用於治療癌症的具鵝膏蕈毒素的靶結合部分的製作方法

2023-09-17 04:34:40 2

專利名稱：用於治療癌症的具鵝膏蕈毒素的靶結合部分的製作方法
技術領域：
本發明涉及腫瘤治療。在一個方面，本發明涉及可用於治療癌症的靶結合部分和毒素的綴合物。具體而言，毒素為鵝膏蕈毒素(amatoxin)，靶結合部分(例如抗體)針對腫瘤相關抗原，例如上皮細胞黏附分子(迎ithelial cell adhesion molecule, EpCAM)。在另一方面，本發明涉及包含這種靶結合部分毒素綴合物的藥物組合物和這種靶結合部分毒素綴合物在製備這種藥物組合物中的用途。本發明的靶結合部分毒素綴合物和藥物組合物可用於治療癌症，尤其是腺癌，例如胰腺癌、膽管癌、乳腺癌和結直腸癌。發明背景和技術狀態鵝膏蕈毒素鵝膏蕈毒素是由8個胺基酸組成的環肽。它們可分離自毒鵝膏(Amanita phalloides)蘑菇，或通過合成從結構單元製備。鵝膏蕈毒素特異性抑制哺乳動物細胞的 DNA依賴的RNA聚合酶II，因此亦抑制受影響細胞的轉錄及蛋白質生物合成。在細胞中抑制轉錄引起生長和增殖停止。儘管不是共價結合，但鵝膏蕈鹼(amanitin)和RNA-聚合酶 II之間的複合物非常緊密(KD = 3nM)。鵝膏蕈鹼與酶解離是非常緩慢的過程，這使得受影響的細胞不可能恢復。當轉錄抑制持續時間過長時，細胞將經歷程序性細胞死亡(細胞凋亡)。上皮細胞黏附分子上皮細胞黏附分子(EpCAM，⑶326)是人腫瘤上研究得最為透徹的靶抗原之一 (Trzpis等，2007 ；Baeuerle和Gires, 2007)。其代表表觀分子量為40kDa的314個胺基酸的I型膜糖蛋白(Balzar等，1999)。其在大部分腺癌中過表達(Winter等，2003 ；Went等， 2004)。具體而言，在結節陽性乳腺癌、上皮卵巢癌、膽管癌、胰腺癌和鱗狀細胞頭頸癌中， EpCAM表達增強。EpCAM表達增加在乳腺癌和膽囊癌中表示預後差(Gastl等，2000 ;Varga 等，2004 ；Spizzo等，2002 ；Spizzo等，2004)。重要的是，在乳房癌、結直腸癌和胰腺癌中通過腫瘤起始或癌症幹細胞來表達EpCAM(Al-Hajj等，2003 ；Dalerba等，2007 ；Li等，2007)。業已將EpCAM特異性單克隆抗體作為診斷工具用於檢測癌症患者中少見的循環腫瘤細胞(Allard等，2004 ;Nagrath等，2007)。目前在臨床研究中調查幾種工程改造的抗-EpCAM抗體。鵝膏蕈毒素和抗體的綴合物本發明人早先的專利申請EP 1 859 811 Al (2007年11月28日公開)描述了其中 β-鵝膏蕈鹼與清蛋白或與單克隆抗體HEA125、0KT3和PA-I偶聯的綴合物。此外，研究了這些綴合物對乳腺癌細胞(MCF-7)、伯基特氏淋巴瘤細胞(Raji)和T-淋巴瘤細胞(Jurkat) 增殖的抑制作用。構成本發明基礎的技術問題現有技術中需要靶結合部分毒素綴合物以極低濃度發揮其對靶細胞或組織的毒性作用。此外，現有技術中還需要治療其它疾病類型，尤其是治療其它類型的癌症，特別是那些對實際腫瘤治療有治療抗性或反應差的癌症。
