轉基因陰溝腸桿菌GEI-tcdA1B1及其構建方法和用途的製作方法

2023-09-12 02:57:50 1

專利名稱：：轉基因陰溝腸桿菌GEI-tcdA1B1及其構建方法和用途的製作方法
技術領域：
：本發明屬於生物
技術領域：
，具體來說是涉及一種轉基因陰溝腸桿菌菌株、其構建方法及其用途。技術背景白蟻在昆蟲分類系統上屬於比較原始的等翅目(Isoptera)，是一類營群體生活的社會性昆蟲。其作為世界性的重要害蟲之一而對經濟產生的危害，已逐步被人類所重視。在我國其活動分布遍布28個省(自治區或地區)，特別是淮河以南地區，白蟻對堤壩、建築物、農作物和林木的危害尤為嚴重。但由於它的危害隱蔽，不易被人們及早發現，往往造成嚴重破壞，產生重大損失。我國曾於1985年調査統計，在24個地區因白蟻危害造成的直接經濟損失就達19億元人民幣；日本每年因白蟻危害造成的損失相當於其國內每年因火災造成的損失量；在美國，因臺灣乳白蟻(Copto^roes/o;7wora"^Shiraki,Isoptera:Rhinotermitidae)造成的直接損失和用於防治其危害的經費每年高達10億美元。白蟻的危害雖然引起了廣泛的關注，但白蟻群往往佔據非常大的區域和有數目眾多的家庭成員，並且通常很難找到包括生殖蟻的精確位置(特別是對地棲白蟻)，所以白蟻防治面臨巨大的挑戰(黃蔚蓉，安徽農業科學，2004，32:252-253)。目前，對白蟻的防治有物理性預防措施，化學措施和生物防治措施，儘管物理預防措施能形成有效的、較為長期的屏障，但是一旦發生白蟻侵入危害，由於白蟻巢區和種群數量大、採食範圍廣，通過有翅生殖蟻擴散或工蟻穿過未處理或處理不透的部位也可再次造成危害，使防治極為困難。而化學措施普遍採用持效殺蟲劑處理土壤來預防白蟻危害，其主要成份是氯丹和其它環戊二烯類，大量地使用殘效期長久的殺蟲劑溶液來阻止地下白蟻的侵害，對環境和非目標生物體造成極大的潛在危害。與化學防治相比，生物防治具有更好的環境接受性。如果成功地實行，可獲得對環境影響最小、經濟實用的持久防治效果。雖然傳統的生物防治措施已用於多種害蟲的防治，但由於捕食性天敵、擬寄生物和病原微生物自身的局限，如環境耐受範圍窄、其它生物之間的頡抗作用、活動範圍小、毒力低及白蟻的天然防衛行為，傳統的生物防治措施大多未能形成持久的、自身維持白蟻種群數量在經濟損失水平之下的控制因子(CullineyandGrace,5"//.五"tomo.ies.,2000,90:9-21)。就是其中最有前景的病原微生物(包括線蟲、病毒、細菌和真菌)作為生物防治機制的成功應用也受到很多問題的限制。例如，病原性微生物本身通常具有很小的或沒有流動性，蟻群對感染的白蟻個體的隔離行為也限制了它們在白蟻群體內的分布與擴散；排斥性或太快的白蟻死亡率將引起對接種源的規避行為，極大地限制了病原菌在蟻群中的傳播。而且，正與化學殺蟲劑一樣，病原微生物在整個種群中的傳播需要很多被接種的個體和大劑量的接種物，這對不容易接近的地棲白蟻而言是很難達到要求的(Lai，D.Z)/飢，t/m'vera/(yo///awa".,1977,140pp;Grace,C2Xf/KiVocee^>zg&f/m'vera/^o/他而仏，1995,166-167)。因此，要達到長久防治白蟻的目的必須探索新的途徑，在方法上有所突破。眾所周知白蟻腸腔中具有數量眾多的腸道微生物群(如大量的鞭毛蟲和細菌)，並且二者存在著互惠共生關係。一方面這些微生物將白蟻取食的食物轉化為可利用的營養，同時也可利用白蟻排洩的廢物，是白蟻必不可少的"生活夥伴"；另一方面，這些微生物也有特異的生存需求和對某些物種的高度特異性，在環境中或非目標生物中存活率低。目前，有關利用白蟻腸道共生微生物來防治白蟻的報導較少，但隨著分子生物學和基因重組技術的發展，殺蟲蛋白基因的分離、重組蛋白的功能鑑定，轉基因抗蟲作物及殺蟲蛋白作用機制的研究也促進了這一方面工作的進展。