金離子檢測及吸附系統及其宿主菌、金離子回收方法與流程
2023-09-11 08:22:15 3
本發明屬於基因工程技術領域，具體涉及一種金離子檢測及吸附系統及其宿主菌、金離子回收方法。
背景技術：
金是人類較早發現和利用的貴金屬，由於其資源稀少及特有的理化性質，自古以來被視為五金之首，有「金屬之王」的稱號。金是重金屬中少有的化學、物理、電子性能優異的金屬，具有較高的穩定性，它的應用領域非常廣泛。由於金具備非常穩定的理化性質，如抗腐蝕性、導電性、導熱性和穩定性，使它能夠廣泛用到許多現代高新技術當中去，金離子在免疫系統能夠作為白細胞等免疫細胞的抑制劑。此外，金在生物學及醫藥學領域同樣扮演重要的作用，如細菌抗性及抗癌藥物研發等。
當今社會重金屬對土壤、水、環境的汙染問題越來越受到重視。重金屬金的礦產資源被開發的同時，有一部分進入環境中，然後通過地大氣、地表水、地下水和生物鏈直至大氣圈等傳播途徑，對人民的生產生活以及生態系統產生汙染、破壞乃至威脅到人們的生存環境及生命健康。此外，在不合理的開採和黃金的冶煉及二次加工等生產過程中產生一些副產物，這些問題已經嚴重影響到黃金產業的發展。眾所周知，黃金的含量是十分有限的，屬於稀有的貴金屬資源，如果我們能夠合理地開發金礦產資源，減少資源的浪費，可以很大程度上提高金礦產資源的有效利用率。所以，能夠對環境中的金離子的檢測，以及能夠合理的回收環境中的金離子十分重要。隨著金應用範圍的不斷擴大，尤其是金在食品安全方面以及醫藥健康的使用，從而致使許多金離子通過食物鏈的富集作用進入到動植物體內，能使蛋白質變性引起環境以及人的健康危害。由於金離子在環境中不能被分解，還能夠在水中的其他的有毒物質結合生成毒性更大的產物，這些有毒產物通過動植物吸收，對消化系統、免疫系統造成嚴重破壞。金離子還能夠在人體內與各種酶發生的結合形成複合物，使酶本身失去活性，進而使人的身體機能遭到破壞，危害人體的健康，嚴重時甚至威脅生命。特別三價金離子能夠與生物體內發生作用，導致生物體中毒，影響生物體的健康。所以重金屬金離子的檢測和回收逐漸為社會所關注，尋找準確、靈敏、快速的金檢測方法在當今科學界具有非常重要的意義，如何檢測和回收環境中的金離子成為當今時代的熱點問題。
現有的重金屬離子回收方法主要是化學方法，通過加入化學試劑與重金屬離子形成沉澱或者懸浮達到回收重金屬的目的。但是化學方法有三個缺點：第一是化學方法有可能由於加入的化學試劑的量不合適而造成二次汙染；第二是化學方法選擇性不夠高，尤其是處理性質極相近的各種重金屬效果不好，即使回收得到了一定的目的金屬，純度也不高，還需要進一步處理；第三是化學方法回收工業廢水中的重金屬，所產生汙水對於環境不友好，沉澱劑等化學試劑可能對於自然環境造成更大的破壞。因此，現有的方法很難實現對工業廢水中金離子的高效選擇性檢測及富集和回收。
技術實現要素：
本發明的目的在於克服現有技術的上述不足，提供一種金離子檢測及吸附系統及其宿主菌、金離子回收方法，旨在解決現有金離子回收純度低、效果不理想，以及汙染環境的技術問題。
為實現上述發明目的，本發明採用的技術方案如下：
一方面，本發明提供一種金離子檢測及吸附系統，包括檢測單元和與所述檢測單元連接的吸附單元，所述檢測單元包括螢光蛋白dna序列，且所述螢光蛋白dna序列與第一啟動子連接；所述吸附單元包括互相連接的大腸桿菌外膜蛋白ompadna序列和金離子結合蛋白golbdna序列，且所述大腸桿菌外膜蛋白ompadna序列與第二啟動子連接；所述檢測單元位於所述吸附單元的上遊。
另一方面，本發明提供一種金離子檢測及吸附蛋白表面展示系統，包括由上述金離子檢測及吸附系統表達的螢光蛋白、大腸桿菌外膜蛋白ompa和金離子結合蛋白golb。
另一方面，本發明提供一種表達載體，包括上述金離子檢測及吸附系統。
又一方面，本發明提供一種宿主菌，所述宿主菌包括上述表達載體或所述宿主菌表達上述金離子檢測及吸附蛋白表面展示系統。
再一方面，本發明提供一種上述金離子檢測及吸附系統的製備方法，包括如下步驟：
從大腸桿菌基因組中擴增出大腸桿菌外膜蛋白ompadna序列，從鼠傷寒沙門氏菌基因組dna中擴增出金離子結合蛋白golbdna序列；
以所述大腸桿菌外膜蛋白ompadna序列和所述金離子結合蛋白golbdna序列為模板，擴增出ompa-golb融合蛋白dna序列；
從大腸桿菌表達載體基因組中擴增螢光蛋白dna序列；
將第一啟動子、所述螢光蛋白dna序列、第二啟動子、所述ompa-golb融合蛋白dna序列依次連接。
最後，本發明提供一種金離子回收方法，包括如下步驟：
提供含有金離子的液體；
將權利要求6所述的宿主菌培養後加入所述液體中，靜置處理；
待所述溶液中出現沉澱後，進行過濾處理得到吸附有金離子的所述宿主菌；
用酸處理吸附有金離子的所述宿主菌，分離後得到金離子。
本發明的金離子檢測及吸附系統基於鼠傷寒沙門氏菌中金離子的調控機制設計，其中包含了檢測單元和吸附單元，檢測單元包括報告螢光蛋白dna序列，其可以可視化檢測金離子，而吸附單元包括ompa-golb吸附部分，高效吸附金離子。將該系統連接到質粒中後導入非致病性的大腸桿菌細胞體內，在啟動子調控下可視化檢測和吸附金離子，因此該種經過改造後的工程菌對金離子的檢測及吸附具有很好的效果；因報告螢光蛋白、大腸桿菌外膜蛋白ompa和金離子結合蛋白golb的高效表達，其工程菌可以表達金離子檢測及吸附蛋白表面展示系統，因此金離子檢測及吸附系統容易製備、成本較低、操作方便。
本發明提供的金離子回收方法，可以集金離子檢測及吸附一體化，用本發明的工程菌對含金工業廢水的處理：將工程菌液加入到廢水中，菌體能夠在檢測到含金廢水的同時在細胞膜外大量表達golb蛋白，將廢水中的金離子結合。在完成金離子的結合吸附後，對菌體進行聚集和沉澱，菌體回收方便。通過對菌體的處理和二次使用，本發明最終能夠通過生物手段實現對工業廢水中重金屬金的檢測及可循環富集和回收；因此，本發明能夠克服現有技術的缺點，不會造成二次汙染，對環境友好。
