改善了靶細胞受體結合活性的融合蛋白質的製作方法

2023-09-16 17:11:50

專利名稱：改善了靶細胞受體結合活性的融合蛋白質的製作方法
技術領域：
本發明涉及出假單胞菌衍生的重組毒素與細胞因子連接而成的融合蛋白質，特別是涉及以重組DNA技術修飾作為導向部分的細胞因子，以提高與毒素部分融合所產生的融合蛋白質的靶細胞受體結合活性。
可使用連接到生長因子、細胞因子、抗體、激素及其他細胞導向分子上的毒素殺傷攜帶特異性受體的有害細胞[Pastan et al．，Cell 47641(1986)；Vitetta et al．，Science 2381098(1987)]。可使多種細胞或植物來源的毒素或內毒素作為細胞毒性劑，但其中使用最為廣泛並且最具開發前景的是由銅綠色假單胞菌(Pseudomonas aeruginosa)分泌的假單胞菌外毒素A(PE)。已知PE進入真核細胞後，通過催化細胞內ADP的核糖基化而失活延伸因子(EF-2)，進而抑制真核細胞中的蛋白質合成，導致細胞死亡。
X射線晶體學研究和突變分析證明，PE分子包括有三個與產生細胞毒性有關的結構區負責與敏感細胞結合的氨基末端受體結合區(Ⅰ區)、負責使毒素與分子轉位到細胞溶質內的中間轉位區(Ⅱ區)，以及負責失活靶細胞蛋白質並引起細胞死亡的羧基末端酶促活性區(Ⅲ區)。其中Ⅰ區包括介導細胞結合的Ⅰa區(胺基酸1-252)和目前未完全了解其功能的Ⅰb區(胺基酸365-399)。對Ⅰ區的突變分析顯示，第57位賴氨酸(Lys57)在受體結合中起到重要作用，並已顯示Glu553、Tyr481和His626對ADP核糖基化活性是不可缺少的。研究表明，Ⅱ區的某些部分對PE分子保留細胞毒性具有重要作用。為消除PE分子的非特異性細胞結合活性而刪除了Ⅰa區，同時保留轉位和ADP核糖基化功能的部分EP分子稱為PE40(分子量約40KDa)。
近年來，關於嵌合毒素的基礎和應用研究主要集中在PE分子上。研究者試圖通過對PE分子各不同功能區或個別胺基酸的刪除或取代來降低毒素分子的非特異毒性，提高對靶細胞的特異毒性、改善分子的受體結合活性和對靶細胞的內化能力，以及降低嵌合毒素的免疫原性或插入不同的識別分子。例如，美國專利5，705，163的主題涉及PE分子的羧基未端在其細胞毒活性中的作用，以及PE分子羧基末端上適於插入為選擇性殺傷靶細胞所需的識別分子(導向分子)的特定區域；美國專利5，821，238公開了缺失Ⅱ區之氨基末端的1至28個胺基酸(例如胺基酸364直接連接到殘基381上的經修飾的PE)，從而顯著提高了對靶細胞的細胞毒性的修飾的PE。美國專利5，621，078公開了用丙氨酸取代殘基265和287上的兩個半胱氨酸；或者用丙氨酸取代殘基265、287、372和379上的四個半胱氨酸，以得到改變了生物學活性(包括提高了細胞殺傷活性並降低了受體結合活性)的修飾的PE分子(還參見歐洲專利申請6，383，599)。
然而，一個不容忽視但目前未引起普遍關注的問題是，為了使嵌合分子與靶細胞表面受體更有效地結合，它必須具有適當的空間構象。這種適當地構象不僅取決於嵌合分子的毒素部分，而且也在很大程度上受到導向(或尋靶)部分的影響。兩個部分融合後，在形成新的二維和三維結構時，導向部分應有足夠的配體結合基團暴露於受體分子，並與之穩定地結合。特別是在使用已刪除了受體結合區(Ⅰa區)的PE40作為毒素部分的情況，這一點就顯得尤為重要。本發明人在成功地構建了可選擇性地殺傷表達的細胞介素6(IL-6)受體的IL6-PE融合蛋白質的基礎上，試圖進一步對IL6分子進行必要的修飾，進而將其偶聯到同樣經過修飾的PE40分子上。結果令人驚奇地發現，與未修飾IL6-PE40相比，經修飾IL-6後製得的融合蛋白質大大提高了其受體結合活性和對攜帶IL-6受體之靶細胞的細胞毒活性，從而成功地完成了本發明。
本發明的一個目的是提供包括連接到細胞毒性蛋白質上的IL-6的融合蛋白質，特徵在於其中作為導向部分的IL-6的氨基末端最多的超過28個胺基酸的缺失。
根據本發明這一目的的優選實施方案，其中所說的IL-6是缺失了氨基末端22個胺基酸的IL-6。
根據本發明這一目的的優選實施方案，其中所說的細胞毒性蛋白質是PE40。
本發明的另一個目的是提供含有上述修飾的IL-6-PE40融合蛋白質及一種或多種醫藥上可接受的載體或賦形劑的藥物組合物。
根據本發明這一目的的一個特別優選的實施方案，其中所說的IL-6-PE40融合蛋白質分子中作為導向部分的IL-6是缺失了氨基末端22個胺基酸的修飾的IL-6。
本發明的再一個目的是涉及按本發明的方法製得的修飾的IL-6-PE40融合蛋白質作為抗腫瘤劑的應用。


圖1顯示用於表達IL6(△1-22)-PE40的重組質粒pKIL6P40的構建。
圖2顯示IL6(△1-22)-PE40對各種培養的腫瘤細胞系的蛋白質合成抑制作用；●-●，SP2／0細胞；▲-▲，HepG2細胞；■-■，HL-60細胞；※-※，Hep2細胞；○，L929細胞；△，K562細胞；□，HeLa細胞。
