具有改良的生長特性的植物及其製備方法

2023-09-09 21:34:30 3

專利名稱：具有改良的生長特性的植物及其製備方法
技術領域：
本發明涉及改善植物生長特性的方法。更具體地，本發明涉及通過調控編碼GRUBX蛋白的核酸的表達和/或通過調控植物中GRUBX蛋白的活性和/或水平而改善植物生長特性的方法。本發明還提供了新的GRUBX蛋白和編碼這樣的蛋白的核酸。本發明還涉及包含GRUBX編碼核酸的構建體和具有受調控的GRUBX蛋白編碼核酸的表達和/或受調控的GRUBX蛋白活性和/或水平的植物，該植物相對於對應的野生型植物而言具有改善的生長特性。
基於不斷增長的世界人口和日益減少的農用土地面積，提高農業效率和增加園藝植物的多樣性仍然是農業研究的一個主要目標。作物和園藝改良的傳統方式採用選擇育種技術來識別具有需要的特性的植物。然而，這種選擇育種技術具有幾個缺點，即這些技術通常是勞動密集型的，導致經常含有異源遺傳組分的植物，其可能不總是產生從親本植物傳承的理想性狀。此外，合適的用於提供理想性狀的供體物種可能是稀少的。分子生物學的進步已經允許人類操縱動物和植物的種質。植物的遺傳工程使分離和操縱遺傳材料(通常為DNA或RNA的形式)以及隨後將遺傳材料導入植物成為可能。這種技術已經導致具有多種改良的經濟學、農藝學或園藝學性狀的植物的開發。具體的、有經濟學價值的性狀是生長特性，例如高產量。產量通常定義為來自作物的經濟價值的可度量生產。這可以以數量和/或質量的方式來定義。作物產量會受到植物或作物面臨的典型壓力的不利影響。這樣的壓力包括非生物的壓力，例如非典型的高溫或低溫造成的溫度壓力；營養缺乏造成的壓力；缺少或過量水造成的壓力(乾旱，水災)，化學試劑例如肥料或殺蟲劑造成的壓力。典型的壓力也包括生物的壓力，其可以由其它植物(雜草，或高密度種植效應)、動物害蟲(包括由放牧造成的壓力)和病原體強加於植物上。作物產量不但可以通過與作物或植物面臨的一種或多種壓力進行鬥爭來提高，也可以通過改良植物的固有生長機理來提高。可以在幾種水平和通過多種代謝過程控制植物的固有生長機理。一種這樣的過程是通過泛素-介導的蛋白降解控制細胞中的蛋白水平。
泛素化指通過綴合泛素分子而修飾蛋白。術語泛素化經常延伸指能介導泛素蛋白或能模仿泛素功能的蛋白的結合的過程。泛素化是真核細胞控制蛋白的穩定性、功能和亞細胞定位的萬能工具。該機制在蛋白降解、細胞周期控制、應激反應、DNA修復、信號轉導、轉錄調節和囊泡運輸中起中心作用。由於泛素介導的蛋白降解是許多細胞過程的基礎，它是受到高度調節的，且需要高底物特異性和足夠的下遊效應物多樣性。已知幾種泛素-結合蛋白。這些蛋白經常具有模塊域結構。例如，泛素結合蛋白通常將泛素結合域與可變的效應物域結合起來。其次，也存在其它的類型，其不含有泛素結合域，但是具有類似於泛素的三級結構，因此可以模仿泛素化的某些方面(泛素樣域)。
隨著有關於基因組序列的更多信息可供利用，泛素相關基序和存在於泛素和泛素樣蛋白中的結構域的數目也在增加。那些結構域的一些原型是例如UBA，UBD，UIM和UBX(見例如Pfam資料庫；Bateman等，Nucleic Acids Research 30(1)276-280(2002))。UBX結構域是約80個胺基酸殘基長的序列，其功能未知，存在於多種生物的蛋白中。大多數這樣的蛋白屬於5個進化保守家族之一，如人FAF1，p47，Y33K，REP8，和UBXD1蛋白所示例(Buchberger等(2001)J.Mol.Biol.307，17-24；Carim-Todd等(2001)Biochim.Biophys.Acta 1517，298-301)。典型地，UBX結構域位於蛋白的C-末端。
結構證據揭示了UBX結構域在泛素-有關的過程中的功能；更具體地，UBX結構域可能參與蛋白-蛋白相互作用。通常預測包含UBX結構域的蛋白主要存在於細胞質中，但是也已經報導了其它的亞細胞定位。例如，已經證實，磷酸化這種用於調節許多蛋白的活性的特異性蛋白修飾也會影響FAF-1向核中的運輸(Olsen等(2003)FEBS Lett.546，218-222)。
總之，已經提出含有UBX的動物蛋白可能參與與細胞凋亡、細胞周期或降解蛋白的靶向有關的基因的增強表達。
Arabidopsis的基因組已經被完全測序，該植物中存在至少15種含有UBX的蛋白。根據序列相似性，它們可以分成FAF1，p47，Y33K和UBXD1組，僅僅與REP8相對應的組似乎不存在於植物中(見

圖1)。象動物界一樣，植物蛋白中的UBX結構域與其它結構域一起存在，象例如SEP，G6PD，PUG，或鋅指結構。已經描述了含有UBX的蛋白和這些蛋白的域結構(見Buchberger(2002)Trends Cell Biol.12，216-221)，它們可以通過使用專門的資料庫例如SMART進行搜索來鑑別(Schultz等(1998)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 95，5857-5864；Letunic等(2002)核酸研究30，242-244)。
PUG結構域(PeptideN-Glycanases and other putative nuclearUBX-domain-containing Proteins；Doerks等(2002)Genome Researeh12，47-56)與對於泛素-介導的蛋白水解重要的結構域共同存在於蛋白中，包括UBX(在哺乳動物和植物中)，UBA(在植物中)和UBC結構域(在Plasmodium中)。認為含有PUG的蛋白例如PNG酶在未摺疊的蛋白反應(即能將異常的蛋白與正確摺疊的蛋白區別開的內質網(ER)質量控制監視系統)中起作用。在一些情況下，已經證實這些錯誤摺疊的和/或未摺疊的蛋白會通過所謂的ER-聯合的降解機制降解，該機制包含泛素-蛋白酶體系統(Suzuki等(2000)J.Cell Biol.149，1039-1052)。PUG結構域的變化形式也存在於IRE1p型激酶中，已知它們在未摺疊蛋白反應的起始階段起作用(Shamu和Walter(1996)EMBO J.15，3028-3039)。
最近表徵的包含UBX結構域的Arabidopsis蛋白是PUX1(Rancour等(2004)J.Biol.Chem.，online publication10.1074/jbc.M405498200)。PUX1是Arabidopsis中的單個基因，可能在植物中普遍表達。已證實該蛋白是AAA-型ATP酶CDC48的非競爭性抑制劑。PUX1通過它的UBX結構域與非六聚形式的CDC48(但不與六聚形式的CDC48)相結合。推測PUX1有利於有活性的六聚CDC48的解裝配，且該過程需要所述蛋白的N-末端結構域。pux1敲除植物表現出了更快發育成熟，但是不具有總體形態學異常。除了PUX1以外，證實了2種其它的包含UBX結構域的蛋白(PUX2和PUX3)能與CDC48相互作用(Rancour等，2004)。PUX2(At2g01650)以前公開在WO 03/085115(基因和蛋白序列分別公開為SEQ ID NO1和SEQ ID NO2)。
現在已經發現，調控植物中編碼GRUBX蛋白(包含生長有關UBX結構域的蛋白)的核酸、尤其是編碼SEQ ID NO2示例的GRUBX蛋白的核酸的表達，能產生具有改良的生長特性的植物。因此，根據本發明的第一個實施方案，提供了改善植物的生長特性的方法，包括調控植物中編碼GRUBX蛋白的核酸的表達，和/或調控植物中GRUBX蛋白的活性和/或水平。根據本發明的一個優選方面，受調控的表達是增加的表達，受調控的活性和/或水平是增加的活性和/或水平。任選地，可以選擇具有改良的生長特性的植物。
對編碼GRUBX蛋白的核酸的表達的調控(增強或減少)或對GRUBX蛋白本身的活性和/或水平的調控，可以源自特定細胞或組織中改變的基因表達和/或基因產物(即多肽)的改變的活性和/或水平。受調控的表達可以源自內源性GRUBX基因的改變的表達水平，和/或可以源自以前導入植物中的GRUBX編碼核酸的改變的表達。類似地，受調控的GRUBX蛋白的水平和/或活性可以是內源性GRUBX基因的改變的表達水平的結果，和/或可以源自以前導入植物中的GRUBX編碼核酸的改變的表達。當GRUBX蛋白的水平沒有變化時，或甚至當GRUBX蛋白的水平減少時，活性可以增加。這可以通過改變固有的性質來實現，例如，通過製備比野生型更有活性的突變體。還包括抑制或刺激調節序列，或提供新的調節序列，其能驅動編碼GRUBX的天然基因或編碼GRUBX的轉基因的表達。這樣的調節序列可以被導入植物中。例如，導入植物中的調節序列可以是啟動子，其能驅動內源性GRUBX基因的表達。
通過導入遺傳修飾(優選地在GRUBX基因的基因座中)，可以調控基因的表達和蛋白的活性和/或水平。如本文中定義的基因的基因座用於指包含目標基因和編碼區上遊或下遊10kb的基因組區域。可以通過例如任一種(或多種)下述的方法導入遺傳修飾TDNA活化，TILLING，定位誘變，同源重組，或通過在植物中導入和表達編碼GRUBX多肽或或其同系物的核酸。在導入遺傳修飾後進行選擇增加的GRUBX多肽活性的步驟，該活性的增加會產生具有改良的生長特性的植物。
T-DNA活化標記(Hayashi等Science(1992)1350-1353)包含以使啟動子能指導所靶向基因的表達的構型將通常含有啟動子(也可以是翻譯增強子或內含子)的T-DNA插入目標基因的基因組區域或基因編碼區的上遊或下遊10kB。典型地，破壞所靶向基因的天然啟動子對它的表達的調節，該基因處於新導入的啟動子控制下。啟動子典型地嵌入在T-DNA中。該T-DNA隨機地插入植物基因組中，例如通過土壤桿菌感染實現，並導致插入的T-DNA附近的基因的過表達。由於所導入啟動子附近的基因的過表達，得到的轉基因植物表現出顯性表型。要導入的啟動子可以是能指導基因在需要的生物(在該情況下是植物)中的表達的任意啟動子。例如，組成型、組織特異性的、細胞類型特異性的和誘導型啟動子都適用於T-DNA活化。
使用TILLING(基因組中靶向誘導的局部損害)技術，也可以將遺傳修飾導入GRUBX基因的基因座中。這是一種誘變技術，可以用於產生和/或鑑別以及最終分離能表現出GRUBX活性的GRUBX核酸的誘變變體。TILLING也允許選擇攜帶這樣的突變變體的植物。這些突變變體甚至可以表現出比處於自然形式的基因更高的GRUBX活性。TILLING將高密度誘變和高通量篩選方法結合起來。典型地，在TILLING中進行如下的步驟(a)EMS誘變(Redei和Koncz(1992)，C Koncz，N-H Chua，J Schell編，Methods in Arabidopsis Research.World Scientific，Singapore，pp 16-82；Feldmann等，(1994)EM Meyerowitz，CR Somerville編，Arabidopsis.Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold SpringHarbor，NY，pp 137-172；Lightner和Caspar(1998)，JMartinez-Zapater，J Salinas編，Methods on Molecular Biology，Vol.82.Humana Press，Totowa，NJ，pp 91-104)；(b)DNA製備和個體的合併；(c)目標區域的PCR擴增；(d)變性和退火，以允許形成異源雙鏈體；(e)DHPLC，其中異源雙鏈體在庫(pool)中的存在以色譜圖中的多餘峰檢測出來；(f)鑑別突變個體；和(g)對突變PCR產物測序。TILLING的方法是本領域眾所周知的(McCallum，Nat Biotechnol.2000Apr；18(4)455-7，Stemple，Nature Rev.Genet.5，145-150，2004)。
定位誘變可以用於產生GRUBX核酸或其保留GRUBX活性(例如陽離子轉移劑活性)的部分的變體。可以有幾種方法可用於實現定位誘變，最常見的是基於PCR的方法(見例如Ausubel等，Current Protocols inMolecular Biology.Wiley Eds.http//www.4ulr.com/products/currentprotocols/index.html)。
TDNA活化、TILLING和定位誘變是能產生新的等位基因和保留GRUBX功能的GRUBX變體的技術實例，因此可以用於本發明的方法中。
同源重組允許在規定的選擇位點處導入所選定核酸的基因組。同源重組是生物科學中常規地用於低等生物(例如酵母和苔蘚Physcomitrella)的標準技術。不但已經針對模型植物(Offringa等(1990)EMBO J.9，3077-3084)，而且已經針對作物植物例如稻(Terada等，(2002)Nature Biotechnol.20，1030-1034；或Iida和Terada(2004)Curr.Opin.Biotechnol.15，132-138)描述了在植物中進行同源重組的方法。待靶向的核酸(其可以是GRUBX核酸分子或如前文定義的變體)不需要被靶向到GRUBX基因的基因座，但是可以導入例如高表達區域。待靶向的核酸可以是用於替代內源基因的等位基因，或可以除內源基因之外還額外導入。
