用病毒抗原表達特異性免疫原的製作方法

2023-09-12 01:18:00

專利名稱：用病毒抗原表達特異性免疫原的製作方法
技術領域：
本發明涉及流感病毒血凝素(HA)嵌合蛋白，這些蛋白可以用作抗病毒、抗病原菌或抗其它對癌組織、變態反應等具有特異性的抗原的疫苗，這些嵌合蛋白還可以用於這類抗原所致症狀的治療和這類抗原或相關抗體的檢測。本發明還提供了編碼這類蛋白質的核苷酸順序。
外源性抗原決定簇，如人類免疫缺陷病毒抗原決定簇，被插入到HA蛋白的抗原性位點，這些嵌合蛋白就能夠誘導針對所插入的抗原決定簇的特異性免疫反應。
有許多手段用於製備疫苗。對病毒性疾病而言，這些方法包括應用滅活病毒、活病毒、活重組病毒、病毒蛋白、病毒亞單位蛋白等。
但是，許多類型的疫苗只取得了有限的成功，其部分原因在於生物體的株系或分離物之間彼此有廣泛的遺傳變異。此外，參與發病機理的人或動物抗原，即參與變態反應的IgE、腫瘤抗原等，在產生這些抗原的同種動物體內並不誘發有益的免疫反應，這些抗原實際上被作為自身蛋白而不是抗原來對待。
然而，希望用具有給定抗原的生物學功能的小的肽順序或抗原決定簇作免疫原，即使在同源動物中也是如此。從理論上講，當這些肽被注射到動物體內後，就能用於誘導免疫反應。但實際上，這些肽常常並不是良好的免疫原，因為它們一般都很小，不能使自身有利地呈遞給免疫系統。
人免疫缺陷病毒(HIV)的外被膜糖蛋白(gp120)第二保守區，就是這類弱免疫原性肽的例子。已發現該區域對於HIV的感染性和抗體中和作用是很重要的(Science，1988年2月26日，p1021)。針對該區域(胺基酸254-274)的抗血清可以在體外中和三種不同的HIV分離物，而不影響病毒與T細胞受體或CD4陽性細胞的結合。據信，該保守區在病毒穿入過程中的後結合作用中很關鍵，因而可能是抗體中和作用的潛在靶體。但是，已經觀察到，在天然的HIV感染過程中，當該區域被呈遞給免疫系統時，它相對地處於「免疫靜止」(immunosilent)狀態。這種免疫靜止現象提示，該抗原決定簇可能由於(例如)蛋白質的構型而被遮掩。
有關HIV抗原進一步的詳細情況可參見下列文獻Rusche等，「抑制人免疫缺陷病毒感染細胞融合的抗體與病毒被膜gp120結合」，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，853198-3202，1988年5月;Bolognesi，「抗SIV和HIV疫苗研製進展」，Journal of Acquired Immune Deficiency Syndromes，3390-394，Raven Press，Ltd，New York，1990;Wain-Hobson，「愛滋病毒LAV的核苷酸順序」，Cell，409-17，1985年1月;Ho等，「gp120的第二保守區對HIV的感染性和抗體中和作用起重要作用」，Science，2391021-1023，1988年2月26日。
增強抗原決定簇肽免疫原性的一個途徑是通過以某種方式將它們與融合蛋白、大分子或佐劑相連接，增大它們的體積，從而增強其識別能力。
Colbere-Garapin等人報導了Ⅲ型脊髓灰質炎病毒插入突變株(薩賓株)的製備，其中，將額外的胺基酸順序(三肽或六肽)插入到衣殼蛋白VP1的中和位點1中(Colbere-Garapin等，「在脊髓灰質炎病毒的主要衣殼蛋白中加入外源性寡肽」，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，858668-8672，1989年11月)。
Evans等人報導了含有Ⅰ型人免疫缺陷病毒(HIV-1)跨膜糖蛋白(gp 41)的抗原決定簇的脊髓灰質炎病毒抗原性嵌合蛋白的構建和鑑定。通過皮下注射活的脊髓灰質炎病毒/HIV嵌合體得到的兔抗血清顯示出對多種美洲和非洲HIV-1分離物具有廣泛的中和作用(Evans等，「一種經過改造的脊髓灰質炎病毒嵌合體能誘導出具有廣泛反應性的HIV-1中和抗體」，Nature，339385-388，1989年6月1日)。但是，利用活的病毒載體，例如脊髓灰質炎病毒，會產生實際應用的問題，因為血清抗體可能會抑制重組病毒在機體中的複製。此外，活的病毒載體對插入片段的大小有嚴格限制，因而所提供的插入位點的數目有限。
Wu等人報導了將對應於B型肝炎病毒表面抗原S(122-137)和前S2(120-145)的胺基酸殘基的合成寡核苷酸碼內(in frame)插入到克隆的沙門氏菌鞭毛蛋白基因的高可變區。正如通過ELISA檢測到的，用活的重組細菌免疫的動物產生了特異於B型肝炎病毒抗原決定簇的抗體(Wu等，「用沙門氏菌的疫苗株以雜交鞭毛蛋白表達B型肝炎表面抗原的免疫原性抗原決定簇」，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，864726-4730，1989年6月)。所產生的免疫反應很弱，持續的時間很短，並在免疫後迅速消退。
Michel等人報導了將各種HIV被膜片段插入到B型肝炎病毒表面抗原中。用這些融合蛋白免疫家兔產生了中和性抗體(Michel等，「在用重組HIV-B型肝炎表面抗原顆粒免疫的家兔體內誘導抗人免疫缺陷病毒(HIV)中和性抗體」，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，857957-7961，1988)。