圖3顯示IL6(△1-22)-PE40與未經修飾的IL6-PE40嵌合毒素對SP2／0細胞系的蛋白質合成抑制作用的比較。結果以相對於未加嵌合毒素的陰性對照組的百分抑制率表示。●-●，IL6(△1-22)-PE40；△-△，IL6-PE40。
圖4顯示部分純化的IL6(△1-22)-PE40對與SP2／0細胞漿膜結合的125I-IL6的置換。○，IL6(△1-22)-PE40；●，IL6-PE40。
圖5顯示純化的IL6(△1-22)-PE40和未修飾的IL6-PE40對接種腫瘤細胞(SP2／0細胞系)的BALB／c小鼠體內腫瘤生成的影響。結果以治療10天後帶瘤小鼠的百分數表示。交叉線用方框代表IL6(△1-22)-PE40；豎直線直方框代表IL6-PE40。
本發明涉及改良的靶細胞特異性嵌合毒素，特別是涉及通過修飾所說的嵌合毒素分子中的導向部分以改善所說的嵌合毒素與靶細胞受體的結合特異性及穩定性。作為一個典型實例，本發明具體描述了包括由IL-6的受體結合部分和PE的活性區域組成的融合蛋白質，其製備方法、含有基本上純的所說的融合蛋白質的藥物組合物，以及所說的藥物組合物在控制腫瘤細胞生長中的應用。
人白細胞介素(IL-6)是正常哺乳動物細胞產生的一種多功能細胞介素，其具有刺激多種類型的細胞分化與生長的功能。已知成熟的人IL-6由184個胺基酸組成，分子氨基端主要是生物學活性區，羧基末端主要是受體結合區，兩區域形成反向平行的A、B、C、D四個螺旋束。已證實天然IL-6缺失第1-28位胺基酸對分子整體的生物學活性沒有明顯影響。但如缺失Arg31或Asp35則可使其活性分別降低50和10，000倍。根據對人和鼠IL-6原始結構的疏水性和同源性比較，推測殘基Glu29-Leu34雖不是分子的活性部位，但它們與羧基末端形成一個疏水中心，對分子的正確摺疊起著重要作用。有人證明缺失Glu29可使生物學活性降低約500倍(Brakenoff，et al．，J．Immunol．145561，1990)。然而，既使缺失至第49位Asn殘基，仍沒有丟失分子的受體結合活性，並且已知其中第29至34位胺基酸殘基是構成IL-6活性結構臨介區域(Brakenoff，J．Immunol．，1431175，1989)。從三維空間結構上看，31位和35位殘基與118位和121位殘基形成的受體結合位點在空間上恰好與157-160位殘基形成的位點處於兩個相反方向，它們在兩個方向上結合兩個受體亞單位gp130。其中31+35位殘基處於A螺旋中，118和121位殘基處於C螺旋中，改變這四個殘基將導致分子不能與gp130結合，進而喪失生物學活性(Kishimoto，Blood．741，1989)。
另一方面，已知白細胞介素6受體(IL-6R)由IL-6受體結合蛋白(gp80)和信號轉導蛋白(gp130)兩個亞單位組成。其中，gp80負責與配體IL-6的結合及隨後與gp130亞基偶聯，gp130則主要參與信號轉導，因此通常將gp80稱為IL-6R。IL-6R分布於淋巴細胞及多種類型的非淋巴細胞上，但腫瘤細胞上IL-6R的數目要比非腫瘤細胞(包括淋巴細胞)高2-20倍(如參見Yawata et al．，EMBDJ．121705，1993)。
在一些腫瘤發生時，往往伴有IL-6R表達的異常和其親和力的改變。例如，已知多發性骨髓瘤病人的血漿中具有高水平的HL-6和可溶性IL-6R。現已證明，IL-6R的高水平表達是誘發骨髓瘤的重要環節之一。另外，發現培養的肝癌細胞系(HepG2)、髓樣白血病細胞系(HL-6)、前列腺癌細胞系(PC-3)等腫瘤細胞系均以高水平表達IL-6R。這些表達水平約相當於同一組織來源的正常細胞的5-200倍。而且其中高親和力受體的數目約佔總受體數目的10％，高、低親和力受體的KD值相差約100倍。
基於上述基礎研究和臨床分析，我們確定使用氨基末端缺失22個胺基酸的IL-6[即IL-6(△1-22)]作為PE分子的載體或導向部分，與缺失完整PE分子之Ia區的PE40(作為毒素部分)融合，以製備腫瘤細胞靶特異性的嵌合毒素IL-6(△1-22)-PE40。就IL-6與PE40的連接方式而言，雖然有人已證明IL6-PE40、IL6-PE40-PE40和PE40-IL6-PE40三種連接方式所得到融合蛋白質中以IL6-PE40的細胞毒性為最強(Siegall，C．B．et al．，J．Biol．Chem．26516318，1990)，但考慮到嵌合毒素的受體結合能力、效率及特異性、分子大小和免疫原性，以及融合蛋白質的細胞穿透能力等綜合因素，特別是考慮到其潛在的臨床實用性，發明人確定以表現有最小LD50值的IL-6-PE40結合方式製備本發明的嵌合毒素。