優選的調控GRUBX基因的表達、或調控GRUBX蛋白的活性和/或水平的方法包括向植物中導入編碼GRUBX蛋白或其同系物、衍生物或活性片段的分離核酸序列。通過例如轉化，可以將該核酸導入植物。因此，根據本發明的一個優選方面，提供了改善植物的生長特性的方法，包括將GRUBX編碼核酸導入植物中並表達。
如本文所定義的，術語GRUBX蛋白指至少包含UBX結構域、優選包含UBX和PUG結構域、並且可選地包含鋅指結構域的蛋白。優選地，GRUBX蛋白在結構上與人UBXD1蛋白(SPTrEMBL AAH07414)相關。優選地，GRUBX蛋白來自植物。更優選地，GRUBX蛋白來自茄科(Solanaceae)，更優選地，GRUBX是來自菸草的蛋白，最優選地，GRUBX是由SEQ ID NO2代表的蛋白或者其同系物、衍生物或活性片段，該同系物、衍生物或活性片段具有與SEQ ID NO2類似的生物活性。但是，應當理解，來自單子葉植物的GRUBX蛋白同樣可以用於本發明的方法中，包括來自玉米(Zea mays)，甘蔗(Saccharum officinarum)(SEQ ID NO 4)，稻(Oryzasativa)(SEQ ID NO 7)，小麥(Triticum sp.)，大麥(Hordeum sp.)，和高粱(Sorghum sp.)的GRUBX蛋白，因為這些序列與SEQ ID NO 2有關(見圖1b)。
當在如本發明中使用的谷醇溶蛋白啟動子控制下在稻中表達編碼這樣的GRUBX蛋白的核酸時，GRUBX蛋白的活性之一是增加種子產量，尤其是提高收穫指數。有利地，GRUBX蛋白能在Rancour等(2004)所述的條件下與植物CDC48蛋白相互作用。
用SMART工具分析了菸草的GRUBX蛋白，並用於篩選Pfam(11.0版，November 2003；Bateman等(2002)Nucl.Acids Res.30，276-280)和InterPro資料庫(Release 7.0，22 July 2003；Mulder等(2003)Nucl.Acids.Res.31，315-318)。GRUBX蛋白包含UBX結構域(PF00789，SM00166，IPR001012)和PUG結構域(SM00580，IPR006567)。如InterPro中定義的UBX結構域出現在泛素-調節蛋白(它們是泛素化途徑的成員)以及許多其它的蛋白中，包括FAF-1(FAS-有關的因子1)，人Rep-8再生蛋白(reproduction protein)和幾種假定的來自酵母的蛋白。在Arabidopsis中，預測約20種蛋白包含該結構域。PUG結構域可見於真核生物的蛋白激酶、N-聚糖酶和其它核蛋白中，推定其參與蛋白-蛋白相互作用(評論見Suzuki Lennarz(2003)Biochem Biophys Res Commun.302，1-5和Biochem Biophys Res Commun.303，732)和RNA結合(Doerks等，2002)。PUG結構域經常與UBA或UBX結構域一起出現在Arabidopsis蛋白中(Doerks等，2002)。圖2a給出了如SMART資料庫(軟體版本4.0，2003年9月15日的序列資料庫更新)中定義的UBX和PUG結構域的共有序列；圖2b顯示了SEQ ID NO 2和SPTrEMBL Q9ZU93各自的UBX和PUG結構域；圖2c顯示了這2種蛋白的BLAST比對；圖2d和2e分別顯示了SEQ ID NO 2和SEQ ID NO 4之間、SEQ ID NO 4和SEQ ID NO 7之間的比對。指示了PUG和UBX結構域。
任選地，鋅指結構域可以存在於GRUBX蛋白中。如InterPro中定義的，鋅指結構域是首先在爪蟾(Xenopus laevis)轉錄因子TFIIIA中鑑定到的核酸結合蛋白結構。已經在許多核酸結合蛋白中發現了這些結構域。鋅指結構域由25-30個胺基酸殘基組成，包括處於C-2-C-12-H-3-H型基序中的2個保守的Cys和2個保守的His殘基。分隔第2個Cys和第1個His的12個殘基主要是極性和鹼性的，表明該區域會參與核酸結合。鋅指結構基序是非同尋常地小的、自摺疊的結構域，其中Zn是它的三級結構的關鍵組分。所有鋅指結構域都能結合四面體陣列中的Zn原子，導致指-樣突出的形成，後者可以與核酸大溝中的核苷酸相互作用。該Zn能結合保守的Cys和His殘基。已經發現指能結合約5個鹼基對的核酸——含有小批量的鳥嘌呤殘基，且具有結合RNA和DNA的能力。鋅指結構因而可以代表原始的核酸結合蛋白。已經提出，以Zn為中心的結構域可以用於蛋白相互作用中，例如蛋白激酶C中。根據參與鋅原子的空間定位的組氨酸和半胱氨酸殘基的數目和位置，表徵了許多類型的鋅指結構。在要表徵的稱作C2H2(IPR007087)的第一類中，第一對鋅配價殘基由半胱氨酸組成，而第二對是組氨酸。另一個鋅指結構域(IPR006642)可以是在釀酒酵母蛋白Rad18中發現的類型。同樣，鋅指結構域是假定的核酸結合序列。但是，如本文定義的GRUBX蛋白中的任選的鋅指結構域不限於C2H2或Rad18類型，而可以是任意類型的鋅指結構域。
如本文所定義的，術語GRUBX核酸/基因指編碼GRUBX蛋白的所有核酸或其互補體。核酸可以(直接地或間接地(如果隨後修飾))源自任何天然的或人工的來源，只要當在植物中表達時該核酸能導致受調控的GRUBX核酸/基因的表達或受調控的GRUBX蛋白活性和/或水平。核酸可以分離自微生物來源，例如細菌、酵母或真菌，或植物、藻類或動物(包括人)來源。優選地，核酸源自真核生物。優選地，GRUBX核酸是植物來源，更優選地是單子葉或雙子葉植物來源，更優選地，GRUBX核酸編碼來自茄科的GRUBX蛋白，更優選地，GRUBX核酸是來自菸草的核酸序列，最優選地，GRUBX核酸是由SEQ ID NO1代表的核酸序列或其功能部分，或是能與其雜交的核酸序列，該雜交序列編碼具有GRUBX蛋白活性、即與SEQ ID NO1類似的生物活性的蛋白，也包括編碼由SEQ ID NO2代表的胺基酸序列或其同系物、衍生物或活性片段的核酸。或者，編碼GRUBX蛋白的核酸可以源自Poaceae科，優選稻。通過審慎的人工操縱，該核酸可以在組成和/或染色體組環境中由其天然形式修飾得到。核酸序列優選地是同源核酸序列，即結構上和/或功能上相關的核酸序列，優選地從植物得到，無論是來自相同的植物物種還是不同的植物物種。
術語「功能部分」指編碼多肽的GRUBX基因的一部分，所述多肽保留了GRUBX蛋白的相同生物活性，且具有UBX結構域，優選地還具有PUG結構域，並且可選地具有鋅指結構域。術語「GRUBX核酸/基因」也包括由於遺傳密碼的簡併性產生的編碼GRUBX蛋白的核酸變體，編碼GRUBX的核酸的等位基因變體，編碼GRUBX的核酸的不同剪接變體，和被一個或多個插入序列中斷的變體。
有利地，使用編碼GRUBX蛋白的核酸序列(例如由SEQ ID NO1代表的序列)的部分，或通過使用優選地在嚴格條件下能與編碼GRUBX蛋白的核酸序列雜交的序列(該雜交序列編碼具有GRUBX活性的蛋白)，或通過使用GRUBX蛋白的同系物、衍生物或活性片段，例如根據SEQ ID NO2的序列，或通過使用編碼這些同系物、衍生物或活性片段的核酸，也可以實施本發明的方法。
在多種真核生物中，可以發現GRUBX蛋白的同系物，例如由SEQ ID NO2代表的。最接近的同系物通常是在植物界中發現。擬南芥基因組似乎具有至少15種GRUBX蛋白，其中具有SPTrEMBL Q9ZU93和Q8LGE5(MIPSNo.At2G01650，或GenBank AY084317和AAM60904)所示序列的同系物是SEQ ID NO2的最接近的同系物，SEQ ID NO2的其它合適的同系物包括來自甘蔗的SEQ ID NO 4，其由SEQ ID NO 3代表的核酸編碼，來自稻的SEQ ID NO 7(其由SEQ ID NO 6代表的核酸序列編碼)，和來自Pinustaeda的GenBank登記號BQ198347和BF778922。
本領域的技術人員熟知搜索和鑑別GRUBX同系物的方法。這樣的方法包括使用本領域眾所周知的進行序列比對或對比的算法，例如GAP(Needleman和Wunsch，J.Mol.Biol.48，443-453(1970))，BESTFIT(使用Smith和Waterman的局部同源性算法(Advances in AppliedMathematics 2，482-489(1981)))，BLAST(Altschul，S.F.，Gish，W.，Miller，W.，Myers，E.W. Lipman，D.J.，J.Mol.Biol.215，403-410(1990))，FASTA和TFASTA(W.R.Pearson和D.J.Lipman Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85，2444-2448(1988))，將計算機可讀格式的由SEQ IDNO 1或2代表的序列與可以從公開資料庫得到的序列進行對比，所述資料庫例如MIPS(慕尼黑蛋白序列信息中心，http//mips.gsf.de/)，GenBank(http//www.ncbi.nlm.nih.gov/Genbank/index.html)或EMBL核苷酸序列資料庫(http//www.ebi.ac.uk/embl/index.html)。可以從國家生物技術信息中心公開地得到進行BLAST分析的軟體。使用blast預設參數(例如BLASTN程序高級選項G-Cost(打開缺口)＝5；E-Cost(延伸缺口)＝2；q-Penalty(錯配)＝-3；r-Reward(匹配)＝1；e-期望值(E)＝10.0；W-字符大小＝11；TBLASTN程序高級選項G-Cost(打開缺口)＝11；E-Cost(延伸缺口)＝1；e-期望值(E)＝10.0；W-字符大小＝3)，可以鑑別出上述的同系物。隨著更多的基因組被測序，預期可以鑑定到更多的GRUBX同系物。
迄今尚不知道由SEQ ID NO6代表的序列。因此，在本發明的第二個實施方案中提供了分離的核酸序列，其包含
(a)由SEQ ID NO6代表的核酸序列，或其互補鏈；(b)編碼由SEQ ID NO7代表的胺基酸序列或其同系物、衍生物或活性片段的核酸序列；(c)能與上述(i)或(ii)的核酸序列(優選地在嚴格條件下)雜交的核酸序列，該雜交序列優選地編碼具有GRUBX活性的蛋白；(d)根據上面的(i)至(iii)的核酸序列，其因遺傳密碼而是簡併性的；(e)核酸，它是根據(a)-(d)的核酸序列的等位基因變體；(f)核酸，它是根據(a)-(e)的核酸序列的可變剪接變體；(g)核酸序列，它與(a)-(f)定義的任意一個或多個序列具有75.00％，80.00％，85.00％，90.00％，95.00％，96.00％，97.00％，98.00％或99.00％序列一致性；(h)上述(a)-(g)中任一項的核酸序列的一部分，該部分優選地編碼具有GRUBX活性的蛋白。
由SEQ ID NO4代表的序列是從4個EST序列(CA154270，CA144028，BQ535511 CA184742)裝配而成，迄今尚不知道。因此，提供了選自下述的分離的GRUBX蛋白(i)如SEQ ID NO 4所述的多肽；(ii)如SEQ ID NO 7所述的多肽；(iii)多肽，其胺基酸序列與SEQ ID NO 4或7所述的胺基酸序列具有至少40.00％序列一致性，優選50.00％、60.00％、70.00％序列一致性，更優選80％或90％序列一致性，最優選95.00％、96.00％、97.00％、98.00％或99.00％序列一致性；(iv)多肽，其至少包含UBX結構域，優選地包含UBX和PUG結構域，並可選地包含鋅指結構域；(v)(i)至(iv)中任一項定義的蛋白的同系物、衍生物、免疫活性的和/或功能性片段，條件是所述多肽序列不是由SEQ ID NO 2或者資料庫條目Q9ZU93，AAR01744，Q9D7L9，Q9BZV1，Q99PL6，ENSANGP00000020442，Q7SXA8，Q9V8K8，Q96IK9，ENSRNOP00000037228，或AAH07414代表的序列。
術語GRUBX包括與SEQ ID NO 2代表的GRUBX同源的蛋白。因此，在本發明的方法中使用的優選同系物至少包含UBX結構域，優選地，它們包含UBX和PUG結構域。GRUBX蛋白的「同系物」包括肽、寡肽、多肽、蛋白和酶，與未修飾的目標蛋白相比，其具有胺基酸取代、缺失和/或插入，且具有與它們所來源的未修飾蛋白相似的生物和功能活性。為了生產這樣的同系物，可以將蛋白的胺基酸替換為具有類似性質(例如類似的疏水性，親水性，抗原性，形成或破壞α-螺旋結構或β-片結構的傾向)的其它胺基酸。保守取代表是本領域眾所周知的(見例如Creighton(1984)Proteins.W.H.Freeman和Company)。
可用於本發明方法的同系物與未修飾的蛋白具有至少40.00％序列一致性或相似性(功能一致性)，或者與未修飾的蛋白具有至少50.00％序列一致性或相似性，或者與未修飾的蛋白具有至少60.00％序列一致性或相似性，或者與未修飾的蛋白具有至少70.00％序列一致性或相似性。典型地，同系物與未修飾的蛋白具有至少80％序列一致性或相似性，優選地具有至少85.00％序列一致性或相似性，更優選地，與未修飾的蛋白具有至少90.00％序列一致性或相似性，最優選地，與未修飾的蛋白具有至少95.00％，96.00％，97.00％，98.00％或99.00％序列一致性或相似性。使用比對程序例如GAP，可以計算一致性百分比。儘管其可能表現出相對較低的序列同源性(低至大約40.00％)，GRUBX蛋白在結構上是高度保守的，所有全長蛋白至少具有UBX結構域、優選地具有UBX結構域和PUG結構域，並且可選地具有鋅指結構域。因此，可以容易地發現其它植物物種中的GRUBX蛋白(如上述稻和甘蔗的新序列所證實的)。