2005年，Husseneder等在臺灣乳白蟻體內用重組大腸桿菌表達了綠色螢光蛋白(GFP)基因，儘管重組菌很快被白蟻取食進入後腸，但由於宿主的抗性和免疫反應重組菌在白蟻腸道存活了不到一周，所以利用外源微生物在白蟻體內表達外源基因存在能否適應白蟻腸道的生存環境和選擇壓力的問題(HussenederWa/.，CwArAfcroWo/.，2005，50:119-123)。接著Husseneder等就選用了白蟻腸道共生菌——陰溝腸桿菌(五"teratocterc/o化ae)在白蟻體內來表達綠色螢光蛋白基因，並估定了陰溝腸桿菌攜帶外源基因在白蟻群體中傳送、表達和傳播的效率，結果顯示重組陰溝腸桿菌在宿主中繁殖存活了三個月，並且工程菌可在群體成員間傳播(HussenederandGrace,Jpp/M/croWo/A'ofec/wo/.,2005，68:360—367)。因為陰溝腸桿菌容易被分離、培養和轉移外源基因，所以在病蟲害防治中有廣泛的應用。Watanabe等就曾經用表達冰核基因的陰溝腸桿菌成功地降低了桑樹螟蛾幼蟲的過冷卻點(WatanabeWa/.，J々p/MZcroWo/.，2000,88:90-97)。張新建等也用表達冰核基因的陰溝腸桿菌成功地降低了玉米螟幼蟲的過冷卻點(張新建等，中國農業科學.2004,37:227-232)。所以選擇陰溝腸桿菌這樣的白蟻腸道共生微生物作為載體在白蟻種群中傳送和表達殺蟲基因將會是白蟻防治中的一種新方法。通過其餵食機制，殺蟲毒素可作為持續的資源在群體中保持，能逐漸消除白蟻種群，並能避免對環境的危害。在有關殺蟲基因的研究方面，無疑從昆蟲病原線蟲共生菌中克隆新的殺蟲毒素基因是近幾年的熱點。目前已從昆蟲病原線蟲共生菌中克隆出與口服活性有關的多個毒素基因，1998年，Bowen首次報導在發光桿菌屬(屍totor/jaMus/wm'"esce"s)W14中存在4個編碼昆蟲毒素蛋白複合體的基因簇(Bowenefa/，々少/.五謂'ro".M/croWo/.，1998，64:3029-3035)，使昆蟲病原線蟲共生細菌殺蟲毒素蛋白基因成為微生物殺蟲蛋白基因家族中的一員。Morgan等從致病桿菌屬(^eTO^Wrf^)H31和173菌株中分離到高活性殺蟲蛋白，對歐洲粉蝶(屍/en;s6ray^cae)、小菜蛾(7VM/e〃axj//oy/e〃fl)、葉甲(/V;"etfowcoc力/ear/ae)有很高的致死率(Morganetal"^p/￡>jWrowM'croto/"2001,67:2062-2069)。Waterfield等從屍./國'腦固sW14菌株中發現了一個127816bp的致病島，包含9個獨立的fc毒素基因，接著構建了fca、fc6、fcc和to/基因大腸桿菌表達系統，對fc基因表達蛋白功能分析結果認為toi4、fcc/S、tocC是對菸草天蛾幼蟲具有殺蟲活性的主效基因(Waterfieldetal.,々^/￡"v/to"M/ctoWo/.，2001,67:5017-5024)。Morgan等分離到的X"ewatop/7a殺蟲蛋白基因簇由xp"/、x/7f57、x;7fC7禾口c/"2組成(Morganetal.，Jp;/五"Wro"^MicroWci/.,2001，67:2062-2069)。2003年屍./,."證raTT01菌株基因組全序列測序完成，序列分析表明屍./w冊'"esce"s為已知基因組序列的細菌中含有殺蟲毒素基因最多的一種細菌，這些毒素基因對多種害蟲具有毒殺和抑制生長活性的作用(Ericetal，Ato及'o/ec/ww/.，2003,21:1307-1313)。這些研究表明昆蟲病原線蟲共生菌所產生的殺蟲毒素蛋白可作為新的殺蟲毒素蛋白基因源，具有很好的商業潛力和應用前景，並給白蟻防治帶來了新的希望。但是，目前仍未發現利用轉殺蟲毒素基因的陰溝腸桿菌防治白蟻的報導。
