、 GX4931、PBT 110 和 PEP 211 菌株(參閱如 Hoch 等，Genetics73 215_228[1973]；美國 專利 No.4,450,235 ；美國專利 No.4,302,544 以及 EP 0134048 (還參閱 Palva 等，Gene 19 81-87 [1982]；以及 Fahnestock 禾Π Fischer, J.Bacteriol.，165 796_804[1986]；和 Wang 等，Gene 69: 39_47[1988])。在一些實施方案中，宿主細胞包括含有表達盒(即啟動子、編碼洗滌劑添加劑 蛋白質的多核苷酸以及轉錄終止子)的重組核酸，其中所述表達盒足以使芽孢桿菌宿主 細胞產生洗滌劑添加劑蛋白質。在一些實施方案中，所述重組核酸被整合進宿主細胞基 因組中，而在另一些實施方案中，所述重組核酸存在於獨立於基因組之外的自主複製的 載體中。在一些實施方案中，編碼洗滌劑添加劑蛋白質的多核苷酸為在芽孢桿菌宿主細 胞中表達該蛋白質而進行了密碼子優化。在一些特別優選的實施方案中，芽孢桿菌宿主細胞被改造成使蛋白質表達最大 化。因此，在一些實施方案中，宿主細胞在至少一個以下基因中含有失活改變degU、 degS、degR 和 / 或 degQ (參閱 Msadek 等，J.Bacterid.，172 824_834[1990]；禾Π Olmos 等，Mol.Gen.Genet.，253 562_567[1997])。在一些特別優選的實施方案中，宿主細 胞為帶有degU32 (Hy)突變的枯草芽孢桿菌。在另一些實施方案中，芽孢桿菌宿主細 胞在以下基因中含有突變和/或缺失scoC4(參閱Caldwell等，J.Bacteriol，.183 7329-7340[2001]) ； spoIIE (參閱 Arigoni 等，MoLMicrobiol., 31: 1407_1415[1999])； oppA 或 opp 操縱子中的其他基因(參閱 Perego 等，MoLMicrobiol., 5 173_185[1991])。事實上，可以想到，opp操縱子中任何與oppA基因突變導致相同表型的突變都將可用於 本發明的改變的芽孢桿菌菌株的一些實施方案中。在一些實施方案中，這些突變單獨出 現，而在另一些實施方案中，存在突變的組合。在一些實施方案中，本發明的改變的芽 孢桿菌可得自已在一個或多個上述基因中包含了突變的芽孢桿菌宿主菌株。在另一些實 施方案中，本發明的改變的芽孢桿菌可以進一步被改造以包含一個或多個上述基因的突 變。使用任何便利的方法構建的芽孢桿菌宿主細胞均可用於本發明，包括通過在細 胞的bgic基因中進行插入、缺失、替換、移碼、點突變和/或重排來改變該bgic基因序 列而構建的細胞，可用於本發明。在一些實施方案中，待改變的基因部分在編碼區中， 或者在表達編碼區所需的調節元件中。在一些實施方案中，基因的該調節或控制序列是 啟動子序列或其功能性部分(即基因表達所必需的部分)。這樣的基因失活方法為本領域 所熟知(參閱如 Wolf 等 Microbiol.，141 281-290 [1995])。在一些實施方案中，如下構建宿主細胞將重組核酸引入芽孢桿菌細胞中， 以 使該重組核酸與細胞基因組中的bglC基因重組；將第二種重組核酸引入細胞中，以提供 分泌型洗滌劑添加劑蛋白質的表達。在一些實施方案中，將核酸插入bglC基因中，而在 另一些實施方案中，該核酸造成bglC基因的至少一部分缺失。用於將多核苷酸序列引入芽孢桿菌細胞的合適方法為本領域技術人員所熟知 (參閱如 Ferrari 等，「Genetics, 「 in Harwood等(ed.)，Bacillus, Plenum Publishing Corp. [1989]，57-72 頁;還參閱 Saunders 等，J。Bacteriol., 157 718-726[1984] ； Hoch 等， J.Bacteriol.