同源蛋白可以歸入「蛋白家族」中。通過功能和序列相似性分析，例如Clustal W，可以確定蛋白家族。通過Clustal W程序，可以產生與GRUBX同源的蛋白的鄰近-連接樹，並得到它的結構和祖先關係的良好概況(見例如圖1a和b，用Vector NTI Suite 5.5，Informax構建)。在本發明的一個具體實施方案中，GRUBX同系物屬於與SEQ ID NO 2對應的蛋白相同的蛋白家族。
在Arabidopsis基因組中，鑑定到了優選的GRUBX蛋白家族成員(Q9ZU93，GenBank Refseq NM_126226)。還在其它植物例如稻、甘蔗或其它單子葉植物中，如上所述鑑別出了GRUBX蛋白家族成員。還有利地，這些家族成員也可以用於本發明的方法中。
同源性的2種特殊形式，即正向同源和共生同源，是用於描述基因的祖先關係的進化概念。術語「共生同源」指因物種基因組內的一個或多個基因重複產生的同源基因。術語「正向同源」指不同生物中由於基因的祖先關係形成的同源基因。如本文使用的，術語「同系物」也包括可用於本發明方法中的蛋白的共生同源物和正向同源物。使用例如BLAST程序，通過用目標查詢基因查詢一個或多個基因資料庫，可以鑑別出正向同源基因。然後，再對搜索得到的最高級別目標基因進行BLAST分析，並僅僅將與查詢基因再次匹配的那些目標基因保留為真正的正向同源基因。
如果尋找例如稻中的正向同源基因，可針對來自可以從NCBI得到的稻Nipponbare的28，469個全長cDNA克隆對目標序列進行搜索(blast)。當從核苷酸開始時，可以使用BLASTn或tBLASTX；或當從蛋白開始時，可以使用BLASTP或TBLASTN，其中使用標準的預設值。可以過濾搜索結果。然後，針對目標序列的來源生物(in casu菸草)的序列，將過濾結果或未過濾結果的全長序列反向搜索(第二次搜索)。然後，對比第一次和第二次搜索的結果。當第二次搜索的結果得到了與查詢GRUBX核酸或GRUBX多肽有最高相似性的擊中(hit)時，則發現了正向同源基因。如果對於特定的查詢序列，用GRUBX的共生同源基因發現了最高擊中，則將這樣的查詢序列也視作GRUBX的同系物，條件是該同系物具有GRUBX活性，且至少包含UBX結構域，優選包含UBX結構域和PUG結構域，並可選地包含鋅指結構域。當用Clustal W分析得到的序列並展示在鄰近連接樹中時，可以進一步細化結果。該方法可以用於鑑定許多不同物種中的正向同源基因。
鑑別相關蛋白組中的功能性正向同源物的另一種方法是，確定該蛋白家族的成員的表達模式和組織分布，由此預期存在於相同組織中並具有類似表達模式的序列將具有相關的功能。鑑別蛋白的功能性同系物的另一種方法是鑑別具有類似的保守域結構的序列。預期攜帶相同結構域的蛋白，尤其是當結構域的分布是保守的時，將能執行類似的功能。因而，化學結構和調節(表達模式，組織特異性)的相似性可以用於鑑定GRUBX的功能同系物。
GRUBX的「同系物」包括與未修飾蛋白相比具有胺基酸取代、插入和/或缺失的蛋白。
蛋白的「取代變體」是這樣的，其中已經去除了胺基酸序列中的至少一個殘基，並且在它的位置插入了不同的殘基。胺基酸取代通常是單個殘基，但是根據多肽的功能限制，也可以成串；插入通常是約1-10個胺基酸殘基的量級，缺失的範圍是從約1至20個殘基。優選地，胺基酸取代包含保守的胺基酸取代。
蛋白的「插入變體」是這樣的，其中在蛋白的預定位置處導入了一個或多個胺基酸殘基。插入可以包括氨基端和/或羧基端的融合以及單個或多個胺基酸的序列內插入。通常，胺基酸序列內的插入比氨基或羧基端的融合小為約1-10個殘基的量級。氨基端或羧基端融合蛋白或肽的實例包括在酵母雙雜交系統中使用的轉錄活化子的結合域或活化結構域、噬菌體包膜蛋白，(組氨酸)6-標籤，穀胱甘肽S-轉移酶標籤，蛋白A，麥芽糖-結合蛋白，二氫葉酸還原酶，標籤·100表位，c-myc表位，FLAG-表位，lacZ，CMP(鈣調蛋白-結合肽)，HA表位，蛋白C表位和VSV表位。
蛋白的「缺失變體」以從該蛋白中去除一個或多個胺基酸為特徵。蛋白的胺基酸變體可以容易地用本領域眾所周知的肽合成技術製成，例如固相肽合成等，或通過重組DNA操作。本領域眾所周知操作DNA序列來產生蛋白的取代、插入或缺失變體的方法。例如，在DNA中預先確定的位點處產生取代突變的技術為本領域技術人員熟知，包括M13誘變，T7-Gen體外誘變(USB，Cleveland，OH)，QuickChange定位誘變(Stratagene，San Diego，CA)，PCR-介導的定點誘變或其它定點誘變方案。
術語「衍生物」指肽，寡肽，多肽，蛋白和酶，它們與天然形式的蛋白質的胺基酸序列、例如SEQ ID NO 2或4所列的胺基酸序列相比，可以包含天然和非天然發生的胺基酸殘基的取代、缺失或添加。GRUBX的「衍生物」包含肽、寡肽，多肽，蛋白和酶，它們與多肽的天然形式的胺基酸序列相比可以包含天然發生的改變，糖基化，醯基化或非天然發生的胺基酸殘基。與其來源的胺基酸序列相比，衍生物也可以包含一個或多個非胺基酸的取代，例如報告分子或其它配體，其與胺基酸序列共價地或非共價地結合，例如結合其上以促進其檢測的報告分子，以及相對於天然發生蛋白的胺基酸序列而屬於非天然發生的胺基酸殘基。
GRUBX蛋白的「活性片段」包括蛋白的至少80個毗鄰胺基酸殘基，該殘基能保留與天然發生的蛋白類似的生物和/或功能活性。活性片段至少包含UBX結構域，優選地，活性片段包含UBX和PUG結構域。
有利地，根據本發明的方法也可以用DNA或核酸序列的部分來實施，該部分編碼保留GRUBX活性的多肽。DNA序列的部分指源自原始(更大的)DNA分子或從中製備的一片DNA，當在植物中表達時，該DNA部分能產生具有改良的生長特性的植物。該部分包含至少200個核苷酸，且至少包含編碼UBX結構域、優選地UBX結構域和PUG結構域以及可選地鋅指結構域的序列。可以通過例如使GRUBX核酸分子產生一個或多個缺失而製備部分。該部分可以包含許多基因，有或沒有其它的控制元件，或可以僅僅含有間隔序列等。該部分可以是分離的形式，或者與其它的編碼(或非編碼)序列相融合，以便例如生成兼有幾種活性的蛋白，所述活性之一是當在谷醇溶蛋白啟動子控制下在植物中表達時，可增加種子產量。優選地，該部分是SEQ ID NO1，SEQ ID NO3或SEQ ID NO6中任一個上的部分。
本發明也包括能與編碼GRUBX蛋白的核酸序列雜交的核酸序列，該核酸序列也可以用於實施根據本發明的方法。如本文定義的，術語″雜交″是基本上同源的互補核苷酸序列相互退火的過程。雜交過程可以完全在溶液中進行，即互補核酸都在溶液中。依賴於這一過程的分子生物學工具包括聚合酶鏈反應(PCR；以及所有以此為基礎的方法)、扣除雜交、隨機引物延伸、核酸酶S1作圖、引物延伸、反轉錄、cDNA合成、RNA差異顯示、以及DNA序列確定。也可以用固定到基質例如磁珠、瓊脂糖珠子或任何其它樹脂上的互補核酸之一進行雜交過程。依賴於這一過程的分子生物學工具包括聚(A+)mRNA的分離。此外，也可以用固定到固體支持物例如硝酸纖維素或尼龍膜，或者用如光刻技術固定到例如矽玻璃支持物(後者稱作核酸陣列或微陣列或核酸晶片)上的互補核酸之一進行雜交過程。依賴於這一過程的分子生物學工具包括RNA和DNA凝膠印跡分析、克隆雜交、斑點雜交、原位雜交和微陣列雜交。為了使雜交發生，核酸分子通常被熱或化學變性，以將雙鏈熔解為兩條單鏈，和/或從單鏈核酸中去除發卡結構或其它二級結構。雜交的嚴格性受條件例如溫度、鹽濃度和雜交緩衝液組成的影響。
對於需要高選擇性的應用，本領域的技術人員通常希望採用相對嚴格的條件，以形成雜合體，例如，人們會選擇相對較低的鹽和/或高溫條件，例如由約0.02M至約0.15M NaCl、約50℃至約70℃的溫度提供的條件。雜交的高嚴格性條件因而包括高溫度和/或低鹽濃度(鹽包括NaCl和檸檬酸鈉，但是也可以受下述因素的影響雜交緩衝液中包含甲醯胺，和/或降低雜交緩衝液中化合物例如SDS(十二烷基硫酸鈉)的濃度，和/或從雜交緩衝液中排除硫酸葡聚糖或聚乙二醇(促進分子擁擠)等化合物。足夠低的嚴格雜交條件特別優選地用於分離與上面定義的本發明DNA序列同源的核酸。有助於同源性的因素包括等位性、遺傳密碼的簡併和優選密碼子用法的差異。
在核酸雜交實驗例如DNA印跡和RNA印跡雜交的上下文中，「嚴格的雜交條件」和「嚴格的雜交洗滌條件」是序列依賴性的，且在不同的環境參數下是不同的。例如，較長的序列能在較高的溫度下特異性地雜交。Tm是在確定的離子強度和pH下，50％靶序列與完全匹配的探針雜交時的溫度。特異性通常是雜交後洗滌的函數。這種洗滌的關鍵因素包括最終洗滌溶液的離子強度和溫度。
通常，嚴格條件被選擇成比特定序列在定義的離子強度和pH下的熱熔點(Tm)低約50℃。Tm是在定義的離子強度和pH下，50％靶序列與完全匹配的探針雜交時的溫度。Tm依賴於溶液條件和探針的鹼基組成，且可以用下面的方程計算Tm＝79.8℃+(18.5×log[Na+])+(58.4℃×％[G+C])-(820×(雙鏈體中的鹼基對數目)-1)-(0.5×％甲醯胺)更優選的嚴格條件是溫度在Tm以下20℃時，最優選的嚴格條件是溫度在Tm以下10℃時。使用許多已知技術中的任一種，例如用含有蛋白的溶液封閉膜，向雜交緩衝液添加異源的RNA、DNA和SDS，以及用RNA酶處理，也可以控制非特異性的結合。
通常在雜交嚴格性或更低條件下進行洗滌條件。通常，用於核酸雜交測定或基因擴增檢測方法的合適的嚴格條件如上所述。也可以選擇更嚴格或更不嚴格的條件。
為了確定嚴格性的水平，可以方便地參考Sambrook等(2001)Molecular Cloninga laboratory manual，3rdEdition Cold SpringHarbor Laboratory Press，CSH，New York或Current Protocols inMolecular Biology，John Wiley Sons，N.Y.(1989)。低嚴格性條件的實例是4-6xSSC/0.1-0.5％w/v SDS，37-45℃，2-3小時。根據雜交中所涉及的核酸的來源和濃度，可以採用替代性的嚴格性條件，例如中等嚴格性條件。中等嚴格性條件的實例包括1-4xSSC/0.25％ w/v SDS，≥45℃，2-3小時。高嚴格性條件的實例包括0.1-1xSSC/0.1％ w/vSDS，60℃，1-3小時。熟練技術人員能知道雜交及洗滌期間可以改變的多種參數，以維持或改變嚴格性條件。例如，另一種嚴格的雜交條件是在4xSSC、65℃雜交，然後在0.1xSSC、65℃洗滌約1小時。或者，另一種嚴格的雜交條件是50％甲醯胺，4xSSC，42℃。嚴格條件的另一個實例包括在62℃、6xSSC、0.05x BLOTTO雜交，在2xSSC、0.1％w/v SDS、62℃洗滌。
使用編碼GRUBX蛋白的核酸序列的可變剪接變體，也可以實施本發明的方法。如本文使用的，術語「可變剪接變體」包括核酸序列的變體，其中所選擇的內含子和/或外顯子已經被切除、替代或加入。這種剪接變體可以是這樣的，其中蛋白的生物活性保留不受影響，這可以通過選擇性地保留蛋白的功能片段來實現。這種剪接變體可以在自然界中發現或人工製造。製造這樣的剪接變體的方法是本領域眾所周知的。因此，根據本發明的另一個方面，提供了改善植物的生長特性的方法，其包括調控編碼GRUBX蛋白的核酸序列的可變剪接變體在植物中的表達，和/或調控由可變剪接變體編碼的GRUBX蛋白的活性和/或水平。優選地，剪接變體是由SEQ ID NO1代表的序列的剪接變體。
有利地，使用編碼GRUBX蛋白的核酸序列的等位基因變體、優選由SEQ ID NO1代表的序列的等位基因變體，也可以實現根據本發明的方法。等位基因變體存在於自然界中，在本發明的方法中包括這些天然等位基因的應用。等位基因變體包括單核苷酸多態性(SNP)，以及小插入/缺失多態性(INDEL)。INDEL的大小通常小於100bp。在大多數生物體的自然發生的多態系中，SNP和INDEL形成了最大一組的序列變體。
本發明也包括這些等位基因變體在特定的常規育種程序中的應用，例如在標記-輔助的育種中的應用；這可以是它們在本發明方法中的應用的補充。這樣的育種程序有時需要通過植物的誘變處理，將等位基因變異導入植物中。一種合適的誘變方法是EMS誘變。然後，通過例如PCR，可以進行等位基因變體的鑑定。其後是選擇GRUBX目標序列的優秀等位基因變體的選擇步驟，所述變體能在植物中產生改良的生長特性。典型地，通過監視含有目標序列的不同等位基因變體(例如，SEQ ID NO1的不同的等位基因變體)的植物的生長性狀來進行選擇。監視生長性狀可以在溫室或田地中進行。其它任選的步驟包括將其中鑑定到了優秀的等位基因變體的植物與另一植物雜交。這可以用於例如製備令人感興趣的表型特徵的組合。
因此，由於GRUBX基因中的突變可以天然產生，它們可以構成選擇表現出高產的植物的基礎。因此，作為本發明的另一個方面，提供了選擇具有改良的生長特性的植物的方法，該方法是基於對GRUBX序列的優秀等位基因變體(其能在植物中產生改良的生長特性)的選擇。