發明內容本發明的目的是提出一種可引入並作用於臺灣乳白蟻種群，對白蟻具有口服毒性的轉基因工程菌一轉基因陰溝腸桿菌(五"terotocto"c/oacae)GEI-tcdAlBl菌株，及其構建方法和用途。這是一種採用基因工程技術，構建表達外源殺蟲基因的白蟻腸腔共生細菌的轉基因工程菌，將這種表達外源基因的白蟻共生細菌作為誘餌餵養白蟻，重組細菌在白蟻腸腔中繁殖，可產生致死白蟻的殺蟲蛋白。這將是可持續控制白蟻的安全有效的方法。本發明所提出的轉基因陰溝腸桿菌(Ewtero6ac^c/oacae)GEI-tcdAlBl菌株，是從白蟻的腸道主要細菌-陰溝腸桿菌入手，利用Tn5轉座子將從昆蟲病原線蟲共生細菌屍/0^^^^^/";/"^"^丁丁01菌株中克隆的兩個殺蟲毒素基因fc^757基因(SEQIDNO.l)插入到陰溝腸桿菌的基因組DNA中，構建而成的對白蟻具有口服毒性的轉基因工程菌。該菌株於2007年12月24日保存於中國典型培養物保藏中心(CCTCC)，編號為CCTCCM207208，中國典型培養物保藏中心的地址為中國武漢市武漢大學。研究表明，白蟻個體攝取轉基因工程菌後，通過其餵食機制，殺蟲毒素可作為持續的資源在群體中轉移，能逐漸消除白蟻種群，並能避免對環境的危害，進而實現對這種入侵害蟲的長期控制。本發明構建的轉基因陰溝腸桿菌(EWeTO&ac^c/oacae)命名為陰溝腸桿菌GEI-tcdAlBl菌株。該菌株是利用Tn5轉座子將昆蟲病源線蟲共生菌兩個殺蟲毒素基因插入到陰溝腸桿菌的基因組DNA中，用於表達殺蟲毒素蛋白的工程菌。本發明所述的轉基因陰溝腸桿菌GEI-tcdAlBl菌株的構建方法，包括如下步驟1)從昆蟲病原線蟲共生細菌戶/iwm'"esce"sTT01菌株中克隆兩個殺蟲毒素基因fcci4/3/。2)利用微轉座子載體pMini-Tn5，將toi4M/基因置入轉座單位裡，構建"自殺性"工程質粒pMini-Tn5-tcdAlBl。3)將構建的工程質粒pMini-Tn5-tcdAlBl導入陰溝腸桿菌中。4)測定to^757基因整合到腸道細菌陰溝腸桿菌基因組DNA上，得到本轉基因陰溝腸桿菌GEI-tcdAlBl。本發明所構建的轉基因陰溝腸桿菌GEI-tcdAlBl菌株，可用於以下測定1)免疫印跡測定fcoL4/5/基因在轉基因陰溝腸桿菌中的表達。2)轉基因陰溝腸桿菌的生物活性測定。3)測定轉基因陰溝腸桿菌在蟻群中的轉移。利用本發明構建的轉基因陰溝腸桿菌培養物混入白蟻飼料(一般為濾紙)餵養白蟻，結果顯示20天後，處理白蟻的校正死亡率約為54%。證明轉基因陰溝腸桿菌對白蟻具有口服毒性作用。因此，本發明所述的轉基因陰溝腸桿菌GEI-tcdAlBl菌株可作為製備殺滅入侵白蟻誘餌藥劑的應用。圖1顯示從載體pUC19中克隆到的tocZ啟動子片段，其中的限制性酶切位點J^al和5^n被用在與載體pET32a(+)的連接中，WWI位點被用在與載體pMini-Tn5的連接中。圖2a是toi4757基因片段在質粒pET32a(+)-tcdAlBl中的連接方式，所標註的限制性酶切位點用於以後的亞克隆中，本圖標註了對應各片段的大小；b是基因片段在GEI-tcdAlBl染色體中的連接方式。圖3顯示SDS-PAGE分析GEI-tcdAlBl中重組TcdAlBl蛋白的表達。條帶M,TakaRa窄範圍蛋白分子量標準(44.3-200kDa);1，GEI-tcdAlBl;2，￡.c/oacae。圖4顯示SDS-PAGE分析屍.Zwm力escemTT01中TcdAlBl蛋白的表達.條帶M,TakaRa窄範圍蛋白分子量標準(44.3-200kDa);/w/m'"esce"sTT01。圖5顯示Westernblot分析GEI-tcdAlBl和屍./w附/"esce"sTT01中TcdAlBl蛋白的表達.條帶M,Hou-Bio預染蛋白分子量標準(2-200kDa);1,GEI-tcdAlBl;2,屍./wTO'"&scemTT01。圖6顯示工程菌GEI-tcdAlBl對白蟻的致死率測定，測定時間為20天，每個處理三個重複，標註標準誤差和方差分析，同項目中不同字母者表示在0.05水平上差異顯著，字母後的數字分別代表三個不同處理。