附圖說明
圖1是本發明實施例1金離子檢測系統質粒構建圖譜；
圖2是本發明實施例1金離子檢測系統質粒的電泳鑑定圖；其中，m是dna分子量標準，1是金離子檢測系統質粒泳道；
圖3是本發明實施例2金離子吸附系統質粒構建圖譜；
圖4是本發明實施例2金離子吸附系統質粒的電泳鑑定圖；其中，m是dna分子量標準，1是融合蛋白表達lpp-ompa-golb質粒泳道；
圖5是本發明實施例3金離子檢測及吸附系統質粒構建圖譜；
圖6是本發明實施例5水體中金離子敏感性檢測效果示意圖；
圖7(a)是本發明實施例6水體中金離子選擇性檢測效果示意圖；
圖7(b)是本發明實施例5水體中金離子選擇性檢測效果示意圖；
圖8是本發明實施例7蛋白表達驗證圖；
圖9是本發明實施例5水體中金離子的濃度和誘導時間對檢測的影響；
圖10是本發明實施例8金離子吸附能力效果圖。
具體實施方式
為了使本發明要解決的技術問題、技術方案及有益效果更加清楚明白，以下結合附圖和實施例，對本發明進行進一步詳細說明。應當理解，此處所描述的具體實施例僅僅用以解釋本發明，並不用於限定本發明。
一方面，本發明實施例提供了一種金離子檢測及吸附系統，包括檢測單元和與該檢測單元連接的吸附單元，檢測單元包括螢光蛋白dna序列，且該螢光蛋白dna序列與第一啟動子連接；吸附單元包括互相連接的大腸桿菌外膜蛋白ompadna序列和金離子結合蛋白golbdna序列，且大腸桿菌外膜蛋白ompadna序列與第二啟動子連接；該檢測單元位於吸附單元的上遊。
在一實施例中，第一啟動子為pgols-gols-pgolb，其序列如seqidno:10所示；第二啟動子為pgolb，其序列如seqidno:19所示。大腸桿菌外膜蛋白ompadna序列如seqidno:3所示，金離子結合蛋白golbdna序列如seqidno:6所示。
具體地，螢光蛋白是一種發光、可視化的蛋白，可為紅色螢光蛋白rfp或綠色螢光蛋白egfp，在本實施例中主要起對金離子可視化檢測報告作用，在本發明一優選的實施例中，螢光蛋白為紅色螢光蛋白rfp，其dna序列如seqidno:13所示。
在本發明一優選實施例的金離子檢測及吸附系統中，第二啟動子與大腸桿菌外膜蛋白ompadna序列之間還連接有脂蛋白lppdna序列，脂蛋白lppdna序列如seqidno:22所示。在該條件下，該系統表達的lpp蛋白可以增強大腸桿菌外膜蛋白ompa的表面展示能力，從而使金離子結合蛋白golb在細胞膜上結合更穩固更緊密。
另一方面，本發明實施例提供一種金離子檢測及吸附蛋白表面展示系統，其包括本發明實施例的金離子檢測及吸附系統表達的螢光蛋白、大腸桿菌外膜蛋白ompa和金離子結合蛋白golb；或包括本發明另一實施例的金離子檢測及吸附系統表達的螢光蛋白、脂蛋白lpp、大腸桿菌外膜蛋白ompa和金離子結合蛋白golb。
另一方面，本發明實施例提供了一種表達載體，該表達載體包括本實施例的金離子檢測及吸附系統。同時，本發明實施例提供了一種宿主菌，該宿主菌包括本實施例的表達載體；或表達本實施例的金離子檢測及吸附蛋白表面展示系統。
又一方面，本發明實施例提供一種上述金離子檢測及吸附系統的製備方法，其特徵在於，包括如下步驟：
s011：從大腸桿菌基因組中擴增出大腸桿菌外膜蛋白ompadna序列，從鼠傷寒沙門氏菌基因組dna中擴增出金離子結合蛋白golbdna序列；
s012：以上述大腸桿菌外膜蛋白ompadna序列和金離子結合蛋白golbdna序列為模板，擴增出ompa-golb融合蛋白的dna序列；
s013：從大腸桿菌表達載體基因組中擴增螢光蛋白dna序列；
s014：將第一啟動子、所述螢光蛋白dna序列、第二啟動子、所述ompa-golb融合蛋白dna序列依次連接。
在一實施例中，擴增大腸桿菌外膜蛋白ompadna序列的引物如seqidno:1、seqidno:2所示；擴增金離子結合蛋白golbdna序列的引物seqidno:4、seqidno:5所示。
而根據具體螢光蛋白不同，選擇的擴增引物也不同，本實施例的螢光蛋白dna序列為紅色螢光蛋白rfpdna序列，其可以從本實驗室的大腸桿菌表達載體基因組中擴增紅色螢光蛋白rfpdna序列，且擴增引物如seqidno:11、seqidno:12所示。而在一實施例中，第一啟動子為pgols-gols-pgolb，且其擴增引物如seqidno:8、seqidno:9所示，第二啟動子為pgolb，且其擴增引物如seqidno:17、seqidno:18所示，兩種啟動子都可以從從鼠傷寒沙門氏菌基因組擴增得到，而本實施例的pgolb優選從本實驗室的大腸桿菌生物磚表達載體pzh2中擴增，效率更高。
又一實施例中，通過從表達脂蛋白lpp的菌種中擴增出脂蛋白lpp的dna序列，連接在第二啟動子pgolb與大腸桿菌外膜蛋白ompadna序列之間，使金離子結合蛋白golb在細胞膜上結合更穩固更緊密。
最後，本發明實施例提供一種金離子回收方法，包括如下步驟：
s021：提供含有金離子的液體；
s022：將本發明實施例的宿主菌培養後加入到上述液體中，靜置處理；
s023：待溶液中出現沉澱後，進行過濾處理得到吸附有金離子的宿主菌；
s024：用酸處理吸附有金離子的宿主菌，分離後得到金離子。
在一優選實施例中，上述步驟s021中，含有金離子的液體可以是各種工業廢水、礦業廢水等中含有金離子回收液，在該液體中金離子的濃度範圍為0.01μm～20μm；本實施例提供宿主菌在金離子濃度為0.01μm時就有很好的檢測效果，且在金離子濃度為10μm時檢測效果最佳。上述步驟s022中，靜置處理的時間範圍為10h～15h，該範圍內宿主菌對液體中金離子的吸附效果達到最佳。
