胰島細胞的離體成熟的製作方法

2023-09-16 17:07:00

胰島細胞的離體成熟的製作方法
【專利摘要】本發明涉及用於促進來自斷奶前哺乳動物之胰島細胞成熟的方法，目的是優化胰島以將其作為供體組織用於異種移植。本發明的方法從供體動物移出胰腺，然後將所述胰腺組織減小成大於完整胰島之大小的碎片，同時保持胰島處於完全的、產生胰島素的狀態。本發明的方法還在提高經培養胰島的葡萄糖響應度的新的成熟培養基中依序地培養經消化的組織，然後選擇有充分葡萄糖響應的胰島用於移植程序。
【專利說明】胰島細胞的離體成熟
[0001]相關申請的交叉引用
[0002]對2011年9月28日提交的美國申請序列號61/540，288和美國申請序列號61/540, 293要求優先權，其全部公開內容通過引用併入本文。
【技術領域】
[0003]本發明涉及將未成熟朗格罕氏島分離並培養至成熟的方法。
【背景技術】
[0004]糖尿病是一類具有多個共同特徵的疾患，其中增加的血液葡萄糖是最明顯的。糖尿病的四種最常見類型為I型糖尿病(TlD)、2型糖尿病、繼發性糖尿病和妊娠期糖尿病。TlD是胰島素缺乏疾病，主要在幼年時期發病，並且如果不治療則以高血糖症為特徵。T2D是胰島素不敏感與胰腺胰島素分泌不能補償胰島素不敏感相結合的疾患。繼發性糖尿病在內分泌系統損害(例如胰腺損傷、肝硬化、內分泌疾患或者某些抗病毒或抗精神病治療)之後發生。妊娠期糖尿病作為懷孕的併發症發生。
[0005]身體唯一的胰島素來源是β細胞，其存在於胰腺的朗格罕氏島(後文中稱為「胰島」)中。胰島是具有獨特細胞結構之內分泌細胞的聚集體，其構成胰腺總體積的約2%。除了產生胰島素的β細胞之外，胰島還包含產生胰高血糖素的α細胞、產生促生長素抑制素的δ細胞、產生胰腺多肽的PP細胞和產生飢餓素的ε細胞。胰島的細胞一起調節內分泌功能，並且代謝紊亂的治療常常涉及恢復或調節胰島外分泌功能。這些治療之一是胰島同種異體移植，並且其可部分或完全治癒TlD數月至數年。但是，其治療應用由於胰腺供體的短缺仍受限，而胰腺供體是人胰島的唯一臨床上認可的來源(Scharp D，等.(1990)Diabetes.39:515-518 ；ffier GC,等.(1997)Diabetesl997 ；46:1247 ；ShapiroAM,等.(2000)N Engl J Med2000 ；343:2303 ;和 Ichii H,等.(2009) J Hepatobiliary Pancreat Surg.16(2): 101-12.Epub2008Dec26)。
[0006]人胰島供給不足的潛在補救措施是異種移植包封於免疫應答保護性屏障中的非人胰島。參見圖1 和(Orive G，等.(2003)Nat Med.9:104 ；Duvivier-Kali VF，等.(2001)Diabetes.50:1698 ;和 Schneider S，等.(2005) Diabetes54:687)。特別是，由於豬胰島與人胰島類似的大小和生理學、人胰島素與豬胰島素幾乎相同的分子結構以及豬胰島素在人糖尿病治療中的長期安全使用，豬是合適的胰島來源。豬還提供具有大產仔數和相對容易交配的額外優點。
[0007]當前僅通過使用市售大小或青壯豬(yuong adult pig)作為供體動物進行用於移植的成熟豬胰島(即，完全功能的胰島)的分離。但是，從青壯和市售重量豬中分離胰島是勞動密集型的並且需要大量的設備和供應，包括將豬飼養至適當大小所需的資源。固有易損的成年豬胰島的最終產量還對諸如飼養的因素、胰腺質量和如下事實敏感:圍繞胰島的絕大部分(約98%)的胰腺組織為具有高度酶促活性的外分泌組織，其在開始常規胰島分離程序之後立即開始破壞胰島。事實上，前述因素加劇了胰島的易損性並且在胰島分離、儲存和培養期間導致大量胰島破碎(即，其細胞結構的破壞)(Socci C，等.(1989)Horm.Metab.Res.25(Suppl.1):32-35 ；Kirchof N,等.(1994)Transplant.Proc.26:616-617 ；Van Deijnen JHM,等.(1992)Cell Tissue Res.267:139-146 ;和 Marchetti P,等.(1992)Diab.Nutr.Metab.5 (Suppl.1):151-154)。因此，每個胰腺的胰島產量大大低於基於每個胰腺的固有胰島計數的理論產量。用H&E染色的組織樣品揭示，與成年豬胰腺中發現的輪廓分明的胰島相反，幼豬胰腺較不緻密並且具有廣泛分散的胰島素陽性細胞而沒有界限清楚的胰島結構。參見圖2。
[0008]新生豬和胎豬也可用作胰島供體。這些胰島來源提供的優點是在這些發育階段的胰腺是未成熟的，因此包含較少的在胰島分離程序期間損傷胰島的外分泌組織。但是，還有使用這些胰島來源的與未成熟相關的缺點，例如在這些階段胰島的模糊胰島界限及其結構的精細。然而，可從新生胰腺和胎胰腺中分離未成熟胰島(Korsgran 0，等.(1988)Transplantationl988 ；45:509-14 ；Latif ZA,等.(1988) Transplantation.45 (4):827-830 ； 1988 ;和 Ricordi C,等.(1990) Islet isolation assessment in man and largeanimals.Acta Diabetol Lat.27 (3):185_95)。但是，這些未成熟膜島在其分離後至少兩周不能分泌響應葡萄糖的胰島素，並且可能在移植至宿主後花費長達兩到三個月來變得響應葡萄糖(Korsgran O,等.(1988)Transplantationl988 ;45:509-14)。因此，來自新生膜腺組織和胎胰腺組織的胰島臨床上由於其可變的葡萄糖響應度和花費長時間來成熟而不令人滿意。