圖7顯示工程菌GEI-tcdAlB112小時內在蟻群中的傳播，柱狀圖顯示在每個時間段受體白蟻帶菌的百分率，每個處理三個重複，標註標準誤差。圖8顯示6天內工程菌GEI-tcdAlBl在不同比例蟻群(l:l，1:10,l:50)中的傳播，柱狀圖顯示受體白蟻帶菌的百分率，每個處理三個重複，標註標準誤差和方差分析，同項目中不同字母者表示在0.05水平上差異顯著，字母後的數字分別代表三個不同處理。具體實施方式以下實施例是對本發明的進一步說明，不是對本發明的限制。實施例一殺蟲毒素基因的克隆及在大腸桿菌中的表達提取i>/柳!V^cemTT01的基因組，用《p"I和5aw//1酶切基因組，回收大約14kbp左右的基因片段，這個片段包括完整的to^7和大部分的fcW7，用相同的酶酶切載體pUC19,進行體外連接並轉化大腸桿菌DH5a感受態細胞。以菌落PCR方法對長出的轉化子進行快速篩選，PCR引物為Pl(見表l)。挑取經初步鑑定的大腸桿菌轉化子，接種到6mLLB抗性液體培養基中少量增殖，使用TIANGEN質粒小提試劑盒提取質粒。將上一步所提取質粒進行/:p"I和萬aw/n雙酶切，回收約14kbp的片段，與pET32a(+)進行體外連接並轉化大腸桿菌Eco/ZBL21(DE3)感受態細胞，以引物P1進行PCR鑑定，陽性克隆子命名為pET32a(+)-tcdAlBl-l。用Easy-A高保真酶從TT01基因組中擴增1的上遊片段約638bp，擴增所用引物為P3(見表1)。Z6aI禾BK/7"I雙酶切PCR產物和質粒pET32a(+)-tcdAlBl-l，回收相應片段並進行體外連接，轉化大腸桿菌五.co/z'BL21(DE3)感受態細胞以引物P1進行PCR鑑定，陽性克隆子命名為pET32a(+)-tcdAlBl-2。表1.實驗中所用到的引物tableseeoriginaldocumentpage6注劃線標註的分別是限制性酶切位點印AI，IandJKwI.。為了殺蟲毒素基因能夠在陰溝腸桿菌中獲得更好的表達，本發明從載體pUC19中擴增出fccZ啟動子片段(見圖i)，引物為P2(見表i)，上遊引物包括sp/ji和油n酶切位點，下遊引物包括^zwi。和JHwI酶切PCR產物和質粒pET32a(+)-tcdAlBl-2並進行體外連接，轉化大腸桿菌￡.co/ZBL21(DE3)感受態細胞，用引物P1進行PCR鑑定，陽性克隆子命名為pET32a(+)-tcdAlBl(見圖2a)。取活化後的重組大腸桿菌和對照的培養物，按3。/。比例接種至新鮮LB(Cart培養基中，繼續培養至OD咖為0.40.6，加入IPTG至終濃度為1mmol/L，37°C,200r/min誘導培養8h。取0.2mL誘導後發酵液至1.5mL潔淨離心管中，離心得菌體，加入50nL雙蒸水與50nL2XSDS-PAGE上樣緩衝液等體積混合，沸水浴10min,進行SDS-PAGE電泳分析兩個毒素基因在大腸桿菌中的表達。質粒pET32a(+)-tcdAlBl於大腸桿菌中的表達產物經純化後作為抗原用於製備抗體。實施例二利用微轉座子載體pMini-Tn5，構建"自殺性"工程質粒pMini-Tn5-tcdAlBl,載體pMini-Tn5是具有廣泛宿主接合轉移特性(含有wo6片段，可被轉移基因fra產物識別)和Tn5轉座作用(含有轉座子Tn5的f"p基因和轉座必需的末端序列)的自殺性質粒(含有R6K的複製起點，在沒有^V基因存在的細菌中不能複製)，而且其Tn5轉座酶位於兩個末端序列的外側，當發生轉座以後，因為缺少轉座酶基因而不會再次轉座，避免了轉基因工程菌對生態環境的潛在威脅。此外，該載體上Tn5轉座子兩個末端序列之間插入卡那黴素抗性基因，有利於重組克隆的篩選。建立轉座載體pMini-Tn5的Won酶切反應體系，並對酶切後的載體片段進行脫磷處理。