本發明先後進行過多次試驗，現舉一部分試驗結果作為參考對發明進行進一步詳細描述，下面結合具體實施例進行詳細說明。
實施例1金離子檢測系統表達質粒的構建及鑑定
1.檢測系統中金離子誘導基因pgols-gols-pgolb片段的擴增
使用特異引物pgolts1(seqidno:8)和pgolts2(seqidno:9)從鼠傷寒沙門氏菌基因組dna(ncbi中的引用位置：nc_003197)中擴增出編碼金誘導基因的dna序列(seqidno:10)；本實施例的金離子誘導基因(goldinductivegene)即為啟動子pgols-gols-pgolb，其可以表達gols蛋白，gols蛋白平時起到阻遏作用，在有金離子存在時才會從啟動子pgolb的dna序列上脫落，引發下遊基因表達。
pcr反應體系(50μl)：
pcr反應條件：
第一步：95℃，3分鐘
第二步：95℃，1分鐘
第三步：60℃，2分鐘
第四步：72℃，4分鐘
第五步：重複第二步至第四步，29個循環
第六步：72℃10分鐘
第七步：4℃保溫。
回收pcr產物，備用。
2.檢測系統中報告基因rfp-terminator片段的擴增
1)紅色螢光蛋白rfp片段基因的擴增
使用特異引物rfp1(seqidno:11)和rfp2(seqidno:12)從本實驗室的大腸桿菌表達載體基因組dna中擴增出編碼紅色螢光蛋白rfp的dna序列(seqidno:13)，反應條件如下。
pcr反應體系(50μl)：
pcr反應條件：
第一步：94℃，2分鐘
第二步：94℃，0.5分鐘
第三步：60℃，0.5分鐘
第四步：72℃，1分鐘
第五步：重複第二步至第四步，29個循環
第六步：72℃。10分鐘
第七步：10℃保溫。
回收pcr產物，備用。
2)終止子terminator片段的基因擴增
根據所需擴增目的dna序列和鹼基互配原理，設計特異引物term1(seqidno:14)和term2(seqidno:15)，從本實驗室所有的大腸桿菌表達載體基因組dna中擴增出終止子terminator的dna序列(seqidno:16)，反應條件如下。
pcr反應體系(50μl)：
pcr反應條件：
第一步：94℃，2分鐘
第二步：94℃，0.5分鐘
第三步：60℃，0.5分鐘
第四步：72℃，0.5分鐘
第五步：重複第二步至第四步，29個循環
第六步：72℃，10分鐘
第七步：10℃保溫。
回收pcr產物，備用。
3)rfp-terminator片段的基因擴增
根據所需擴增目的dna序列和鹼基互配原理，使用特異引物rfp1(seqidno:11)和term2(seqidno:15)，以上述第1和2點回收的擴增產物為模版，擴增出rfp-terminator片段的dna序列，反應條件如下。
pcr反應體系(50μl)：
pcr反應條件：
第一步：94℃，2分鐘
第二步：94℃，0.5分鐘
第三步：65℃，0.5分鐘
第四步：72℃，1分鐘
第五步：重複第二步至第四步，29個循環
第六步：72℃，10分鐘
第七步：10℃保溫。
回收pcr產物，備用。
3.檢測系統中金離子誘導基因和報告基因融合蛋白表達質粒的構建與鑑定
1)使用dna限制性內切酶ecori和psti酶切上述金離子誘導基因：啟動子pgols-gols-pgolb擴增得到的dna片段(seqidno:10)，然後使用t4dna連接酶插入到本實驗室所有的大腸桿菌生物磚表達載體pzh2中。
酶切反應體系(20μl)：
反應條件：37℃，水浴10小時。
dna連接反應體系(10μl，100ngdna)：
反應條件：16℃，水浴16小時。
2)使用dna限制性內切酶xbai和psti酶切上述rfp-terminator的擴增dna片段，然後使用t4dna連接酶插入1)步驟構建完成的大腸桿菌生物磚表達載體pzh2中。
酶切反應體系(20μl)：
反應條件：37℃，水浴10小時。
dna連接反應體系(10μl，100ngdna)：
反應條件：16℃，水浴16小時。
3)檢測系統中金離子誘導基因和報告基因融合蛋白表達質粒的提取結果請見圖1(圖中golb啟動子即為啟動子pgols-gols-pgolb)，電泳鑑定結果請見圖2。
實施例2金離子吸附系統表達質粒的構建及鑑定
1.吸附系統中金離子誘導基因pgolb片段的擴增
根據所需擴增目的dna序列和鹼基互配原理，設計特異引物pgolb1(seqidno:17)和pgolb2(seqidno:18)，從本實驗室所有的大腸桿菌生物磚表達載體pzh2中擴增出金離子調控基因的啟動子的pgolbdna序列(seqidno:19)，反應條件如下。
pcr反應體系(50μl)：
pcr反應條件：
第一步：95℃，2分鐘
第二步：95℃，0.5分鐘
第三步：63℃，0.5分鐘
第四步：72℃，0.5分鐘
第五步：重複第二步至第四步，29個循環
第六步：72℃，10分鐘
第七步：4℃保溫。
回收pcr產物，備用。
2.吸附系統中金離子吸附基因片段的擴增
1)大腸桿菌外膜蛋白a(ompa)片段的基因擴增
根據所需擴增目的dna序列和鹼基互配原理，設計特異引物ompa1(seqidno:1)和ompa2(seqidno:2)，從大腸桿菌基因組dna(ncbi中的引用位置：nc_000913)中擴增出編碼大腸桿菌外膜蛋白a(ompa)第1位至第159位胺基酸的dna序列(seqidno:3)。
反應條件如下：
pcr反應體系(50μl)：
pcr反應條件：
第一步：95℃，2分鐘
第二步：95℃，0.5分鐘
第三步：63℃，0.5分鐘
第四步：72℃0.5分鐘
第五步：重複第二步至第四步，29個循環
第六步：72℃，10分鐘
第七步：4℃保溫。
回收pcr產物，備用。
2)金離子結合蛋白golb片段的基因擴增