[0009]作為至少因為上述原因而是有問題的常規胰島移植方法的可替代選擇，本文中描述的本發明是用於分離並培養導致高產量胰島當量之胰島(即在移植前為有葡萄糖響應之胰島)的可再現、有成本效益和可擴縮的方法。因此，本發明的方法將使得能夠作出有依據的胰島素給藥決定，因為胰島移植物的胰島素分泌功能可在移植前被確證。
[0010]發明概述
[0011]本發明涉及用於促進來自斷奶前(pre-weaned)哺乳動物之胰島細胞成熟的方法，目的是優化胰島以將其作為供體組織用於異種移植。在多個實施方案中，供體動物是仔豬(piglet)。本發明的方法從供體動物移出胰腺並將所述胰腺組織減小成大於完整胰島之大小的碎片，同時保持胰島處於完全的、產生胰島素的狀態。本發明的方法還在蛋白酶溶液中消化所得組織碎片，所述蛋白酶溶液輕柔分離圍繞胰島的外分泌組織但不會對胰島細胞或胰島細胞結構引起大量損傷。本發明的方法還在提高所述經培養胰島的葡萄糖響應度的新的成熟培養基中依序培養所述經消化的組織，並且選擇用於移植程序的有充分葡萄糖響應的胰島。在本發明的多個實施方案中，所述成熟培養基包含a)動物來源的不確定(undefined)成分；b)抗氧化化合物；c)增強β細胞的葡萄糖依賴性胰島素分泌的成分；d)維生素B衍生物；f)維生素E衍生物；g)肝素；h)鹼性胰腺胰蛋白酶抑制劑；i)絲氨酸蛋白酶抑制劑；和j)脫氧核糖核酸酶。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0012]圖1是胰島細胞分離程序的流程圖，包括將幼豬胰腺切割、用膠原酶混合物處理組織切片，以及加工用於異種移植的胰島。
[0013]圖2例示了成年豬胰腺與幼豬胰腺的組織學比較。組織樣品取自來自市售重量成年豬或幼豬(15天齡)之胰腺的脾端。將胰腺樣品固定並用蘇木精和伊紅染色法(hematoxylin and eosin stain,H&E)或者抗膜島素和蘇木精(膜島素，Insulin)染色。成體胰腺顯示出完全胰島形成和整體上較密集的細胞群體(較密集的細胞核體積)，而當與成年豬胰腺相比時，幼豬胰腺顯示出沒有可見的完整胰島形成以及非結構化胰島素和胰高血糖素染色。所有圖像在20 X放大下拍攝,標尺=100 μ m。
[0014]圖3顯示出胰島數目經成熟培養期的變化，包括胰島當量、純度、生存力和功能。在消化後0、1、3、5、7、9和14天、胰島成熟期間取得胰島樣品用於分析。用用於鑑定胰島當量和胰島純度的二硫腙(DTZ)或用於確定細胞生存力的螢光素二乙酸酯/磺化丙啶(FDA/PD對胰島組織樣品進行染色。胰島當量(A)計算為陽性DTZ染色的百分比。胰島純度(B，灰色線)計算為未染色組織的百分比，胰島生存力(B，黑線)計算為存活百分比(綠色)/死亡百分比(紅色)。對於胰島功能(C)，在5% CO2下將100個胰島在2.8mM葡萄糖，然後是28mM葡萄糖，然後是28mM葡萄糖和IBMX，之後是2.8mM葡萄糖中於37°C孵育一小時。使用標準豬胰島素ELISA分析了樣品的胰島素釋放。在(D)中，培養5天後用FDA/PI染色的胰島樣品的圖像顯示出周圍組織的主要特徵為細胞死亡，而胰島的內部區室仍是存活的。結果展示為每個胰腺的平均值土 SEM (η = 6，一式兩份)。
[0015]表格簡述
[0016]表I報導了在組織培養中經14天表徵胰島成熟的數據。胰島部分地酶促解離並使得在組織培養(37°C，5% CO2)中成熟14天。在培養中3天、7天和14天後，酶消化後直接取得胰島樣品，然後用二硫腙(DTZ)染色以定量胰島的數目(胰島計數)並確定「胰島當量」，(即，經染色胰島相比未經染色胰島的百分比)。使用裝配有標準10X10目鏡計數線的標準立體顯微鏡確定了胰島大小的百分比(25X放大，η =數目，如果是胰腺)。結果展示為平均數土 SEM。
[0017]表2報導了表徵在組織培養中胰島成熟過程中在多個點處胰島的細胞組成的數據。胰島樣品在成熟期間在0、3、7和11天解離，然後對於C-肽、胰高血糖素或澱粉酶進行染色並使用流式細胞術進行分析。結果給出為平均值土SEM，η = 3，一式三份地進行。
[0018]發明詳述
[0019]本發明涉及促進胰島離體成熟為可作為供體組織用於異種移植之有葡萄糖響應之成熟胰島的方法。在本文中應理解，本發明的方法分離並加工從幼年哺乳動物的胰腺中移出的胰島。例如，在多個實施方案中，本發明的方法分離從出生與斷奶之間任何發育階段(即，不再看護)的哺乳動物的胰腺中移出的胰島。在本發明的方法中使用斷奶前供體豬的原理是斷奶後豬對固體食物的消耗活化胰腺外分泌組織產生消化酶，繼而在移出並加工來自動物的胰腺之後損傷胰島。因此，考慮到前述原理，還有本發明方法的一些實施方案考慮使用通常處於與正在斷奶有關之年齡但是尚未開始消耗固體食物的動物的供體胰腺。
[0020]在多個實施方案中，本發明的方法使用獲自幼豬、即仔豬的供體胰腺。通常，這樣的幼豬為約30天齡或更小。在一些實施方案中，例如，本發明的方法分離並培養來自約14至約22天齡仔豬的胰島，而在另一些實施方案中，幼豬胰島供體可以是約18至約28天齡。