本發明滿足這些和其它的需要。例如，發明人在構成本發明基礎的實驗中發現，包含鵝膏蕈毒素和新的嵌合抗體huHEA125的綴合物能夠以比現有技術所述綴合物低得多的濃度抑制腫瘤細胞增殖。具體而言，包含鵝膏蕈毒素和嵌合抗體huHEA125的綴合物以在使用現有技術的綴合物時所需濃度的約百分之一的濃度發揮其抑制作用。此外，發明人發現， 包含鵝膏蕈毒素和EpCAM特異性抗體的綴合物不僅能抑制乳腺癌細胞的增殖，而且意想不到地亦能夠抑制胰腺癌細胞、結直腸癌細胞和膽管癌細胞的增殖。另外，發明人發現選擇綴合物的鵝膏蕈毒素部分中的特定連接點，產生高度有效的靶結合部分毒素綴合物(尤其抗體毒素綴合物)，其以極低濃度(IC5tl大約ZxIO-12^xIO-11M)發揮其對靶細胞的毒性活性，並對其靶細胞具有高度特異性。不希望受特定理論的束縛，該後一優點可得到解釋，因為鵝膏蕈毒素是在靶細胞內而不是在靶細胞外從靶結合部分鵝膏蕈毒素綴合物上被有效釋放。上述概述未必闡述本發明解決的所有問題。發明簡述在第一方面，本發明涉及一種用於治療患者的胰腺癌、膽管癌或結直腸癌的抗體毒素綴合物，其中綴合物包含(i)特異性結合上皮細胞黏附分子(EpCAM)表位的抗體或其抗原結合片段；(ii)鵝膏蕈毒素；和(iii)任選的連接體Li。在第二方面，本發明涉及一種抗體毒素綴合物，其包含(i)特異性結合上皮細胞黏附分子(EpCAM)的抗體或其抗原結合片段，其中抗體或其抗原結合片段包含(a) huHEA125重鏈，其中重鏈選自(al)SEQ ID NO=I的重鏈的膜結合形式，其中SEQ ID NO 3 所示的重鏈可變域VH，包含位於VH框架區中的0-10個胺基酸交換、0-10個胺基酸缺失和/ 或0-10個胺基酸插入，SEQ ID NO 26所示的重鏈恆定域包含0_10個胺基酸交換、0_10個胺基酸缺失和/或0-10個胺基酸插入；和(a2)SEQ ID NO 2的重鏈的可溶形式，其中SEQ ID NO 3所示的重鏈可變域VH包含位於VH框架區中的0_10個胺基酸交換、0_10個胺基酸缺失和/或0-10個胺基酸插入，SEQ ID NO :27所示的重鏈恆定域包含0-10個胺基酸交換、 0-10個胺基酸缺失和/或0-10個胺基酸插入；和(b)SEQ ID NO 11的huHEA125輕鏈，其中SEQ ID NO :12所示的輕鏈可變域VL包含位於VL框架區中的0-10個胺基酸交換、0-10 個胺基酸缺失和/或0-10個胺基酸插入，SEQ ID NO :28所示的輕鏈恆定域CL包含0-10 個胺基酸交換、0-10個胺基酸缺失和/或0-10個胺基酸插入；(ii)鵝膏蕈毒素；和(iii) 任選的連接體L2。在第三方面，本發明涉及一種用於醫藥的第二方面的抗體毒素綴合物。在第四方面，本發明涉及一種用於治療患者癌症的第二方面的抗體毒素綴合物， 其中所述癌症選自胰腺癌、膽管癌、乳腺癌和結腸癌。在第五方面，本發明涉及一種靶結合部分毒素綴合物，其包含(i)靶結合部分； (ii)鵝膏蕈毒素；和(iii)任選的連接體L3 ；其中所述鵝膏蕈毒素通過鵝膏蕈毒素3號胺基酸的δ C-原子與所述靶結合部分或可能存在的連接體L3連接。在第六方面，本發明涉及一種用於醫藥的第五方面的靶結合部分毒素綴合物。在第七方面，本發明涉及一種用於治療患者癌症的第五方面的靶結合部分毒素綴合物，其中所述癌症選自胰腺癌、膽管癌、乳腺癌、結直腸癌、肺癌、前列腺癌、卵巢癌、胃癌、 腎癌、惡性黑色素瘤、白血病和惡性淋巴瘤。在第八方面，本發明涉及一種藥物組合物，其包含第一方面或第二方面的抗體毒素綴合物或第五方面的靶結合部分毒素綴合物，且還包含一種或多種藥學上可接受的稀釋劑、載體、賦形劑、填充劑、粘合劑、潤滑劑、助流劑、崩解劑、吸附劑和/或防腐劑。該發明概述未必闡述本發明的所有特徵。附圖簡述