根據所需擴增目的dna序列和鹼基互配原理，設計特異引物golb1(seqidno:4)和golb2(seqidno:5)從鼠傷寒沙門氏菌基因組dna(ncbi中的引用位置：nc_003197)中擴增出編碼金離子結合蛋白golb的dna序列(seqidno:6)，並在其c端加上編碼flag-tag的序列，反應條件如下。
pcr反應體系(50μl)：
pcr反應條件：
第一步：95℃，2分鐘
第二步：95℃，0.5分鐘
第三步：60℃，0.5分鐘
第四步：72℃，0.5分鐘
第五步：重複第二步至第四步，29個循環
第六步：72℃，10分鐘
第七步：4℃保溫。
回收pcr產物，備用。
3)終止子terminator片段的基因擴增
根據所需擴增目的dna序列和鹼基互配原理，設計特異引物term1(seqidno:14)和term2(seqidno:15)，從本實驗室所有的大腸桿菌表達載體基因組dna中擴增出終止子terminator的dna序列(seqidno:16)，反應條件如下。
pcr反應體系(50μl)：
pcr反應條件：
第一步：94℃，2分鐘
第二步：94℃，0.5分鐘
第三步：60℃，0.5分鐘
第四步：72℃，0.5分鐘
第五步：重複第二步至第四步，29個循環
第六步：72℃，10分鐘
第七步：10℃保溫。
回收pcr產物，備用。
3.lpp-ompa-golb融合蛋白表達質粒的構建及鑑定
1)設計特異引物l1(seqidno:20)和l2(seqidno:21)，從表達脂蛋白lpp的大腸桿菌中擴增出脂蛋白lppdna(seqidno:22)產物，使用dna限制性內切酶xbai和psti酶解該脂蛋白lpp片段以及上述pgolb片段、ompa片段、golb片段、terminator片段的擴增產物，然後使用t4dna連接酶插入大腸桿菌生物磚表達載體pzh2中，lpp-ompa-golb融合蛋白表達質粒構建圖譜請詳見圖3；其中ompa-golb融合蛋白的dna序列為：seqidno:7。。
酶切反應體系(20μl)：
反應條件：37℃水浴10小時。
dna連接反應體系(10μl，100ngdna)：
反應條件：16℃水浴16小時。
2)lpp-ompa-golb融合蛋白表達質粒的提取與鑑定，結果請見圖4。
實施例3金離子檢測及吸附系統表達質粒的構建及鑑定
1.使用dna限制性內切酶psti和spei酶解上述實施例1中得到的pgols-gols-pgolb-rfp-terminator酶解片段，使其具有粘性末端，使用dna限制性內切酶psti和xbai酶解上述實施例2中得到的pgolb-lpp-ompa-golb-terminator酶解片段，使其具有粘性末端然後使用t4dna連接酶插入到大腸桿菌生物磚質粒骨架pzh2中。
酶切反應體系(20μl)：
反應條件：37℃水浴10小時。
dna連接反應體系(10μl，100ngdna)：
反應條件：16℃水浴16小時。
2.金離子檢測及吸附一體化表達質粒的提取結果請見圖5。
實施例4金離子檢測及吸附系統質粒轉入宿主菌
1)將上述實施例4得到的重組質粒pzh2通過化學轉化方法導入大腸桿菌細胞dh5α中，通過在含有氨苄青黴素(50μgml-1)的lb固體培養基上於37℃中培養16小時，從中篩選出陽性克隆並加以保存。
感受態細胞的熱激轉化和稀釋塗布步驟如下：將連接反應的產物於感受態細胞(dh5α)中，手指輕彈混勻；冰浴30分鐘後42℃熱激95秒，快速轉移至冰上；冰浴2分鐘後每管加入事先37℃預熱好的lb培養基900μl，37℃，200rpm培養1小時使其復甦；3000rpm離心30秒，移去0.9ml上清後，取下層0.1ml塗布相應的抗性平板，37℃培養10小時。
2)重組菌的篩選和鑑定
採用常規菌落pcr法和抽提陽性克隆的質粒後酶切鑑定法，具體可參見《takara限制性內切酶採購目錄和技術指南》。測序由上海生物工程技術服務公司完成，金離子檢測及吸附系統質粒的提取與鑑定。
實施例5金離子檢測及吸附系統檢測金離子能力的測試
1.金離子的濃度對檢測的影響
1)將用於檢測金離子的大腸桿菌菌種接入適量含有氨苄青黴素(50μgml-1)的lb液體培養基中於37℃中培養過夜；將過夜培養菌液1:100稀釋入適量含有氨苄青黴素(50μgml-1)lb液體培養基中於37℃中培養至培養液od600＝0.6，向培養液中加入終濃度為0；0.001；0.01；0.1；0.25；0.5；1；5；10；20μm的金離子，培養液在37℃中繼續培養過夜；
2)培養10h的細菌培養液通過離心(8000轉/分鐘，2min)收集後，用去離子水清洗1次；
3)清洗後的菌體使用1×pbs緩衝液重懸；
4)使用酶標儀檢測重懸後的菌液。
5)具體檢測結果請見圖6，經改造的工程菌在金離子濃度為0.01μm時就有很好的檢測效果，且在金離子濃度為10μm時檢測效果最好。
2.金離子的濃度和誘導時間對檢測的影響
1)將用於檢測金離子的大腸桿菌菌種接入適量含有氨苄青黴素(50μgml-1)的lb液體培養基中於37℃中培養過夜；將過夜培養菌液1:100稀釋入適量含有氨苄青黴素(50μgml-1)lb液體培養基中於37℃中培養至培養液od600＝0.6，設置四個不同的濃度梯度，在四個不同的濃度梯度下設置不同的時間梯度。四個不同的金濃度梯度，分別為0.1、1、5、20μmol，時間梯度分別為0.5、1、1.5、2、3、5、7.5、10h。培養10h。
2)培養10h的細菌培養液通過離心(8000轉/分鐘，2min)收集後，用去離子水清洗1次；
3)清洗後的菌體使用1×pbs緩衝液重懸；
4)使用酶標儀檢測重懸後的菌液。