，93 1925_1937[1967] ； Mann 等，Curr.Mierobiol., 13 131_135[1986]； 以及 Holubova，FoliaMicrobiol.，30 97[1985] ； Chang 等，Mol.Gen.Genet，168 11-115 ； [1979] ； Vorobjeva 等，FEMS Microbiol丄ett.，7 261_263[1980] ； Smith 等， Appl.Env.Microbiol., 51: 634[1986] ； Fisher 等，Arch.Microbiol.，139 213_217[1981]； 以及 McDonald，J.Gen.Microbiol., 130 203[1984])。事實上，諸如轉化等方法，包括 原生質體轉化和congression、轉導和原生質體融合，是本領域已知的，並且適用於本發 明。如上文指出的，除了產生水平降低(例如檢測不到)的纖維素酶以外，本發明提 供還包含用於產生分泌型洗滌劑添加劑蛋白質的重組核酸的芽孢桿菌宿主細胞，其中分 泌型洗滌劑添加劑蛋白質是從細胞中分泌出來並將添加入洗衣洗滌劑中的蛋白質(例如 酶)。示例性的洗滌劑添加劑蛋白質包括但不僅限於蛋白酶(如枯草桿菌蛋白酶)、α-澱 粉酶、甘露聚糖酶、纖維素酶、裂合酶、醯基轉移酶、芳基酯酶和脂肪酶等。在一些實 施方案中，洗滌劑添加劑蛋白質可由與該洗滌劑添加劑蛋白質的來源菌株相同的菌株表 達。酶枯草桿菌蛋白酶(即胞外鹼性絲氨酸蛋白酶)是特別有意義的。任何合適的枯 草桿菌蛋白酶均可用於本發明(參閱如Siezen，Protein Sci., 6 501-523[1997] ； Bryan, Biochim.Biophys.Acta，1543 203_222[2000] ； Maurer, Curr.Op, Biotechnol., 2004 15 330-334[2004]；以及 Gupta，Appl.Mierobiol.Biotechnol., 59 15-32[2002])。在一些實
施方案中，目的枯草桿菌蛋白酶具有據IUMBM酶命名法描述為EC 3.4.4.16的活性。
在一些實施方案中，這樣的枯草桿菌蛋白酶具有可見於野生型基因組的胺基酸 序列(即該枯草桿菌蛋白酶是天然存在的枯草桿菌蛋白酶)，而在另一些實施方案中， 所述枯草桿菌蛋白酶是天然存在的枯草桿菌蛋白酶的變體。在一些優選的實施方案中， 所述變體枯草桿菌蛋白酶包含與野生型基因組所編碼的枯草桿菌蛋白酶具有至少80 %、 至少90%、至少95%或至少98%同一性的胺基酸序列。示例性枯草桿菌蛋白酶包括 但不僅限於ALCANASE (Novozymes)、FNA (Genencor), SAVINASE (Novozymes)、PURAFECT (Genencor)、KAP (Kao)、EVERLASE (Novozymes)、 PURAFECT OxP (Genencor) > FN4 (Genencor)、BLAP S (Henkel) > BLAP X (Hen kel) > ESPERASE (Novozymes)、KANNASE (N ovozymes)禾口 PROPERASE (Genencor)。在另一些實施方案中，所述枯草桿菌蛋白酶包括但不僅 限於枯草桿菌蛋白酶168、枯草桿菌蛋白酶BPN'、枯草桿菌蛋白酶Carlsberg、枯草 桿菌蛋白酶DY、枯草桿菌蛋白酶147或枯草桿菌蛋白酶309 (參閱如EP414279B ； W089/06279 ；和 Stahl 等、J.Bacteriol.、159 811_818[1984])。