圖1顯示不同鵝膏蕈毒素的結構式。粗體數字(1-8)指出形成鵝膏蕈毒素的8個胺基酸的標準編號。用希臘字母α、β、Y和δ標出3號胺基酸中最重要的碳原子。亦顯示(取代的)色氨酸即4號胺基酸側鏈的原子編號(1』 _7』號)。圖2顯示通過結合競爭分析比較的huHEA125-Ama和huHEA125與靶細胞的結合親和力。將表達EpCAM的Colo205細胞與固定量的直接FITC-標記的小鼠HEA125抗體孵育。 通過流式細胞術分析與靶細胞的結合。漸增量的huHEA125-Ama或huHEA125的結合競爭顯示對靶抗原的親和力極為相似。圖3顯示通過間接免疫螢光檢測的不同癌細胞系中EpCAM抗原的表面表達圖 3A Capan-I (人胰腺癌)；圖3B Colo205 (人結腸腺癌)；圖3C OZ (人膽管癌)；和圖3D MCF-7(人乳腺癌系)；圖3E BxPC-3(人胰腺癌)；和圖3F PC_3(人前列腺癌)。各圖左邊的灰色陰影柱狀圖顯示用對照抗體Xolair 獲得的結果；各圖右邊具有白色區域的柱狀圖顯示用抗體huHEA125獲得的結果。圖4顯示由具鵝膏蕈鹼的抗體huHEA125、具鵝膏蕈鹼的對照抗體Xolair 和游離鵝膏蕈鹼引起的抑制Capan-I細胞增殖的比較。圖5顯示由具鵝膏蕈鹼的抗體huHEA125、具鵝膏蕈鹼的對照抗體Xolair 和游離鵝膏蕈鹼引起的抑制Colo205細胞增殖的比較。圖6顯示由具鵝膏蕈鹼的抗體huHEA125、具鵝膏蕈鹼的對照抗體Xolair 和游離鵝膏蕈鹼引起的抑制MCF-7細胞增殖的比較。圖7顯示由具鵝膏蕈鹼的抗體huHEA125、具鵝膏蕈鹼的對照抗體Xolair 和游離鵝膏蕈鹼引起的抑制OZ細胞增殖的比較。圖8顯示由具鵝膏蕈鹼的抗體huHEA125、具鵝膏蕈鹼的對照抗體Xolair 和游離鵝膏蕈鹼引起的抑制BxPC-3細胞增殖。圖9顯示用huHEA125_鵝膏蕈鹼治療後在N0D/SCID小鼠中的BxPC_3腫瘤異種移植物的生長抑制。圖10顯示用huHEA125_鵝膏蕈鹼治療後在N0D/SCID小鼠中的PC_3腫瘤異種移植物的生長抑制。發明詳述^X在下文詳述本發明之前，應該理解本發明不限於本文所述的特定方法、方案和試劑，因為這些可變化。亦應理解本文所用術語僅用於描述特定實施方案的目的，並非旨在限制僅由所附權利要求限定的本發明範圍。除非另外定義，否則本文所用所有技術及科學術語具有本領域普通技術人員所通常理解的相同含義。優選本文所用術語按照以下文獻所述進行定義「A multilingual glossary of biotechnological terms (IUPAC Recommendations) Leuenberger, H. G. W, Nagel, B.禾口 Kolbl, H.主編(1995), Helvetica Chimica Acta, CH-4010 Basel, Switzerland)。