根據本發明的方法也可以通過向植物中導入(自然的或人工的)染色體(例如細菌人工染色體(BAC))的至少一部分來實現，該染色體至少含有編碼GRUBX蛋白的基因/核酸序列(例如SEQ ID NO1或SEQ IDNO 3)，優選地還含有一個或多個相關基因家族成員和/或編碼GRUBX表達和/或活性的調節蛋白的核酸序列。因此，根據本發明的另一個方面，提供了通過向植物中導入至少包含編碼GRUBX蛋白的基因/核酸的染色體的至少一部分來改善植物的生長特性的方法。
根據本發明的另一個方面，可以在育種程序中利用編碼GRUBX蛋白的核酸。該核酸序列可以位於染色體或其一部分上，其至少包含編碼GRUBX蛋白的核酸序列，並優選地包含一個或多個相關的家族成員。在這樣的育種程序的實例中，鑑定出可以與能調控植物中編碼GRUBX蛋白的核酸表達的基因遺傳上連接的DNA標記，該基因可以是編碼GRUBX蛋白本身的基因，或是可能直接或間接影響編碼GRUBX蛋白的基因表達和/或GRUBX蛋白本身的活性的任意其它基因。然後，該DNA標記可以用於育種程序，以選擇具有改良的生長特性的植物。
本發明因此擴展到編碼GRUBX蛋白的核酸序列在育種程序中的應用。
GRUBX核酸或其變體或者GRUBX多肽或其同系物可以用於育種程序，其中鑑定出可能與GRUBX基因或其變體遺傳上連接的DNA標記、理想的性狀或數量性狀基因座(QTL)。該理想特徵或QTL可以包含能影響該理想性狀的單個基因或一串相連的基因。GRUBX或其變體或者GRUBX或其同系物可以用於定義分子標記。該DNA或蛋白標記然後可以用於育種程序，以選擇具有改良的生長特性的植物。GRUBX基因或其變體可以是例如由SEQ ID NO1代表的核酸，或編碼任一種上述同系物的核酸。
GRUBX的等位基因變體也可以用於標記-輔助的育種程序。這樣的育種程序有時需要通過對植物的誘變處理，使用例如EMS誘變，導入等位基因變異；或者，該程序可以從所謂的(無意中造成的)「天然」來源的等位基因變體集合開始。然後，可以通過例如PCR進行等位基因變體的鑑別。其後是選擇目標序列的優秀等位基因變體的選擇步驟，所述變體能在植物中產生改良的生長特性，例如提高的收穫指數。通常通過監測含有目標序列的不同等位基因變體(例如，SEQ ID NO1的不同等位基因變體)或編碼任一種上述植物同系物的核酸的不同等位基因變體之植物的生長性狀來進行選擇。可以在溫室或田間監測生長性狀。其它任選的步驟包括將其中鑑定出導致增強的GRUBX活性的優秀等位基因變體的植物與另一植物雜交。這可以用於例如製備令人感興趣的表型特徵的組合。
GRUBX核酸或其變體也可以用作探針，對它們作為其中一部分的基因在遺傳上和物理上作圖，以及作為與那些基因有聯繫的性狀的標記。這樣的信息可以用於植物育種，以開發具有需要的表型的品系。GRUBX核酸或其變體的這種應用僅僅需要至少10個核苷酸長的核酸序列。GRUBX核酸或其變體可以用作限制性片段長度多態性(RFLP)標記。可以用GRUBX核酸或其變體探測限制性消化的植物基因組DNA的DNA印跡。然後，可以使用電腦程式例如MapMaker(Lander等(1987)Genomics 1，174-181)，對得到的帶型進行遺傳分析，以構建遺傳圖譜。另外，該核酸可以用於探測DNA印跡，後者含有一組個體的經限制性內切核酸酶處理的基因組DNA，所述個體代表確定的遺傳雜交的親本和後代。注意到DNA多態性的分離，並用於計算GRUBX核酸或其變體在以前使用該群體得到的遺傳圖譜中的位置(Botstein等(1980)Am.J.Hum.Genet.32，314-331)。
植物基因衍生的探針的生產和在遺傳作圖中的應用記載在Bematzky和Tanksley(Plant Mol.Biol.Reporter 4，37-41，1986)。許多出版物描述了使用上述方法或其變化形式對特定cDNA克隆進行遺傳作圖。例如，F2雜交群體，回交群體，隨機交配的群體，近等基因系，和其它組的個體可以用於作圖。這樣的方法是本領域的技術人員眾所周知的。
核酸探針也可以用於物理作圖(即，將序列置於物理圖譜上；見Hoheisel等Non-mammalian Genomic AnalysisA Practical Guide，Academic press 1996，pp.319-346，和其中引用的文獻)。
在另一個實施方案中，核酸探針可以用於直接螢光原位雜交(FISH)作圖中(Trask(1991)Trends Genet.7，149-154)。儘管當前的FISH作圖方法偏好使用大克隆(幾至幾百kb；見Laan等(1995)Genome Res.5，13-20)，靈敏度的提高可以允許使用更短探針進行FISH作圖。
使用核酸可以實現許多基於核酸擴增的遺傳和物理作圖方法。實例包括等位基因特異性的擴增(Kazazian(1989)J.Lab.Clin.Med.11，95-96)，PCR-擴增的片段的多態性(CAPS；Sheffield等(1993)Genomics 16，325-332)，等位基因特異性的連接(Landegren等(1988)Science 241，1077-1080)，核苷酸延伸反應(Sokolov(1990)NucleicAcid Res.18，3671)，放射雜交作圖(Walter等(1997)Nat.Genet.7，22-28)和Happy Mapping(Dear和Cook(1989)Nucleic Acid Res.17，6795-6807)。對於這些方法，核酸序列被用於設計和生產用於擴增反應或引物延伸反應的引物對。這樣的引物的設計是本領域的技術人員眾所周知的。在採用基於PCR的遺傳作圖的方法中，必須鑑別作圖雜交的親本在與本核酸序列相對應的區域中的DNA序列差異。但是，這通常不是作圖方法所必需的。
這樣，可以產生、鑑別和/或分離具有改變的GRUBX活性、表現出改良的生長特性的改良植物。
根據本發明的另一個特徵，提供了改善植物生長特性的方法，其包括調控植物中編碼GRUBX蛋白的核酸序列的表達和/或調控GRUBX蛋白的水平和/或活性，其中所述核酸序列和所述蛋白包括選自下述的變體(i)編碼GRUBX蛋白的核酸序列的可變剪接變體，或其中所述GRUBX蛋白由剪接變體編碼；(ii)編碼GRUBX蛋白的核酸序列的等位基因變體，或其中所述GRUBX蛋白由等位基因變體編碼；(iii)編碼GRUBX蛋白的核酸序列，其包含在人工染色體的至少一部分上，該人工染色體優選地還包含一個或多個相關基因家族成員；(iii)GRUBX編碼核酸的功能部分；(iv)能與GRUBX編碼核酸雜交的序列；(v)GRUBX蛋白的同系物、衍生物和活性片段。
根據本發明的一個優選的方面，實現了核酸的增強的或增加的表達。獲得基因或基因產物的增強的或增加的表達的方法是本領域熟知的，包括例如(強)啟動子驅動的過表達，轉錄增強子或翻譯增強子的使用。可以將充當啟動子或增強子元件的分離的核酸導入非異源形式的多核苷酸的合適位置(通常為上遊)，以便上調GRUBX核酸或其變體的表達。例如，通過突變、缺失和/或取代，可以體內地改變內源性啟動子(見Kmiec，美國專利號5,565,350；Zarling等，PCT/US93/03868)，或可以將分離的啟動子以合適的方向和與本發明基因的距離導入植物細胞，以便控制基因的表達。優選地，在植物或植物細胞中過表達在本發明中有用的核酸。如本文使用的，術語過表達指在原始野生型表達水平上附加的任意形式的表達。優選地，要導入植物中的核酸和/或要在植物中過表達的核酸相對於它所可操作地連接的啟動子而言是有義方向。優選地，要過表達的核酸編碼GRUBX蛋白，更優選地，編碼GRUBX蛋白的核酸序列分離自雙子葉植物，優選茄科，更優選地，其中所述序列分離自菸草，最優選地，所述核酸序列由SEQ ID NO1或其一部分代表，或編碼由SEQ ID NO2代表的胺基酸序列或其同系物、衍生物或活性片段。或者，編碼GRUBX蛋白的核酸序列由MIPS No.At2g01650，SEQ ID NO3或6代表，或是其一部分，或編碼由Q9ZU93，SEQ ID NO4或7代表的胺基酸序列，或編碼其同系物、衍生物或活性片段。應當指出，本發明的適用性不依賴於由SEQ ID NO1代表的核酸的應用，也不依賴於編碼SEQ ID NO2的胺基酸序列的核酸序列，而是在本發明的方法中可以使用編碼SEQ IDNO2的同系物、衍生物或活性片段的其它核酸序列，或SEQ ID NO1的一部分，或能與SEQ ID NO1雜交的序列。更具體地，在本發明的方法中有用的核酸編碼至少包含UBX結構域、優選包含UBX結構域和PUG結構域、以及可選地包含鋅指結構域的蛋白質。
根據本發明的另一個實施方案，提供了促進可用於本發明方法中的核苷酸序列的導入和/或表達的遺傳構建體和載體。因此，根據本發明的第三個實施方案，提供了基因構建體，其包含(i)編碼GRUBX蛋白的核酸；(ii)一個或多個控制序列，其能調節(i)所述核酸序列的表達；和任選的(iii)轉錄終止序列。
條件是所述編碼GRUBX蛋白的核酸不是由GenBank登記號AX927140代表的核酸。
使用本領域的技術人員眾所周知的重組DNA技術，可以建立可用於本發明方法中的構建體。可以將該基因構建體插入載體，後者可以從商業上得到，適用於轉化植物，並適用於目標基因在轉化的細胞中的表達。所述遺傳構建體可以是表達載體，其中核酸序列可操作地連接了一個或多個允許在原核和/或真核宿主細胞中表達的控制序列。
根據本發明的一個優選實施方案，所述遺傳構建體是設計成過表達核酸序列的表達載體。該核酸序列可以是編碼GRUBX蛋白或其同系物、衍生物或活性片段的核酸序列，例如前文所述的任一種核酸序列。優選的核酸序列是由SEQ ID NO1代表的序列或其部分或能與其雜交的序列或者編碼由SEQ ID NO2代表的序列或其同系物、衍生物或活性片段的核酸序列。優選地，相對於它所可操作地連接的控制序列而言以有義方向克隆該核酸。
用包含目標序列的載體(即能調控編碼GRUBX蛋白的核酸表達的核酸序列)轉化植物，該序列可操作地連接了一個或多個控制序列(至少是啟動子)。術語「調控元件」、「控制序列」和「啟動子」在這裡都可互換使用，並且作廣義理解，指能實現它們所連接的序列的表達的調節核酸序列。前述術語包括源自經典的真核基因組基因的轉錄調節序列(包括精確的轉錄起始所必需的TATA盒，具有或不具有CCAAT盒序列)以及附加的調控元件(即上遊活化序列，增強子，沉默子)，其響應於發育和/或外部刺激或者以組織特異性的方式改變基因表達。在該術語範圍內也包含經典原核基因的轉錄調控序列，在該情形下，它可以包括-35盒序列和/或-10盒轉錄調節序列。術語「調控元件」也包含能賦予、活化或增強核酸分子在細胞、組織或器官中的表達的合成融合分子或衍生物。如本文使用的，術語「可操作地連接」指啟動子序列和目標基因之間的功能性連接，這種連接使得啟動子序列能夠啟動目標基因的轉錄。
有利地，根據所需要的結果，可以使用任意類型的啟動子來驅動核酸序列的表達。合適的啟動子包括在單子葉植物例如稻或玉米中有活性的啟動子。
優選地，能調控編碼GRUBX蛋白的基因的表達的核酸序列可操作地連接了種子偏好的啟動子。如本文定義的，術語「種子偏好的」指主要在種子組織中表達的啟動子，但不一定僅在該組織中表達。術語「種子偏好的」包括在種子中有活性的所有啟動子。種子組織包括種子的任何部分，包括胚乳、糊粉或胚。優選地，種子偏好的啟動子是谷醇溶蛋白啟動子，或類似強度的啟動子和/或具有類似表達模式的啟動子。最優選地，谷醇溶蛋白啟動子由SEQ ID NO5所示表達盒中的核苷酸1-654代表。通過例如將啟動子偶聯到報告基因上，並測定報告基因在各種植物組織中的表達，可以分析啟動子強度和/或表達模式。本領域的技術人員眾所周知的一種合適的報告基因是細菌β-葡糖醛酸糖苷酶。其它種子-偏好的啟動子的實例如表1所示，這些啟動子可用於本發明的方法中。
表1用於實施本發明的種子偏好的啟動子實例
也可以將內含子序列添加到5′非翻譯區或部分編碼序列的編碼序列處，以增加在胞質中積累的成熟信使的量。已經證實，在植物和動物表達構建體的轉錄單元中包含可剪接的內含子可以使基因表達在mRNA和蛋白水平上增加高達1000-倍(Buchman和Berg，Mol.Cell Biol.8，4395-4405(1988)；Callis等，Genes Dev.1，1183-1200(1987))。當置於轉錄單元的5′末端附近時，這種基因表達的內含子增強通常是最大的。本領域已知玉米內含子Adh1-S內含子1、2和6，Bronze-1內含子的應用。一般參見The Maize Handbook，Chapter 116，Freeling andWalbot，Eds.，Springer，N.Y.(1994)。
任選地，在導入植物的構建體中也可以應用一個或多個終止子序列。術語「終止子」包括控制序列，其是在轉錄單元末端的DNA序列，它給予初級轉錄物的3』端加工和多聚腺苷酸化和轉錄終止的信號。其它的調控元件可以包括轉錄以及翻譯增強子。本領域技術人員已知適用於實施本發明的終止子和增強子序列。本領域技術人員可以知道或可以容易地得到這種序列。
本發明的遺傳構建體還可以包括複製序列起點，其是在特定細胞類型中維持和/或複製所必需的。一個實例是，當需要在細菌細胞中以附加體遺傳元件(例如質粒或粘粒分子)形式維持遺傳構建體之時。優選的複製起點包括，但不限於f1-ori和colE1.