同樣，還發現大鼠肥大細胞在體外和體內的組胺釋放可由於用人肽-蛋白結合物進行免疫而受到抑制(Stanworth等，「用一種肽類疫苗進行變態反應治療」，The Lancet，3361279-1281，1990年10月7日;Stanworth等，「高親和性和低親和性IgE受體在細胞信號傳遞過程中的作用」，Molecular Immunology，27(12)1291-1296，1990)。
單克隆抗體(mAbs)也已廣泛用於被動免疫和診斷目的，以檢測感染或象是否有腫瘤抗原存在這樣的病理狀況。但是，生產所需特異性單克隆抗體要做大量工作，而且結果難以預料。為了確定一個單克隆抗體的特異性，需要進行涉及一系列重疊肽的多個盲目篩選和測定步驟。有時，功能性抗原決定簇可能並不存在於供抗原產生抗該區單克隆抗體的免疫顯性位置上。
因此，需要本發明的能夠利用抗原決定簇潛在免疫原性的疫苗、診斷試劑和治療劑。
現已發現了具有免疫原性的一些嵌合蛋白，它們含有插入了外源性抗原決定簇的甲型流感病毒HA蛋白。用這些重組或合成的嵌合蛋白免疫哺乳動物導致肽特異性抗體的產生。由這些嵌合蛋白誘發的免疫反應持續時間長，例如持續六個月以上。這些嵌合蛋白或相應抗體還可以作為診斷工具和抗感染免疫療法用於某些病理狀況以及象醫院中偶然發生的針刺等所致的後暴露病例中。
還已經發現了編碼HA嵌合蛋白的DNA片段。這些片段所含有的核苷酸順序，基本上與編碼具有5個免疫顯性抗原性位點的甲型流感病毒HA表面蛋白的順序相同。根據本發明，將一段基本上與編碼某種外源抗原決定簇的順序相同的核苷酸順序，插入到編碼至少一個抗原性位點的核苷酸順序中。
本發明還包括一些肽，它們所包含的胺基酸順序與具有5個免疫顯性抗原性位點的甲型流感病毒HA表面蛋白基本相同，其中，與外源性抗原決定簇基本上相同的一段胺基酸順序，被插入到至少一個免疫原性抗原性位點的胺基酸順序中。
這些蛋白可以以有效量給需要治療或預防各種病症的哺乳動物(包括人)施用。此外，可以用這些肽或相應抗體，最好通過血液或血液的某一部分，檢測哺乳動物所接觸到的各種抗原。含有上述肽的疫苗;含有上述DNA片段的表達載體，特別是杆狀病毒;以及轉化的微生物宿主，都包含在本發明中。


圖1是甲型流感病毒HA蛋白的示意圖。
圖2是將一個示例性HIV抗原決定簇插入HA基因，並在HA基因的498bp處(相應於胺基酸139)產生一個ApaⅠ位點的流程圖。
本發明涉及含有一個插入了抗原決定簇的HA流感病毒表面蛋白的新DNA和肽的合成、表達和應用，以及這些DNA和肽本身。
A.流感病毒HA蛋白甲型流感病毒的HA表面蛋白是甲型流感病毒的兩種表面蛋白之一。另一種表面蛋白是神經氨酸苷酶(NA)。HA是該病毒的主要表面糖蛋白，是中和性抗體所針對的抗原。HA還控制病毒與細胞受體的附著，因此也控制病毒感染的啟動。甲型流感病毒引起常見流行病是因為該病毒有廣泛的抗原變異，這些變異源於HA主要抗原性位點中的胺基酸變化。
已克隆了不同流感病毒株的各種HA基因，它們都適用於本發明。特別值得注意的是A/WSN/33株的HA基因。該基因的長度是1775個核苷酸，編碼565個胺基酸(Hiti等，Virology，111113-124，1981)。
對從核苷酸順序推測出的胺基酸順序進行分析表明，存在一個信號肽(17個胺基酸殘基)，該信號肽在HA的分泌過程中被切掉。成熟HA具有HA1(325個殘基)和HA2(222個殘基)兩個亞基，這兩個亞基由單個精氨酸殘基連接，該殘基在成熟過程中被切掉，生成雙鏈HA。C末端的胺基酸順序(512-530)具有很強的疏水性，可能構成HA的跨膜區。有7個潛在的糖基化優點。HA作為三聚體存在，主要由二個明顯不同的結構區組成，一個是從膜開始伸出76
的α螺旋纖維狀捲曲系統，一個是反向平行的β片層球形區，後者含有受體結合位點和位於該區長軸頂端的可變抗原性位點。
與其它流感病毒亞型相比較表明，在所有病毒株中，順序中的許多區段，包括所有的半胱氨酸，都是保守的。這一事實提示，HA的功能活性需要一個基本結構。HA2的胺基酸順序比HA1保守性更大，因而株間變異是因為HA1順序的變化(Hiti等，Virology，111113-124，1981;Wiley等，Nature，289373-378，1981)。
Wilson等人說明了HA蛋白的三維結構(Nature，289366-373，1988)(見圖1)。它具有圍繞受體結合位點的5個抗原性位點A、B、C、D和E，受體結合位點以凹形袋狀結構存在。在流感病毒A/WSN/33株的HA中，對應於5個抗原性位點的位置鑑別如下位點A(胺基酸136-142)是一個凸環區，位點B(胺基酸183-192)是一個α-螺旋的外部殘基區，位點C是四級結構中位於半胱氨酸42和半胱氨酸274之間的二硫鍵處的膨出部分，位點D是位於亞基間界面內的隱蔽區，由胺基酸197-216組成，位點E由胺基酸52-74組成。產生新的流行性流感病毒株似乎需要5個抗原性位點中的每一個都發生至少一個胺基酸置換。此外，還觀察到針對這5個抗原性位點的抗體能中和病毒性感染。據信，由於位點A容易接近，它很適於產生高活性的中和性抗體(Wiley等，Nature，289373-378，1981;Wiley等，Ann.Rev.Biochem.，56365-394，1987)。
在本發明中，HA蛋白用作攜帶非HA或外源性抗原決定簇的載體。優選插入到HA5個抗原區中的一個或多個，最好插入到A區。更優選的插入位點是由胺基酸183-192所限定的區域。