可按照本領域技術人員已知的重組DNA技術(例如參見Sambrook et al．，Molecula CloningA Laboratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratory，2thed．，1989)完成各種操作。首先，可用適當的核酸內切酶從攜帶PE40基因的起始質粒如pVC8中切出編碼PE40毒素的核苷酸片段，並用同樣的核酸內切酶從質粒pBluescript中切出較大的載體片段。然後於T4 DNA連接酶存在下，將PE40基因片段連接到載體pBluescript上。經酶切鑑定後，得到攜帶PE40基因的重組中間質粒pBluescript-PE40。
然後在四種脫氧核苷三磷酸存在下，使用合成的寡核苷酸引物，並以pUC19-IL-6 cDNA作為模板，經PCR反應擴增氨基末端缺失22個胺基酸的IL-6(△1-22)。
在標準反應條件下，將已用同樣的核酸內切酶雙酶切的攜帶PE40基因的中間質粒與N端截短的IL-6基因一起進行連接反應。用所得的連接反應混合物轉化適當的大腸桿菌細胞並保溫後，挑選抗生素抗性菌落並對被轉化菌株所包含的質粒DNA進行酶切鑑定。選擇連接正確的重組質粒進行DNA序列分析。
用適當的內切酶切割如上得到的重組質粒，然後將包含PE40和IL-6(△1-22)核苷酸編碼序列並帶有適當的酶切位點的DNA序列連接到質粒載體pKK-223-3中。經進一步的酶切鑑定後得到以高水平表達本發明的IL-6(△1-22)-PE40融合蛋白質的重組表達質粒pKIL6P40。圖1顯示了重組表達質粒pKIL6P40的構建策略。
用如上得到的重組表達質粒pKIL6P40轉化適當的大腸桿菌宿主細胞，並在適於表達所需的融合蛋白質的條件下，培養被轉化細胞。培養後收穫並經超聲處理破碎細胞。超離心收集包涵體並在適當的緩衝液中經變性和復性處理，再次超速離心並收集上清液，將該上清液對磷酸鹽緩衝鹽水透析後得到IL-6(△1-22)-PE40融合蛋白質的粗提物。
可用細胞毒性檢測法檢測粗提物或經離子交換和凝膠過濾層析後得到的部分純化的融合蛋白質的細胞毒活性。部分純化過程中使用十二烷基磺酸鈉-聚丙烯醯胺凝膠電泳法(SDS-PAGE)和Western印跡法監測洗脫的蛋白質樣品。
由於融合蛋白質主要以包涵體形式積聚在細胞的不溶性部分中，從而有利於通過對不溶性部分的變性和復性部分純化重組蛋白質。
部分純化的部分富集了IL-6(△1-22)-PE40融合蛋白質，故可使我們能夠檢測其體外細胞毒活性。經進一步離子交換和凝膠過濾純化後，蛋白質產物的純度約達到96％。經SDS-PAGE分析各純化步驟的洗脫產物，顯示於一條相當於59KD分子大小的主帶。用放射標記的PE40所作的免疫印跡分析進一步證實這些數據。
可用四項基本試驗鑑定由IL-6和PE40連接而成的雜交分子的性質(1)ADP核糖基化試驗用於檢測抑制哺乳動物蛋白質合成的IL-6(△1-22)-PE40的酶促活性；(2)競爭性結合抑制試驗檢測雜交分子對結合於小鼠骨髓瘤SP2／0細胞膜囊泡表面IL-6受體上的放射標記之IL-6的抑制作用，藉以估計IL-6(△1-22)-PE40的IL-6受體結合活性；(3)細胞毒性試驗檢測IL-6(△1-22)-PE40對各種原代培養物及細胞系的細胞毒活性；(4)體內抗腫瘤活性試驗用接種骨髓瘤細胞系的活體動物模型估測IL-6(△1-22)-PE40的體內抗腫瘤活性。所有試驗中使用按同樣方法製備的未經修飾的IL6-PE40和在同樣條件下表達並提取的PE40作為對照。
通過檢測蛋白質合成抑制作用來估計部分純化的IL-6(△1-22)-PE40對不同惡性增殖細胞系的細胞毒活性。結果發現，本發明的融合蛋白質能夠以劑量依賴方式殺傷細胞，並且在不同細胞系之間有著較大差異。由表1和圖2所示的結果可以看出，本發明的IL6(△1-22)-PE40融合蛋白質對所試驗的幾個腫瘤細胞系表現的細胞毒性強弱依次是骨髓瘤SP2／0細胞系，肝腺癌HepG2細胞系，急性髓樣白血病HL-60細胞系，喉癌Hep2細胞系。引起50％細胞死亡的IL-6(△1-22)-PE40的量依次為0．3、0．7、0．9、1．3μg總蛋白質／孔(表1)。這些實驗結果還顯示，本發明的融合蛋白質對纖維瘤L929細胞系和子宮頸癌HeLa細胞系的細胞毒性相對小得多。另外，雖然急性髓樣白血病細胞(HL-60)對IL-6(△1-22)-PE40十分敏感，但在相同濃度下融合蛋白質對慢性白血病細胞系(K562)的毒性作用則明顯較小。這些結果可能與某些腫瘤細胞表面的IL-6受體數目有關，並且提示在腫瘤發育的不同階段，其細胞表面受體的數目、分布及受體-配體親和性可能有所變化。因此，在臨床實踐中，根據病人所患腫瘤的細胞來源和性質，並基於必要的體外細胞毒性和敏感性試驗，預先確定病人是否適於使用本發明的融合蛋白質並選擇適當的用藥劑量將是十分重要的。
表2和圖4顯示本發明的IL-6(△1-22)-PE40與作為陽性對照的IL6-PE40融合蛋白質對SP2／0骨髓瘤細胞系的IL-6受體結合活性和細胞毒性(ID50)的比較。這些結果清楚地表明，與未對導向部分修飾的IL-6-PE40融合蛋白質相比，本發明的IL-6(△1-22)-PE40顯著地提高了抑制放射標記的白細胞介素-6與SP2／0細胞膜上白細胞介素6受體結合的能力，並且提高了其殺傷SP2／0細胞的能力。總地說來，這些結果進一步提示IL-6(△1-22)-PE40似乎比未經修飾的IL-6-PE40具有更好的靶特異性和細胞毒活性。