其他可用於本發明的 枯草桿菌蛋白酶和其他蛋白酶包括但不僅限於以下文獻中所述的那些WO 99/20770 ； WO 99/20726 ； WO 99/20769 ； W089/06279 ； RE 34,606 ；美國專利 No.4,914,031 ； 美國專利No.4,980,288 ；美國專利No.5,208,158 ；美國專利No.5,310,675 ；美國專利 No.5,336,611 ；美國專利No.5,399,283 ；美國專利No.5,441,882 ；美國專利No.5,482,849 ； 美國專利No.5,631,217 ；美國專利No.5,665,587 ；美國專利No.5,700,676 ；美國專利 No.5,741,694 ；美國專利No.5,858,757 ；美國專利No.5,880,080 ；美國專利No.6,197,567 ； 以及美國專利No.6,218,165。洗滌劑和洗滌劑添加劑蛋白質 在一些實施方案中，使用宿主細胞製備蛋白質組合物和洗衣洗滌劑，其中在一 些優選的實施方案中，所述洗滌劑含有至少一種纖維素性聚合物。在一些實施方案中，培養宿主細胞以提供至少一種分泌型洗滌劑添加劑蛋白質 進入培養細胞的培養基中。在一些特別優選的實施方案中，使用任何適宜的方法(如沉 澱、離心、親和、過濾或任何其他本領域已知方法)從培養基中回收所述分泌型洗滌劑 添加劑蛋白質。例如，可以使用親和層析(Tilbeurgh等，FEBS Lett.，16: 215 [1984])； 離子交換層析法(Goyal 等，Bio.Technol.，36: 37[1991] ； Fliess 等，Eur.J.Appl.Microbiol. Biotechnol., 17: 314[1983] ； Bhikhabhai 等，J.AppLBiochem., 6 336[1984]；禾口 Ellouz 等，Chromatogr.，396 307[1987])，包括使用具高分辨力的材料進行的離子交換層析 (參閱如 Medve 等，J.Chromatogr.A 808 153[1998])；疏水相互作用層析(Tomaz 禾口 Queiroz, J.Chromatogr.A 865 123 [1999]；兩相分配(Brambauer 等，Bioseparation 7 287[1999])；乙醇沉澱；反相HPLC ； 二氧化矽或陽離子交換樹脂(如DEAE)上的層 析；層析聚焦；SDS-PAGE ；硫酸銨沉澱；和凝膠過濾(例如SEPHADEX G_75)。在一些優選的實施方案中，不經從培養基的其他組分中純化而使用洗滌劑添加 劑蛋白質。在一些這樣的實施方案中，簡單地濃縮所述培養基，接著不經進一步從培養 基組分中純化該蛋白質而進行使用。
與含有未改變(如野生型)bglC基因的等同芽孢桿菌宿主細胞相比，使用本發明 宿主細胞產生的蛋白質組合物一般含有減少的纖維素酶。
在一個實施方案中，組合物的纖維素酶含量通過在將該組合物加入纖維素性聚 合物溶液(例如含有羧甲基纖維素(CMC)的溶液)後測量該溶液的粘度改變來評估。 這樣的方法是熟知的(參閱如 Manning，Biochem.Biophys.Meth.，5 189-202 [1981]；禾口 Sheperd, Biochem.J., 193 67_74[1981])。可用於本發明的一種示例性粘度測定試驗在
下文的實施例中提供。 在包含本發明蛋白質組合物的一些實施方案中，與使用具有未改變bglC基因 的芽孢桿菌細胞產生的等同蛋白質組合物造成的減少相比，本發明組合物能夠造成少於 80% (例如少於50%、少於30%、少於20%或少於10%)的纖維素性材料溶液粘度減 少。在一些實施方案中，本發明蛋白質組合物不使纖維素性材料溶液的粘度產生可檢測 的降低，在這種情況下該蛋白質組合物被認為是「無纖維素酶」的蛋白質組合物。無纖維素酶的蛋白質組合物可用於多種情況，包括但不僅限於洗衣洗滌劑，特 別是含有纖維素性聚合物的洗滌劑。在一些實施方案中，包含本發明無纖維素酶的蛋白 質組合物的洗衣洗滌劑包含約至80% (例如5%至50%)(以重量計)的表面活性劑。 