[0021]如上所述，本發明的方法分離並加工來自供體胰腺組織的胰島。在本文中應理解，本發明中使用的術語「胰島」包括本領域技術人員公認為具有朗格罕氏島的形態學和組織學特徵的任何細胞結構，並且包括包含β細胞的較少結構化的細胞聚集體。本文中公開的胰島是有利的，至少部分因為它們具有某些與成功異種移植有關的形態特徵，以及因為細胞維持與葡萄糖響應有關的胰島樣體系結構。
[0022]在多個實施方案中，本發明的方法通過外科手術移出哺乳動物胰腺，包括消減任何非胰腺組織(例如，脂肪等)。通常，收穫十至十五個胰腺，之後合併用於組織加工。加工胰腺組織涉及使用這樣的技術，將組織減小成約完整胰島大小的部分，同時注意不妨礙胰島的細胞排列和體系結構。通常，在冷凍的條件下進行胰腺組織切割。在多個實施方案中，通過使用剪刀和攪拌技術進行切割。在多個實施方案中，胰腺組織被切割成最長為約
0.1mm至約IOmm的塊。在某些其他實施方案中，胰腺組織切片直徑的最長尺寸為約0.5mm至約1.0mm。通常，從移出胰腺到完成切碎步驟所經過的時間為約20分鐘或更少。但是，在多個實施方案中，在本發明的方法中，從移出胰腺到完成切碎步驟所經過的時間可多於20分鐘，例如，長達30或40分鐘。
[0023]本發明的方法還酶促消化經切割的、即經切碎的胰腺組織以將胰島與非胰島組織分開。通常，本發明的方法使經切碎的胰腺組織與低劑量、優選無菌的膠原酶溶液接觸。在本發明方法的多個實施方案中，膠原酶溶液可包含來自溶組織梭菌(Clostidiumhistolyticum)的約60%經純化I類(Cl)和約40%經純化II類(C2)膠原酶。在多個其他實施方案中，膠原酶溶液除了 Cl和C2膠原酶以外還可包含其他類型的蛋白酶。例如，膠原酶溶液還可包含溶組織梭菌膠原酶3類(C3)、溶組織梭菌膠原酶4類(C4)、梭菌蛋白酶、thennalysin、胰蛋白酶、糜蛋白酶或彈性酶、或者上述物質的任何組合,例如市售為
Liberasef8^P BIendzymeκ的蛋白酶的那些組合。通常，在37 °c下進行經切割胰腺組織的酶消化，同時以40~70rpm輕微離心，直到大部分圍繞胰島的腺泡基質組織與胰島分開。在多個實施方案中，本 發明的方法在將圍繞的腺泡組織與胰島細胞分開後在相同的反應條件下繼續將消化反應進行額外的時間，以使得胰島的膠原基質更完全地被消化。額外膠原酶消化時期可花費的時間長度沒有限制，但是可進行長至本領域技術人員確定的除去與胰島無關的組織而不過度損傷胰島所需的時間。通常，本發明的方法保持膠原酶消化儘可能簡短，以幫助維持初始胰島體系結構，其在發育的斷奶前階段表徵為具有可容易被破壞的發育不良膠原基質。
[0024]本發明的方法通過添加補充有血清或白蛋白或者其二者的冰冷緩衝鹽溶液使胰腺組織的膠原酶消化停止。在多個實施方案中，本發明的方法通過向反應混合物中添加補充有HEPES和10%牛血清白蛋白(BSA)的漢克(Hank)平衡鹽溶液(HBSS)使膠原酶消化反應停止。膠原酶消化停止後，經消化的胰腺組織通過金屬網漏鬥過濾以除去碎片和不期望的大組織碎片。在多個實施方案中，本發明的方法使用500μπι金屬網漏鬥，以除去大於500 μ m的組織碎片。
[0025]如上所述，本發明的方法促進胰島的成熟。更具體地，本發明的方法包括組織培養期，其被分為至少兩個階段，恢復階段和成熟階段。這些階段通過順序(即，恢復階段在成熟階段之前)和通過某些培養基成分之濃度的變化來進行區分。培養胰島的恢復階段從進行上述膠原酶消化反應之後開始，並且通常持續約48小時。培養胰島的成熟階段從恢復階段之後開始，並且通常持續約6至8天。本文中，應理解，術語「細胞培養」、「胰島培養」和「培養」是指在人為的體外環境中維持細胞。術語「胰島」和「胰島培養物」是指單獨的胰島細胞(例如β細胞)並且是包含在胰島中的所有細胞的總稱。短語「細胞培養基(cellculture medium) 」、「培養基(culture medium) 」、「培養基製劑(medium formulation) 」或簡單地說「介質(medium) 」(在每種情形下，複數是「media」)是指培養細胞(即，胰島)的營養溶液，並且可以互換使用。
[0026]本發明方法的恢復階段涉及上述經過濾的膠原酶消化的胰腺組織之組織培養的初始48小時。在恢復期期間,胰腺組織在本文中稱為「恢復成熟培養基」或「第一成熟培養基」的特定培養基中培養。通常，恢復成熟培養基是基礎培養基，其額外地包含:a)不確定成分，例如豬血清或來自動物胚胎、器官或腺體的提取物山)抗氧化化合物；c)增強β細胞的葡萄糖依賴性胰島素分泌的成分；d)維生素B的衍生物；e)維生素E的衍生物；f)肝素；g)鹼性胰腺胰蛋白酶抑制劑；h)絲氨酸蛋白酶抑制劑；和i)脫氧核糖核酸酶。