具體檢測結果請見圖9，經改造的工程菌在金離子濃度為0.01μm時就有很好的檢測效果，且在金離子濃度為10μm時檢測效果最好。對菌體進行螢光檢測的結果顯示在金離子濃度為0.1μmol時，螢光強度依次增加，在10h時達到最大值16000左右。在金離子濃度為1μmol時，螢光強度呈現峰形分布，在5h時達到最大值45000左右。在金離子濃度為5μmol時，螢光強度呈現峰形分布，在5h時達到最大值65000左右。
如此可知：此系統可等效為一個濃度依賴性的化學反應與一個分解反應的偶聯，滿足動力學方程的濃度作用規律，即起始濃度越高，反應達到平衡所需的時間就越短，而由於分解反應的存在，綠色螢光蛋白最終會降解，因此螢光強度相對時間的函數會呈現峰型分布。
3.混合金屬溶液中金離子選擇性檢測
1)將用於檢測金離子的大腸桿菌菌種接入適量含有氨苄青黴素(50μgml-1)的lb液體培養基中於37℃中培養過夜；將過夜培養菌液1:100稀釋入適量含有氨苄青黴素(50μgml-1)lb液體培養基中於37℃中培養至培養液od600＝0.6，加入金，金、銀、銅、鎘、鎳、鋅和銀、銅、鎘、鎳、鋅，培養液在37℃中繼續培養過夜；
2)培養10h的細菌培養液通過離心(8000轉/分鐘，2min)收集後，用去離子水清洗1次；
3)清洗後的菌體使用1×pbs緩衝液重懸；
4)使用酶標儀檢測重懸後的菌液。
5)具體檢測結果請見圖7(b)，對菌體進行螢光檢測的結果顯示混合金屬對金離子的螢光檢測有微弱影響，金的選擇性依然很高。
實施例6金離子檢測及吸附系統對金離子選擇性能力的檢測
1.將用於檢測金離子的大腸桿菌菌種接入適量含有氨苄青黴素(50μgml-1)的lb液體培養基中於37℃中培養過夜；將過夜培養菌液1:100稀釋入適量含有氨苄青黴素(50μgml-1)lb液體培養基中於37℃中培養至培養液od600＝0.6，向培養液中分別加入終濃度為10μm的銀、鎳、鋅、銅、鎘、鉻、汞、鉛離子，培養液在37℃中繼續培養10h；
2.培養10h的細菌培養液通過離心(8000轉/分鐘，2min)收集後，用去離子水清洗1次；
3.清洗後的菌體使用1×pbs緩衝液重懸；
4.使用酶標儀檢測重懸後的菌液。
具體檢測結果請見圖7(a)，經改造的工程菌對金離子有較好的選擇性。
實施例7表達lpp-ompa、lpp-ompa-golb融合蛋白的質粒轉入宿主菌及宿主菌的培養
1.表達lpp-ompa融合蛋白的質粒轉入宿主菌
1)將用於表達lpp-ompa融合蛋白的質粒通過化學轉化方法導入大腸桿菌細胞dh5α中，通過在含有氨苄青黴素(50μgml-1)的lb固體培養基上於37℃中培養16小時，從中篩選出陽性克隆並加以保存。
感受態細胞的熱激轉化和稀釋塗布步驟如下：將連接反應的產物於感受態細胞(dh5α)中，手指輕彈混勻；冰浴30分鐘後42℃熱激95秒，快速轉移至冰上；冰浴2分鐘後每管加入事先37℃預熱好的lb培養基900μl，37℃，200rpm培養1小時使其復甦；3000rpm離心30秒，移去0.9ml上清後，取下層0.1ml塗布相應的抗性平板，37℃培養10小時。
2)重組菌的篩選和鑑定
採用常規菌落pcr法和抽提陽性克隆的質粒後酶切鑑定法，具體可參見《takara限制性內切酶採購目錄和技術指南》。測序由上海生物工程技術服務公司完成。lpp-ompa融合蛋白表達質粒測序圖譜請見圖2。
2.表達lpp-ompa-golb融合蛋白的質粒轉入宿主菌
1)將用於表達lpp-ompa-golb融合蛋白的質粒通過化學轉化方法導入大腸桿菌細胞dh5α中，通過在含有氨苄青黴素(50μgml-1)的lb固體培養基上於37℃中培養16小時，從中篩選出陽性克隆並加以保存。
感受態細胞的熱激轉化和稀釋塗布步驟如下：將連接反應的產物於感受態細胞(dh5α)中，手指輕彈混勻；冰浴30分鐘後42℃熱激95秒，快速轉移至冰上；冰浴2分鐘後每管加入事先37℃預熱好的lb培養基900μl，37℃，200rpm培養1小時使其復甦；3000rpm離心30秒，移去0.9ml上清後，取下層0.1ml塗布相應的抗性平板，37℃培養10小時。
2)重組菌的篩選和鑑定
採用常規菌落pcr法和抽提陽性克隆的質粒後酶切鑑定法，具體可參見《takara限制性內切酶採購目錄和技術指南》。測序由上海生物工程技術服務公司完成。
3.誘導培養
將用於表達lpp-ompa、lpp-ompa-golb融合蛋白的大腸桿菌菌種接入適量含有氨苄青黴素(50μgml-1)的lb液體培養基中於37℃中培養過夜；將過夜培養菌液1:100稀釋入適量含有氨苄青黴素(50μgml-1)lb液體培養基中於37℃中培養至培養液od600＝0.6，向培養液中加入終濃度分別為1μm；5μm；20μm進行誘導，培養液在37℃中繼續培養過夜。
4.蛋白表達驗證
離心收集37℃中培養過夜的細菌(5000rpm，5min)，棄上清液。沉澱使用1mlpbs(含10ul100mm的pmsf)重懸。使用超聲波破碎儀破碎收集下來的細菌(10min，超聲5s，間歇5s)，後於4℃、12000rpm離心10min，沉澱使用tdsetbuffer(1％tritonx-100，0.2％sodiumdeoxycholate，0.1％sds，10mmtetrasodiumedta，10mmtris/hcl)處理兩次。12000rpm離心10min，棄去上清，沉澱使用500μlpbs重懸。
1)sds-page驗證
①配製12％sds-page膠，具體配方見下表1。
表1
②取20μl破碎上清液及沉澱重懸液，加入5μl5×樣品緩衝液，95℃恆溫處理10min。後12000rpm離心10min。
③在電泳槽中加入1×電泳緩衝液，上樣，先75v恆壓運行30min，後160v恆壓50min。
④完成後加入考馬斯亮藍染色液染色20min。
⑤考馬斯亮藍脫色液脫色2次，每次20min。
⑥使用凝膠成像儀在白光下成像、拍照。
2)westernblot驗證
①12％sds-page分離蛋白。