B.示例性外源性抗原決定簇對本發明有用的外源性抗原決定簇，包括本領域技術人員已知的除HA蛋白抗原決定簇以外的任何抗原決定簇。與對應於天然存在的抗原決定簇的順序基本相同的肽和核苷酸順序，對本發明也是有用的。
外源性抗原決定簇的例子包括(但不限於)病毒性抗原決定簇(如HIV-1抗原決定簇、B型肝炎抗原決定簇、C型肝炎抗原決定簇、還原病毒抗原決定簇、單純皰疹病毒抗原決定簇);細菌蛋白抗原決定簇;IgE效應位點抗原決定簇(在變態反應中起作用);SP10抗原決定簇(一種妊娠抗原);包括乳腺癌抗原決定簇在內的腫瘤抗原決定簇;其它任何具有病理學意義的抗原決定簇及其中和性蛋白或其免疫原性部分。
術語「免疫原性部分」包括某種蛋白在任何條件下都具有免疫原性的各部分，包括那些在插入前呈免疫靜止狀態，而與HA蛋白融合後變成具有免疫原性或抗原性的部分。鑑別這類肽或抗原決定簇的方法是已知的(Chou等，Biochemistry，13222-245，1974;Holper等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，783824-3828，1981)。
術語「基本相同」包括相同的核苷酸或胺基酸順序以及經生物學、遺傳學或臨床技術修飾而具有基本相同的生物活性的順序。在核苷酸順序的情況下，生物活性可以是(例如)編碼能誘發相應抗體產生的抗原決定簇的能力。在胺基酸順序的情況下，生物活性的例子可以是誘發相應抗體形成的能力。這類活性的測定可以用本領域技術人員已知的方法進行，包括(但不限於)免疫螢光法、ELISA、Western吸印、放射自顯影等。
1.HIV抗原決定簇根據本發明，HIV-1病毒抗原決定簇是一類供插入HA中的外源性抗原決定簇。HIV是獲得性免疫缺陷綜合症(愛滋病)的致病因子。HIV-1基因組在gag區、pol區和env或病毒被膜區這三個區編碼三種病毒結構蛋白。gag區產生病毒核心蛋白。
最初合成的主要核心蛋白為前體蛋白p55。隨後通過由pol區編碼的病毒蛋白酶的作用，p55被加工為p17、p24、p15(p9和p6)。gag前體被認為在病毒顆粒於質膜處的組裝過程中起關鍵性作用(Gheysen等，Cell，59103-112，1989)。象大多數還原病毒gag蛋白一樣，p55(和加工後的p17)在其N末端被十四烷基化。
p24存在於HIV的內核上。p17似乎位於脂膜的內側面上，而p15由於其鹼性特徵強，可能與HIV基因組相連。p24是最早在愛滋病患者體內檢測到的HIV蛋白之一，並且，抗p24和p17的抗體存在於所有愛滋病患者體內。據認為，核心蛋白即gag能夠誘導細胞介導的免疫。
HIV-1的pol區編碼反轉錄酶、蛋白酶和核酸內切酶蛋白。
env區轉錄被加工成gp120和gp41的被膜蛋白gp160。主要被膜蛋白gp120作為「刺突」位於病毒粒子的外表面，跨膜蛋白gp41包括一段膜附著順序並作為gp120在HIV-1表面的附著位點。gp120含有T細胞受體(CD4)結合位點以及被中和性抗體識別的主要位點。
在反覆注射重組gp120或gp160後，誘導出低效價的中和性抗體。HIV的主要中和性決定簇位於gp120V3環的高可變區(胺基酸303-338)。由該肽產生的抗體具有病毒變異體特異性(Javaherian等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，866768-6772，1989)。
從同一感染個體中分離出了一系列抗原性不同的HIV。核苷酸順序分析也表明，各HIV-1分離物有顯著的變異。這些變異似乎集中在gp120中，使病毒能侵害大部分免疫監視機制。所預計的gp120中抗原決定簇的主要部分位於高可變區，並散布於高保守區(Modrow等，J.Virology，61570-578，1987)。gag和pol順序不具有高可變區。
已採用了數種方法生產愛滋病疫苗，例如滅活病毒、活的重組病毒、病毒亞單位蛋白等。這些方法到目前為止僅取得了有限的成功，這部分是因為HIV分離物相互間的遺傳變異。實際上可以相信，被膜中約25%的胺基酸可發生突變。與如上述合成寡肽的免疫原性相對照，已證實當以gp120形式呈遞給免疫系統時，HIV的保守區呈「免疫靜止」狀態。含有一般為免疫靜止的HIV保守區的抗原決定簇，在根據本發明被插入到HA的一個或多個抗原性位點中時則變得具有免疫原性。
幾種適合於本發明的HIV抗原決定簇列於下表1中
表 1HIV抗原決定簇
A肽的命名表示出肽的大小以及該肽的第一個和最後一個胺基酸。除了一個抗原決定簇外其餘抗原決定簇都來自病毒蛋白的保守區。有一個抗原決定簇即N22G對應於稱為V3環的gp120高可變區。
2.IgE抗原決定簇另一個適用於本發明的抗原決定簇是免疫球蛋白IgE的一部分。IgE以低濃度存在於血液中。它由重鏈和輕鏈二條鏈組成。IgE是總的血清免疫球蛋白中的次要成分，介導引起變態反應的速髮型超敏反應，所說的變態反應包括(但不限於)枯草熱、哮喘、食物和藥物過敏等。用合成的大鼠ε鏈或重鏈肽及抗肽抗體研究了IgE在觸發變態反應中的作用(Stanworth，Molecular Immunology，211183-1190，1984;Stanworth等，Molecular Immunology，271291-1296，1990)。循環的IgE與表達在肥大細胞和嗜鹼細胞表面的高親合性IgE Fc受體(FcεRI)結合。在IgE介導的反應中，多價變應原引起結合於受體上的IgE交聯，導致下面的FcεRI受體聚集，繼而觸發組胺及其它變態反應化學調節因子的釋放。反覆暴露於一種變應原導致特異性IgE的生成增加，因而增強了變態反應，有時導致致命性的變態反應。由於具有使結合有IgE的受體交聯的能力，單克隆和多克隆抗體是強效的變應原。