在一些實施方案中，所述表面活性劑為非離子型表面活性劑，而在另一些實施方案中， 它是陽離子型表面活性劑，在另一些實施方案中，它是陰離子型表面活性劑，在另一些 實施方案中，它是兼性離子表面活性劑，在另一些實施方案中，它包含這些表面活性劑 的任何組合(例如陰離子及非離子型表面活性劑的混合物)。示例性表面活性劑包括但不 僅限於烷基苯磺酸鹽(ABS)，包括直鏈烷基苯磺酸鹽和直鏈烷基磺酸鈉、烷基苯氧基聚 乙氧基乙醇(例如壬基苯氧基乙氧基化物或壬基酚)、二乙醇胺、三乙醇胺和單乙醇胺。 可用於洗衣洗滌劑的表面活性劑的其他描述提供於美國專利No.3,664,961、3,919,678、 4,222,905 和 4,239,659。包含本發明無纖維素酶的酶的洗衣洗滌劑可以以任何形式(如固體、液體、凝 膠等)使用。在一些實施方案中，所述洗衣洗滌劑還包含緩衝劑，例如碳酸鈉、碳酸 氫鈉或洗滌劑助洗劑、漂白劑、漂白活化劑、酶、酶穩定劑、增泡劑、抑泡劑、防晦暗 齊IJ、抗腐蝕劑、汙物助懸劑、汙物釋放劑、殺菌劑、ρΗ調節劑、非助洗劑鹼性源、螯合 齊 、有機或無機填充劑、溶劑、水溶助長劑、螢光增白劑、染料或香料。如上文所述，在一些實施方案中，洗衣洗滌劑含有纖維素性聚合物(如纖維素 聚合物)或改性的纖維素聚合物。合適的纖維素性聚合物包括但不僅限於陰離子修飾的 纖維素、非離子修飾的纖維素、陽離子修飾的纖維素、兼性離子修飾的纖維素及其混合 物，以及纖維素、纖維素醚、纖維素酯、纖維素醯胺、甲基纖維素、羧甲基纖維素、乙 基纖維素、羥乙基纖維素、羥丙基甲基纖維素、酯羧甲基纖維素及其任何混合物。在一 些實施方案中，改性的纖維素醚聚合物(參閱如美國專利Νο.6,833,347)或其他纖維素性 聚合物(參閱如美國專利5,009,800和4,661,267)可用於本發明。在一些實施方案中，洗 衣洗滌劑含有以重量計約0.1%至8% (例如約0.5%至4%或約至3%)的纖維素性聚 合物。實驗以下實施例為本領域普通技術人員提供了關於如何實施和使用本發明的完整公 開及描述，並且不旨在限制本發明人所認為的其發明的範圍，且也不意味著以下實驗是 所進行的全部或僅有的實驗。已經盡力保證所用數字(例如量、溫度等)的準確性，但一些實驗誤差和偏差也應考慮在內。除非另外指明，否則分數為按重量計分數，分子量 為重量平均分子量，溫度為攝氏度，壓力為大氣壓或接近大氣壓。在以下實驗公開內容中，使用了以下縮寫V (攝氏度)；rpm(每分鐘轉數)； H20(水)；aa(胺基酸)；bp(鹼基對)；kb(千鹼基對)；kD(千道爾頓)；gm(克)； yg和ug(微克)；mg(毫克)；ng(納克)；yl和ul(微升)；ml(毫升)；mm(毫 米)；nm(納米)；μιη和um(微米)；M(摩爾)；mM(毫摩爾)；μM和uM(微摩 爾)；U (單位)；V(伏特)；MW (分子量)；sec (秒)；min (分鐘)；h和hr (小時)； OD28tl (280nm 的光密度)；OD4tl5 (405nm 的光密度)；OD6tltl (600nm 的光密度)；PAGE (聚 丙烯醯胺凝膠電泳)；LAS (月桂基磺酸鈉)；SDS(十二烷基硫酸鈉)；Tris(三(羥甲 基)氨基甲烷)。實施例1構建bglC::壯觀黴素菌株
缺失bglC基因的一般策略示於圖IA-B中。簡言之，通過PCR擴增bglC基因 側翼的上遊及下遊DNA片段，並在載體中連接在一起。通過限制性內切核酸酶消化打開 該插入片段，並將側翼為IoxP位點的壯觀黴素盒連接進去。通過限制性內切核酸酶消化 將所得質粒線性化，並轉化進芽孢桿菌中。通過用引入的抗微生物劑標記(壯觀黴素) 進行選擇，通過雙交換事件實現了目的基因的置換。對於bglC的情況，以壯觀黴素抗性 基因置換編碼區，之後使用識別側翼IoxP位點的Cre重組酶，將該壯觀黴素抗性基因環 出ο利用WO 03/083125所述策略及表1所述引物，使用PCR技術，構建DNA構建體。
表1.引物
~引物中的~~~ 『 ρη rn
引物名，J制性位引物序列
BgiC SacI UFIUF SacI "acaaatGAGCTCgctggagcattggatggcgcaUcc3