②剪下與膠大小相近的pvdf膜，在甲醇中浸泡20s，再用水浸泡2min。
③在電泳槽中加入1l電轉液，採用溼式轉膜法法轉膜，膠與膜的放置順序為：海綿/濾紙/膠/膜/濾紙/海綿，低溫下250ma恆流電轉2h。
④轉膜完成後，取出膜，在一定方向剪角以區分正反面。使用tbst清洗膜3次，每次5min。
⑤清洗完成後，加入50ml5％脫脂奶粉封閉2h。
⑥封閉完成後，使用tbst清洗膜4次，每次5min。以1：1000稀釋的抗flag標籤抗體作一抗，4℃孵育過夜。
⑦tbst清洗膜4次，每次5min。使用1：1000稀釋的山羊抗小鼠igg-hrp抗體作二抗，常溫孵育2h，
⑧tbst清洗膜4次，每次5min。在膜上加400μlcecl低背景化學發光檢測劑，使用凝膠成像儀成像、拍照。
結果如圖8所示，從左至右分別為：
1:單純金離子環境下，golb蛋白被大量誘導，由於golb蛋白末端帶有之前所述的flag標籤，因此可以被螢光抗體識別，最終在膠片上顯影產生條帶。
2:金離子與其他金屬離子混合存在的前提下，gols蛋白仍然能被金離子特異性誘導而失去阻遏能力，導致golb的表達。
3:僅存在其他金屬離子時，gols蛋白仍然結合在dna上起到阻遏作用，因此golb蛋白不表達。
實施例8lpp-ompa、lpp-ompa-golb金離子吸附能力的檢測
兩種工程菌lpp-ompa、lpp-ompa-golb進行吸附實驗。實驗前兩種菌均劃線培養於lb固體培養基中(氨苄青黴素抗性)。
金離子濃度對吸附能力的影響
①從兩個個培養皿中分別挑取單菌落接種於5mllb(含5ul氨苄青黴素)培養基中，37℃、220rpm培養過夜。
②將細菌培養液以1：100重新接種於100mllb(含100ul氨苄青黴素)培養基中，37℃、220rpm培養至od600＝0.6，加入au3+至終濃度分別為1μmol，5μmol，20μmol。37℃、220rpm繼續培養10h。每個實驗組設置3個重複。
③收集細菌，棄上清液。ddh2o清洗3次。-80℃凍存6h後用凍幹機凍幹細菌沉澱。
④稱重後用1ml濃硝酸消解至完全，用雙蒸水定容至10ml，最後使用電感耦合等離子發射光譜(icp-aes)檢測。
具體檢測結果請見圖10。圖中結果顯示，lpp-ompa-golb工程菌表現出對金離子強有力的吸附能力。
以上所述僅為本發明的較佳實施例而已，並不用以限制本發明，凡在本發明的精神和原則之內所作的任何修改、等同替換和改進等，均應包含在本發明的保護範圍之內。
sequencelisting
深圳勁宇生物科技有限公司
金離子檢測及吸附系統及其宿主菌、金離子回收方法
22
patentinversion3.3
1
45
dna
擴增編碼大腸桿菌外膜蛋白ompa的基因的引物
1
ctttcttcgaattcgcggccgcttctagagatgaaaaagacagct45
2
46
dna
擴增編碼大腸桿菌外膜蛋白ompa的基因的引物
2
ctttcttcctgcagcggccgtactagtacatacgggtagcgatttc46
3
477
dna
大腸桿菌外膜蛋白ompa的dna序列
3
atgaaaaagacagctatcgcgattgcagtggcactggctggtttcgctaccgtagcgcag60
gccgctccgaaagataacacctggtacactggtgctaaactgggctggtcccagtaccat120
gacactggtttcatcaacaacaatggcccgacccatgaaaaccaactgggcgctggtgct180
tttggtggttaccaggttaacccgtatgttggctttgaaatgggttacgactggttaggt240
cgtatgccgtacaaaggcagcgttgaaaacggtgcatacaaagctcagggcgttcaactg300
accgctaaactgggttacccaatcactgacgacctggacatctacactcgtctgggtggc360
atggtatggcgtgcagacactaaatccaacgtttatggtaaaaaccacgacaccggcgtt420
tctccggtcttcgctggcggtgttgagtacgcgatcactcctgaaatcgctacccgt477
4
45
dna
擴增編碼金離子結合蛋白golb的基因的引物
4
ctttcttcgaattcgcggcccttctagagaatgcagttccatatt45
5
63
dna
擴增編碼金離子結合蛋白golb的基因的引物
5
gtttcttcctgcagcggccgtactagtataaaggatgacgacgataagatctgaaagctt60
ggg63
6
228
dna
金離子結合蛋白golb的dna序列
6
atgcagttccatattgatgacatgacctgcggcggctgcgccagtacggtaaaaaagacg60
attctgactctcgatgctaatgcgacggtgagaactgacccggcgacgcgtctggttgac120
gttgaaacgtcgctatccgcggagcagattgccgccgccctgcaaaaggccggtttcccg180
ccgcgcgagaggctcgaggattacaaggatgacgacgataagatctga228
7
705
dna
ompa-golb融合蛋白的dna序列
7
atgaaaaagacagctatcgcgattgcagtggcactggctggtttcgctaccgtagcgcag60
gccgctccgaaagataacacctggtacactggtgctaaactgggctggtcccagtaccat120