[0027]通常，基礎培養基可以是與胰島細胞成熟相容的任何單一基礎培養基溶液或基礎培養基溶液的組合。例如，基礎培養基可選自但不限於BME培養基(Proc.Soc.Exp.Biol.Med.，89，363 (1965) )、BGJb 培養基(Exp.Cell Res.，25，41 (1961))、CMRL1066 培養基(N.Y.Academy of Science, 5，303 (1957)) ,Glasgow MEM 培養基(Virology, 16，147 (1962))、改進的 MEM 鋅選擇培養基(J.National Cancer Inst.，49，1705 (1972))、IMDM 培養基(InVitro, 9,6 (1970))、Mediuml99 培養基(Proc.Soc.Exp.Biol.Med.,73,1 (1950))、伊格爾(Eagle’s)MEM培養基(Science, 130，432 (1959))、a MEM培養基(Nature New Biology, 230,310(1971))、杜爾貝科(Dulbecco，s)MEM 培養基(Virology, 8，396 (1959))、Ham，s 培養基(Exp.Cell Res.，29，515 (1963) ;Proc.Natl.Acad.Sc1.USA，53，288 (1965))、RPMI1640 培養基(J.A.M.A.，199，519 (1967))、Fischer』 s 培養基(Methods in Med.Res.，10 (1964))、McCoy，s 培養基(Proc.Soc.Exp.Biol.Med.，100，115 (1959))、William，s E 培養基(Exp.Cell Res.，69，106(1971) ；Exp.Cell Res.，89，139 (1974))、其混合培養基等。在本發明的多個實施方案中，恢復成熟培養基的基礎培養基是Ham』 s F-12，而在另一些實施方案中，其為Mediuml99。在又一些實施方案中，恢復成熟培養基的基礎培養基為Ham』 s F-12和Mediuml99培養基的混合物。例如，恢復成熟培養基組合物包含以選自1: 10至10: I的比率混合的Ham 『s F-12和Mediuml99培養基。
[0028]關於恢復成熟培養基的不確定成分，I?20% v/v濃度的豬血清最常用作不確定成分，來自動物胚胎、器官或腺體的提取物(0.5?10% v/v)。還常規地使用其他血清或白蛋白來源，包括新生的牛、馬和人。已經用於製備培養基補充物的提取物的器官或腺體包括頜下腺(Cohen (1961) J.Biol.Chem.237:1555-1565)、垂體(Peehl 和 Ham(1980) InVitrol6:516-525 ;參見 U.S.Pat.N0.4，673，649)、下丘腦(Maciag,等.(1979) Proc.Natl.Acad.Sc1.USA76:5674-5678 ；Gilchrest,等.(1984)J.Cell.Physiol.120:377-383)、和腦(Maciag，等.(1981)Science211:1452-1454)。這些類型的化學不確定補充物在細胞培養基中提供數種有用的功能(參見Lambert,等.(1985) In:Animal Cell Biotechnology,Vol.1, Spier 等.，Eds.,Academic Press, New York,即.85-122 (1985))。例如，這些補充物
(I)提供用於不穩定或水不溶性營養物的載體或螯合劑；(2)結合併中和有毒部分；(3)提供激素和生長因子、蛋白酶抑制劑和必需的常常是未確認或不確定的低分子量營養物；以及(4)保護細胞免受物理應力和損傷。因此，血清或器官/腺體提取物通常用作相對低成本的補充物以提供培養動物細胞的最佳培養基。
[0029]關於恢復成熟培養基的抗氧化化合物成分，該成分發揮防止由反應性氧物質(如自由基和過氧化物)引起的對重要細胞成分之損傷的作用。在多個實施方案中，抗氧化物成分是穀胱甘肽。存在於恢復成熟培養基中的穀胱甘肽的量可變，但是通常以落入
0.0025~0.125% (w/v)範圍內的濃度存在。
[0030] 如上所述，恢復成熟培養基包含增強β細胞的葡萄糖依賴性胰島素分泌的成分。在多個實施方案中，該成分是合成的或天然的肽激素，其通過其胰島素分泌的葡萄糖依賴性刺激來發揮有效的葡萄糖調節作用。所述肽的實例包括但不限於胃抑制多肽(GIP)和胰高血糖素樣肽I (GLP-1)，以及這些肽的模擬物或類似物。在本發明的多個實施方案中，恢復成熟培養基包含足以促進β細胞成熟的濃度的GLP-1模擬物，Exenatide?(由CaliforniaPeptide Research, Inc., Napa, CA生產的exendin-4的合成形式)。在本發明的另一些實施方案中，增強β細胞的葡萄糖依賴性胰島素分泌的成分是胰島素或胰島素衍生物。胰島素可來源於任何物種，例如人、牛、豬、馬、犬或鼠，並且可以是合成胰島素或胰島素類似物。術語「胰島素類似物」等在本文中可互換使用並且意圖涵蓋上述任何形式的「胰島素」，其中多肽鏈內的一個或更多個胺基酸已被替換為可替換胺基酸和/或其中一個或更多個胺基酸已缺失或者其中一個或更多個額外胺基酸已被添加至多肽鏈或胺基酸序列中，其仍具有天然胰島素的至少一種功能，例如降低血液葡萄糖水平。在某些實施方案中，恢復成熟培養基可包含胰島素-轉鐵蛋白-亞硒酸鈉(ITS)激素。在又一些實施方案中，恢復成熟培養基的增強β細胞的葡萄糖依賴性胰島素分泌的成分可以是前述因子的任何組合。