對攜帶腫瘤移植物的實驗動物的治療實驗將為本發明IL-6(△1-22)-PE40嵌合毒素的細胞毒性和臨床適用性提供更為直接的證據。從圖5所示的結果可以看出，在小鼠腹腔內接種SP2／0細胞後36小時用修飾的嵌合毒素處理小鼠，可見IL-6-PE40和本發明的IL-6(△1-22)-PE40均以劑量依賴方式阻止腫瘤發育，高劑量(40ng／天／小鼠)組有效率分別為80％和90％，低劑量組(20ng／天／小鼠)有效率分別為60％和70％。相反，只接受IL-6和PBS的對照組，則分別有70％和80％的小鼠腹腔內出現了肉眼可見的實體腫瘤。體內腫瘤生成抑制實驗中對本發明的IL-6(△1-22)-PE40與未經修飾的IL-6-PE40融合蛋白質的比較研究進一步證明了上述體外實驗的結果。
在對IL-6(△1-22)-PE40和IL-6-PE40的體外和體內腫瘤抑制實驗中，出現這種顯著差異的原因是多方面的，但我們推測可能是由於刪除了IL-6分子中的前22個胺基酸，從而提高了嵌合毒素的受體結合效率，減少了毒素進入細胞的空間位阻以及分子摺疊後更有利於細胞內蛋白酶對PE40的切割。
可將本發明的IL-6(△1-22)-PE40嵌合全毒素作為基本活性成分，並加入一種或多種醫藥上可接受的載體或賦形劑，製成適於臨床上用於腫瘤治療目的的藥物組合物。其中所說的載體或賦形劑包括但不只限於磷酸鹽緩衝鹽水、生理鹽水、等滲葡萄糖溶液、葡聚糖、乳糖及右旋糖苷等。根據所治療的腫瘤類型及疾病嚴重程度的不同，可在本發明的藥物組合物中加入一種或多種與本發明的嵌合毒素有輔助或協同作用的其他天然、合成或重組來源的活性化合物。另外，可在本發明的藥物組合物中加入選自人血清白蛋白、低分子量肽、甘氨酸或賴氨酸等胺基酸及金屬Zn2+、Mn2+、Mg2+、Ca2+等金屬離子的蛋白質保護劑，以及選自聚乙二醇、羧甲基纖維素、多聚甘氨酸、穀胱甘肽的穩定劑。
可通過常規給藥途徑，最好是胃腸道外途徑投用本發明的藥物組合物，例如通過靜脈內、肌肉內、體腔內、器官腔內、皮內、皮下或黏膜內途徑給藥。本發明的藥物組合物的用藥劑量可從幾毫微克至幾毫克／天，但每個病人的具體用藥劑量將取決於待治療的疾病的性質、類型和嚴重程度、病人的年齡、體重、一般狀況和對藥物的敏感性，以及所使用的給藥方式和途徑等因素。
本發明的IL-6(△1-22)-PE40嵌合毒素的一個優選用途是治療腫瘤，特別是治療以IL-6為導向因子或配體結合因子的腫瘤，其中包括但不只限於肝癌、胃癌、喉癌、膀胱癌、結腸癌、乳癌、多發性骨髓瘤、淋巴癌、神經膠質瘤、急性髓性白血病和急性淋巴樣白血病等惡性增生性疾病。IL-6(△1-22)-PE40的另一個優選的治療應用是用於治療自家兔疫病及其他由T和B細胞引起的免疫系統疾病，如器官移植物排斥反應、紅瘢狼瘡、重症肌無力、類風溼性關節炎、多發性硬化症等。
另一方面，本發明的IL-6(△1-22)-PE40可以作為診斷試劑用於對手術切除的腫瘤或活體病理組織或細胞進行體外組織病理學檢查、組織化學分析及進行細胞殺傷和特異性結合分析，藉以判定靶腫瘤的治療敏感性及用藥劑量。
下列實施例旨在進一步舉例描述本發明，而不是以任何方式限制本發明待批權利要求的範圍。
實施例1重組表達載體的構建Ⅰ．起始質粒的大量製備分別用攜帶PE40基因的pVC8(Novagen)、pUC19／IL-6和pBluescript SK質粒DNA(各100ng)轉化感受態大腸桿菌JM105。然後將被轉化的細胞接種於含氨苄青黴素(500μg／ml)的LB培養基中，37℃振蕩培養24小時。提取質粒DNA後，分別用XbaI和EcoRI從pVC8中切出含PE40基因的約12kb片段。用同樣的酶雙酶切pBluescript，得到長約295kb的大的載體片段。於T4連接酶存在下，將PE40退火連接到pBluescript載體片段上，形成環化的質粒pBluescript-PE40。經酶切(NdeI+EcoRI和ApaI+SacI)鑑定後，於-20℃下保存備用。
Ⅱ．在標準反應條件下，使用合成的寡核苷酸引物15』-CCGAGCTCGAATTCATGTCAGAACGAATTGACAAAC-3』(SEQ ID NO1)和引物25』-CTACATATGCCGAAGCCCTC-3』(SEQ ID NO2)，並用質粒pUC19／IL-6的線性化cDNA作為模板，PCR擴增含IL-6(△1-22)基因的DNA片段。分別用SacI+NdeI雙酶切擴增的IL-6片段和上文(Ⅰ)中所述的質粒pBluescript-PE40。回收所得到的SacI-NdeI片段後，按IL-6片段pBluescript-PE40約4∶1的摩爾比例混合，在T4 DNA連接酶存在下進行連接反應，以使IL-6(△1-22)片段連接到PE40基因的5』末端上，得到重組質粒pBIL6-PE40。