gacactggtttcatcaacaacaatggcccgacccatgaaaaccaactgggcgctggtgct180
tttggtggttaccaggttaacccgtatgttggctttgaaatgggttacgactggttaggt240
cgtatgccgtacaaaggcagcgttgaaaacggtgcatacaaagctcagggcgttcaactg300
accgctaaactgggttacccaatcactgacgacctggacatctacactcgtctgggtggc360
atggtatggcgtgcagacactaaatccaacgtttatggtaaaaaccacgacaccggcgtt420
tctccggtcttcgctggcggtgttgagtacgcgatcactcctgaaatcgctacccgtatg480
cagttccatattgatgacatgacctgcggcggctgcgccagtacggtaaaaaagacgatt540
ctgactctcgatgctaatgcgacggtgagaactgacccggcgacgcgtctggttgacgtt600
gaaacgtcgctatccgcggagcagattgccgccgccctgcaaaaggccggtttcccgccg660
cgcgagaggctcgaggattacaaggatgacgacgataagatctga705
8
43
dna
擴增啟動子pgols-gols-pgolb的引物
8
ctttcttcgaattcgcggccgcttctagagaaggaaaggtcaa43
9
43
dna
擴增啟動子pgols-gols-pgolb的引物
9
gtttcttcctgcagcggccgtactagtacttttgtgtgggaac43
10
3231
dna
啟動子pgols-gols-pgolb的序列
10
acaacgaaggaaaggtcaagcgttcctgacgggtttttacggggcgtgggtcggcatcgt60
ggcgtaaatgtctcgcatcatcctcttttatgagccatctcacattctcgccgaaccgtg120
cagcctgaatacgcttgaccttcccacaatggcaagctttaggctttctgataccgaata180
gtcaggatggggaagtcgtcatgagtcagtcagaaaatcgtcacgacacgataagcttac240
ttattgaaggtatgacctgcgcgtcgtgcgtcgctcgcgttgaaaaaggtattaaggctg300
tgcctggcgtaacggacgctacggtgaatctggcgacggagcgcgccaccgtccgcggga360
cggcgtcggcggaggcggtgatcgcggcgattgaaaaaacggggtataaggcgcgaccga420
tagagacggcggggcagggcgaagacgactctgaagagaaaaaagaggccgagcgcgtca480
ggctgaagcgcgatctgattctcgccagcgtgctggcgctccccgtttttgtgcttgaaa540
tgggctcgcaccttattcctggtatgcacgagtgggtgataaaaacgattggcctgcaac600
aaagctggtactggcaatttgcactgaccctgttggtgctgacgatccccggtcgccgtt660
tttaccttaaagggttcccggcgctggcgcgtctggcgccggacatgaactcgctggtcg720
ccgtgggaaccgcagcggcattcggctactcgctggtggcgacctttacgcccgacctgt780
tgcctgaagggacggtaaacgtctattacgaggccgccgcagtgattgtcgcgcttattc840
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tggtggggctacaggcgcgggtcgcgcatgtgttacgcgagggccgcatcgtggatatcc960
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atctcgacgtggccagcggctttgaacgccgtgaggtgctggcgaaagtcgcggcggtag1620
aatcgcgttcagagcatccgattgcccgtgcgattgtcgtgtcggcagaagaggaaggga1680
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ttgacggtacgcgtgttgacgtgggggctgatcgctatatgcgcgaaattggcgtggata1800
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accagaatctgttctgggcctttgcttacaatacggcgctgattcctgtcgcggcaggcg2340
cgctatttccggtctggggcatattattgtcaccggtattcgccgcaggggcgatggcga2400
tgtcgagcgtgttcgtgctgggcaacgctttgcggctgcgccgtttccgggcgccgatgg2460
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taatcaattgcattttatacgccgcgcgcgcgacctcggtttttcagttgctgaaatcag2880