遺傳構建體可以可選地包含選擇標記基因。如本文使用的，術語″選擇標記基因″包括能賦予它在其中表達的細胞以表型從而促進已被本發明核酸構建體轉染或轉化的細胞的鑑別和/或選擇的任何基因。合適的標記可以選自能賦予抗生素或除草劑抗性的標記，其能導入新的代謝性狀，或允許視覺選擇。選擇標記基因的實例包括賦予對抗生素(例如能磷酸化新黴素和卡那黴素的nptII，或能磷酸化潮黴素的hpt)、除草劑(例如能提供對Basta的抗性的bar，能提供對草甘磷的抗性的aroA或gox)的抗性的基因，或能提供代謝性狀的基因(例如manA，其允許植物使用甘露糖作為唯一碳源)。視覺標記基因會導致顏色(例如β-葡糖醛酸糖苷酶，GUS)、發光(例如螢光素酶)或螢光(綠色螢光蛋白，GFP，和其衍生物)的形成。
在優選的實施方案中，如上所述的遺傳構建體包含以有義方向偶聯到啟動子上的GRUBX，所述啟動子優選地是種子偏好的啟動子，例如稻穀醇溶蛋白啟動子。因此，本發明的另一個方面是載體構建體，其包含基本上類似於SEQ ID NO 5的表達盒，其中包含谷醇溶蛋白啟動子，菸草GRUBX基因和T-玉米醇溶蛋白+T-二磷酸核酮糖氧合酶/羧化酶δGA轉錄終止子序列。基本上類似於SEQ ID NO 5的序列包括編碼與SEQ IDNO 2同源的蛋白或與SEQ ID NO 1雜交的第一核酸序列，該第一核酸可操作地連接了谷醇溶蛋白啟動子或具有類似表達模式的啟動子，另外或備選地，該第一核酸連接了轉錄終止序列。
因此，根據本發明的另一個方面，提供了核酸構建體，其包含表達盒，其中含有選自下述的編碼GRUBX蛋白的核酸序列(i)由SEQ ID NO1代表的核酸序列或其互補鏈；(ii)編碼由SEQ ID NO2代表的胺基酸序列或其同系物、衍生物或活性片段的核酸序列；(iii)能與上述(i)或(ii)的核酸序列(優選地，在嚴格條件下)雜交的核酸序列，該雜交序列優選地編碼具有GRUBX蛋白活性的蛋白；(iv)根據上述(i)至(iii)的核酸序列，其由於遺傳密碼而是簡併的；(v)核酸序列，它是根據(i)至(iv)的核酸序列的等位基因變體；(vi)核酸序列，它是根據(i)至(v)的核酸序列的可變剪接變體。
本發明也包括可通過根據本發明的方法得到的植物。本發明因此提供了可通過根據本發明的方法得到的植物，該植物具有改良的生長特性，且該植物具有改變的GRUBX蛋白活性和/或水平和/或編碼GRUBX蛋白的核酸的改變的表達，條件是所述GRUBX蛋白不是由GenBank登記號AX927140代表的核酸序列編碼。
因而，根據本發明的第四個實施方案，提供了生產具有改良的生長特性的轉基因植物的方法，包括向植物中導入和表達本發明的核酸分子。
更具體地，本發明提供了生產具有改良的生長特性的轉基因植物的方法，該方法包括(a)向植物或植物細胞中導入核酸序列，該核酸序列能與其或其一部分雜交，編碼GRUBX蛋白或其同系物、衍生物或活性片段；(b)在促進植物生長的條件下培養該植物。
可以將GRUBX蛋白本身和/或GRUBX核酸本身細胞直接導入植物細胞或植物本身(包括導入植物的組織、器官或任何其它部分)。根據本發明的一個優選的特徵，所述核酸優選地通過轉化導入植物內。該核酸優選地是SEQ ID NO1代表的核酸或其一部分或能與其雜交的序列，或是編碼由SEQ ID NO2代表的胺基酸序列或其同系物、衍生物或活性片段的核酸。或者，該核酸序列是MIPS No.At2g01650，SEQ ID NO3，SEQID NO 6中的任一個，或其一部分，或能與任一種前述序列雜交的序列。或者，胺基酸序列可以是由SPTrEMBL Q9ZU93，GenBank登記號AAR01744，SEQ ID NO4，SEQ ID NO 7中的任一個代表的序列，或其同系物、衍生物或活性片段。
這裡涉及的術語「轉化」包括將外源性多核苷酸轉移到宿主細胞中，而不考慮用來轉移的方法。能夠隨後克隆繁殖(無論通過器官發生的還是胚發生的)的植物組織都可以用本發明的遺傳構建體來轉化，由此再生整株植物。選擇的特定組織根據可供利用的克隆繁殖系統而變化，且最好適合於被轉化的特定物種。代表性的組織目標包括葉盤、花粉、胚、子葉、下胚軸、雌配子體、愈傷組織、已有的分生組織(例如頂端分生組織，腋芽，以及根分生組織)，和誘導的分生組織(例如，子葉分生組織和下胚軸分生組織)。多核苷酸可以被瞬時地或穩定地導入宿主細胞中，並可以非整合形式保持，例如作為質粒。或者，它可以整合入宿主基因組。所獲得的轉化植物細胞然後可以用於以本領域技術人員已知的方式再生轉化植物。
目前植物物種的轉化是一種相當常規的技術。有利地，可以使用幾種轉化方法中的任意一種，將目標基因導入合適的祖細胞中。轉化方法包括使用脂質體、電穿孔、能增加游離DNA攝入的化學物質、向植物中直接注射DNA、粒子槍轟擊、用病毒或花粉轉化和顯微發射。方法可以選自用於原生質體的鈣/聚乙二醇方法(Krens，F.A.等，1882，Nature 296，72-74；Negrutiu I.等，June 1987，Plant Mol.Biol.8，363-373)；原生質體的電穿孔(Shillito R.D.等，1985 Bio/Technol 3，1099-1102)；向植物材料顯微注射(Crossway A.等，1986，Mol.GenGenet 202，179-185)；DNA或RNA-包被的粒子轟擊(Klein T.M.等，1987，Nature 327，70)，用(非整合的)病毒感染等。
採用任何一種眾所周知的稻轉化方法，例如下列文獻中的任一篇所描述的方法，生成表達GRUBX基因的轉基因稻植物，優選通過土壤桿菌-介導的轉化進行公開的歐洲專利申請EP1198985 A1，Aldemita和Hodges(Planta，199，612-617，1996)；Chan等(Plant Mol.Biol.22(3)491-506，1993)；Hiei等(Plant J.6(2)271-282，1994)；其內容在這裡全篇引作參考。在玉米轉化的情形下，優選的方法記載在Ishida等(Nat.Biotechnol.1996 Jun；14(6)745-50)或Frame等(PlantPhysiol.2002 May；129(1)13-22)，其內容在這裡全篇引作參考。
通常，在轉化後，篩選植物細胞或細胞組中由與目標基因共轉移的植物可表達基因編碼的一個或多個標記的存在情況，接著使轉化材料再生為完整的植物。
DNA轉移和再生後，可以例如使用DNA印跡分析評價推定轉化的植物中目標基因的存在、拷貝數和/或基因組組成。可選地或附加地，可以使用RNA印跡和/或蛋白分析這兩種本領域普通技術人員所熟知的技術監測新導入的DNA的表達水平。
所產生的轉化植物可以通過多種方式繁殖，如通過克隆繁殖或傳統的育種技術。例如，第一代(或T1)轉化植物可以自花受精，以產生純合的第二代(或T2)轉化體，T2植物進一步通過傳統育種技術繁殖。
所產生的轉化生物體可以採取多種形式。例如，它們可以是轉化細胞和非轉化細胞的嵌合體；克隆轉化體(例如，所有細胞被轉化而含有表達盒)；轉化和非轉化組織的嫁接體(例如，在植物中，將轉化的根狀莖(rootstock)嫁接到未轉化的接穗上)。
本發明無疑延伸至通過本文描述的任意方法產生的任意植物細胞或植物，及其所有植物部分、繁殖體和後代。本發明進一步延伸至包含已經由任意的前述方法產生的初級轉化或轉染細胞、組織、器官或整株植物的後代，唯一的要求是後代表現出與通過根據本發明的方法在親本中產生的相同的基因型和/或表型特徵。本發明也包括含有分離的編碼GRUBX蛋白的核酸分子的宿主細胞。優選的根據本發明的宿主細胞是植物細胞。因此，本發明也包括宿主細胞，轉基因植物細胞，或具有改良的生長特性的轉基因植物，其特徵在於所述宿主細胞、轉基因植物或植物細胞具有編碼GRUBX蛋白的核酸序列的增加表達和/或GRUBX蛋白的增加的活性和/或水平。
本發明也延伸至植物的可收穫部分，例如但不限於種子、葉、果實、花、莖或莖培養物、根莖、根、塊莖、鱗莖和其直接衍生的產物，例如幹球或粉末、油、脂肪和脂肪酸、澱粉或蛋白。
如本文使用的，術語「植物」包括整株植物、植物的祖先和後代、植物部分、植物細胞、組織和器官。術語「植物」也包括懸浮培養物、胚、分生組織區域、愈傷組織、葉、花、果實、種子、根(包括根莖和塊莖)、芽、球莖、莖、配子體、孢子體、花粉、以及小孢子。本發明的方法中特別有用的植物包括藻類、厥類和所有屬於植物界(Viridiplantae)超家族的植物，特別是單子葉和雙子葉植物，包括飼料或草料豆類、觀賞植物、糧食作物、樹木或灌木，其選自下列植物秋葵屬(Abelmoschus spp.)，槭屬(Acer spp.)，獼猴桃屬(Actinidiaspp.)，冰草屬(Agropyron spp.)，蔥屬(Allium spp.)，莧屬(Amaranthus spp.)，菠蘿，番荔枝屬(Annona spp.)，旱芹(Apiumgraveolens)，擬南芥，花生屬(Arachis spp)，菠蘿蜜屬(Artocarpusspp.)，石刁柏(Asparagus officinalis)，燕麥(Avena sativa)，陽桃(Averrhoa carambola)，冬瓜(Benincasa hispida)，Bertholletiaexcelsea，甜菜，芸苔屬(Brassica spp.)，Cadaba farinosa，茶(Camellia sinensis)，美人蕉(Canna indica)，辣椒屬(Capsicumspp.)，番木瓜(Carica papaya)，大花假虎刺(Carissa macrocarpa)，紅花，山核桃屬(Carya spp.)，慄屬(Castanea spp.)，Cichoriumendivia，樟屬(Cinnamomum spp.)，西瓜(Citrullus lanatus)，柑桔屬(Citrus spp.)，椰子屬(Cocos spp.)，咖啡屬(Coffea spp.)，可樂果屬(Cola spp.)，芋頭(Colocasia esculenta)，榛屬(Corylusspp.)，山楂屬(Crataegus spp.)，香瓜屬(Cucumis spp.)，南瓜屬(Cucurbita spp.)，菜薊屬(Cynara spp.)，野胡蘿蔔(Daucus carota)，山螞蝗屬(Desmodium spp.)，龍眼(Dimocarpus longan)，薯蕷屬(Dioscorea spp.)，柿樹屬(Diospyros spp.)，稗屬(Echinochloaspp.)，(Eleusine coracana)，枇杷(Eriobotrya japonica)，紅果仔(Eugenia uniflora)，蕎麥屬(Fagopyrum spp.)，水青岡屬(Fagusspp.)，無花果(Ficus carica)，金橘屬(Fortunella spp.)，草莓屬(Fragaria spp.)，銀杏(Ginkgo biloba)，大豆屬(Glycine spp.)，陸地棉(Gossypium hirsutum)，向日葵屬(Helianthus spp.)，木槿屬(Hibiscus spp.)，大麥屬(Hordeum spp.)，甘薯(Ipomoea batatas)，胡桃屬(Juglans spp.)，萵苣(Lactuca sativa)，山黧豆屬(Lathyrusspp.)，浮萍屬(Lemna spp.)，兵豆(Lens culinaris)，亞麻(Linumusitatissimum)，荔枝(Litchi chinensis)，百脈根屬(Lotus spp.)，稜角絲瓜(Luffa acutangula)，羽扇豆屬(Lupinus spp.)，硬皮豆屬(Macrotyloma spp.)，Malpighia emarginata，蘋果屬(Malus spp.)，Mammea americana，Mangifera indica，木薯屬(Manihot spp.)，人心果(Manilkara zapota)，紫苜蓿(Medicago sativa)，草木犀屬(Melilotus spp.)，薄荷屬(Mentha spp.)，苦瓜屬(Momordica spp.)，Morus nigra，芭蕉屬(Musa spp.)，菸草屬(Nicotiana spp.)，木犀欖屬(Olea spp.)，仙人掌屬(Opuntia spp.)，料豆屬(Ornithopusspp.)，稻屬(Oryza spp.)，稷(Panicum miliaceum)，Passifloraedulis，歐防風(Pastinaca sativa)，鱷梨屬(Persea spp.)，皺葉歐芹(Petroselinum crispum)，菜豆屬(Phaseolus spp.)，刺葵屬(Phoenix spp.)，酸漿屬(Physalis spp.)，松屬(Pinus spp.)，阿月渾子(Pistacia vera)，豌豆屬(Pisum spp.)，早熟禾屬(Poa spp.)，楊屬(Populus spp.)，牧豆樹屬(Prosopis spp.)，李屬(Prunus spp.)，番石榴屬(Psidium spp.)，石榴(Punica granatum)，西洋梨(Pyruscommunis)，櫟屬(Quercus spp.)，蘿蔔(Raphanus sativus)，Rheumrhabarbarum，茶蔗子屬(Ribes spp.)，懸鉤子屬(Rubus spp.)，甘蔗屬(Saccharum spp.)，接骨木屬(Sambucus spp.)，黑麥(Secalecereale)，胡麻屬(Sesamum spp.)，茄屬(Solanum spp.)，高粱(Sorghum bicolor)，菠菜屬(Spinacia spp.)，蒲桃屬(Syzygium spp.)，酸豆(Tamarindus indica)，可可(Theobroma cacao)，三葉草屬(Trifolium spp.)，Triticosecale rimpaui，小麥屬(Triticum spp.)，越桔屬(Vaccinium spp.)，野豌豆屬(Vicia spp.)，豇豆屬(Vignaspp.)，葡萄屬(Vitis spp.)，玉米，Zizania palustris，棗屬(Ziziphus spp.)等。