Ⅲ．用得到連接反應混合物轉化大腸桿菌JM109，並將被轉化的菌株37℃保溫2小時。然後挑選陽性菌落，並提取質粒DNA進行酶切鑑定，進一步測定重組DNA的核苷酸序列，以證實IL-6(△1-22)和PE40的存在。分別用EcoRI消化(37℃，2小時)pBIL6-PE40和質粒pKK-223-3(Pharmacia)，並電泳分離包含IL-6(△1-22)與PE40基因的片段(1700bp)和pKK載體片段。將所得兩片段按4∶1的摩爾比例混合後進行連接反應，並用反應混合物轉化大腸桿菌JM105。培養被轉化的細胞，並對其所包含的質粒DNA進行酶切鑑定和序列分析，進一步證實IL-6(△1-22)和PE40融合基因的存在。SEQ ID NO3和SEQID NO4分別列出了IL6(△1-22)-PE40基因的核苷酸序列和由之編碼的胺基酸序列。將如此得到重組表達質粒定名為pKIL6-PE40。
圖1顯示了用於表達IL6(△1-22)-PE40融合蛋白質的重組表達質粒中pKIL6-PE40的構建。
實施例2嵌合毒素的表達和純化Ⅰ．用重組質粒pKIL6-PE40轉化大腸桿菌JM105，並於37℃培養至對數生長期。擴大接種於含氨苄青黴素的LB培養基上培養至OD值約為1．0～1．2時加入IPTG誘導2．5小時。離心收集細胞並於-70℃放置3小時。融解冷凍的細胞沉澱物並懸浮於裂解緩衝液(50mM Tris-HCl，pH8．0，1mM EDTA，0．2mg／ml溶菌酶)中，然後超聲處理(3×30秒)，並以25，000×g離心20分鐘。除去上清(可溶部分)並將沉澱物懸浮於變性緩衝液(6M鹽酸胍，0．2M Tris-HCl，pH8．4，1mM EDTA，50mM NaCl和10mM二硫蘇糖醇)。再次離心後將蛋白質稀釋到重摺疊緩衝液(50mM Tris-HCl，pH8．0，1mM EDTA，0．25M NaCl和5mM二硫蘇糖醇)中(1∶50)，並於4℃放置24小時。將重摺疊的蛋白質對PBS透析後，用於細胞毒性試驗，或用離子交換或凝膠過濾法進一步純化。
Ⅱ．在復性的蛋白質溶液中加入DEAE-Sepharose Fast Flow樹脂(Pharmacia)並混合均勻(4℃，30分)，然後裝入玻璃柱內，並用含0．1M NaCl的TE緩衝液(20mM Tris-HCl，pH8．0，1mM EDTA)洗柱(A280≈0)。用含有0．1-0．5mlNaCl梯度的TE緩衝液洗脫嵌合毒素。收集洗脫物並使用裝有YM-35膜的Amicon濃縮器濃縮後，使濃縮物通過在含有0．4M NaCl的0．2M磷酸鉀緩衝液(pH6．5)中平衡過的Sephacryl S-200 HR柱(Pharmacia)。用含0．1-0．5M NaCl梯度的TE緩衝液洗脫高純度的嵌合毒素。收集洗脫的峰值部分並對PBS透析後分裝保存(-20℃)。
實施例3樣品檢測與生物學分析Ⅰ．樣品純化步驟中，按照Chung和Collier(J．Infect．Immun，16832-841，1977)所述的方法，將各蛋白質製劑與[14C]NAD和富集延伸因子2的麥胚提取物一起保溫，檢測各洗脫部分的ADP核糖基化活性。同時，使用市售的Vectastain試劑盒(Vector Laboraories，Inc．)並用兔抗PE抗血清對各洗脫部分進行Western印跡分析。另外，用SDS-PAGE法檢測蛋白質含量，並估計分子大小。
Ⅱ．使用已建株的各種腫瘤細胞作為靶細胞，檢測本發明的IL6(△1-22)-PE40的細胞毒活性。簡單地說，將常規培養的腫瘤細胞(200μl培養基各含約106個細胞)接種於96孔微量滴定板的各孔內，在5％CO2環境下37℃保溫過夜後向各孔內加入不同濃度的IL6(△1-22)-PE40以及對照樣品PE40。37℃保溫24小時後加入3H標記的亮氨酸(Amersham，Corp．)(5μCi／孔)，繼續保溫12小時。將平板置於-70℃冷凍2小時並37℃快速融解後，將細胞收穫到玻璃纖維濾膜上，然後用β計數器檢測摻入到細胞中的放射活性。結果以未接觸蛋白質之對照組的百分摻入率表示。表1 IL6(△1-22)-PE40對不同組織來源的腫瘤細胞系的生長抑制作用 從表1和圖2所示的結果可以看出，本發明IL6(△1-22)-PE40能夠以劑量依賴方式殺傷多種不同組織來源的腫瘤細胞。從加入嵌合毒素後24小時的細胞死亡數所反映的對靶細胞胺基酸摻入量的抑制作用看，本發明的IL6(△1-22)-PE40對骨髓瘤、肝腺癌、急性髓樣白血病及人喉癌等多種細胞系均具有顯著的細胞毒活性(ID50值為0．3-1．3μg蛋白質／孔)。然而，對其他組織來源或不同發育階段的腫瘤細胞系(纖維瘤和慢性髓樣白血病細胞系)則表現出低得多的細胞毒性(ID50值為1．6-2．5μg蛋白質／孔)。
另外，從圖3所示的比較試驗結果還可以看出，本發明的IL6(△1-22)-PE40似乎較未經修飾的IL6-PE40毒素對SP2／0細胞具有更好的生長抑制作用。
為了證實細胞毒活性的特異性，實驗中使用了在同樣條件下表達並部分純化的單純PE40蛋白質作對照樣品，結果未見PE40有實質性的腫瘤生長抑制作用(結果未示出)。