除非上下文另有要求，否則貫穿本說明書及以上權利要求，用詞「包含」及變體例如「包括」和「含有」應理解為表示包括所述整數或步驟或者整數群或步驟群，但不排除任何其它的整數或步驟或者整數群或步驟群。本說明書通篇引用若干文獻。本文引用的每篇文獻(包括所有專利、專利申請、科學出版物、製造商說明書、操作指南、GenBank登錄號序列提交等)，不管是上文還是下文， 皆以其整體通過引用結合到本文中。本文不應解釋為承認本發明無權由於先前發明而早於這些公開。本文所用術語「靶結合部分」指可特異性結合靶分子或靶表位的任何分子或分子部分。本申請上下文中的優選靶結合部分為(i)抗體或其抗原結合片段；(ii)抗體樣蛋白質；和(iii)核酸適配體。適合用於本發明的「靶結合部分」通常具有40000Da(40kDa)以上的分子量。本申請上下文中，術語「靶分子」和「靶表位」分別指各由靶結合部分特異性結合的抗原和抗原表位，優選靶分子為腫瘤相關抗原，特別是與非腫瘤細胞表面相比以增加的濃度和/或不同空間構型存在於一種或多種腫瘤細胞類型表面上的抗原或表位。優選所述抗原或表位存在於一種或多種腫瘤細胞類型表面而非非腫瘤細胞表面上。本文所用術語「抗體或其抗原結合片段」指免疫球蛋白分子和免疫球蛋白分子的免疫活性部分，即含有免疫特異性結合抗原的抗原結合位點的分子。亦包含通過包括諸如噬菌體展示等技術選擇的特異性結合靶分子(例如靶蛋白EpCAM)的免疫球蛋白樣蛋白質。本發明免疫球蛋白分子可為免疫球蛋白分子的任何類型(例如IgG、IgE、IgM、IgD、 IgA和IgY)、種類(例如IgGU IgG2、IgG3、IgG4、IgAl和IgA2)或亞類。適合用於本發明的「抗體及其抗原結合片段」，包括但不限於多克隆抗體、單克隆抗體、單價抗體、雙特異性抗體、異種綴合抗體、多特異性抗體、人抗體、人源化抗體(特別是CDR-嫁接的)、去免疫化(deimmunized)抗體或嵌合抗體、單鏈抗體(例如scFv)、Fab片段、F(ab' )2片段、由 Fab表達文庫產生的片段、雙抗體或四抗體(tetrabody) (Holliger P.等，1993)、納米抗體 (nanobody)、抗獨特型(抗-Id)抗體(包括例如抗本發明抗體的抗-Id抗體)和以上任一種的表位結合片段。在某些實施方案中，抗原結合片段為本發明的人抗原結合抗體片段，包括但不限於Fab、Fab'和F(ab' ) 2、Fd、單鏈Fv (scFv)、單鏈抗體、二硫鍵連接的Fv (dsFv)和包含VL 或VH結構域的片段。包括單鏈抗體在內的抗原結合抗體片段可包含單獨的一個或多個可變域，或與以下的整體或部分組合的一個或多個可變域鉸鏈區、CL、CHU CH2和CH3結構域。亦包括在本發明中的是還包含一個或多個可變域與鉸鏈區、CL、CH1、CH2和CH3結構域的任何組合的抗原結合片段。可用於本發明的抗體可來自任何動物來源，包括鳥類和哺乳動物。優選抗體來源為人、齧齒動物(例如小鼠和大鼠)、驢、綿羊、兔、山羊、豚鼠、駱駝、馬或雞。特別優選抗體為人或鼠來源。本文所用「人抗體」包括具有人免疫球蛋白胺基酸序列的抗體，並包括分離自人免疫球蛋白文庫或分離自一種或多種人免疫球蛋白的轉基因動物(其不表達內源免疫球蛋白)的抗體，如例如Kucherlapati和Jakobovits的美國專利號5，939，598所述。術語「抗體樣蛋白」指業已經過工程改造(例如通過環誘變)以特異性結合靶分子的蛋白質。通常這樣的抗體樣蛋白包含至少一個兩端均與蛋白質支架連接的可變肽環。這種雙重結構約束將抗體樣蛋白的結合親和力大大提高到可與抗體的結合親和力相比的水平。可變肽環的長度通常由10-20個胺基酸組成。支架蛋白可為具有良好溶解性的任何蛋白質。優選支架蛋白為小球狀蛋白。