採用TIANGEN公司生產的瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒回收載體pMini-Tn5約6.8kb的片段和質粒pET32a(+)-tcdAlBl中約14kb的fcAWS/插入片段。利用TaKaRa的CIAP對載體回收片段進行脫磷處理。將目的片段與轉座載體進行體外連接並將連接產物(具有Km抗性標記)導入co//S17-1(A;^)感受態細胞中。利用PCR和Wwl酶切鑑定陽性克隆，用其作為下一步接合實驗的供體菌。載體pMini-Tn5經Atol酶切後，載體DNA5'端帶有磷酸基團，如用此載體直接轉化大腸桿菌，其自身環化機率非常高，影響連接、轉化效率。因此使用鹼性磷酸酶(CIAP)對其進行脫磷處理。建立以下體系pMini-Tn5酶切體系44pL10xAlkalinePhosphataseBuffer5CIAP(1030U爾L)_1pLTotalvolume50|aL37'C水浴30分鐘後，採用TIANGEN瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒回收載體片段。實施例三將構建的工程質粒pMini-Tn5-tcdAlBl導入陰溝腸桿菌中。pMini-Tn5含有廣宿主範圍IncP質粒RP4的mo6基因。大腸桿菌S17-l(義p的染色體上整合有RP4質粒的加基因。因此，當pMini-Tn5轉化至大腸桿菌Sn-101一)B寸，後者即能提供一反式作用元件與前者的mo6區相作用，促使pMini-Tn5質粒能夠被接合轉移進入其他革蘭陰性菌，但是發生轉移的只是載體部分，大腸桿菌S17-1(A;7的染色體上的RP4質粒整合區並不被轉移至受體菌中。1)供體菌的培養將重組^.7//817-1於LB(KmO平板劃線，在37'C下培養過夜，挑單菌落接入10mLLB(KmO培養液中，在37'C下培養過夜，然後以l:10的接種量接入帶同樣抗菌素的新鮮培養液，於37'C，200r/min培養12小時(OD,值約為1.0)。2)受體菌的培養將陰溝腸桿菌(具有Cm抗性)於LB(CmO平板劃線，在28'C下培養過夜，挑單菌落接入10mLLB(Crf)培養液中，在28'C下培養過夜，然後以l:IO的接種量接入帶同樣抗菌素的新鮮培養液，於28'C，200r/min培養12小時(OD,值約為1.0)。3)供體菌和受體菌的接合(1)將對數期供體菌和受體菌在1000r/min離心10分鐘，以無菌10mmol/LMgS04(或無菌0.9%NaCl)清洗菌體一次以除去抗菌素，1000r/min再次離心10分鐘。(2)重懸菌體於無菌10mmol/LMgSO4中(或無菌0,9%NaCl)，並調整菌濃度(OD600=1.0)。(3)將供體菌和受體菌分別以1:5，2:4，3:3，4:2，5:1的比例混合，3000r/min離心5分鐘。(4)留100nL上清重懸菌體後濃縮在孔徑為0.2nm的硝酸纖維素濾膜(高壓滅菌)上。(5)濾膜置於LB培養基平板表面，28'C培養24小時，可見濾膜上長出一層菌膜。(6)用約10mLMgSO4(10mmol/L)將菌膜洗下後稀釋成不同濃度(可x10,x跳xioOO，x腦00),在LB平板(含Km和Cm)上塗布，28'C培養48小時(或根據菌株的生長情況確定)，挑取具有Km、Cm雙抗性的接合子。4)陰溝腸桿菌中的質粒分離鑑定pMini-Tn5質粒的自殺性來源於其有缺陷的R6K複製子，而此複製子必須在有義p/r基因編碼的兀蛋白的條件下才能行使其複製功能，也就是該載體只有在轉導有含基因的X原噬菌體的宿主菌中才能進行複製。由於陰溝腸桿菌中沒有p!V基因存在，因此所構建的pMini-Tn5-tcdAlBl質粒在陰溝腸桿菌中也不能自我複製。從Km和Cm雙抗LB平板上隨機挑取長出的接合子，利用質粒分離試劑盒從接合子中分離質粒，鑑定pMini-Tn5-tcdAlBl是否存在。如果未發現pMini-Tn5-tcdAlBl質粒存在，說明接合子所表現的抗性是由於轉座的作用將抗性基因整合的結果。