BglC BamHl UR BamHI TgatctGGATCCccttcgcatcattttggctctacac— 4
BglC BamHl DF BamHl AaaactGGATCCgggaacagaaccaaattagttaagc5
bglC Sail DR__SailatggtaGTCGACgcaaaogcggctaoaatatggctca6
bglC Uout chk___ttccgcggagggccggcctactata__7
bglC Dout chk___catattcacaatgcgatggtagagg_ 8
bglC DF chkdel__Ttatgcacaaagcggcgattattcc9
SPECchkUR: _ Atctcttgccagtcacgttacg— IQ
bglS xba UF__Xba__ggagtgTCTAGAactgaccagcttccgtctttccctg__11
Bg!S BamHl UR BamHl ActaacGGATCCcctgtaactatcatcatcttccctc12
BgIS BamHl DF BamHl CaaaaaGGATCCgccaaatgtgaaagagcctgctgca13
bglS Sac DR__Sac__agaggtGAGCTCaccgctgattcccgctatgatcgcc__14
bglS Uout chk___Caatatacacaatacagtgctgaaagc__IS
bglS Drout chk___Gcgggaatagcgatgcttggttcgg__ 6
bglS DF chk del___Gatgaacttgtggaatggcacgggt__17
PloxBamUF—"T^GACGGTATCGATAAGCTGGATCCATAAC — 18 ~
ploxBamPRGCCTAGGATGCATATGGGATCCGCATAAC'ITC 「 19限制性位點按如下命名XbaI為 TCTAGA (SEQ ID NO 20) ； BamHI 為 GGATCC (SEQ ID NO 21) ； SacI 為 GAGCTC (SEQ ID NO 22) ； Asp718為 GGTACC (SEQ ID NO 23) ； PstI 為 CTGCAG (SEQ ID NO 24)，HindIII 為 AAGCTT (SEQ ID NO 25)。在該方法中，使用150 μ L Eppendorf管進行IOOyL PCR反應，所述管中含有 84μ L7jc> 10 μ L PCR緩衝液、IyL每種引物(即，BglC SacI UF和BglC BamHl UR，或 者IoxPBamHlF和IoxPBamHlR)、2 μ L dNTP、1 μ L DNA模板(例如野生型芽孢桿菌染
色體或對照質粒)和1 μ L DNA聚合酶。所使用的DNA聚合酶包括Taq Plus高保真聚合 酶和Herculase (Stratagene)。反應使用以下程序在Hybaid PCRExpress熱循環儀中進行。
首先將樣品在94°C加熱5分鐘，接著冷卻至50°C保持。在該點加入DNA聚合酶。25個 擴增循環各由95°C 1分鐘、50°C 1分鐘和72°C 1分鐘構成。最終的72°C 10分鐘確保完 全延伸。將樣品保持在4°C至分析。該反應獲得了側翼DNA盒(各約Ikb)以及5』和 3』末端帶有BamHI限制性位點的IoxP壯觀黴素盒。PCR完成後，將每個反應物各10 μ L在Invitrogen 1.2%瓊脂糖E-凝膠上以60伏 電泳30分鐘，以檢查正確大小條帶的存在。本文所述所有凝膠電泳法均使用這些條件。 如果存在條帶，則根據生產商的說明使用Qiagen QIAQUICK PCR純化試劑盒來純 化剩餘的反應物，接著用適當的限制性酶對進行切割。