[0031 ] 還將維生素B和E家族的衍生物添加至恢復成熟培養基中以幫助某些能量形成成分並降低氧化應激或損傷。維生素B的任何衍生物可以是適當的，維生素B衍生物的實例包括但不限於煙醯胺、煙醯胺類似物、煙醯胺或煙醯胺類似物衍生物、或者煙醯胺或煙醯胺類似物代謝物。在多個實施方案中，維生素B衍生物可以以0.02~0.12% (w/v)的濃度存在於恢復成熟培養基 中。可添加至本發明恢復成熟培養基中的維生素E衍生物可以是本領域技術人員已知的任何物質，包括但不限於維生素Ε(α -生育酚)、α -生育酚琥珀酸酯、α-生育酚磷酸酯、！'!01(--(6-羥基-2，5，7，8-四甲基色滿-2-羧酸)和維生素E本身，以及上述物質的任何組合。在多個實施方案中，恢復成熟培養基的維生素E衍生物成分以
1.0X Kr4 ~5Χ10-4% (w/v)的濃度存在。
[0032]關於恢復成熟培養基的鹼性胰腺胰蛋白酶抑制劑成分，合適的抑制劑包括但不限於腔分泌蛋白酶的抑制劑，如抑肽酶(aprotinin)、Bowman-Birk抑制劑、大豆胰蛋白酶抑制劑、雞卵類黏蛋白、雞卵抑制劑、人胰腺胰蛋白酶抑制劑、甲磺酸卡莫司他、類黃酮抑制劑、抗蛋白酶、亮抑肽酶、對氨基苄脒、AEBSF, TLCK, APMSF, DFP、PMSF、聚(丙烯酸酯)衍生物、胰凝乳蛋白酶抑制劑、苄氧羰基-Pro-Phe-CHO、FK-448、糖聯苯基硼酸複合物、.β.-苯基丙酸酯/鹽、彈性蛋白酶抑制劑、甲氧基琥珀醯-Ala-Ala-Pr0-Val-氯甲基酮(MPCMK)、EDTA和殼聚糖-EDTA綴合物。合適的蛋白酶抑制劑還包括膜結合蛋白酶的抑制劑，例如胺基酸、二肽和三肽、氨肽酶抑制劑、苯丁抑制素、嘌呤黴素、桿菌肽、次膦酸二肽類似物、.α.-氨基硼酸衍生物、Na-甘氨膽酸鹽、I，10-菲咯啉、阿西維辛(acivicin)、L-絲氨酸-硼酸鹽、塞奧芬和膦醯二肽。在多個實施方案中，恢復成熟培養基的鹼性胰腺胰蛋白酶抑制劑成分以約20至500mM的濃度存在。
[0033]如上所述，恢復成熟培養基可包含肝素。通常，肝素以肝素鈉的形式添加至培養基中。在多個實施方案中，本發明恢復成熟培養基的肝素成分可以是硫酸乙醯肝素，替代肝素或與肝素組合存在。
[0034]如上所述，恢復成熟培養基可包含絲氨酸蛋白酶抑制劑成分。在多個實施方案中，絲氨酸蛋白酶抑制劑會抑制可在上述胰島分離程序的膠原酶消化步驟期間被活化的供體胰腺的內源性酶的活化。參見Rose NL等.(2OO3) Transplantation75 (4):462-466,其通過引用併入本文。在多個實施方案中，本發明的恢復成熟培養基包含蛋白酶抑制劑，Pefabloc?(Roche Biochemicals Inc., Indianapolis, IN)。在多個其他實施方案中，恢復成熟培養基的絲氨酸蛋白酶抑制劑成分以0.2至0.7mM的濃度存在。
[0035]關於本發明恢復成熟培養基的DNA酶成分，該成分存在於培養基中以防止當細胞死亡並釋放脫氧核糖核酸(DNA)時趨於發生的細胞結塊。合適的DNA酶的實例包括DNA酶的DNA酶I以及DNA酶II形式，包括來源於任何哺乳動物來源的這些酶(包括人、牛和豬DNA酶)的重組形式。在多個實施方案中，恢復成熟培養基的DNA酶成分是鏈道酶a (dornase alfa)，其為市售為 Pulmozyme?(Genentech, South San Francisco, CA)的 DNA酶I的重組人形式。在多個其他實施方案中，恢復成熟培養基的DNA酶成分可以以200至400mM的濃度存在。
[0036]恢復成熟培養基還可任選地包含抗生素或抗生素組合。理想地，考慮包含在本發明培養基中的抗生素在寬範圍的溫度下是穩定的，並且既不被蛋白質滅活也不以會干擾胰島生長或成熟的方式抑制蛋白質部分。在本發明的多個實施方案中，恢復成熟培養基包含用於組織培養之標準濃度(例如0.0025% (w/v))的硫酸慶大黴素。
[0037]如上所述，本發明的方法包括組織培養期，其被分為至少兩個階段，恢復階段和成熟階段。成熟階段通常在恢復階段48小時後立即開始，並且涉及將胰島培養物的恢復成熟培養基更換為「成熟培養基」或稱作「第二成熟培養基」。除了成熟培養基包含一半量的絲氨酸蛋白酶抑制劑和脫氧核糖核酸酶成分之外，成熟培養基具有與恢復成熟培養基相同的組成。本發明的方法在β細胞成熟期期間至少每48小時更換50%的成熟培養基。在每一 48小時的時間點，計數胰島的數目並檢查其生存力。在多個實施方案中，本發明的方法通過用二硫腙(DTZ)對培養物的等分試樣染色來確定胰島計數(IC)和胰島當量(IE)，所述DTZ結合存在於胰島β細胞中的鋅離子，從而將胰島染成紅色。在更具體的實施方案中，本發明的方法移出胰腺組織培養物的100 μ I等分試樣，然後將該等分試樣與ImlDTZ混合。通過共焦顯微術或流式細胞術分析DTZ染色的細胞來確定成熟β細胞。因此，DTZ染色使得能夠確定在胰島中為成熟β細胞的細胞比例。在多個實施方案中，本發明的方法產生約IXlO2或更多IE/g胰腺組織。例如，本發明的方法可產生，但不限於5X102、1X103、5X 103、I X 104、5X IO4IE或其中的任何IE產量/g胰腺組織。舉例來說，在某些實施方案中，本發明方法的產量可以是在胰島分離後第八天加工之前6.4X103IE/g收穫的胰腺。
[0038]通常可通過本發明的方法通過用螢光素二乙酸酯(FDA)、碘化丙啶(PI)或Newport Green對胰島培養物的等分試樣染色，然後通過共焦顯微術或通過使用微板閱讀器分析經染色的細胞來確定β細胞成熟期期間胰島培養物的生存力。在多個實施方案中，本發明的方法在胰島分離後的第七天產生大於80%的細胞生存力。例如，在胰島分離後的第七天，胰島培養物的細胞生存力可以是但不限於胰島分離後的第七天85%