實施例四測定fcflL4/S7基因整合到腸道細菌陰溝腸桿菌基因組DNA上。pMini-Tn5-tcdAlBl重組質粒在無選擇壓力下會自然脫落並將fc^/S/基因整合到宿主染色體DNA上。通過提取接合子DNA，並進行PCR擴增(見下)，若能擴出目的基因片段則可再次驗證tcdAlBl基因是否已整合到陰溝腸桿菌的基因組中。建立以下反應體系I體系II體系ddH20ddH2019.8|_iL10XPCRbuffer10XPCRbuffer2.5dNTPMix(10mmol/L)dNTPMix(10mmol/L)0.5P4-for(10pmol/L)PI-for(10nmol/L)0.5&P卜rev(10|xmol/L)PI-rev(10nmol/L)0.5DNAtemplateDNAtemplate1TaqDNAPolymeraseTaqDNAPolymerase0.2TotalvolumeTotelvolume25I體系以pMini-Tn5載體上Km抗性基因的特異性引物P4-for為反應的上遊引物，toW7S/基因的特異性引物Pl-rev為該反應的下遊引物。II體系以目的基因toi4^W的特異性引物P1為反應的上下遊引物。進行如下PCR程序formulaseeoriginaldocumentpage8以1%瓊脂糖凝膠電泳檢測擴增結果，在合適大小處出現特異性擴增條帶的樣品即為陽性克隆。電泳結果顯示，fc^M/基因已插入陰溝腸桿菌染色體DNA中，且位於Km抗性基因下遊，方向一致。Southernblot進一步鑑定目的基因整合到陰溝腸桿菌的染色體上，以引物P4擴增Tn5轉座子中的卡那抗性基因作為Southernblot的探針。提取工程菌RNA，並進行RT-PCR反應，以檢測fcoWIW在工程菌中的轉錄情況。RT-PCR結果顯示說明fcdL4757基因在工程菌中實現了轉錄。fcoL4M/基因傳代穩定性測定按照如下方法進行。挑取經鑑定正確的接合子接種5mLLB(含Km和Cm)，28°C，200r/min搖培36小時，按3%接種量繼代培養(培養液中不再添加抗生素)，每12小時轉接l次，在不添加抗生素的LB平板上劃線，培養24小時後隨機挑取50個菌斑複印到LB(含Km和Cm)平板上，統計長出菌落的數目。在無抗性平板上連續傳代15次，如果菌株可在抗性平板上繼續生長，說明轉座子在受體菌的染色體上是穩定傳代的。將重組菌在無抗性的LB(不含抗生素)中連續轉接培養15次後仍能在Km和Cm雙抗LB平板上生長。表明/^抗性基因和to^757基因己整合到陰溝腸桿菌的基因組，並具有良好的穩定性。實施例五TcdAlBl蛋白抗血清的製備及ELISA測定1)蛋白純化本發明使用Novagen的BugBuster蛋白抽提試劑、Benzonase及rLysozyme對大腸桿菌BL21(DE3)/pET32a(+)-tcdAlBl的蛋白進行抽提，用Ni-NTAHisbind純化試劑盒純化蛋白。參照郭堯君編著的《蛋白質電泳技術》提取i5/wm/"esce"sTT01的殺蟲毒素蛋白。2)抗血清的製備以無菌PBS緩衝液溶解抗原，使總蛋白的濃度為2mg/mL，將弗氏完全佐劑與抗原溶液以1:1比例混合，在乾淨無菌的研缽內研磨，直至形成穩定的油包水型乳劑(一小滴乳劑在水面上不擴散)。免疫前，耳緣靜脈採血約2mL。置37。C1h，4。C靜置過夜使血清析出，離心(2000r/min，4°C，10min)，吸取上清，分裝後-8(TC保存。用弗氏完全佐劑乳化的抗原溶液，在兔背部、大腿處進行皮內、肌肉多點注射。皮內注射每處約O.lmL，共注射20-30處；肌肉注射每點1mL，兩點注射。注射完畢，輕輕按摩注射部位以幫助吸收，注射位置出現白色小皮丘。一周後，用弗氏不完全佐劑乳化的抗原進行加強免疫，過程同初次免疫。每隔一周，以PBS溶解的抗原(總蛋白濃度為2mg/mL)加強免疫一次。免疫4次後，間接ELISA法測定抗血清效價上升情況。