消化在37°C進行1小時，20yL 反應物由9 μ L /K、2 μ L10XBSA、2 μ L適當的NEB限制性緩衝液(根據2000-01 NEB 目錄和技術資料)、5 μ L模板和1 μ L每種限制性酶組成。例如，用SacI和BamHI在 NEB (New England BioLabs)限制性緩衝液B中切割bglC上遊片段。通過凝膠電泳純化經 消化的片段並根據生產商的說明使用QiagenQIAQUICK 凝膠提取試劑盒進行提取。根據生產商的說明使用Takara連接試劑盒或者使用T4 DNA連接酶(反應內容 每種插入片段各5 μ L、1 μ L經切割的pUC19質粒、3 μ LT4DNA連接酶緩衝液和1 μ L Τ4 DNA連接酶)，在兩個步驟中將片段連接進質粒載體中。首先，將經切割的上遊及下遊 片段在15°C過夜連接進先已經SacI消化並凝膠純化的pUC19質粒(參閱如Yanisch-Reman 等，Gene33: 103-119 [1985])多接頭中的單限制性酶切位點中，在共有的BamHI位點 連接以重新形成環狀質粒。使用生產商的One Shot轉化方案將此重新環化的質粒轉化進 Invitrogen的感受態「Top 10」大腸桿菌細胞中。 在以1.5%瓊脂(LA)加50 μ g/ml羧苄青黴素固化的、含有X_gal (Sigma)用於 藍白篩選的、Luria-Bertani(LB)培養基上選擇轉化體。挑取克隆並在37°C在5mL Luria Bertani培養液(LB)加50 μ g/ml羧苄青黴素中培養過夜，使用Qiagen的QIAQUICK 小量製備試劑盒分離質粒。使用SacI進行的限制性分析證實了 2kb插入片段的存在。在 如上述消化反應(以額外的1 μ L水代替第二種限制性酶)中用BamHI切割經證實帶有該 插入片段的質粒以將其線性化，用1 μ L小牛腸或蝦的磷酸酶在37°C處理1小時以防止再 環化，並連接經BamHI消化的側翼為IoxP位點的壯觀黴素抗性盒。將這種連接混合物轉 化進大腸桿菌Top 10細胞中，並在含有100 μ g/ml壯觀黴素的LA平板上選擇菌落。如 上述通過以BamHI進行限制性分析來證實所分離質粒中的標記插入。在轉化進枯草芽孢 桿菌中之前，用ScaI將質粒線性化，以確保雙交換事件。實施例2粘度測定試驗在含有50mL適於生產枯草桿菌蛋白酶的培養基的250ml帶擋板錐形瓶中培養細胞(參閱 Christianson 等，Anal.Biochem.，223 119_129[1994]；以及 Hsia 等，Anal.
Biochem.，242 221-227 [1996])。用50 μ L的8小時5mL培養物接種該培養基，並 在37°C培養40小時同時以250 RPM搖動。培養宿主A(_bglC)、宿主B(_bglC)、宿主 C (-bglS)和 Host D (-bglS)培養物 48 小時。在37小時時 從每個搖瓶中取Iml樣品。離心除去細胞，對60 μ L上清液進行粘 度測定試驗。在t = 0、t = 22小時和t = 120小時時測量粘度。使用水作為對照。使用以下方法測量粘度對於每個實驗，將2ml體積的纖維素性材料(羧甲 基纖維素)在深低溫小瓶中分散。將60 μ L樣品加入2ml體積的纖維素性材料中。輕柔 混合後，在適當的預定時間(例如孵育20小時)取樣進行分析。就分析而言，將500 μ L 樣品和底物吸入粘度計(BrookfieldLV DVIII Cone&Plate粘度計，帶有設置為25°C的CP40 水浴)的樣品杯中，並將粘度計編程以便SSN(設置速度)為16 RPM，WTI(等待時間) 設置為30秒(Rheocalc軟體)。30秒後，顯示摘要單。這些測定的結果在圖2提供。對於接觸纖維素性材料的對照、宿主A(-bglC) 和宿主B(-bglC)樣品而言，在實驗過程中未觀察到粘度下降，表示樣品中不存在纖維素 酶活性。如粘度的下降所表示的，具有缺失的bglS基因組序列的宿主菌株顯示出顯著的 纖維素酶活性。