IgE還與存在於B細胞和T細胞上的低親合性IgE Fc受體(FcεRII)結合。該受體也稱為CD23，據信它在B細胞的IgE合成中起重要作用。
發現負責IgE與受體結合的位點及負責效應物活性的位點，存在於IgE分子的不同部分。當結合位點位於IgE的CH3和CH4兩個區中時，效應物或觸發物位點位於CH4區。觸發物位點的肽的特徵在於，由三個胺基酸將N末端陽離子「頭」與親水性尾分開。研究表明，該肽介導肥大細胞中應答變應原刺激的免疫觸發信號(Stanworth等，Lancet，3361279-1281，1990)。該肽的胺基酸順序是Lys-Thr-Lys-Gly-Ser-Gly-Phe-Phe-Val-Phe，它對應於人IgE重鏈的胺基酸497-506。該肽可以從下列二條互補寡核苷酸進行合成
K T K G S G F F V F5′ AAA ACC AAG GGA TCA GGA TTC TTT GTA TTC GGG GCC 3′CCGG TTT TGG TTC CCT AGT CCT AAG AAA CAT AAG CCSty1 Apa1該抗原決定簇存在於編碼H22V的核苷酸順序中，H22V的胺基酸順序為HSTTQPRKTKGSGFFVFSRLEV。該肽可從下列核苷酸順序合成Apa 1 H S T T Q P R K T KCAC AGT ACT ACA CAG CCC CGC AAA ACC AAGCCGG GTG TCA TGA TGT GTC GGG GCG TTT TGG TTCG S G F F V F S R L E VGGA TCA GGA TTC TTT GTA TTC TCA CGC CTA GAG GTG GCCCCT AGT CCT AAG AAA CAT AAG AGT GCG GAT CTC CAC.HA嵌合肽本發明的HA嵌合肽可用作疫苗，以產生對該肽內若干順序具有混合特異性的肽特異性抗體。這些抗體具高親和力，適用於診斷及免疫治療。本發明範圍內的肽也能預防性給藥以預防感染。可通過本領域技術人員已知的任何手段作為疫苗給藥或為進行免疫治療而給藥，包括(但不限於)口服給藥、直腸給藥、經鼻給藥、頰部給藥或非腸道給藥。用於免疫治療中的疫苗或藥物組合物還包括本領域常用的任何可藥用載體或佐劑。
可以在任何HA嵌合體中插入一個或多個抗原決定簇，以提供二價、三價、四價或五價嵌合體HA。位於每個插入位點的抗原決定簇可以相同或不同。如果抗原決定簇是相同的，將看到遠強於單價HA嵌合體的抗體反應。如果抗原決定簇不相同，將產生多抗體反應。還可以插入不止一個拷貝的一種抗原決定簇和一個或多個其它抗原決定簇，以產生增強的抗體反應和多抗體反應。這種方法的一個具體應用是設計一種多價疫苗，它可以用來同時針對若干疾病或病原株進行接種。
可藉助本領域技術人員已知的手段確定在每一種應用中肽的有效量。例如，用本發明活性劑的連續稀釋製備物與某種適宜的測試方法相配合，能確定最適劑量。另外，可以確定各種劑量的基質和給藥頻率，並且可以將實驗對象分組配給基質的每個部分，以確定最佳條件。
通常在一種疫苗中，將HA-抗原決定簇嵌合抗原與一種佐劑即Syntex佐劑或明礬充分混合，並給宿主注射約1-100μg。可以對宿主定期(即每隔4周)進行加強免疫，直到獲得高效價的抗肽抗體。在同一疫苗中可以混合不止一種相似或不相似的HA-抗原決定簇蛋白。疫苗的製備一般包括，將帶有外源抗原決定簇順序(如HIV抗原決定簇順序)的HA基因，插入到合適的表達載體中。在組織培養中表達新的蛋白質，並分離嵌合蛋白。然後給適宜的動物接種。
本發明的HA-抗原決定簇抗原也可用於診斷與抗原的接觸或病毒感染。ELISA是檢測血液中是否存在感染性病毒抗原最常用的方法(Current Protocol in Molecular Biology，John Wiley Son，1989)。通常用肽特異性(俘獲)抗體塗布微量滴定板的各小孔，然後與含病毒抗原的血清一起保溫。洗掉未結合的抗原，並加入結合了檢測載體如酶、辣根過氧化物酶的另一種抗原。然後通過例如基質底物的反應檢測酶的存在。
所產生的針對本發明HA-抗原決定簇嵌合蛋白的抗體，可用於這些診斷方法和診斷藥盒中。用針對上述HA-HIV抗原決定簇和HA-B型肝炎或C型肝炎抗原決定簇而產生的抗體進行篩選極為有效。
同樣，可通過將可疑樣本，如血液或其一部分，與本發明的嵌合抗原接觸，檢測抗體的存在。
本發明的HA-抗原決定簇嵌合蛋白也可用於免疫治療。例如，在治療對象已經受到感染的情況下，用所產生的針對本發明HA-抗原決定簇蛋白的病原特異性抗體或中和性抗體抑制感染和疾病發生。這將包括被動免疫，因為含有針對感染因子的中和性抗體的免疫球蛋白可用於抑制或控制感染。被動免疫的例子包括針對動物或人的狂犬病免疫、用單克隆抗體治療由革蘭氏陰性細菌引起的膿毒性休克綜合症、以及抗HIV免疫。
編碼本發明嵌合蛋白的基因組可以插入到表達載體系統中。適宜的表達載體包括BPV(牛乳頭狀瘤病毒)基表達載體、二氫葉酸還原酶(dhfr)相關載體、腺病毒載體或牛痘病毒載體。特別要提到的是杆狀病毒表達系統，如感染昆蟲細胞如草地粘蟲(Sfg)的苜蓿銀紋夜蛾核多角體病毒(AcMNPV)。