根據本發明的一個優選的特徵，所述植物是作物植物，包含大豆，向日葵，芸苔(canola)，苜蓿，油菜(rapeseed)或棉花。更優選地，根據本發明的植物是單子葉植物，例如甘蔗，最優選地穀類，例如稻，玉米，小麥，黍，大麥，黑麥，高粱或燕麥。
但是，預期本發明的方法可以適用於廣泛種類的植物，因為已知的真核GRUBX同系物中的結構域保守性暗示著在細胞代謝中同樣保守的功能。
有利地，本發明方法的實施會產生具有許多改良的生長特性的植物，這樣的改良的生長特性包括改良的生長，增加的產量和/或增加的生物量，改良的結構和改良的細胞分裂，每項都是相對於對應的野生型植物而言。
本發明涉及改良植物的生長特性的方法，或生產具有改良的生長特性的植物的方法，其中所述生長特性包含選自下述的任意一個或多個增加的產量，增加的生物量，增加的總地上面積，增加的植物高度，增加的分櫱數，增加的第一圓錐花序數，增加的第二圓錐花序數，增加的種子總數，增加的飽滿種子數，增加的每株植物總種子產量，增加的種子生物量，增加的種子大小，增加的種子體積，提高的收穫指數，增加的千粒重量(TKW)，改變的周轉時間和/改變的生長曲線。本發明也提供了改變上述生長特性之一而不損及其它生長特性之一的方法，例如增加地上綠組織面積，同時維持相同的飽滿種子數和相同的種子產量。
術語「增加的產量」包括與對應的野生型植物的生物量相比，植物的一個或多個部分的生物量的增加。該術語也包括種子產量的增加，這包括種子生物量(種子重量)的增加和/或(飽滿)種子數的增加和/或種子大小的增加和/或種子體積的增加，每項都是相對於對應的野生型植物而言的。對於玉米，種子產量的增加可以由每穗(種子)排數的增加和/或每排粒數的增加來反映。以稻為例，產量增加可以表現為下述的一項或多項每公頃或英畝的植物數，每株植物的圓錐花序數，每個圓錐花序的小穗數，每個圓錐花序的花數，種子飽滿率的增加，等等。種子大小和/或體積的增加也可以影響種子的組成。種子產量的增加可能是由於花朵數目和/或大小的增加所致。產量的增加也可能提高收穫指數，後者以總生物量與可收穫部分(例如種子)的產量的比例；或千粒重量表示。增加的產量也包括以更高的密度種植的能力(每公頃或英畝的植物數)。
術語「改良的細胞分裂」包括細胞分裂的增加或減少或者異常的細胞分裂/胞質分裂，改變的分裂平面，改變的細胞極性，改變的細胞分化。該術語也包含核內有絲分裂、胞質分裂(acytokinesis)、多倍性、多染色線和核內再複製等現象。
可以預見，當與對應的野生型植物相比較時，具有增加的生物量和高度的植物能表現出改良的生長速率。如本文使用的，術語「改良的生長速率」包括、但不限於在植物生命周期的一個或多個階段，植物的一個或多個部分的(包括綠色生物量，包括種子)更快的生長速率。術語「改良的生長」包括增強的活力，更早的開花，改良的循環時間。如果生長速率得到足夠提高，所引起的更短的循環時間可以允許在一個常規生長期內有額外收穫。在有些植物的情況下，也可以從相同的根狀莖(rootstock)收穫額外的次數。植物的收穫周期的改善可以導致每英畝的年度生物量生產的增加(由於任何特定植物可以生長和收穫的次數(以年計)的增加)。生長速率的增加也允許在比它們的野生型對應物更廣的地理區域栽培改良的植物，因為用於種植作物的土地限制經常由不利的環境條件決定，包括在種植時(早期)或在收穫時(晚期)。如果縮短收穫周期，則可以避免這樣的不利條件。具有改良的生長的植物可以表現出改良的生長曲線，且可以具有改良的Tmid或T90值(分別是都相對於對應的野生型植物而言達到它們的最大面積的一半或它們的面積的90％所需的時間)。
根據本發明的一個優選的特徵，本發明方法的實施會產生具有增加的產量的植物。優選地，增加的產量至少包括相對於對照植物而言收穫指數的提高。因此，根據本發明，提供了增加植物的產量、尤其是收穫指數的方法，該方法包括增加植物中編碼GRUBX蛋白的核酸序列的表達和/或增加GRUBX蛋白本身的活性，優選地，其中該GRUBX蛋白由SEQ IDNO1代表的核酸序列或其一部分編碼，或由能與其雜交的序列編碼，或其中該GRUBX蛋白由SEQ ID NO2代表，或是其同系物、衍生物或活性片段。或者，該GRUBX可以由MIPS No.At2g01650，SEQ ID NO3中的任一個代表的核酸序列或其一部分編碼，或由能與其雜交的序列編碼，或其中所述GRUBX是由SPTrEMBL Q9ZU93，SEQ ID NO4中的任一個代表，或是其同系物、衍生物或活性片段。
本發明的方法可以有利地適用於作物植物，因為本發明的方法可以用於提高植物的收穫指數。因此，本發明的方法特別適用於為它們的種子栽培的作物植物，例如穀類。因此，本發明的一個具體實施方案涉及提高穀類的收穫指數的方法。
與對照植物相比，無論植物是在無壓力條件下，還是植物暴露於各種壓力下，都會發生產量和/或生長的增加。植物通常通過生長得更緩慢來對壓力的暴露作出響應。在嚴重的壓力條件下，植物甚至可以完全停止生長。另一方面，在本文中將溫和的壓力定義為植物暴露的任何壓力，其不會導致植物喪失恢復生長能力的完全停止生長。由於農業實踐(灌溉，澆肥，殺蟲劑處理)的進步，在種植的作物植物中不會經常遇到嚴重的壓力。結果，由溫和的壓力誘導的受損的生長經常是農業的不希望的特徵。溫和的壓力是植物所暴露的典型壓力。這些壓力可以是植物每天暴露的生物的和/或非生物的(環境的)壓力。典型的非生物的或環境的壓力包括非典型的熱或冷/冷凍溫度造成的溫度壓力，鹽壓力，水壓力(乾旱或水災)。化學試劑也可以造成非生物的壓力。生物壓力通常是由病原體例如細菌、病毒、真菌或昆蟲造成的那些壓力。
「改良的結構」可能是由於細胞分裂的變化所致。如本文使用的，術語「結構」包括植物的外觀或形態，包括任一種或多種結構特徵或其結構特徵的組合。這種結構特徵包括植物的任意細胞、組織或器官或細胞、組織或器官組的形狀、大小、數量、位置、紋理、排列和模式，包括根、葉、芽、莖或分櫱、葉柄、毛狀體、花、花序(對於單子葉和雙子葉植物)、圓錐花序、花瓣、柱頭、花柱、雄蕊、花粉、胚珠、種子、胚、胚乳、種皮、糊粉、鬚根、形成層、木材、心材、薄壁組織、通氣組織、篩分子、韌皮部或者脈管組織等。因此，改良的結構包括植物的改良的生長的所有方面。
本發明還涉及編碼GRUBX蛋白的核酸和其部分或能與其雜交的核酸在改善植物的生長特性中的應用，優選地，在增加植物的產量和/或生物量中的應用。本發明還涉及GRUBX蛋白和其同系物、衍生物和活性片段在改善植物的生長特性中的應用。所述核酸序列優選地由SEQ ID NO1，6代表，或是其一部分或能與其雜交的序列，或編碼由SEQ ID NO2，4，7代表的胺基酸序列或其同系物、衍生物或活性片段。
本發明還涉及編碼GRUBX蛋白和其變體的核酸序列以及GRUBX蛋白本身和其同系物、衍生物和活性片段作為生長調節劑的應用。前文所述的核酸序列(和其部分以及能與其雜交的序列)和前文所述的胺基酸序列(和其同系物、衍生物和活性片段)可以用於改善植物的生長特性，如前文所述。因此，該序列可以用作生長調節劑，以刺激或抑制植物生長。因此，本發明提供了一種用於改善植物的生長特性的組合物，其包含GRUBX蛋白或由SEQ ID NO 2代表的蛋白或其同系物、衍生物或活性片段。本發明此外提供了一種用於改善植物的生長特性的組合物，其包含能編碼GRUBX蛋白的核酸，或由SEQ ID NO 1代表的核酸或其一部分或者能與其雜交的序列。本發明也提供了一種用作生長調節劑的組合物，其包含由任一種前述的胺基酸序列代表的蛋白或其同系物、衍生物或活性片段。
現在將參考下列附圖描述本發明，其中圖1a.代表包含UBX結構域的擬南芥蛋白和動物參考蛋白的系統樹，如通過SMART工具所識別的。人蛋白由它們的GenBank登記號NP_079517(含有1的人類UBX結構域(UBXD1))，AAP97263(人類Fas-有關的蛋白因子FAF1mRNA)，NP_005662(人類再生8(D8S2298E)，REP8)代表，大鼠蛋白由NP_114187(褐鼠p47蛋白)代表。對於擬南芥蛋白，其它的標識符(除了SEQ ID NO 2，SEQ ID NO 4和SEQ ID NO 7以外)是GenBank或SPTrEMBL登記號。
圖1b.代表包含PUG結構域的植物蛋白的系統樹，如通過SMART工具所識別的。將SEQ ID NO 2和SEQ ID NO 4與擬南芥蛋白(SPTrEMBL登記號Q9ZU93(表達的蛋白)，Q9FKI1(與鋅金屬蛋白酶類似)，Q9MAT3(F13M7.16蛋白)，Q9FKC7(基因組DNA，染色體5，TAC克隆K24G6)，Q9SF12(假定的蛋白)，Q9C5S2(核糖核酸內切酶/蛋白激酶IRE1)，Q8RX75(AT5g24360/K16H17_7)，Q94IG5(Ire1同系物-1))，和稻蛋白SPTrEMBL Q7XIT1(OsIre1p)進行了對比。
圖2a.通過它們的共有序列對UBX1和PUG結構域進行定義(SMART資料庫)。CONSENSUS/50％、/65％和/80％是包含UBX1或PUG結構域的參照序列中50，65和80％所享有的共有序列。大寫字母是各種胺基酸的標準單字母IUPAC碼，其它的字母象徵著如下所述的胺基酸的性質
圖2b.存在於SEQ ID NO 2和Q9ZU93中的UBX和PUG結構域序列。
圖2c.Q9ZU93和SEQ ID NO 2的比對，PUG結構域標有下劃線，UBX結構域以粗體表示。
圖2d.SEQ ID NO 2和SEQ ID NO 4的比對，PUG結構域標有下劃線，UBX結構域以粗體表示。
圖2e.SEQ ID NO 4和SEQ ID NO 7的比對，PUG結構域標有下劃線，UBX結構域以粗體表示。
圖3.條目克隆p77的示意圖，其在AttL1和AttL2位點內含有CDS0669，用於在pDONR201主鏈中進行Gateway克隆。CDS0669是菸草GRUBX編碼序列的內部碼。該載體也含有細菌卡那黴素-抗性盒和細菌複製起點。
圖4.在谷醇溶蛋白啟動子(PRO0090)控制下在稻中表達菸草GRUBX基因(CDS0669)的二元載體。該載體含有源自Ti質粒的T-DNA，其由左邊界(LB重複，LB Ti C58)和右邊界(RB重複，RB Ti C58))界定。從左邊界至右邊界，該T-DNA含有用於轉化植物的抗生素選擇的盒；用於轉化植物的可視篩選的盒；用於表達菸草GRUBX基因的PRO0090-CDS0669-玉米醇溶蛋白和rbcS-deltaGA雙終止子盒。該載體還含有用於細菌複製的來自pBR322的複製起點和用於壯觀黴素和鏈黴素細菌選擇的選擇標記(Spe/SmeR)。
圖5.可用於本發明的序列實例。SEQ ID NO1和SEQ ID NO2分別是在實施例中使用的GRUBX核酸和GRUBX蛋白的序列。SEQ ID NO3和SEQ ID NO4代表著甘蔗GRUBX正向同源物的編碼序列和蛋白質序列，SEQ ID NO5是在轉化的稻植物中使用的表達盒的序列，SEQ ID NO6和SEQ ID NO7分別代表著稻GRUBX正向同源物的編碼序列和蛋白質序列。
實施例現在參考下列實施例描述本發明，這些實施例僅僅用於舉例說明。
DNA操作除非另外說明，根據(Sambrook(2001)Molecular Cloningalaboratory manual，第三版，Cold Spring Harbor Laboratory Press，CSH，紐約)，或Ausubel等(Current Protocols in Molecular Biology.New YorkJohn Wiley和Sons，1998)中所述的標準方法進行重組DNA技術。用於植物分子工作的標準材料和方法記載在Plant MolecularBiology Labfax(1993)，作者R.D.D.Croy，BIOS ScientificPublications Ltd(UK)和Blackwell Scientific Publications(UK)出版。
實施例1CDS0669序列的克隆從菸草克隆GRUBX基因片段在同步化的菸草BY2細胞培養物(菸草L.cv.Bright Yellow-2)上，進行cDNA-AFLP實驗，選擇BY2表達的受到細胞周期調控的序列標籤用於進一步克隆。所述表達序列標籤用於篩選菸草cDNA庫和分離目標全長cDNA，即編碼GRUBX基因(CDS0669)的cDNA。
BY2細胞的同步化.
如下所述，通過用阿非迪黴素將細胞阻斷在早期S-階段，對菸草BY2(菸草L.cv.Bright Yellow-2)的培養細胞懸浮液同步化。如(Nagata等Int.Rev.Cytol.132，1-30，1992)所述，維持菸草L.cv.Bright Yellow2的細胞懸浮液。為了同步化，在添加了阿非迪黴素(Sigma-Aldrich，St.Louis，MO；5mg/l)(一種DNA-聚合酶α抑制藥物)的新鮮培養基中，將7日齡靜止培養物稀釋10倍。24小時後，通過用新鮮培養基洗滌幾次而將細胞解除阻斷，此後它們的細胞周期進程得到恢復。
RNA提取和cDNA合成使用LiCl沉澱法(Sambrook等，2001)製備總RNA。根據生產商的說明書，使用Oligotex柱(Qiagen，Hilden，Germany)，從500μg總RNA提取了poly(A+)RNA。從1μg poly(A+)RNA開始，通過用生物素化的寡-dT25引物(Genset，Paris，France)和Superscript II(Life Technologies，Gaithersburg，MD)進行反轉錄，合成第一鏈cDNA。通過用大腸桿菌連接酶(Life Technologies)，DNA聚合酶I(USB，Cleveland，OH)和RNAse-H(USB)進行鏈置換，完成第二鏈的合成。
cDNA-AFLP分析.