實施例3構建產生蛋白酶的bglC::壯觀黴素菌株在本實驗中測試了以下菌株產生枯草桿菌蛋白酶的枯草芽孢桿菌菌株以及帶 有插入失活的bglC的相同菌株。如下構建待測試的菌株。用來自產生枯草桿菌蛋白酶的菌株的染色體DNA轉化 SC6 菌株(spoIIE，amyE，aprE Pxyl comK)。在含有氯黴素(5 μ g/ml)和 1.6% 脫脂乳 的L瓊脂平板上選擇轉化體。通過含有脫脂乳的平板上產生的暈圈來證實枯草桿菌蛋白 酶的存在。所得菌株MDT04-250用來自具有插入失活的bglC基因的菌株的染色體DNA 進行轉化，並在含有壯觀黴素(100 μ g/ml)的L瓊脂平板上選擇轉化體。通過對氯黴素 (5 μ g/ml)和壯觀黴素(100 μ g/ml)的抗性來證實新菌株MDT05-28。為獲得蛋白酶， 擴增這兩種菌株，這通過將其依次在含有氯黴素(10 μ g/ml)然後含有氯黴素(25 μ g/ml) 的L瓊脂平板上培養來進行。在250mL帶擋板的錐形瓶中，在含有25ml LB (Difco)、葡 萄糖(0.1% )和氯黴素(25μιη/ιη1)的搖瓶中培養這些經擴增的菌株。將搖瓶在37°C孵 育同時以280rpm搖動，在OD55tl為0.8時，將ImL培養物與0.5ml 30%甘油混合併冷凍 於_70°C。以解凍管中的30 μ L接種250ml三角瓶中的40ml FNII培養基。每個菌株使 用兩瓶。將搖瓶在280rpm搖動下以37°C孵育數天，收集上清液樣品進行粘度測試和枯 草桿菌蛋白酶分析。在培養過程中在不同時間(如16、48和68小時)後從液體培養物中收穫上清 液，並在25°C在含有0.3 mM N-琥珀醯-L-Ala-L-Ala-L-Pro-L-Phe-對硝基苯胺(Vega Biochemicals)、0.1M Tris, pH 8.6的溶液中如前述測定枯草桿菌蛋白酶(參閱Estell等， J.Biol.Chem.，260 6518_6521[1985])。該測定法測量由於對硝基苯胺的水解和釋放導致 的每分鐘410nm吸光度的提高。這些菌株以相等的速率產生相等量的枯草桿菌蛋白酶。在接種後16、48或68小時時自親本菌株MDT04-250或bglC::spec菌株(MDT05-28)的搖瓶中取上清液樣品，並與纖維素底物(4.5ml 5% CMC+0.5ml上清液)孵 育1、24或48小時。通過纖維素底物的粘度下降來衡量纖維素酶對纖維素底物的活性， 上述粘度下降根據生產商的指導使用軟體通過流變儀測量(如上文所述)。數據以對照 (dH20)讀數的百分比來表示。得自MDT05-28搖瓶的樣品未顯示纖維素底物的粘度降 低，而來自MDT04-250的所有樣品都快速地降低纖維素底物的粘度。這表明bglC的失 活阻止了對纖維素底物的活性。這些測定試驗的結果示於圖3。這些結果顯示，具有已 破壞的bglC基因的表達枯草桿菌蛋白酶的宿主芽孢桿菌菌株的培養物上清液未顯示顯著 的纖維素酶活性。儘管已經舉例說明和描述了本發明的具體實施方案，但對於本領域技術人員而 言很明顯的是，可以進行多種其他改變和修改，而不背離本發明的精神和範圍。因此， 所附的權利要求書旨在涵蓋所有這些在本發明範圍之內的改變和修改。本說明書中提及的所有專利及出版物代表了本發明所屬領域技術人員的水平。 所有專利及出版物均以參考方式併入本文，其程度等同於每篇單個出版物均具體且單獨 地指明以參考方式併入。