在感染過程中，杆狀病毒製造大量的多角體蛋白，後者促使病毒封閉於包涵體中。已經證明，多角體基因對病毒的感染或複製是非必需的。該基因的缺失產生包涵體陰性病毒。通過轉移載體與野生型DNA間的同源重組產生重組杆狀病毒。轉移載體(如pVL941)包括含有多角體啟動子的病毒DNA片段(見實施例3)。需表達的基因插入到啟動子順序的下遊。
插入到表達載體中的基因可以象腺病毒或牛痘病毒疫苗等活病毒疫苗那樣來施用。插入基因還可通過轉化適宜宿主如大腸桿菌和純化產物而大量表達。
所有的核苷酸順序、肽及含有它們的組合物，都可通過重組技術或合成進行製備。
下面的實施例用於說明本發明。HA的核苷酸順序和胺基酸順序的編號如Hiti等所述(Virology，111113-124，1981)。HA基因得自人流感病毒A/WSN/33株。酶反應、質粒DNA製備、位點特異性突變及細菌和哺乳動物細胞轉化等常規重組DNA方法，按照供貨商的說明或Sambrook等所述進行(Molecular Cloning，A Laboratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989)。除非特別說明，所有給出的份數和百分比均按重量計。
實施例1-7說明在HA的抗原性位點A構建一個插入位點，其中外源性抗原決定簇插入到該位點產生嵌合蛋白。實施例8說明用相似的方法有可能在HA的其它已知抗原性位點上構建插入位點。然後將外源性抗原決定簇插入到任何新構建的HA位點中，實施例8特別說明了在HA胺基酸184/185位置上構建獨特的Bgl Ⅱ限制性位點，所說胺基酸位置是抗原性位點B的一部分。實施例9表明多個HA插入位點的應用。
實施例1HA表達載體的構建參見圖2。用BamHI消化攜帶HA基因完整編碼順序的質粒pHAX(也稱為pSV-HA質粒，見Hartman等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，79233-237，1982)，分離出1.75kb片段。然後將這個編碼HA的DNA片段插入至pTZ19R(Pharmacia公司)的BamHI位點，以獲得重組克隆ptz19HA。
用ptz19HA分離含有作為正鏈攜帶的HA順序的單鏈DNA(Baldari等，Gene，3527-32，1985)。該DNA用於完成用下列寡核苷酸進行的寡核苷酸介導的位點突變，該寡核苷酸為5′-TCT GTA AAA ACT GCT TTT TCG GGC CCT ATG GGA GCA TGA TAC-3′(＃972)。上述寡核苷酸對應於在中間插入了ApaⅠ位點(GGGCCC)的HA基因的bp480-518。上述寡核苷酸所致的突變和大腸桿菌JM109細胞的轉化，是按已發表的研究報告進行的(Sambrook等，Molecular Cloning，A Laboratory Manual，p15-51，1989)。發現克隆ptz HA139-15具有新構建的ApaⅠ位點，其中gly139被ala-arg置換，而順序的其餘部分保持不變。這是由該區的DNA順序分析所證實的。
實施例2蛋白抗原決定簇的插入再參見圖2。用磷酸三酯法合成編碼不同肽的互補寡聚體(Crea等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，705765，1978)。將等摩爾濃度的互補寡聚體混合，得到帶有側翼ApaⅠ順序的雙鏈寡聚體。連接前，用ATP和T4DNA激酶按供貨商的說明(Pharmacia公司)將寡聚體的5′端磷酸化。用ApaⅠ消化約10μg ptzHA139-15，並用細菌鹼性磷酸酶脫磷酸化(Sambrook等，MolecularCloning，A Laboratory Manual，1989)。經ApaⅠ切割的約100ng質粒和1μg寡核苷酸分別進行連接，並用於轉化大腸桿菌。用放射標記的寡聚體進行原位雜交，篩選細菌菌落。然後對含有插入片段的潛在重組克隆測序，以確定插入片段的正確取向以及正確的讀碼。使用了表1和圖2中的9個HIV抗原決定簇。
實施例3重組杆狀病毒的構建利用標準的重組DNA技術(Sambrook等，Molecular Cloning，A Laboratory Manual，1989)將以BamHI順序為側翼的1.75kb HA或HA/HIV抗原決定簇嵌合基因，分別插入由AcMNPV衍生的轉移載體pVL941(得自Dr.Max D.Summers，描述於A Manual of Methods for Baculovirus Vectors and Insect Cell Culture Procedures，Texas A M University，College Station，TX，1988)。在多角體啟動子的轉錄調控下表達異源蛋白基因。用磷酸鈣沉澱法(Smith，G.E.等，Molec.Cell Biol.，32156-2165，1983)使野生型病毒AcMNPV DNA(1μg)和重組轉移質粒DNA(2μg)一起共轉染到Sf9細胞中，產生含有所需基因的重組杆狀病毒。六天後，收集含有野生型和重組杆狀病毒的培養基，並通過有限稀釋法，以連續稀釋病毒感染的Sf9細胞的32P標記HA基因在96孔板中進行雜交，鑑定重組病毒(Germann等，J.Biol.Chem.，2647814-7824，1989)。進行3至5輪雜交篩選後獲得純的包涵體陰性(多角體陰性)病毒，如編碼HA-N22G蛋白的AcHA-N22G，該病毒在Sf9細胞中繁殖。