血清中抗體的效價上升且達到穩定值後，加強免疫一次，一星期後採血獲得大量抗血清；3)ELISA測定原理將抗原吸附在固相載體表面，加入抗血清，抗體和抗原在載體表面形成抗原-抗體複合物，洗去未結合抗體，然後加入辣根過氧化物酶標記的二抗(抗體的抗體)，二抗與抗體結合，洗去未結合二抗，加底物顯色劑顯色，在一定波長下測定OD值，根據OD值判斷血清中抗體的產生情況。步驟如下以包被液(碳酸鹽緩衝液)包被抗原溶液，使抗原終濃度為2.5pg/mL;在酶聯板的每孔中加入lOOpL抗原包被液，處理及對照包括抗原包被液+—抗+二抗和抗原包被液+二抗，輕輕振動平板使抗原分布均勻，將包被的微量滴定板用塑料保鮮膜封好，37'C潮溼孵育60min，再置4'C過夜；加有抗原溶液的微量滴定板封好後於4'C可保存數月。次日，在洗板機上用PBST洗滌三次；每孔加入150|aL~200nL封閉液，37。C潮溼孵育60min;倒掉封閉液，用PBST洗滌三次，最後每塊滴定板用一大紙巾包裹，孔口朝下，在幾張紙巾上輕輕拍打，棄去殘餘的液體；用稀釋液將抗血清做i:20、i:40、i:80、i:160稀釋，取ioojxL分別加入到對應包被孔中，微量滴定板用塑料保鮮膜封好，37'C潮溼孵育60min;洗板機上用PBST洗滌三次，最後一次洗滌後，如步驟5所述棄去殘餘液體；每孔中加入100nL辣根過氧化物酶標記的羊抗兔IgG二抗稀釋液(1:10000稀釋)，37'C潮溼孵育60min，洗滌三次；混合TMB底物溶液A液與B液，每孔加入50|iL，37'C顯色15~30min;每孔中加入502mol/L&804終止反應；酶標儀上測定OD450值。實施例六SDS-PAGE和Westernblot印記分析基因工程菌中毒性蛋白的表達1)SDS-PAGE取活化後的P/"/m'"^ceraTT01的培養物按3%比例接種至新鮮LB培養基中，基因工程菌以及對照的培養物，按3。/。比例接種至新鮮LB(Kmr和Cm。培養基中，28°C,200r/min培養24h。取0.2mL發酵液至1.5mL潔淨離心管中，離心得菌體，超聲破碎後與2XSDS-PAGE上樣緩衝液等體積混合,沸水浴10min，進行SDS-PAGE電泳分析，圖3和圖4結果證明兩個毒素基因的表達。2)Westernblot印記準備足夠的轉印緩衝液，用於填充轉印槽及平衡凝膠、PVDF膜和濾紙；？/訓/"esmwTT01和工程菌的培養物SDS-PAGE蛋白電泳後，從玻璃板上卸下凝膠，小心剔去濃縮膠部分，同時切下分離膠的左上角作為方向標記；剪下與膠等大小的PVDF膜1張及Whatman3mm濾紙片6張；將凝膠浸於轉印緩衝液中平衡30min，濾紙至少平衡30s;將膜浸於甲醇中活化至少15s，膜將由不透明變為半透明狀，小心將膜浸於雙蒸水中2min，然後在轉印緩衝液中至少平衡5min;從負極開始依次放入3張濾紙、膠、膜、另3張濾紙，注意不要有氣泡；將夾板移入預先裝有轉印緩衝液的轉印槽中，補加緩衝液至完全覆蓋夾板；打開製冷系統，連接電源，恆流轉膜250mA，4h;轉膜完畢後，將膜取出後完全浸泡於甲醇中5min;將膜浸入封閉液中4'C封閉過夜；棄封閉液，TBS洗膜4次，每次10min;以稀釋液稀釋一抗至適當的濃度(按i:5000~i:ioooo比例)，加入一抗，孵育2h,室溫緩搖；陰性對照以i^bsa取代一抗，其他步驟與實驗組相同；棄一抗，TBS洗膜4次，每次10min;加入適量二抗稀釋液(1:30000比例稀釋)，室溫緩搖lh;棄二抗，TBS洗膜4次，每次10min;加入適量底物顯色液，密切觀察顯色過程，並在較淺本底且達到適當顯色強度時流水終止顯色。圖5結果證明兩個毒素基因的表達。實施例七工程菌對臺灣乳白蟻的口服毒性測定將轉基因陰溝腸桿菌挑單菌落接入lOmLLB培養液中，在28'C下培養過夜，然後以500nL工程菌菌液浸溼濾紙，加入室內飼養的白蟻種群中。以未轉入fc^/5J基因的陰溝腸桿菌和雙蒸水作為對照。每個處理設三個重複，每個重複100頭白蟻。