儘管描述了本發明的優選實施方案，但對本領域普通技術人員而言很明顯的 是，可以對所公開的實施方案進行多種修改，而且這些修改均在本發明的範圍之內。本領域技術人員十分清楚，本發明非常適應於實現本發明的目的並獲得所描述 的結果和優點以及其內在的結果和優點。本文所述的組合物和方法代表優選實施方案， 是示例性的，並且不意在限制本發明的範圍。對本領域技術人員而言很明顯的是，可以 對本文所述發明進行多種替換和修改，而不背離本發明的範圍和精神。適宜地，本文示例性描述的發明可以在缺少本文未具體公開的任何要素、限制 條件的情況下實施。所使用的術語和表述用作描述用語而非限制，這些術語及表述的使 用並不旨在排除所示及所述特徵的任何等同方案或其部分，而是應該認識到，在本發明 要求保護的範圍之內可以有多種修改。因此，應該理解，儘管本發明通過優選實施方案 和任選特徵進行了具體公開，但本領域技術人員可以對本文所公開的概念進行修改和改 變，這些修改和改變均被認為在後附權利要求書所定義的本發明範圍之內。本文對本發明進行了寬泛和一般性的描述。落入公開的上位概念之內的每種下 位概念及亞組均構成本發明的一部分。這包括附條件或負向限制因素的、對本發明的 上位描述，以從該上位概念中除去任何主題，無論該被排除的主題是否在本文中具體提 及。
權利要求
1.重組芽孢桿菌宿主細胞，其包含含有失活的bgic基因的基因組，其中所述細胞還 包含用於產生分泌型洗滌劑添加劑蛋白質的重組核酸。
2.權利要求1的重組芽孢桿菌宿主細胞，其中所述失活的bglC基因包含缺失、插 入、替換或重排。
3.權利要求1的重組芽孢桿菌宿主細胞，其中所述芽孢桿菌細胞為地衣芽孢杆 菌(B.licheniformis)、枯草芽孢桿菌、克勞氏芽孢桿菌(B.clausii)、嗜鹼芽孢桿菌 (B.alkalophilus)或耐鹽芽孢桿菌(B.halodurans)的細胞。
4.權利要求1的重組芽孢桿菌宿主細胞，其中所述分泌型洗滌劑添加劑蛋白質為選自 蛋白酶、澱粉酶、果膠酸裂合酶、醯基轉移酶、芳基酯酶和脂肪酶的酶。
5.權利要求4的重組芽孢桿菌宿主細胞，其中所述酶是蛋白酶。
6.權利要求5的重組芽孢桿菌宿主細胞，其中所述蛋白酶是枯草桿菌蛋白酶。
7.權利要求1的重組芽孢桿菌宿主細胞，其中所述bglC基因編碼與SEQID NO 2 具有至少80%同一性的多肽。
8.細胞培養物，其包含 培養基；和權利要求1的重組芽孢桿菌宿主細胞。
9.一種方法，其包括在適於產生所述分泌型洗滌劑添加劑蛋白質的條件下維持權利要求8的細胞培養物。
10.權利要求9的方法，還包括從所述培養基中回收所述分泌型洗滌劑添加劑蛋白質。
11.權利要求10的方法，還包括將所述分泌型洗滌劑添加劑蛋白質與洗衣洗滌劑組合。
12.權利要求9的方法，其中所述分泌型洗滌劑添加劑蛋白質是枯草桿菌蛋白酶。
13.通過權利要求9的方法產生的無纖維素酶的蛋白質組合物。
14.權利要求13的無纖維素酶的蛋白質組合物，其中所述組合物包含由芽孢桿菌產 生的分泌型洗滌劑添加劑蛋白質，並且其特徵在於該組合物不具有可檢測的纖維素酶活 性。
15.包含通過權利要求9的方法產生的分泌型洗滌劑添加劑蛋白質的無纖維素酶的洗 衣洗滌劑。
16.權利要求15的無纖維素酶的洗衣洗滌劑，其中所述洗滌劑含有纖維素性聚合物。
17.構建細胞的方法，其包括a)將第一重組核酸引入芽孢桿菌細胞中，以使所述重組核酸與所述細胞的bglC基因 重組；和b)將第二重組核酸引入所述細胞中，其提供所述分泌型洗滌劑添加劑蛋白質的表達。
18.權利要求17的方法，其中所述核酸插入到所述bglC基因中。
19.權利要求17的方法，其中所述核酸造成所述bglC基因的至少一個部分缺失。
20.權利要求17的方法，其中所述分泌型洗滌劑添加劑蛋白質是枯草桿菌蛋白酶。
全文摘要
本發明提供用於產生洗滌劑添加劑蛋白質的重組細菌細胞。在一些實施方案中，所述細胞為芽孢桿菌屬細胞。在另一些實施方案中，所述細胞包含含有失活的bglC基因的基因組以及用於產生至少一種分泌型洗滌劑添加劑蛋白質的重組核酸。在一些優選的實施方案中，所述分泌型洗滌劑添加劑蛋白質是蛋白酶。本發明還提供使用所述細菌細胞產生至少一種洗滌劑添加劑蛋白質的方法，以及含有至少一種洗滌劑添加劑蛋白質的無纖維素酶的組合物。
文檔編號C12N15/09GK102016028SQ200780037346
公開日2011年4月13日 申請日期2007年9月26日 優先權日2006年10月6日
發明者M·A·塞爾溫 申請人:丹尼斯科美國公司