以每個T-150(150cm2)培養瓶約7×107個細胞的密度接種Sf9細胞。另一種作法是將Sf9細胞作為懸浮培養在旋轉瓶中培養至密度為2-3×106個細胞/ml。用重組病毒以5-10的感染複數(MOI)感染細胞。3-4天後，HA嵌合體的表達達到最高水平，此時收集細胞。用PBS洗滌後，再用含有等量Triton×100和脫氧膽酸鹽的1%去汙劑混合物提取細胞，以分離膜結合HA或HA嵌合體。因為HA是一種糖蛋白，所以使提取物通過外源凝集素Sepharose 4B(兵豆外源凝集素，得自Sigma化學公司-St.Louis，MO)親和柱進行部分純化。將部分純化的HA或嵌合體用於免疫動物(豚鼠)，以評估其作為免疫原的效力。
實施例4HA和HA/HIV嵌合蛋白的生物特性用高滴度(109pfu/ml)重組病毒感染新鋪板的Sf9細胞。三天後收集細胞，並按實施例3的方法進行處理以分離重組蛋白。經凝膠考馬斯藍染色，估計重組蛋白佔細胞總蛋白的約10-20%。約2-10%的重組蛋白可用去汙劑提取，並可能呈現天然形式。其餘蛋白為貯存於細胞內的不溶性蛋白。合成的HA和HA-HIV嵌合蛋白為三條帶。較下的條帶(約55KD)代表非糖基化形式，因為用糖基化抑制劑衣黴素處理過的被感染細胞只產生該蛋白帶。上面兩條帶(68KD和66KD)可能代表不同的糖基化加工程度，當用去汙劑提取重組HA杆狀病毒感染的細胞時，只有66KD蛋白帶是可提取的，表明此蛋白是連在膜上的，可能代表HA的天然形式。
用兔抗流感病毒(A/WSN/33)血清和螢光素結合的第二抗體即羊抗兔IgG，進行免疫螢光檢測(Posse，Virus Res.，543-59，1986)。用重組病毒感染的細胞表現出強的膜螢光。模擬感染的細胞和野生型感染的細胞沒有顯示出任何螢光。
通過用1%雞紅細胞進行血細胞吸附和血細胞凝集，檢測被重組杆狀病毒感染的Sf9細胞的生物活性(Posse，Virus Res.，543-59，1986)。用重組HA杆狀病毒感染的細胞表現出顯著的血細胞吸附作用，而用野生型或編碼HA-HIV嵌合體(N22G、D18S和T16G)的重組杆狀病毒感染的其它細胞在該測定中未顯示出任何活性。當用細胞去汙劑提取物進行血細胞凝集時，獲得了相似的結果。這些結果表明，HA中HIV抗原決定簇的插入影響了介導HA生物活性的受體結合位點。HA上的受體結合位點鄰近抗原決定簇所選擇性插入的抗原性位點A(圖1)。
實施例5豚鼠對注射HA-HIV嵌合體蛋白的免疫反應根據實施例3的方法製備編碼HA-N22G和HA-D18S的重組杆狀病毒，並用來感染20-30個T150燒瓶中的Sf9細胞，感染複數為10。感染後72小時收集細胞，用PBS洗3次，並進行純化處理。用部分純化的HA或HA嵌合蛋白免疫豚鼠。每隔4周進行加強免疫注射。每次注射後二周採集血清。
通過血細胞凝集抑制(HA)試驗測定血清的效力，該試驗測定的是抗血清抑制4單位重組HA和1%雞紅細胞所顯示的血細胞凝集反應的能力。所有血清首先以1∶10進行稀釋，再用高嶺土(100mg/ml/ml)處理以去除天然抑制劑。高嶺土處理並不影響抗體效價。
結果在表2中說明。
在第二次注射後，所有抗重組HA或HA-HIV嵌合蛋白的血清所具有的HI效價，從針對N22G的160到針對D18S的5120各不相同。無抗原對照血清的效價為20。
在第三次注射後，所有動物體內的HI效價都有進一步的提高。用從AcHA-N22G重組杆狀病毒感染的細胞製備的粗質膜免疫的動物，也產生60-80的HI效價。HI效價等於或大於40被認為在給人進行疫苗接種時能起預防流感病毒感染的作用。
當用異源流感病毒株(A+臺灣)的HA重複上述實驗時，未觀察到中和作用，這表明杆狀病毒或所表達的HA抗原能誘導病毒株特異性中和性抗體。此外，如Western吸印所顯示。抗HA-D18S和HA-N22G的抗血清含有對HIV gp160有反應性的抗體。HA-N22G免疫的結果示於表3中。
抗原決定簇N22G對應於HIV gp160的主要中和性區域，因此是疫苗研製的主靶(Javaherian等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，866762-6772，1989)。用重組HA或HA-N22G重複進行動物實驗，首先用含1-2μg HA或嵌合蛋白的部分純化製備物免疫動物，然後加強免疫3次。通過下述方法測定抗插入肽N22G抗體的產生(Ⅰ)抗肽(N22G)ELISA;(Ⅱ)被膜gp160的Western吸印;(Ⅲ)體外中和試驗(如表3所示)。在第二次(2°)和第3次(3°)加強免疫後，動物在所有三個測定中都表現出特異性高效價抗體的產生。正如所預料的，用HA免疫的動物在這些測定中未顯示出任何活性。在用HA-N22G免疫的動物中產生抗HIV感染的中和性抗體是特別令人感興趣的。
表2在第2次(2°)和第3次(3°)注射2周後採集的豚鼠血清的血細胞凝集抑制(HA)效價抗原 豚鼠號 高嶺土 HAI 效價2° 3°HA A + 1280 10240B + 1280 2560N22G C + 160 -aD + 160 -D18S E + 5120 10240F + 640 3790無b9 + 20 4010 + 20 60N22G粗膜 11 + 80 N.D.
12 + 60 N.D.