抗體樣蛋白包括但不限於親和體(affibody)、抗運載蛋白(anticalin)和設計的錨蛋白重複蛋白(綜述參見Binz等，2005)。抗體樣蛋白可源自大的突變體文庫，例如可自大的噬菌體展示文庫淘選，並可以以與常規抗體類似的方式分離。同樣，可通過組合誘變球狀蛋白質上的表面暴露殘基來獲得抗體樣結合蛋白。術語「核酸適配體」指通過多輪體外選擇或SELEX(指數富集配體系統進化 (systematic evolution of ligands by exponential enrichment))進工禾呈改造以與靶分子結合的核酸分子(綜述參見Brody和Gold，2000)。核酸適配體可為DNA或RNA分子。適配體可含有修飾，例如修飾核苷酸，例如2』 -氟取代的嘧啶。術語「鵝膏蕈毒素」包括分離自鵝膏屬(Amanita)並在參考資料(Wieland， Τ.和Faulstich H.，1978)中描述的由8個胺基酸組成的所有環肽；還包括其所有的化學衍生物；還包括其所有的半合成類似物；還包括其所有根據天然化合物的主結構由結構單元構建的合成類似物(環狀，8個胺基酸)；還包括含有非羥基化胺基酸取代羥基化胺基酸的所有合成或半合成類似物；還包括這樣的所有合成或半合成類似物其中硫醚亞碸部分被硫化物(sulfide)、碸取代，或被不同於硫的原子取代，例如被鵝膏蕈鹼的卡巴類似物 (carbaanalog)中的碳原子取代。鵝膏蕈毒素在功能上被定義為抑制哺乳動物RNA聚合酶II的肽或酯肽。優選鵝膏蕈毒素為具有可與連接體分子或蛋白質(例如抗體或抗體片段)反應的官能團(例如羧基、氨基、羥基、硫醇基或硫醇捕獲基團)的那些。特別適於本發明綴合物的鵝膏蕈毒素為圖1所示的α-鵝膏蕈鹼、β-鵝膏蕈鹼、Y-鵝膏蕈鹼、ε-鵝膏蕈鹼、鵝膏素(amanin)、 三羥鵝膏毒肽醯胺(amaninamide)、鵝膏無毒環肽(amanullin)和一羥鵝膏毒肽羧酸 (amanullinic acid)以及其鹽、化學衍生物、半合成類似物和合成類似物。特別優選用於本發明的鵝膏蕈毒素為α-鵝膏蕈鹼、鵝膏蕈鹼和三羥鵝膏毒肽醯胺。本文所用化合物的「衍生物」，指具有與該化合物相似的化學結構但含有至少一個該化合物中不存在的化學基團和/或缺乏至少一個該化合物中存在的化學基團的物質。該化合物相對於其衍生物被稱為「母體」化合物。通常可在一個或多個化學反應步驟中從母體化合物產生「衍生物」。本文所用化合物的「類似物」與該化合物在結構上相關但不相同，並表現出該化合物的至少一種活性。該化合物相對於其類似物被稱為「母體」化合物。前述活性包括但不限於與另一化合物的結合活性；抑制活性，例如酶抑制活性；毒性作用；激活活性，例如激活酶的活性。不要求類似物表現出與母體化合物同樣的程度的這樣的活性。在本申請上下文中將某化合物認為是類似物的條件是，其表現出母體化合物活性的至少(更優選至少5%、更優選至少10%、更優選至少20%、更優選至少30%、更優選至少40%和更優選至少50% )程度的相關活性。因而，本文所用「鵝膏蕈毒素類似物」指這樣的化合物其在結構上與圖1所示的α-鵝膏蕈鹼、β-鵝膏蕈鹼、γ-鵝膏蕈鹼、鵝膏蕈鹼、鵝膏素、三羥鵝膏毒肽醯胺、鵝膏無毒環肽和一羥鵝膏毒肽羧酸中的任何一種相關，且與α-鵝膏蕈鹼、鵝膏蕈鹼、Y-鵝膏蕈鹼、鵝膏蕈鹼、鵝膏素、三羥鵝膏毒肽醯胺、鵝膏無毒環肽和一羥鵝膏毒肽羧酸中的至少一種相比，表現出對哺乳動物RNA聚合酶II的抑制活性的至少1 % (更優選至少5 %、更優選至少10 %、更優選至少20 %、更優選至少30 %、更優選至少 40%和更優選至少50%)。