100 %或其中細胞生存力的任何百分比。在某些實施方案中，例如，根據評估生存力的FDA和PI方法，在胰島分離後的第七天，細胞生存力可大於98%。在某些其他實施方案中，根據評估生存力的Newport Green方法,在胰島分離後的第七天,細胞生存力可大於90%。
[0039]β細胞的重要功能之一是根據葡萄糖水平調節其胰島素分泌。考慮該功能，可通過使用本領域技術人員已知的適合用於該目的的任何方法在本發明方法的成熟期內監測胰島培養物的葡萄糖響應。例如，可使用葡萄糖刺激的胰島素釋放(GSIR)測定在本文中描述的β細胞成熟過程的任何階段評估胰島功能。更具體地，標準GSIR測定以以下溶液順序將獲自胰島培養物的約100至150個胰島細胞孵育特定的時間，通常為一小時，並且每個葡萄糖溶液孵育之間用PBS進行兩次PBS洗滌。之後該測定檢測細胞分泌的胰島素的量:1)低葡萄糖溶液(2.8mM葡萄糖)；2)高葡萄糖溶液(28mM葡萄糖)；3)還包含3-異丁基-1-甲基黃嘌呤(ΙΒΜΧ，50μΜ)的高葡萄糖溶液(28mM葡萄糖)；以及之後4)低葡萄糖溶液(2.8mM葡萄糖)。
[0040]基於高葡萄糖條件下β細胞分泌的胰島素與低葡萄糖條件下β細胞分泌的胰島素的量的比率，隨後將胰島素釋放數據用於計算刺激指數(SI)。最大SI (MX)可計算為高葡萄糖和IBMX條件下分泌的胰島素的量除以僅高葡萄糖條件下分泌的胰島素的量。
[0041]為了檢測分泌的胰島素，在每一上述葡萄糖刺激步驟之後分別從板中吸出培養基，離心，然後收集。收集上清液用於胰島素分析，在_20°C下儲存直到通過任何本領域已知的並且在本發明方法中適合用於該目的的胰島素檢測方法來確定胰島素含量。在多個實施方案中，本發明的GSIR測定通過放射免疫測定(RIA)來檢測胰島素，而在另一些實施方案中，該測定使用標準酶聯免疫吸附測定(ELISA)來檢測胰島素。
[0042]通常，通過本發明方法分離的胰島在分離後(許多β細胞尚未成熟的階段)立即具有葡萄糖響應性。隨著在本發明方法下β細胞的成熟，可觀察到葡萄糖反應性的連續增加。在多個實施方案中，本發明的方法經時間增加了胰島培養物的SI。在某些實施方案中，在β細胞成熟過程期間的時間點之間，SI的增加可以是約5%或更少，而在另一些實施方案中，SI的增加百分比可以是並且包括5%至200%。例如，在一些實施方案中，SI在分離時可以為約1.3，分離後第3天可以為1.7，並且分離後第7天可以為約2.6。
[0043]如上所述，在本發明方法的β細胞成熟過程期間，經培養的胰島經歷某些發育變化，這通過展示經分化胰細胞的多種表型和基因型標記而證實。事實上，有許多可用於鑑定胰細胞群體的細胞標誌物。據信，這些標記或標誌物的變化涉及經培養胰島的成熟。其中，這些變化包括凋亡的細胞比例的減少、β細胞成熟的細胞標誌物的表達和胰島大小的增加。
[0044]可通過使用本領域技術人員已知的適合用於該目的的任何方法(包括使用市售的凋亡檢測試劑盒)來確定本發明方法的β細胞成熟期期間的凋亡水平的變化。用於檢測胰島培養物中凋亡的另一些示例性方法包括基於羰花青核酸染色的技術，如YO-PIK^-1碘化物和Vybrant?1凋亡測定試劑盒(均購自Life Technologies)。通
常，胰島在β細胞成熟過程期間主要在胰島的外部腺泡細胞層中經歷凋亡的漸進性減少。在多個實施方案中，經歷凋亡的胰島細胞的部分在β細胞成熟過程中可減少十倍或更多。例如，分離後第3天的凋亡胰島細胞部分可以是約22.5%，之後分離後第8天減少至約4.2%。
[0045]可通過使用本領域技術人員已知的適合用於該目的的任何方法來檢測β細胞成熟的細胞標誌物。例如，檢測胰島細胞標誌物的一個標準方法是通過流式細胞術。簡要地，可用抗體對經過濾的(例如，70 μ m過濾器)、分散酶解離的胰島細胞懸液進行免疫組織化學染色，所述抗體對胰島素(對β細胞具有特異性)、胰高血糖素(對α細胞具有特異性)、促生長素抑制素(對δ細胞具有特異性)、胰多肽(PP)(對ρρ產生細胞具有特異性)和澱粉酶(對腺泡組織具有特異性)具有特異性。在本發明的多個實施方案中，對於澱粉酶染色呈陽性的胰島細胞(即，腺泡細胞)的比例減少，而對於胰島素染色呈陽性的胰島細胞(即，β細胞)的比例隨時間增加。在某些實施方案中，澱粉酶陽性細胞在分離後第2天相對於第7天的比例可分別從約75%減少到10% ;例如，從約65%減少到約25%。相反地，在某些實施方案中，胰島素陽性細胞在分離後第2天相對於第7天的比例可分別從約25%增加到約85% ;例如，從約42%增加到約70%。
[0046]可通過使用本領域技術人員已知的適用於該目的的任何方法來確定胰島細胞形態學和體系結構。通常，胰島的標準蘇木精和伊紅染色法(Η&Ε)染色揭示其細胞組成和結構特徵。如上所述，胰島的直徑與功能(即，葡萄糖響應性)正相關。在這方面，本發明方法可產生分離後第8天其中絕大部分的胰島直徑超過50 μ m的培養物。例如，在多個實施方案中，本發明方法產生胰島培養物，其中約90 %或更多胰島的直徑為並且包括50 μ m至150 μ m0
實施例
[0047]實施例1.胰島移出和分離