Ⅲ．基本上按照Qayum等人(Br．J．Cancer 6297-99，1990)所述的方法，用SP2／0細胞的胞漿膜進行IL6(△1-22)的特異性結合實驗。簡單地說，將SP2／0細胞(約106個)懸浮在含有10mM Tris-HCl，pH7．5，1mM二硫蘇糖醇、0．1％BSA，1mM EDTA的緩衝液中製備細胞勻漿。4℃離心(500×g)15分鐘後，取上清再次以20，000×g離心20分鐘並將漿膜沉澱物懸浮於上述緩衝液中。
按每孔100μg(終體積100μl)將如上製備的膜蛋白加於24孔滴定板中，然後各加入10-6M125I-IL-6，在加或不加[125I]標記的IL-6或IL6(△1-22)-PE40或IL-6-PE40條件下，4℃保溫3小時。保溫後，用5ml上述緩衝液通過Whatman濾紙洗樣品並用γ計數器測定殘留的放射活性(cpm)。所有結合試驗樣品均一式三份。在未標記的IL-6存在下確定非特異性結合。
圖4顯示了部分純化的(過DEAE柱後)IL6(△1-22)-PE40(0)和IL6-PE40(●)在未標記的IL-6存在下置換與SP2／0細胞的胞漿膜結合的125I-IL-6的能力。其中B代表在競爭物IL-6、IL6(△1-22)存在時與膜結合的125I-IL-6的量(cpm)；Bo代表在沒有競爭物存在時與膜結合的125I-IL-6的量(cpm)。從中可以看出，加入漸增濃度的IL6(△1-22)-PE40融合蛋白質，可隨濃度逐漸增加而逐漸置換與骨髓瘤SP2／0細胞漿膜結合的125I-IL-6。在同樣條件下表達並純化的IL6-PE40也得到相似的結果，但後者的置換能力顯然低於前者。
Ⅳ．為了進一步研究本發明的IL6(△1-22)-PE40融合蛋白質對腫瘤細胞的體內殺傷能力，我們建立了骨髓瘤帶瘤動物模型，並觀察和記錄了用本發明的嵌合毒素處理後小鼠體內實體瘤的發生率。簡單地說，將飼養的雄性Balb／c小鼠隨機分為6組，每組10隻。實驗組(第1-4組)分別經腹腔內注射(i．p．)約1．2×106個SP2／0骨髓瘤細胞。接種腫瘤細胞後36小時(第四天)按5和100μg天／小鼠的劑量分別用純化的IL6(△1-22)-PE40和IL6-PE40治療小鼠(i．p．)。對照組(第5和6組)則投用(i．p．)含等摩爾量IL-6的等體積的PBS。每天注射一次，連續治療10天後處死帶瘤動物，經開腹解剖觀察，肉眼可見的實體瘤生成。
從圖5所示的結果看出，修飾和未修飾的IL6-PE40均以劑量依賴方式阻止腫瘤發育，但與未修飾的IL6-PE40相比，本發明的IL6(△1-22)-PE40顯然具有更強的腫瘤生長抑制活性。
序列表(1)一般信息(Ⅰ)申請人中國人民解放軍農牧大學(Ⅱ)發明名稱改善了靶細胞受體結合活性的融合蛋白質(Ⅲ)序列數5(Ⅵ)通訊地址(A)聯繫人朱平(B)街道西安大路175號(C)城市長春(D)郵編130062(E)國家中華人民共和國(V)計算機可讀形式(A)介體類型3．5英寸軟盤CXXⅢ(B)計算機IBM PC(C)作業系統WINDOWS95(D)軟體WORD97(Ⅵ)電訊信息(A)電話86-0431-7962109(B)電傳86-0431-7973911-66692(2)SEQ ID NO1的信息(Ⅰ)序列特徵(A)長度36鹼基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結構線性(Ⅱ)分子類型cDNA(Ⅲ)序列描述SEQ ID NO1CCGAGCTCGA ATTCATGTCA GAACGAATTG ACAAAC(2)SEQ ID NO2的信息(Ⅰ)序列特徵(A)長度20鹼基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結構線性(Ⅱ)分子類型cDNA(Ⅲ)序列描述SEQ ID NO2CTACATATGC CGAAGCCCTC(2)SEQ ID NO3的信息(Ⅰ)序列特徵(A)長度492鹼基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結構線性(Ⅱ)分子類型cDNA(Ⅲ)序列描述SEQ ID NO3ATGTCAGAAC GAATTGACAA ACAAATTCGG TAGATCCTCG ACGGCATCTCAGCCCTGAGA AAGGAGACAT GTAACAAGAG TAACAGTTGT GAAAGCAGCAAAGAGGCACT GGCAGAAAAC CTGAACCTTC CAAAGATGGC TGCTGAAAAAGATGGATGCT TCCAATCTGG ATTCAATGAG GAGACTTGCC TGGTGAAAATCATCACTGGT CTTTTGGAGT TTGAGGTATA CCTAGAGTAC CTCCAGAACAGATTTGAGAG TAGTCAGGAA CAAGCCAGAG CTGTGCAGAT GAGTACAAAAGTCCTGATCC AGTTCCTGCA GAAAAAGGCA