在28'C下觀察20天，每天記錄死亡的個體數目並清出死亡個體留待後續的實驗。20天後分析白蟻的死亡率，以校正死亡率來估計工程菌對臺灣乳白蟻的口服毒性。圖6結果證明，和對照相比轉基因陰溝腸桿菌對白蟻具有明顯的口服毒性作用。實施例八工程菌在白蟻群中的轉移取臺灣乳白蟻工蟻700頭(作為以下實驗的供體白蟻)放入浸有1%蘇丹紅7B的濾紙中28t:條件下飼養一周，染料確保不影響工程菌在蟻群中的攝取、傳送和定殖。被染色供體工蟻於加入50(HiL工程菌菌液的濾紙中飼菌2天，然後轉移到加入500nL無菌水的濾紙中。取樣5頭白蟻經70%乙醇表面消毒10min，滅菌ddH20衝洗3次；用無菌鑷子將死亡白蟻腹部剖開，用無菌環取腸道物，ddH20稀釋不同倍數後在LB平板(添加50ng/mLKm和50ng/mLCm)上塗布；待長出菌落後通過菌落形態及目的基因PCR檢測來鑑定工程菌，測定工程菌在蟲體腸道的存在。受體工蟻700頭以浸ddH2O的濾紙同條件飼養。供體工蟻和受體工蟻各50頭放於一個平板中混合飼養，12小時內每隔2小時從中取5頭受體工蟻按照上述方法進行體表消毒、破腹稀釋內容物劃板，測定工程菌在蟲體腸道的存在，記錄帶菌受體工蟻的數量，以觀察工程菌在工蟻間的轉移，實驗設三個重複，記錄供體工蟻和受體工蟻的死亡數量。圖7結果顯示12個小時後工程菌的轉移效率能達到70%以上。供體工蟻和受體工蟻以不同比例(1:1、l:10禾ni:50)(每個比例各3個重複)混合飼養6天，每天從中取5頭供體工蟻和5頭受體工蟻按照上述方法進行體表消毒、破腹稀釋內容物劃板，測定工程菌在蟲體腸道的存在，記錄帶菌受體工蟻的數量，以測定供體工蟻和受體工蟻的不同比例對工程菌轉移的影響。每天記錄供體工蟻和受體工蟻的死亡數量。圖8結果顯示前兩個比例中5天後工程菌的轉移效率達到90%以上，並且在較低的比例下工程菌也可以在蟻群中轉移。序列表toi4/B/基因核苷酸序列(SEQIDNO.l)〈110〉廣東省昆蟲研究所〈120〉轉基因陰溝腸桿菌GEI-tcdAlBl及其構建方法和用途112074DNA<213〉_P/iotor/ja6c/i/w加!'"esce"sTTOl(Symbioticbacteriaofentomopathogenicnematodes)〈220〉CDS(14)…(12074)1aatatgaattcgcctgtaaaagagatacctgatgtattaaa犯acc犯tg60tggttttaattgCCtg3C3gcagctcttttaacgaatttcaccaacaagt120atctgctcacctctcttggtCCg犯gC3C3cgacttatatcatgatgcccaacaggccca180cggctatEitg犯gCCCgtElttcttaagcgcgcg犯tcctc240tgccgtacatcttgccatcatcgcccctaatgtcgaactgataggctataELceigccaatt300togcggt聊gccagtcaatatgtcgcaccgggtaccgtttcctccatgttctcccccgc360cgcttatttgactgagcttttcgcaatttacacgccagcaactccgttta420ttatctggatacccgccgccC3g3tctC犯atcaatggcgctcagccaacaaaatstgga480taccgaactttccacgctctcgttatccaatgagctattgttggaaagtatt3a犯ctga540gtct犯gctgctaaagtgatggaaatgctctccactttccgtccttccgg600cgcgacgccttatcacgatgcttatgaa犯tgtgcgtg犯gttatccagctacaagatcc660tgggcttgagCSLtCELCCggCaaUgccgggCt￡L￡L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