[0048]將正在斷奶的仔豬用作未成熟胰島的供體來源。通常的胰島製備方法使用十隻14至26天齡的Yorkshire仔豬。通過快速外科手術獲取(即，少於五分鐘)從仔豬移出胰腺，之後置於冰冷的器官保存溶液(Corning Cellgro)中。整個冷卻的缺血時間限制在20分鐘。將收穫的胰腺合併並如下切割。冷凍後，切除胰腺周圍的動物脂肪和淋巴組織，之後細細地切碎直到組織切片的直徑通常為0.5mm至1.0_。使用標準剪刀和攪拌技術繼續進行切割過程，以將胰腺組織切碎。將切碎的組織添加至低劑量Clzyme膠原酶ΜΑ/BP蛋白酶的酶混合物(75?250mg/胰腺，VitaCyte LLC, Indianapolis, IN)中，然後使得在37°C下消化並溫和地搖動旋轉(40?60rmp)，直到大部分周圍腺泡組織與未成熟胰島輕輕地分開。之後使胰腺組織在同一條件下再消化150分鐘。在消化反應結束時，將補充有HEPES和10% BSA的100?150ml冷的Hank平衡鹽溶液(HBSS)添加至組織-膠原酶混合物中，以使消化反應停止。消化時間保持儘可能短，以幫助保存初期胰島體系結構，因為在其分離的時候胰島的膠原基質發育不良並且容易遭受破壞。將經消化組織通過500 μ m金屬網漏鬥過濾，以除去直徑大於500 μ m的未經消化的組織，留下的未成熟胰島通常直徑為50 μ m至500 μ m0之後，使胰島經受使得它們經歷成熟的組織培養條件。簡要地，胰島的培養分為兩個階段:i)恢復階段；和ii)成熟階段。恢復階段涉及外科手術分離胰島之後48小時的時期，並且成熟階段涉及從恢復階段結束至胰島足夠成熟以在異種移植當天有葡萄糖響應的時間的時期，通常約八天。這些培養階段描述於以下實施例中。
[0049]實施例2.經分離胰島的回收
[0050]對於首個分離後48小時，將胰島簇培養於被稱為恢復成熟培養基的新的組織培養基中。製備恢復成熟培養基中的第一步驟涉及獲得Ham』 s F-12/Mediuml99基礎培養基(F-12/199培養基)，其中Ham，s F-12和Mediuml99成分以I: I比率存在。在這些研究中，通過將Ham』 8?-12和]^(1丨11111199粉末(均購自Cellgro，Inc.)以各自0.815%的重量/體積(w/v)濃度(即，8.15g在IL水中)添加至滿足IS09001:2000和cGMP指南(ThermoScientific Inc.,Waltham,MA)的無菌水中來製備F-12/199培養基。之後向該F-12/199培養基添加:5.5% (w/v)豬血清(Lampire Biological Laboratories, Inc.，Pipersville,PA) ；2.5 X IO-3 % (w/v)硫酸慶大黴素(Fisher Bioreagents, Thermo Fisher Scientific,Inc., Waltham, MA) ；0.062 % (w/v)穀胱甘妝三妝(Acros Organics, Thermo FisherScientific, Inc., Waltham, MA) ；0.6 % (w/v)胰島素-轉鐵蛋白-亞硒酸鈉(ITS)激素(Sigma-Aldrich C0., LLC, St.Lous,MO) ；0.029% (w/v) L-穀氨酸胺(Fisher Bioreagents,Thermo Fisher Scientific, Inc., Waltham, MA) ；0.0244% (w/v) 6-羥基-2, 5, 7,8-四甲基色滿-2-羧酸(Trolox?, Acros Organics, Thermo Fisher Scientific, Inc., Waltham, MA)；
4.2X 10_6% (w/v)艾塞那肽(Exenatide, exendin-4 的合成形式，由 California PeptideResearch, Inc., Napa, CA 製造)；0.066% 肝素(150U/mg 肝素納，Fisher Bioreagents,Thermo Fisher Scientific, Inc.，Waltham, MA) ;215mM 抑妝酶(Sigma-Aldrich C0.，LLC,St.Lous, MO) ；0.5mM Pefabloc?(Sigma-Aldrich C0.，LLC, St.Lous, MO) ；417mM DNA 酶a (Genentech Inc., S.San Francisco, CA);以及足夠量的HEPES緩衝液以將培養基的pH維持在7.2至7.5 (通常為5mM至20mM)。在T-175懸浮燒瓶中以80~100 μ I組織在40ml培養基中的組織密度於37°C和5% CO2下在恢復成熟培養基中培養胰島。
[0051]實施例3.經切除胰島的成熟
[0052]在恢復成熟培養基中培養48小時後，將胰島從恢復成熟培養基移出，以200Xg離心兩分鐘，然後再懸浮於本文中簡稱為「成熟培養基」的恢復成熟培養基修改形式中。具體地，恢復成熟培養基和成熟培養基之間的差異為成熟培養基具有一半量的Pefabloc?和DNA酶a。將胰島培養於成熟培養基中，直到胰島完全成熟，時期為約八天至九天，在此期間每48小時更換50%的培養基 。根據以下實施例中描述的組織化學和功能分析來定義胰島的完全成熟。當胰島達到完全成熟時，可以將它們長期培養在「經補充成熟培養基」中，該培養基為包含額外5mM濃度鈣的成熟培養基。需要額外的鈣用於幫助防止胰島包囊的崩解。