AAGAATCTAG ATGCAATAACCACCCCTGAC CCAACCACAA ATGCCAGCCT GCTGACGAAG CTGCAGGCACAGAACCAGTG GCTGCAGGAC ATGACAACTC ATCTCATTCT GCGCAGCTTTAAGGAGTTCC TGCAGTCCAG CCTGAGGGCT CTTCGGCATA TG(2)SEQ ID NO4的信息(Ⅰ)序列特徵(A)長度1092鹼基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結構線性(Ⅱ)分子類型cDNA(Ⅲ)序列描述SEQ ID NO4GCCGAAGAGG GCGGCAGCCT GGCCGCGCTG ACCGCGCACC AGGCTTGCCACCTGCCGCTG GAGACTTTCA CCCGTCATCG CCAGCCGCGC GGCTGGGAACAACTGGAGCA GTGCGGCTAT CCGGTGCAGC GGCTGGTCGC CCTCTACCTGGCGGCGCGGC TGTCGTGGAA CCAGGTCGAC CAGGTGATCC GCAACGCCCTGGCCAGCCCC GGCAGCGGCG GCGACCTGGG CGAAGCGATC CGCGAGCAGCCGGAGCAGGC CCGTCTGGCC CTGACCCTGG CCGCCGCCGA GAGCGAGCGCTTCGTCCGGC AGGGCACCGG CAACGACGAG GCCGGCGCGG CCACCGCCGACGTGGTGAGC CTGACCTGCC CGGTCGCCGC CGGTGAATGC GCGGGCCCGGCGGACAGCGG CGACGCCCTG CTGGAGCGCA ACTATCCCACT GGCGCGGAGTTCCTCGGCGA CGGCGGCGAC GTCAGCTTCA GCACCCGCGG CACGCAGACCTGGACGGTGG AGCGGCTGCT CCAGGCGCAC CGCCAACTGG AGGAGCGCGGCTATGTGTTCG TCGGCTACCA CGGCACCTTC CTCGAAGCGG CGCAAAGCATCGTCTTCGGC GGGGTGCGCG CGCGCAGCCA GGACCTCGAC GCGATCTGGCGCGGTTTCTAT ATCGCCGGCG ATCCGGCGCT GGCCTACGGC TACGCCCAGGACCAGGAACC CGACGCACGC GGCCGGATCC GCAACGGTGC CCTGCTGCGGGTCTATGTGC CGCGCTCGAG CCTGCCGGGC TTCTACCGCA CCAGCCTGACCCTGGCCGCG CCGGAGGCGG CGGGCGAGGT CGAACGGCTG ATCGGCCATCCGCTGCCGCT GCGCCTGGAC GCCATCACCG GCCCCGAGGA GGAAGGCGGGCGCCTGGAGA CCATTCTCGG CTGGCCGCTG GCCGAGCGCA CCGTGGTGATTCCCTCGGCG ATCCCCACCG ACCCGCGCAA CGTCGGCGGC GACCTCGACCCGTCCAGCAT CCCCGACAAG GAACAGGCGA TCAGCGCCCT GCCGGACTACGCCAGCCAGC CCGGCAAACC GCCGCGCGAG GACCTGAAGT AA(2)SEQ ID NO5的信息(Ⅰ)序列特徵(A)長度胺基酸(B)類型胺基酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結構線性(Ⅱ)分子類型蛋白質(Ⅲ)序列描述Met-Ser-Glu-Arg-Ile-Asp-Lys-Gln-Ile-Arg-Tyr-Ile-Leu-Asp-Gly-Ile-Ser-Ala-Leu-Arg-Lys-Glu-Thr-Cys-Asn-Lys-Ser-Asn-Met-Cys-Glu-Ser-Ser-Lys-Glu-Ala-Leu-Ala-Glu-Asn-Leu-Asn-Leu-Pro-Lys-Met-Ala-Ala-Glu-Lys-Asp-Gly-Cys-Phe-Gln-Ser-Gly-Phe-Asn-Glu-Glu-Thr-Cys-Leu-Val-Lys-Ile-Ile-Thr-Gly-Leu-Leu-Glu-Phe-Glu-Val-Tyr-Leu-Glu-Tyr-Leu-Gln-Asn-Arg-Phe-Glu-Ser-Ser-Glu-Glu-Gln-Ala-Arg-Ala-Val-Gln-Met-Ser-Thr-Lys-Val-Leu-Ile-Gln-Phe-Leu-Gln-Lys-Lys-Ala-Lys-Asn-Leu-Asp-Ala-Ile-Thr-Thr-Pro-Asp-Pro-Thr-Thr-Asn-Ala-Ser-Leu-Leu-Thr-Lys-Leu-Gln-Ala-Gln-Asn-Gln-Trp-Leu-Gln-Asp-Met-Thr-Thr-His-Leu-Ile-Leu-Arg-Ser-Phe-Lys-Glu-Phe-Leu-Gln-Ser-Ser-Leu-Arg-Ala-Leu-Arg-Gln-Met-Ala-Glu-Glu-Gly-Gly-Ser-Leu-Ala-Ala-Leu-Thr-Ala-His-Gln-Ala-Cys-His-Leu-Pro-Leu-Glu-Thr-Phe-Thr-Arg-His-Arg-Gln-Pro-Arg-Gly-Trp-Glu-Gln-Leu-Gly-Gln-Cys-Gly-Tyr-Pro-Val-Gln-Arg-Leu-Val-Ala-Leu-Tyr-Leu-Ala-Ala-Arg-Leu-Ser-Trp-Asp-Gln-Val-Asp-Gln-Val-Ile-Arg-Asn-Ala-Leu-Aln-Ser-Pro-Gly-Ser-Gly-Gly-Asp-Leu-Gly-Glu-Ala-Ile-Arg-Glu-Gln-Pro-Gln-Gln-Ala-Arg-Leu-Ala-Leu-Thr-Leu-Ala-Ala-Ala-Glu-Ser-Glu-Arg-Phe-Val-Arg-Gln-Gly-Thr-Gly-Asn-Asp-Gln-Ala-Gly-Ala-Ala-Asn-Ala-Asp-Val-Val-Ser-Leu-Thr-Cys-Pro-Val-Ala-Ala-Gly-glu-Cys-Ala-Gly-Pro-Ala-Asp-Gly-Asp-Ala-Leu-Leu-Glu-Arg-Asn-Tyr-Pro-Thr-Gly-Ala-Glu-Phe-Len-Gly-Asp-Gly-Gly-Asp-Val-Ser-Phe-Ser-Thr-Arg-Gly-Thr-Glr-Asn-Trp-Thr-Val-Gln-Arg-Leu-Leu-Gln-Ala-His-Arg-Gln-Leu-Gln-Gln-Arg-Gly-Tyr-Val-Phe-Val-Gly-Tyr-His-Gly-Thr-Phe-Leu-Gln-Ala-Ala-Gln-Ser-Ile-Val-Phe-Gly-Gly-Arg-Ala-Arg-Ser-Gln-Gln-Asp-Leu-Asp-Asp-Ala-Ile-Trp-Arg-Gly-Phe-Tyr-Ile-Ala-Gly-Asp-Pro-Ala-Leu-Ala-Tyr-Gly-Tyr-Ala-Gln-Asp-Gln-Gln-Pro-Asp-Ala-Gly-Arg-Ile-Arg-Asp-Gly-Ala-Leu-Len-Arg-Val-Tyr-Val-Pro-Arg-Ser-Ser-Len-Pro-Gly-Phe-Tyr-Arg-Thr-Ser-Leu-Thr-Leu-Ala-Ala-Pro-Gln-Ala-Ala-Gly-Gln-Val-Gln-Arg-Leu-Ile-Gly-His-Pro-Leu-Pro-Leu-Arg-Leu-Asp-Ala-Ile-Thr-Gly-Pro-Gln-Gln-Gly-Gly-Arg-Leu-Gln-Thr-Ile-Leu-Gly-Trp-Pro-Leu-Ala-Gln-Arg-Thr-Val-Val-Ile-Pro-Ser-Ala-Ile-Pro-Thr-Asp-Pro-Arg-Asn-Val-Gly-Gly-Asp-Leu-Asp-Pro-Ser-Ser-Ile-Pro-Asp-Lys-Gln-Gln-Ala-Ile-Ser-Ala-Leu-Pro-Asp-Tyr-Ala-Ser-Gln-Pro-Gly-Lys-Pro-Arg-Gln-Asp-Leu-Lys-end
權利要求
1．包括連接到細胞毒性蛋白質上的修飾的IL-6的融合蛋白質，特徵在於其中對所說的作為導向部分的IL-6的修飾包括刪除氨基末端最多不超過28個胺基酸。
2．根據權利要求1的融合蛋白質，其中所說的修飾包括刪除對作為導向部分的IL-6的氨基末端22個胺基酸。
3．根據權利要求1的融合蛋白質，其中所說的細胞毒性蛋白質是PE40。
4．含有權利要求1的修飾的IL6-PE40融合蛋白質及一種或多種醫藥上可接受的載體或賦形劑的藥物組合物。
5．根據權利要求4的藥物組合物，其中所說的修飾的IL6-PE40融合蛋白質分子中作為導向部分的IL-6是缺失氨基末端22個胺基酸的IL-6。
6．根據權利要求5的藥物組合物作為抗腫瘤劑的應用。
全文摘要
本發明涉及由假單胞菌衍生的重組毒素與細胞因子連接而成的融合蛋白質,特別是涉及以重組DNA技術修飾作為導向部分的細胞因子以提高與毒素部分融合所產生的嵌合毒素的靶細胞受體結合活性。本發明進一步涉及含有所說的融合蛋白質的藥物組合物,以及所說的藥物組合物在腫瘤治療中的應用。
文檔編號C07K14/435GK1293207SQ9912220
公開日2001年5月2日 申請日期1999年10月13日 優先權日1999年10月13日
發明者朱平, 柳增善 申請人:中國人民解放軍農牧大學軍事獸醫研究所