如(Vos等，Nucleic Acid Res.23(21)4407-4414，1995；Bachem等，植物J.9(5)745-53，1996)所述，經改進後，將500ng雙鏈cDNA用於AFLP分析。使用的限制酶是BstYI和MseI(Biolabs)，並在2個分開的步驟中進行消化。用一種酶進行第一個限制消化後，藉助於它們的生物素化尾巴將3′末端片段捕獲到Dyna珠子(Dynal，Oslo，Norway)上，而其它的片段則被洗掉。用第二種酶消化後，收集釋放的限制性片段，並在隨後的AFLP步驟中用作模板。為了預擴增，將沒有選擇性核苷酸的MseI引物與含有T或C作為3′最末端核苷酸的BstYI引物相組合。PCR條件如(Vos等，1995)所述。將得到的擴增混合物稀釋600倍，將5μl用於使用P33-標記的BstYI引物和Amplitaq-Gold聚合酶(Roche Diagnostics，Brussels，Belgium)的選擇性擴增。使用Sequigel系統(Biorad)，在5％聚丙烯醯胺凝膠上分離擴增產物。將乾燥的凝膠暴露於Kodak Biomax膠片，並在PhosphorImager(Amersham Pharmacia Biotech，LittleChalfont，UK)中掃描。
AFLP片段的表徵從凝膠中分離與有差別地表達的轉錄物相對應的帶，其中(部分)轉錄物對應著SEQ ID NO 1(或CDS0669)，並在與用於選擇性擴增相同的條件下重新擴增所洗脫的DNA。通過對用選擇性BstYI引物重新擴增的聚合酶鏈反應產物直接測序，或在將片段克隆進pGEM-T easy(Promega，Madison，WI)內並對各克隆測序後，得到序列信息。通過BLAST序列比對(Altschul等，Nucleic Acid Res.25(17)3389-3402 1997)，將得到的序列與可公開得到的資料庫中的核苷酸和蛋白質序列進行比較。當可行時，用更長的EST或分離的cDNA序列替代標籤序列，以增加發現顯著同源性的機會。隨後，如下所述從商業化的菸草cDNA文庫中擴增與SEQ ID NO 1(CDS0669)相對應的物理cDNA克隆GRUBX基因(CDS0669)的克隆用從活躍地分裂的、非-同步化的BY2菸草細胞分離的poly(A+)RNA，製備了平均大小為1,400bp的插入物的cDNA文庫。將這些文庫插入物克隆進載體pCMVSPORT6.0，後者包含attB Gateway盒(LifeTechnologies)。從該文庫中選擇46,000個克隆，排列在384-孔微量滴定板中，隨後一式兩份地點在尼龍濾膜上。使用數百种放射性標記的標籤的集合作為探針(包括與序列CDS0669，SEQ ID NO 1相對應的BY2-標籤)篩選排列的克隆。分離陽性克隆(其中有克隆對應著CDS0669，SEQID NO 1)，測序，並與標籤序列比對。當與標籤雜交失敗時，通過PCR擴增選擇與該標籤對應的全長cDNA使用引物3程序(http//www-genome.wi.mit.edu/genome_software/other/nrimer3.html)設計標籤特異性引物，並與普通的載體引物組合使用，以擴增部分cDNA插入物。將來自50,000，100,000，150,000，和300,000個cDNA克隆的DNA庫用作PCR擴增的模板。然後，從瓊脂糖凝膠分離擴增產物，克隆，測序，並將它們的序列與標籤序列進行比對。接著，通過LR反應，將與SEQ ID NO 1的核苷酸序列相對應的全長cDNA從pCMVsport6.0文庫載體克隆進pDONR201，即一種Gateway供體載體(Invitrogen，Paisley，UK)內，產生條目克隆p77(圖3)。
實施例2載體構建隨後，將條目克隆p77與p0830(一種用於稻轉化的目標載體)用於LR反應中。該載體在T-DNA邊界內含有下述內容作為功能元件植物選擇標記；可視標記表達盒；和用於與已經克隆進條目克隆的目標序列進行LR體內重組的Gateway盒。用於種子-優選的表達的谷醇溶蛋白啟動子(PRO0090)在該Gateway盒的上遊。LR重組步驟後，將得到的表達載體p72(圖4)轉化進土壤桿菌株LBA4404中，並隨後轉化進稻植物內。
實施例3用PRO0090-CDS0669構建體轉化稻將稻日本品種Nipponbare的成熟幹種子去殼。通過將種子在70％乙醇中溫育1分鐘，然後在0.2％HgCl2中30分鐘，並用無菌蒸餾水洗滌6次、每次15分鐘，完成滅菌。然後，使無菌的種子在含有2，4-D的培養基(愈傷組織誘導培養基)中發芽。在黑暗中溫育4周後，切下胚性的、盾片衍生的愈傷組織，並在相同的培養基上繁殖。2周後，通過在相同培養基上繼代培養另外2周，使愈傷組織倍增或繁殖。在共培養前3天，在新鮮培養基上繼代培養胚性愈傷組織片，以促進細胞分裂活性。將攜帶二元載體p72的土壤桿菌株LBA4414用於共培養。在28℃，在含有適當抗生素的AB培養基上培養土壤桿菌株3天。然後收集細菌，並以約1的OD600懸浮在液體共培養培養基中。將懸浮液轉移到有蓋培養皿中，並將愈傷組織進入懸浮液15分鐘。接著，將愈傷組織幹點在濾紙上，轉移到固化的共培養培養基中，並在25℃，在黑暗中溫育3天。此後，在28℃，在含有2，4-D的培養基上，在有適當濃度的選擇劑存在下，培養共培養的愈傷組織4周。在該階段中，形成迅速生長的抗性愈傷組織小塊。將該材料轉移到再生培養基中，在光下溫育，會釋放出胚胎發生潛力，在以後的4-5周形成芽。從愈傷組織切下芽，在含有生長素的培養基上溫育2-3周，從中轉移到土壤。在高溼度和短日照下，在溫室中生長變硬的芽。最後，在移植後3-5個月收穫種子。該方法能以超過50％的比例得到單基因座轉化體(Aldemita和Hodges，Planta 199，612-617，1996；Chan等，Plant Mol.Biol.22(3)，491-506，1993；Hiei等，Plant J.6(2)，271-282，1994)。
實施例4評價用PRO0090-CDS0669構建體轉化的轉基因稻產生了大約15到20個獨立的T0稻轉化體。將一代轉化體從組織培養室轉移到溫室中，以便生長並收穫T1種子。保留6個事件，這些事件中T1後代中轉基因的存在/缺失以3∶1的比例分離。對於這些事件中的每一個，通過監測可視標記表達，選擇大約10株含有轉基因的T1幼苗(雜合子和純合子)和大約10株缺少轉基因的T1幼苗(零合子)。如下所述評價了許多與植物生長和種子生產有關的參數，並統計分析所有數據統計分析t-檢驗和F-檢驗將雙因子ANOVA(變體的分析)用作植物表型特徵的總體評價的統計模型。對用本發明的基因轉化的所有植物的所有事件測量的所有參數，進行F-檢驗。進行F-檢驗，以檢查基因對所有轉化事件的作用，並驗證基因的總作用，在本文中也稱作「總體基因作用」。如果F-檢驗的值表明數據是顯著的，則認為存在「基因」作用，這意味著不僅僅基因的存在或位置會造成表型的差異。真實的總基因作用的顯著性閾值設定為F-檢驗的5％概率水平。
4.1植物生長測量將選擇的T1植物(大約10株具有轉基因，大約10株沒有轉基因)轉移到溫室中。每株植物接受獨特的條碼標記，以清楚地將表型數據和對應的植物相聯繫。在下面的環境設置下，使選擇的T1植物在10cm直徑盆中的土壤上生長光周期＝11.5h，日照強度＝30,000lux或更高，白天溫度＝28℃或更高，夜間溫度＝22℃，相對溼度＝60-70％。使轉基因植物和對應的零合子在隨機的位置並列生長。從播種階段直到成熟階段，每株植物通過數碼成像盒幾次，並成像。在每個時間點，從至少6個不同的角度，為每株植物拍數碼圖像(2048×1536像素，1600萬色)。使用圖像分析軟體，可以從所有植物的所有數碼圖像以自動化方式得出幾個參數。
4.2種子-有關的參數測量
收穫成熟的第一圓錐花序，裝袋，用條碼標記，然後在37℃烘箱中乾燥3天。然後拍打圓錐花序，收集所有種子，並計數。使用吹風裝置，將飽滿的秕(husk)與空秕分開。拋棄空秕，再次計數剩下的部分。在分析天平上稱量飽滿秕。該方法能產生一組種子有關的參數。
植物的收穫指數將本發明中的收穫指數定義為總種子產量和地上面積(mm2)的比，並乘以因子106。如上所述，通過稱量從植物收穫的所有飽滿秕來測量每株植物的總種子產量。通過計算來自與背景區別開的地上植物部分的數碼圖像的像素總數，確定植物地上面積。該值是在同一時間點從不同角度拍攝的照片的平均值，並通過校正而轉化成以mm2表示的物理表面值。實驗表明，以該方式測量的地上植物面積與地上植物部分的生物量相關。
在用T2植物進行的第二個實驗中，證實了在第一個實驗中得到的數據。選擇了具有正確的表達模式的3個系用於進一步分析。通過監視標記表達，篩選來自T1中的陽性植物(雜合子和純合子)的種子批次。對於每個選擇的事件，再保留雜合子種子批次用於T2評價。在每個種子批次中，使相同數目的陽性和陰性植物生長在溫室中，用於評價。
在T2代中，總共評價120株GRUBX轉化植物，即針對每個事件採用40株植物中，其中20株是轉基因陽性的，20株是陰性的。
因為已經進行了具有重疊事件的2個實驗，故進行了合併分析。這可以用於檢查2個實驗的效果的一致性，如果確是這種情況，則積累來自2個實驗的證據，以增加結論的可靠性。使用的方法是混合模型方法，其考慮了數據的多級結構(即實驗-事件-分離子)。通過對比似然比值測定和卡方分布，得到了P-值。
在第一個實驗中，評價了T1代中的6個系。與零合子系相比，收穫指數存在平均增加，2個系具有50％或更高的顯著增加(表2)。
表2對兩個表現最好的T1事件進行評價
列2和3中給出了T1代中的轉基因系(TR)和對照植物(零)的收穫指數測量值的平均絕對值，列4給出了絕對差值，列5給出了％差值，列6給出了以在t-檢驗中得到的p-值表示的顯著性。
在T2代中證實了從T1代得到的結果；收穫指數的平均增加是13％，F-檢驗證實，該增加是顯著的(p-值為0.0447)。此外，在與T1代的結果的合併分析中，重新評價了這些T2數據，從F-檢驗得到的p-值再次證實所觀察到的效果是顯著的(p-值0.0181)。
序列表110CropDesign N.V.
120具有改良的生長特性的植物及其製備方法130CD-107-PCT150EP 03104764.01512003-12-17150US 60/531,8661512003-12-221607170PatentIn version 3.321012111380212DNA213菸草(Nicotiana tabacum)4001atgggtgaca tgaaggataa agtcaaaggg ttcatgaaaa aagtcacatc ttcttcttca 60ggtaagttta aaggccaagg tagggttttg ggtggttcat cttcttcagg accctcaaat 120catgtcaata atttttcatc acatccccta aatacaaggc aagatcaaca accttcatat 180acaaaaactt cgcctcaaaa accaagtaat tctgatcaaa gaattgagaa tatatgtgaa 240attcagttca acaaaagtga atcaaaggat ggttttgatc catttggtga attagtcact 300tctgggaaga gaaacccaaa agggtattca cttactaatg tgtttgaatg ccctgtctgt 360ggtagtggtt ttgtttctga agaagaggtg tcaactcata ttgatagctg tttaagttct 420gaagtgtctt ctaatttggg agttgaaagt aaagttgaag ttaaaagtga attggaaaca 480tgtgttagtg catatgtttc agggaagccc tcagaagggt cagttgaagt ggtcattaag 540ttgttaaaga atattgtgaa ggaaccagag aatgccaagt ttaggaaaat aaggatgggg 600aatccaaaaa taaaaggtgc tataggtgat gttgtaggag gagtggagct attggaattt 660gttggatttg agttgaaaga agaaggtggg gaaatttggg ctgtgatgga tgttccttct 720gaagaacaac ttgttatgct taagaatgta gtttcactct tggaaccgaa gaaggttgaa 780gagttggcgt ccttatccca agttaaggcg agtgaaccag ttgagccgaa gaagattgat 840agacagattc gagtgttctt ttctgttccc gagagcgtag cagcaaaaat tgagctacct 900gattccttct ttaacctctc acgtgaggaa ttgagaagag aagcagagat gaggaagaag 960aaattagaag attccaaatt attgattcct aaatcttatc gggaaaagca ggcaaaagct1020gcaagaaaga agtacacaaa atccattatc cgtgtacagt ttccagatgg agcattgctt1080caaggtgtct ttctaccttc ggagccaact agtgctcttt atgagtttgt gagcgcagcg1140ttaaaggaac caagcttaga gttcgaattg ttacatccgg tgcttgttaa aaagcgggtg1200attccccatt ttccagctgc tggggagagg gctgtaacag ttgaagagga ggatttggtt1260cctgcagctc tactcaaatt taaacctatc gaaacagatt ctgttgtttt tactggtctt1320tgtaatgagc ttcttgaaat tagcgagccc ctcgagaccg gatcagttgc ttcctcgtaa13802102211459212PRT213菸草4002Met Gly Asp Met Lys Asp Lys Val Lys Gly Phe Met Lys Lys Val Thr1 5 10 15Ser Ser Ser Ser Gly Lys Phe Lys Gly Gln Gly Arg Val Leu Gly Gly
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Gln Ala Lys Ala Ala Arg Lys Lys Tyr Thr Lys Ser Ile Ile Arg Val340 345 350Gln Phe Pro Asp Gly Ala Leu Leu Gln Gly Val Phe Leu Pro Ser Glu355 360 365Pro Thr Ser Ala Leu Tyr Glu Phe Val Ser Ala Ala Leu Lys Glu Pro370 375 380Ser Leu Glu Phe Glu Leu Leu His Pro Val Leu Val Lys Lys Arg Val385 390 395 400Ile Pro His Phe Pro Ala Ala Gly Glu Arg Ala Val Thr Val Glu Glu405 410 415Glu Asp Leu Val Pro Ala Ala Leu Leu Lys Phe Lys Pro Ile Glu Thr420 425 430Asp Ser Val Val Phe Thr Gly Leu Cys Asn Glu Leu Leu Glu Ile Ser435 440 445Glu Pro Leu Glu Thr Gly Ser Val Ala Ser Ser450 45521032111311212DNA213甘蔗(Saccharum officinarum)220