流感病毒WSN 兔313 + 5120- 5120a 兩隻動物都在採血時死亡。
b 未經高嶺土處理的正常血清的HI效價為320。
c N.D.＝未測。
表3用HA和HA-N22G(HIVMN V3環胺基酸307-330)免疫的豚鼠的血清學分析(每組二隻動物)
-＝陰性。
N.D.＝未測。
實施例6HA-IgE(HA-K10F)抗原決定簇的製備通過修飾側翼限制性位點促進重組HA基因在杆狀病毒轉移載體pBL1(Vialard等，J.Virology，6937-50，1990)中的克隆。用BamHI消化約2μg ptzHA-139-15，分離1.75kb DNA片段。在用DNA聚合酶Klenow片段和脫氧核苷三磷酸(dNTP)進行填充後，將該DNA片段插入到HindⅢ/填充pGEM-9zf(-)質粒(Promega Biotec-Madison，WI)中，獲得pHA.Nhel。在用SpeⅠ和XbaⅠ消化後，從該質粒中切下以1.75kb DNA片段存在的HA或嵌合HA基因。
用ApaⅠ消化約1μg pHA.Nhel質粒DNA，然後用細菌鹼性磷酸酶脫磷酸化。合成編碼K10F肽的二個互補寡核苷酸K T K G S G F F V F5′ AAA ACC AAG GGA TCA GGA TTC TTT GTA TTC GGG GCC 3′CCGG TTT TGG TTC CCT AGT CCT AAG AAA CAT AAG CCSty1 Apa1將等摩爾量的兩個寡聚體混合，並用T4多核苷酸激酶和ATP進行磷酸化。將約0.1μg脫磷酸化的載體和1μg雙鏈寡聚體連接，然後用於轉化大腸桿菌MM294細胞。
從12個克隆中製得微量製備物，用StyⅠ消化，以篩選出含有插入寡聚體的克隆。發現克隆pHA.Nhe-hIgE-11在正確編碼順序中含有插入的核苷酸順序。核苷酸順序測定證實了在所需位點上的正確順序。用SpeⅠ和XbaⅠ一起消化約10μg該質粒，分離1.8kb DNA片段。
用NheⅠ消化約10μg杆狀病毒轉移載體pBlueBac(pBL1-Invitrogen Corp.-San Diego，CA)，並用BAP脫磷酸化。用約等摩爾量的1.8kb DNA和經NheⅠ切割的載體連接，然後用連接混合物轉化大腸桿菌MM294細胞。選擇12個克隆製備微量質粒製備物，鑑定出克隆pBL-HA-K10F-5-2具有正確取向的HA.K10F基因。
為了獲得重組杆狀病毒，利用磷酸鈣沉澱法(Summers等，AManual of Methods for Baculovirus Vectors and Insect Cell Culture Procedures，Texas AM University，College Station，TX，1988)，用約1μg野生型病毒AcMNPVDNA和2μg重組轉移載體pBL-HA-K10F-5-2轉染Sf9昆蟲細胞。通過轉移載體和野生型病毒DNA間的同源重組產生重組杆狀病毒。轉染6天後，收集含有野生型病毒和重組病毒混合物的培養基。在經連續稀釋(10-3-10-6)後，用該培養基感染在100mm培養皿中新鋪板的Sf9細胞，然後在培養皿中鋪蓋含β-半乳糖苷酶底物X-ga1的瓊脂糖。通過若干輪噬斑純化，對出現藍色噬斑的重組病毒進一步純化(Vialard等，J Virology，6937-50，1990)。該重組杆狀病毒被命名為AcHA.K10F。用抗肽兔抗體進行感染的Sf9細胞蛋白的Western吸印分析，測定嵌合蛋白HAK10F的表達。在為大規模生產和純化進行培養後，用嵌合體作為疫苗。
實施例7HA-IgE(HA-H22V)抗原決定簇的製備按實施例6的方法，將編碼肽H22V的核苷酸順序插入到HA基因中，然後在杆狀病毒表達系統中進行表達。合成二個互補寡核苷酸Apa 1 H S T T Q P R K T KCAC AGT ACT ACA CAG CCC CGC AAA ACC AAGCCGG GTG TCA TGA TGT GTC GGG GCG TTT TGG TTC
G S G F F V F S R L E VGGA TCA GGA TTC TTT GTA TTC TCA CGC CTA GAG GTG GCCCCT AGT CCT AAG AAA CAT AAG AGT GCG GAT CTC CA將該雙鏈寡聚體插入到pHA.Nhe1的ApaⅠ位點，獲得重組pHA-Nhe-H22V。將從上述質粒中獲得的1.8kbSpeⅠ/XpaⅠ DNA片段插入pBL1的NheⅠ位點，獲得重組轉移質粒pBL-HA-H22V-1。通過該質粒和AcMNPVDNA的同源重組獲得重組杆狀病毒AcHA-H22V。在感染Sf9細胞後，該重組杆狀病毒表達HA-H22V嵌合蛋白，經純化後可用作疫苗。
實施例8構建在位點B、C、D和E處建立起插入位點的HA表達載體用攜帶HA基因的重組質粒ptz19HA製備單鏈DNA(Baldari等，Gene，3527-32，1985)。用下列寡聚體完成對該DNA的位點特異性突變5′ ACT CTG TTG CTC AGA TCT GCT GGA CGG GTG ATG AAC 3′。該寡核苷酸對應於在其中部插入了Bgl Ⅱ限制性位點(AGATCT)的HA基因的bp615-650(胺基酸178-189)。由該寡聚體所致的突變和大腸桿菌JM109的轉化按已發表的研究報告進行(Sambrook等，Molecular Cloning，A Laboratory Manual p15-51，1989)。發現克隆ptzHA184-1具有新構建的Bgl Ⅱ位點。這是由該區的DNA測序證實的。突變導致分別以arg和Ser殘基置換Ser184和asp185，而該順序的其餘部分保持不變。
實施例9構建含多個插入位點的HA表達載體構建了二個插入位點，它們分別位於HA的抗原性位點A和位點B，這兩個位點可以插入二個相同或不同順序的的抗原決定簇。實施例1所述的重組質粒ptzHA139-15含有HA基因，其中在相應於抗原性位點A的順序處構建了獨特的限制性位點ApaⅠ。以實施例8的寡聚體順序使從上述質粒製得的單鏈DNA突變，該寡聚體順序是為構建出位於位點B的獨特Bgl Ⅱ識別順序而設計的。發現克隆pHA139/184具有二個新構建的位點ApaⅠ和BglⅡ，隨後通過相關區的DNA測序得以證實。然後將相同或不同的外源性抗原決定簇插入到任何一個已知的HA抗原性位點中。