[0053]實施例4.胰島生存力、數目和成熟度
[0054]在每48小時更換培養基時，評價了組織等分試樣的胰島計數、細胞生存力和β細胞成熟度。在本文中稱為胰島計數(IC)的培養基中胰島的數目以及在本文中稱為胰島當量(IE)的包含成熟中β細胞之胰島的數目通過將胰島培養物的100 μ I等分試樣添加至Iml 二硫腙(DTZ)(結合存在於β細胞之鋅離子的紅色染料)中來確定(LatifZA,等.(1988) Transplantation45 (4):827-830 ;Ricordi C,等.(1990) Acta DiabetolLat27(3):185-95 ;和 Scharp DW，等.(1984) World J Surg.8 (2):143-151)。將 DTZ 染色進行5分鐘之後,利用裝配有10X10目鏡計數線的標準立體顯微鏡(Max Erb Instrument C0.,Santa Ynez,CA)以25X放大率來觀察胰島。計數每個胰島簇以得到1C。基於檢測的成熟中β細胞的存在，使用陽性DTZ染色在成熟期內確定了胰島純度的百分比。更具體地，通過各個組織簇內陽性DTZ染色的量除以未染色區域的量確定了純度百分比。
[0055]通過使用突光素二乙酸酯(FDA)和碘化丙唳(PI)或Newport Green/PI染色、然後通過共焦顯微術(使用ZeissLSM510共焦顯微鏡(Carl Zeiss, Inc.))的可視化分析了細胞生存力百分比，並使用微板閱讀器定量了生存力(Tecan Infinite F200, Magellan V7)(lglesias I,等.(2008) Transplant Proc.40(2):351-354 ;Lamb Μ,等.(2011) TransplantProc.43 (9):3265-3266;和 Lukowiak B,等.(2001) J Histochem Cytochem.49(4):519-528)。
[0056]緊接著其分離，胰島純度平均為8.5% ±1.1。參見圖3B。培養7天後，胰島的純度已增加至78% ±1.5。參見圖3B。DTZ陽性組織的比例在組織培養期間增加(培養7天後，12.6X103±183IEQ(平均值土 sem)增加至 33.3 X 103± 136 (η = 10)，ρ < 0.05)，並且大部分胰島的直徑為50~150 μ m(7天後94.52±11% )。參見表1和圖3A。
[0057]分離後7天發生經培養胰島的完全成熟，並且沒有直徑超過350 μ m的胰島，約90%的胰島為50 μ m至150 μ m。參見表1。在培養的第7天，生存力為> 98% ±0.03 (FDA/PI)和> 90% ±0.4 (Newport Green)。參見圖 3B。
[0058]表1.[0059]
【權利要求】
1.用於促進來自斷奶前哺乳動物之胰島細胞成熟的方法，其包括: a)從斷奶前哺乳動物中移出胰腺； b)將所述胰腺組織減小成大於完整胰島之大小的碎片，同時保持胰島處於完全的、產生胰島素的狀態； c)在蛋白酶溶液中消化所述組織碎片，使得圍繞所述胰島的任何外分泌組織僅部分地與所述胰島分開； d)在第一成熟培養基中培養所述經消化的組織； e)在第二成熟培養基中培養所述經消化的組織； f)確定所述經培養胰島的葡萄糖響應度；以及 g)選擇有葡萄糖響應的胰島。
2.根據權利要求1所述的方法，其中所述斷奶前哺乳動物是仔豬。
3.根據權利要求1所述的方法，其中所述第一成熟培養基包含: a)動物來源的不確定成分；b)抗氧化化合物；c)增強β細胞的葡萄糖依賴性胰島素分泌的成分；d)維生素B衍生物；f)維生素E衍生物；g)肝素；h)鹼性胰腺胰蛋白酶抑制劑；i)絲氨酸蛋白酶抑制劑；和j)脫氧核糖核酸酶。
4.根據權利要求1所述的方法，其中所述第二成熟培養基包含: a)動物來源的不確定成分；b)抗氧化化合物；c)增強β細胞的葡萄糖依賴性胰島素分泌的成分；d)維生素B衍生物；f)維生素E衍生物；g)肝素；h)鹼性胰腺胰蛋白酶抑制劑；i)絲氨酸蛋白酶抑制劑；和j)脫氧核糖核酸酶，其中所述絲氨酸蛋白酶抑制劑和所述脫氧核糖核酸酶成分的濃度不大於其在所述第一成熟培養基中濃度的一半。
5.根據權利要求3或權利要求4所述的方法，其中所述動物來源的不確定成分為豬血清。
6.根據權利要求3或權利要求4所述的方法，其中所述抗氧化化合物為穀胱甘肽。
7.根據權利要求3或權利要求4所述的方法，其中所述增強β細胞的葡萄糖依賴性胰島素分泌的成分為Exenatide?、胰島素、胰島素-轉鐵蛋白-亞硒酸鈉(ITS)激素、或其組八口 ο
8.根據權利要求3或權利要求4所述的方法，其中所述維生素B衍生物為煙醯胺。
9.根據權利要求3或權利要求4所述的方法，其中所述維生素E衍生物為6-羥基-2，5，7，8-四甲基色滿-2-羧酸。
10.根據權利要求3或權利要求4所述的方法，其中所述鹼性胰腺胰蛋白酶抑制劑為抑肽酶。
11.根據權利要求3或權利要求4所述的方法，其中所述絲氨酸蛋白酶抑制劑為Pefabloc?。
12.根據權利要求3或權利要求4所述的方法，其中所述脫氧核糖核酸酶為鏈道酶α。
【文檔編號】G01N33/567GK104011546SQ201280047827
【公開日】2014年8月27日 申請日期:2012年9月28日 優先權日:2011年9月28日
【發明者】喬納森·Rt·萊基 申請人:胰島科學股份有限公司