221misc_feature222(277)..(279)223n可以是任何核苷酸4003atgatgaagg acaagatgaa ggagttcatg aagaaggtca cctcctccgg gtccgggacc 60ccctcctcct tcaagggcac ctcccacgtc ctcggctccg gcccctcccc ctcctcctcc 120caccccgctg cccgctcctc aaaccctagc ccaaacctca ggcccgctcc taagcggacc 180tcgccaccta ccccgcccac tttaaccacc gatttgacct ccttcacgcc cctcgtctgc 240tactcctccc gccgccccga cgcgaacggc accgcgnnng ccgtcgccac cgtcgcgtgc 300cccagctgcg gagacgcgtt tccgtccgag ctcgccgtct ccgagcatct cgacggctgc 360ctcgcgtcgg cggggggcgc ccgcgcgcgc gccgccgcgt acctcgccgc cgacccgcct 420ccgcccgcgg cctccgtaga ggtggtcaaa cgcctgctgg gcaacctgct ccgggagccc 480ggcaacgata agttcaggcg ggtgagattg ggtaacccgc ggatcaagga ggccctggca 540gacagggatg gcggggtgga gctcctggag gccgtcggct tcacagttgg ggatgagggc 600ggggagccct tcgccgtgat ggacgaagtg cctagcgacc ctaggctcaa cgggatcagg 660agggccgtcc tcctgctcga gggggcacac ccctctgcgc ctccagtgaa ggcggaggct 720gaggccaagg agagctgcag caatgtgtct gacgtgcagg agggtgctaa gactattgat 780cggcagattc gggtatttgt ctctgttcct gggagttcta tggcacaaaa tgatgtacca 840gattcttttt acaagcttag tggtgaggag ataaggaatg aagcaaagat gaggagggaa 900aggttagaac aatctcgatt gctgatacca aagtcttaca aggagaaaca ggcattggct 960gctcgacaga agtataaaca agcagtcatt cgagttcagt ttccagatag aatgattctt1020cagggcatat tcctaccagg agaggccact agttcactgt atgagttcgt cacatctgct1080ctgaagcaat caggtttgga attcgaactt atctctccag ccatacctaa gccacgtgtg1140gtgccccatt ttccaaaccc gggagagcgg gcacgcacct tgcaagagga ggagctggtc1200ccatctgcgc tcctcaagtt cattcccaag gagactgatt ccatggtttt caccggtttg1260cttgatgagc ttctcatggc cagtgagccg cttcctgctg catcacaatg a 13112104
211436212PRT213甘蔗220
221MISC_FEATURE222(93)..(93)223Xaa可以是任何胺基酸4004Met Met Lys Asp Lys Met Lys Glu Phe Met Lys Lys Val Thr Ser Ser1 5 10 15Gly Ser Gly Thr Pro Ser Ser Phe Lys Gly Thr Ser His Val Leu Gly20 25 30Ser Gly Pro Ser Pro Ser Ser Ser His Pro Ala Ala Arg Ser Ser Asn35 40 45Pro Ser Pro Asn Leu Arg Pro Ala Pro Lys Arg Thr Ser Pro Pro Thr50 55 60Pro Pro Thr Leu Thr Thr Asp Leu Thr Ser Phe Thr Pro Leu Val Cys65 70 75 80Tyr Ser Ser Arg Arg Pro Asp Ala Asn Gly Thr Ala Xaa Ala Val Ala85 90 95Thr Val Ala Cys Pro Ser Cys Gly Asp Ala Phe Pro Ser Glu Leu Ala100 105 110Val Ser Glu His Leu Asp Gly Cys Leu Ala Ser Ala Gly Gly Ala Arg115 120 125Ala Arg Ala Ala Ala Tyr Leu Ala Ala Asp Pro Pro Pro Pro Ala Ala130 135 140Ser Val Glu Val Val Lys Arg Leu Leu Gly Asn Leu Leu Arg Glu Pro145 150 155 160Gly Asn Asp Lys Phe Arg Arg Val Arg Leu Gly Asn Pro Arg Ile Lys165 170 175Glu Ala Leu Ala Asp Arg Asp Gly Gly Val Glu Leu Leu Glu Ala Val180 185 190Gly Phe Thr Val Gly Asp Glu Gly Gly Glu Pro Phe Ala Val Met Asp195 200 205Glu Val Pro Ser Asp Pro Arg Leu Asn Gly Ile Arg Arg Ala Val Leu210 215 220Leu Leu Glu Gly Ala His Pro Ser Ala Pro Pro Val Lys Ala Glu Ala225 230 235 240Glu Ala Lys Glu Ser Cys Ser Asn Val Ser Asp Val Gln Glu Gly Ala245 250 255Lys Thr Ile Asp Arg Gln Ile Arg Val Phe Val Ser Val Pro Gly Ser
260 265 270Ser Met Ala Gln Asn Asp Val Pro Asp Ser Phe Tyr Lys Leu Ser Gly275 280 285Glu Glu Ile Arg Asn Glu Ala Lys Met Arg Arg Glu Arg Leu Glu Gln290 295 300Ser Arg Leu Leu Ile Pro Lys Ser Tyr Lys Glu Lys Gln Ala Leu Ala305 310 315 320Ala Arg Gln Lys Tyr Lys Gln Ala Val Ile Arg Val Gln Phe Pro Asp325 330 335Arg Met Ile Leu Gln Gly Ile Phe Leu Pro Gly Glu Ala Thr Ser Ser340 345 350Leu Tyr Glu Phe Val Thr Ser Ala Leu Lys Gln Ser Gly Leu Glu Phe355 360 365Glu Leu Ile Ser Pro Ala Ile Pro Lys Pro Arg Val Val Pro His Phe370 375 380Pro Asn Pro Gly Glu Arg Ala Arg Thr Leu Gln Glu Glu Glu Leu Val385 390 395 400Pro Ser Ala Leu Leu Lys Phe Ile Pro Lys Glu Thr Asp Ser Met Val405 410 415Phe Thr Gly Leu Leu Asp Glu Leu Leu Met Ala Ser Glu Pro Leu Pro420 425 430Ala Ala Ser Gln43521052113048212DNA213人工序列220
223包含GRUBX(1011-2390)以及與之可操作連接的谷醇溶蛋白啟動子(1-654)和T-Zein+T-Rubisco deltaG終止子(2615-2808和2852-3048)的表達盒4005cttctacatc ggcttaggtg tagcaacacg actttattat tattattatt attattatta 60ttattttaca aaaatataaa atagatcagt ccctcaccac aagtagagca agttggtgag120ttattgtaaa gttctacaaa gctaatttaa aagttattgc attaacttat ttcatattac180aaacaagagt gtcaatggaa caatgaaaac catatgacat actataattt tgtttttatt240attgaaatta tataattcaa agagaataaa tccacatagc cgtaaagttc tacatgtggt300gcattaccaa aatatatata gcttacaaaa catgacaagc ttagtttgaa aaattgcaat360ccttatcaca ttgacacata aagtgagtga tgagtcataa tattattttc tttgctaccc420atcatgtata tatgatagcc acaaagttac tttgatgatg atatcaaaga acatttttag480gtgcacctaa cagaatatcc aaataatatg actcacttag atcataatag agcatcaagt540aaaactaaca ctctaaagca accgatggga aagcatctat aaatagacaa gcacaatgaa600aatcctcatc atccttcacc acaattcaaa tattatagtt gaagcatagt agtaatttaa660atcaactagg gatatcacaa gtttgtacaa aaaagcaggc tggtaccggt ccggaattcc720cgggatatcg tcgacccacg cgtccgccaa tatcagattt ctttcatgaa ctccacttcc780
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權利要求
1.改善植物生長特性的方法，其包括增加植物中編碼GRUBX蛋白的核酸序列的表達，和/或包括增加植物中GRUBX蛋白的活性和/或水平，並可選地選擇具有改良的生長特性的植物。
2.權利要求1的方法，其中所述增加是通過導入遺傳修飾、優選地在編碼GRUBX蛋白的基因的基因座中導入遺傳修飾來實現的。
3.根據權利要求2的方法，其中所述遺傳修飾是通過定位誘變、同源重組、TILLING和T-DNA活化之一來實現的。
4.改善植物生長特性的方法，其包括向植物中導入和表達編碼GRUBX蛋白的分離核酸序列。
5.根據權利要求4的方法，其中所述編碼GRUBX蛋白的核酸在植物中過表達。
6.根據權利要求4或5的方法，其中所述核酸源自真核生物，優選源自植物。
7.根據權利要求6的方法，其中所述核酸源自雙子葉植物，優選源自茄科，更優選源自菸草(Nicotiana tabacum)。
8.根據權利要求6的方法，其中所述核酸源自單子葉植物，優選源自禾本科(Poaceae)，更優選源自稻(Oryza sativa)。
9.根據權利要求7的方法，其中所述核酸由SEQ ID NO1代表，或是其一部分，或是能與其雜交的序列，或編碼由SEQ ID NO2代表的GRUBX蛋白，或者其同系物、衍生物或活性片段。
10.根據權利要求4-9中任一項的方法，其中所述核酸序列和所述蛋白包括選自下述的變體(i)編碼GRUBX蛋白的核酸序列的可變剪接變體，或其中所述GRUBX蛋白由剪接變體編碼；(ii)編碼GRUBX蛋白的核酸序列的等位基因變體，或其中所述GRUBX蛋白由等位基因變體編碼；(iii)包含在人工染色體的至少一部分上的核酸序列，該人工染色體優選地還包含一個或多個相關基因家族成員；(iv)GRUBX編碼核酸的功能性部分；(v)能與GRUBX編碼核酸雜交的序列；(vi)GRUBX蛋白的同系物、衍生物和活性片段。
11.根據權利要求4-10中任一項的方法，其中所述編碼GRUBX蛋白的核酸的表達是由種子偏好的啟動子、優選谷醇溶蛋白啟動子驅動的。
12.根據權利要求1-11中任一項的方法，其中所述改良的生長特徵是增加的產量和/或改良的植物結構，每項都是相對於對應的野生型植物而言的。
13.根據權利要求1-12中任一項的方法，其中所述增加的產量是增加的種子產量。
14.根據權利要求1-13中任一項的方法，其中所述增加的產量和所述改良的植物結構包含下述的一項或多項(i)增加的種子生物量，(ii)增加的種子總數，(iii)增加的飽滿種子數，(iv)增加的種子大小，(v)增加的種子體積，(vi)提高的收穫指數，和(vii)增加的千粒重量，每項都是相對於對應的野生型植物而言的。
15.增加植物產量的方法，該方法包括增加植物中GRUBX編碼核酸的表達和/或增加植物中GRUBX蛋白的活性和/或水平。
16.生產具有改良的生長特性的轉基因植物的方法，該方法包括a.向植物或植物細胞中導入能與編碼GRUBX蛋白或者其同系物、衍生物或活性片段的核酸序列或其部分雜交的核酸序列；b.在能促進植物生長的條件下培養植物。
17.選擇具有改良的生長特性的植物的方法，該方法是基於選擇GRUBX編碼序列的優秀等位基因變體，所述等位基因能引起改良的植物生長特性。
18.可通過根據權利要求1-17中任一項的方法得到的植物，條件是所述GRUBX蛋白不是由GenBank登記號AX927140代表的核酸序列編碼。
19.分離的核酸序列，其包含(i)由SEQ ID NO6代表的核酸序列，或其互補鏈；(ii)編碼由SEQ ID NO7代表的胺基酸序列或者其同系物、衍生物或活性片段的核酸序列；(iii)能與上述(i)或(ii)的核酸序列(優選地，在嚴格條件下)雜交的核酸序列，該雜交序列優選地編碼具有GRUBX活性的蛋白；(iv)根據上述(i)至(iii)的核酸序列，其因遺傳密碼而是簡併性的；(v)核酸，它是根據(i)至(iv)的核酸序列的等位基因變體；(vi)核酸，它是根據(i)至(v)的核酸序列的可變剪接變體；(vii)核酸序列，它與(i)至(vi)定義的任意一個或多個序列具有75.00％，80.00％，85.00％，90.00％，95.00％，96.00％，97.00％，98.00％或99.00％序列一致性；(viii)根據上述(i)至(vii)中任一項的核酸序列的部分，該部分優選地編碼具有GRUBX活性的蛋白。
20.分離的蛋白，其包含選自下述的多肽之一的至少部分(i)如SEQ ID NO 4所述的多肽；(ii)如SEQ ID NO 7所述的多肽；(iii)一種多肽，其胺基酸序列與SEQ ID NO 4或7所述的胺基酸序列具有至少40.00％序列一致性，優選地50.00％、60.00％、70.00％序列一致性，更優選地80％或90％序列一致性，最優選地95.00％、96.00％、97.00％、98.00％或99.00％序列一致性；(iv)一種多肽，其至少包含UBX結構域、優選UBX結構域和PUG結構域，並可選地包含鋅指結構域；(v)(i)至(iv)中任一項定義的蛋白的同系物、衍生物、免疫活性和/或功能性片段，條件是所述蛋白序列不是由SEQ ID NO 2或者資料庫條目Q9ZU93，AAR01744，Q9D7L9，Q9BZV1，Q99PL6，ENSANGP00000020442，Q7SXA8，Q9V8K8，Q96IK9，ENSRNOP00000037228，或AAH07414代表的序列。
21.構建體，其包含(i)編碼GRUBX蛋白的核酸序列；(iv)一個或多個控制序列，其能調節(i)所述核酸序列在植物中的表達；以及可選地(ii)轉錄終止序列，條件是所述編碼GRUBX蛋白的核酸不是由GenBank登記號AX927140代表的核酸。
22.根據權利要求21的構建體，其中所述編碼GRUBX蛋白的核酸是編碼SEQ ID NO 2代表的蛋白或根據權利要求20中(i)至(v)中任一項的蛋白的核酸序列。
23.根據權利要求21或22的構建體，其中所述控制序列至少包含種子偏好的啟動子，優選谷醇溶蛋白啟動子。
24.構建體，其包含基本上類似於SEQ ID NO 5的表達盒。
25.轉基因植物或植物細胞，其特徵在於，所述植物或植物細胞中編碼GRUBX蛋白的核酸序列的表達增加和/或GRUBX蛋白的活性和/或水平增加。
26.根據權利要求25的轉基因植物或植物細胞，其具有改良的生長特性。
27.根據權利要求25或26的轉基因植物，其中所述植物是作物植物，包含大豆、向日葵、芸苔(canola)、苜蓿、油菜(rapeseed)或棉花，優選單子葉植物例如甘蔗，最優選穀類，例如稻、玉米、小麥、黍、大麥、黑麥、高粱或燕麥。
28.根據權利要求18、25、26或27中任一項的植物的植物細胞，植物部分，包括直接源自它們的可收穫部分和/或產物，以及繁殖體或後代。
29.編碼GRUBX蛋白的核酸序列、其部分或能與其雜交的核酸在改善植物的生長特性中的應用。
30.GRUBX蛋白、其同系物、衍生物和活性片段在改善植物的生長特性中的應用。
31.根據權利要求20的GRUBX蛋白在改善植物的生長特性中的應用。
32.包含GRUBX蛋白的組合物，其用於改善植物的生長特性。
33.包含編碼GRUBX蛋白的核酸的組合物，其用於改善植物的生長特性。
34.編碼GRUBX蛋白的核酸序列在育種程序中的應用。
全文摘要
本發明涉及通過調控植物中編碼GRUBX蛋白的核酸序列的表達和/或調控植物中GRUBX蛋白的活性和/或水平而改良植物的生長特性的方法。本發明還提供了新的GRUBX蛋白和編碼這樣的蛋白的核酸。本發明還涉及包含GRUBX編碼核酸的構建體，和具有改良的生長特性的轉基因植物，該植物具有編碼GRUBX蛋白的核酸的受調控表達。
文檔編號C07K14/415GK1914323SQ200480041328
公開日2007年2月14日 申請日期2004年12月17日 優先權日2003年12月17日
發明者V·弗朗卡德, V·米羅諾夫, A·I·桑莫利納羅 申請人:作物培植股份有限公司