實施例9的方法可以擴展而包括在對應於HA的抗原性位點C、D和/或E的區域中構建其它獨特限制性位點。這裡所說的獨特限制性位點包括並不存在於HA或質粒ptz19R順序中的位點。除ApaⅠ和BglⅡ外，其它獨特限制性位點的例子有Af1Ⅱ、AvrⅡ、BclⅡ、NheⅠ、XhoⅠ等。
實施例10用抗N22G抗體進行被動免疫以預防HIV感染在個體偶然接觸到被感染的血液或任何血液衍生成分的情況下，被動免疫是有用的。該應用也適合於控制母親對胎兒的HIV傳染。施用HIV-1 V3環(N22G)特異性抗體能預防感染發生(Berzofsky，J.A.等，「抗HIV疫苗研製的途徑和問題」，J.Acquired Immune Deficiency Syndromes，4451-459，1991)。
為了獲得大量的N22G肽特異性抗體，通過多次注射免疫大型動物(例如馬)，直到如實施例5和表3所述獲得高效價抗HIV-1中和性抗體。給動物放血獲取血清。然後按供貨商的說明(GIBCO BRL，Life Technology，Inc.Gaithersburg，MD)使血清通過蛋白A瓊脂糖親和柱，以富集IgG部份。IgG部份含有HIV-1特異性抗體。將用適當載體配製的適量IgG注射給懷疑接觸過HIV-1的個體。通過對人的臨床試驗確定注射劑量和時間。
上面提到的專利、出版物和試驗方法，都引入本文作為參考。
根據上面的詳細說明，對本發明進行多種改變是本領域技術人員容易做到的，並且也包括在本發明及所附權利要求書的範圍內。
本申請所提出的疫苗提供了由病毒、細菌及腫瘤抗原性物質所致感染的預防作用，因為它使宿主產生針對外源性侵入物的中和性抗體，從而預防了疾病的進一步發展。例如，前面所述的在豚鼠體內產生的抗體，將在侵入的HIV進入細胞並在細胞繁殖之前就把它中和(殺死)。通過例如用抗HIV的人單克隆抗體與經修飾的本發明HA-HIV複合物反應，可證明本發明的抗原性多肽起到導入到HA中的外源性抗原決定簇的抗原作用。
各種佐劑可與本發明的抗原性多肽一起使用，所說的佐劑包括Syntex佐劑、明礬(0.2%緩衝水溶液)、免疫刺激複合物(ISCOM)、破傷風類毒素、白喉類毒素、糖苷Quit A佐劑(Spikoside;Iscotec AB)(Morein等，Nature 308457-460，1984)、胞壁醯二肽衍生物(MTP-PE)(分散於低油乳劑MF59中)、最好是膽甾醇半琥珀酸酯(CHS)基脂質體(WO90/01947，1990年3月8日;WO90/1948，1990年3月8日;US 4，721，612)。
通過將抗原性多肽與佐劑在室溫下混合，常規性製備疫苗。
根據疫苗的配製方法，可通過口服、腸道外、直腸、經鼻，最好是肌內注射，給有感染危險的病人接種，有效劑量為1至約500μg，通常是5-300μg，有可能是15-100μg，單次劑量或多次劑量。可應用加強免疫以達到所需的中和性抗體效價(在HIV情況下為300)。根據病情的不同，可在約1年內進行加強免疫。
本申請通篇在提到特異性抗原決定簇時，要麼指出末端胺基酸的本性和胺基酸順序的長度，如N22G，其中N末端胺基酸是Asn，C末端胺基酸是Gly，順序長度為22個胺基酸;要麼用見於文獻中的該順序的俗名表示，如gp160和gp120。
插入到HA蛋白的至少一個抗原性位點的胺基酸順序長度最好至少為12個胺基酸。
權利要求
1.一種製備抗病毒、病原菌或其它抗原疫苗的方法，其中，使一種肽與一種佐劑混合或結合，所述肽含有與具有5個免疫顯性抗原性位點的甲型流感病毒HA表面蛋白基本相同的胺基酸順序，所說的肽在至少一個所說抗原性位點插入了一段胺基酸順序，該順序與功能性呈遞所說病毒、病原菌或其它抗原的外源性抗原決定簇基本相同。
2.權利要求1的方法，其中所說的抗原性位點是HA蛋白的A區。
3.權利要求1的方法，其中所說的抗原性位點相應於HA蛋白的胺基酸183-192。
4.權利要求1-3中任一項的方法，其中所說的插入是至少12個胺基酸單位的胺基酸順序。
5.權利要求1-4中任一項的方法，其中外源性抗原決定簇是病毒抗原決定簇、IgE效應位點抗原決定簇、細菌蛋白抗原決定簇、腫瘤抗原決定簇或SP10抗原決定簇。
6.權利要求1-4中任一項的方法，其中外源性抗原決定簇是HIV抗原決定簇。
7.權利要求6的方法，其中抗原決定簇是T20E、T16G、D18S、G20E、K27R、E14Q、N22G、p17、p24、gp160或gp120。
8.權利要求1-7中任一項的方法，其中佐劑是Syntex佐劑或明礬。
9.一種製備肽的方法，所說的肽含有與具有5個免疫顯性抗原性位點的甲型流感病毒HA表面蛋白基本相同的胺基酸順序，所說的肽在至少一個所說抗原性位點插入了一段與一種外源性抗原決定簇基本相同的胺基酸順序，該方法包括，通過重組DNA技術構建含有編碼所說肽的DNA順序的可複製表達載體，轉化適宜的宿主細胞以導入所說的表達載體並獲得轉化的宿主細胞，培養轉化的宿主細胞以表達所說的肽，回收所說的肽。
10.權利要求9的方法，其中所說的抗原性位點是HA蛋白的A區。
11.權利要求9的方法，其中所說的抗原性位點相應於HA蛋白的胺基酸183-192。
12.權利要求9-11中任一項的方法，其中所說的插入是長度至少為12個胺基酸的胺基酸順序。
13.權利要求9-12中任一項的方法，其中外源性抗原決定簇是病毒抗原決定簇、IgE效應位點抗原決定簇、細菌蛋白抗原決定簇、腫瘤抗原決定簇或SP10抗原決定簇。
14.權利要求9-12中任一項的方法，其中外源性抗原決定簇是HIV抗原決定簇。
15.權利要求14的方法，其中抗原決定簇是T20E、T16G、D18S、G20E、K27R、E14Q、N22G、P17、P24、gp160或gp120。
全文摘要
提供了嵌合DNA片段，它包括與編碼具有5個免疫顯性抗原性位點的甲型流感病毒HA表面蛋白的核苷酸順序基本相同的核苷酸順序，其中，與編碼外源性抗原決定簇的核苷酸順序基本相同的核苷酸順序被插入到抗原性位點的核苷酸順序中。還提供了相應的嵌合肽、表達載體及轉化的宿主。這些肽可用於提供抗不同抗原的疫苗，並可用於檢測這類抗原存在的檢測藥盒中。此外，這些肽或其相應抗體可用於治療和預防由於接觸這些抗原而引起的症狀的方法，包括免疫療法。
文檔編號G01N33/53GK1073878SQ9211370
公開日1993年7月7日 申請日期1992年12月10日 優先權日1991年12月11日
發明者洪伯文, 林少光, N·K·卡利揚 申請人:美國家用產品公司