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gcagacgcacattgatgaactggacagacgtatccagaacatgcagcacatggcgcaaac3000
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tacgcttggacaacctgacgatagcgagccggaggcgcgtaccggagcggtattgcgacg3120
tcctcgtcgccacggactggcaaagcgtctgtaagtcctgagattacgcttgaccttcca3180
acactggcaaggtccagactggcaacagttcccacacaaaaggagttcact3231
11
50
dna
擴增編碼紅色螢光蛋白rfp的基因的引物
11
ctttcttcgaattcgcggccgcttctagagatggcttcctccgaagacgt50
12
41
dna
擴增編碼紅色螢光蛋白rfp的基因的引物
12
gtttcttcctgcagcggccgtactagtaattaagcaccggt41
13
681
dna
紅色螢光蛋白rfp的dna序列
13
atggcttcctccgaagacgttatcaaagagttcatgcgtttcaaagttcgtatggaaggt60
tccgttaacggtcacgagttcgaaatcgaaggtgaaggtgaaggtcgtccgtacgaaggt120
acccagaccgctaaactgaaagttaccaaaggtggtccgctgccgttcgcttgggacatc180
ctgtccccgcagttccagtacggttccaaagcttacgttaaacacccggctgacatcccg240
gactacctgaaactgtccttcccggaaggtttcaaatgggaacgtgttatgaacttcgaa300
gacggtggtgttgttaccgttacccaggactcctccctgcaagacggtgagttcatctac360
aaagttaaactgcgtggtaccaacttcccgtccgacggtccggttatgcagaaaaaaacc420
atgggttgggaagcttccaccgaacgtatgtacccggaagacggtgctctgaaaggtgaa480
atcaaaatgcgtctgaaactgaaagacggtggtcactacgacgctgaagttaaaaccacc540
tacatggctaaaaaaccggttcagctgccgggtgcttacaaaaccgacatcaaactggac600
atcacctcccacaacgaagactacaccatcgttgaacagtacgaacgtgctgaaggtcgt660
cactccaccggtgcttaataa681
14
43
dna
擴增終止子序列terminator的引物
14
ctttcttcgaattcgcggccgcttctagagcggcggcatggac43
15
37
dna
擴增終止子terminator的引物
15
gtttcttcctgcagcggccgtactagtaaaaggccca37
16
171
dna
終止子terminator的序列
16
accggcggcatggacgagctgtacaagtaataatactagagccaggcatcaaataaaacg60
aaaggctcagtcgaaagactgggcctttcgttttatctgttgtttgtcggtgaacgctct120
ctactagagtcacactggctcaccttcgggtgggcctttctgcgtttatat171
17
50
dna
擴增啟動子pgolb的引物
17
gtttcttcgaattcgcggccgcttctagaggacgcgctgccagattgccc50
18
49
dna
擴增啟動子pgolb的引物
18
gtttcttcctgcagcggccgctactagtaagtgaactccttttctgtgg49
19
192
dna
啟動子pgolb的序列
19
atgcagttccatattgatgacatgacctgcggcggctgcgccagtacggtaaaaaagacg60
attctgactctcgatgctaatgcgacggtgagaactgacccggcgacgcgtctggttgac120
gttgaaacgtcgctatccgcggagcagattgccgccgccctgcaaaaggccggtttcccg180
ccgcgcgagagg192
20
25
dna
擴增編碼脂蛋白lpp的基因的引物
20
atgaaagctactaaactggtactgg25
21
25
dna
擴增編碼脂蛋白lpp的基因的引物
21
ttacttgcggtatttagtagccatg25
22
236
dna
脂蛋白lpp的dna序列
22
atgaaagctactaaactggtactgggcgcggtaatcctgggttctactctgctggcaggt60
tgctccagcaacgctaaaatcgatcagctgtcttctgacgttcagactctgaacgctaaa120
gttgaccagctgagcaacgacgtgaacgcaatgcgttccgacgttcggctgctaaagatg180
acgcagctcgtgctaaccagcgtctggacaacatggctactaaataccgcaagtaa236