適合用於本發明的「鵝膏蕈毒素類似物」甚至可表現出比α-鵝膏蕈鹼、β-鵝膏蕈鹼、γ-鵝膏蕈鹼、鵝膏蕈鹼、鵝膏素、三羥鵝膏毒肽醯胺、鵝膏無毒環肽或一羥鵝膏毒肽羧酸中任何一種更強的針對哺乳動物RNA聚合酶II的抑制活性。可通過測定發生50%抑制的濃度(IC5tl值)來測量抑制活性。本申請上下文中的「連接體」，指增加兩個組分之間距離的分子，例如以便減少靶結合部分和鵝膏蕈毒素之間的空間幹擾，否則這種幹擾可能降低鵝膏蕈毒素與RNA聚合酶 II相互作用的能力。連接體可服務於另一個目的，因為其可促進鵝膏蕈毒素在由靶結合部分靶向的細胞中的特異性釋放。優選連接體和優選一側的連接體和鵝膏蕈毒素之間的鍵和另一側的連接體和抗體之間的鍵在細胞外的生理條件(例如血液)下穩定，同時其可在細胞內被切割，特別是在靶細胞內，例如癌症細胞或免疫細胞內。為了提供這種選擇性的穩定性，連接體可包含優選對PH敏感的官能性，以產生對ρΗ敏感的連接體，例如S. Fletcher, Μ. R. Jorgensens 和 A. D. Miller ；Org. Lett. 2004，6 (23)，第 4245-4248 頁中所述；或可包含對蛋白酶敏感的官能性，以產生對蛋白酶敏感的連接體，例如L. DA Ibsen, Blood 2003， 102,1458-65 Francisco JA, Cerreny CG, Meyer DL, Nat. Biotechnol 2003,21,778-84 中所述。或者，連接連接體與靶結合部分的鍵可提供選擇性的穩定性。優選連接體具有至少 1 個、優選 1-20 個原子的長度(例如 1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、 19或20個原子)，其中連接體一側與鵝膏蕈毒素反應，另一側與靶結合部分反應。在本發明上下文中，連接體優選為任選取代的C1J-烷基、CV2tl-雜烷基、c2_2(1-烯基、c2_2(1-雜烯基、 c2_20-炔基、c2_2(l-雜炔基、環烷基、雜環烷基、芳基、雜芳基、芳烷基或雜芳烷基。連接體可含有一種或多種結構元件，例如醯胺、酯、醚、硫醚、二硫化物、烴部分等。連接體亦可含有這些結構元件中兩種以上的的組合。這些結構元件中每一種可在連接體中出現多於一次，例如兩次、三次、四次、五次或六次。在某些實施方案中，連接體可包含二硫鍵。應該理解，連接體必須在單個步驟或在兩個以上後續步驟中與鵝膏蕈毒素和靶結合部分連接。為此，連接體應攜帶兩個基團，優選在近端和遠端，其可(i)與優選為鵝膏蕈毒素或靶結合肽上的活化基團的基團形成共價鍵；或(ii)其可被或被活化以與鵝膏蕈毒素上的基團形成共價鍵。 因此，若存在連接體，則優選化學基團在連接體的遠端和近端，其為諸如酯、醚、尿烷、肽鍵等這樣的偶聯反應的結果。任選存在「連接體」，即在本發明靶結合部分毒素綴合物的某些實施方案中毒素可直接與靶結合部分的殘基連接。優選連接體經由鍵直接與靶向部分優選在其末端連接。若靶結合部分包含游離氨基、羧基或巰基，例如呈可包含在多肽中的Asp、 Glu, Arg, Lys, Cys殘基形式，那麼優選連接體與這樣的基團偶聯。如本文所用，若第一種化合物(例如抗體)對於第二種化合物(例如抗原，例如靶蛋白質)具有以下解離常數KD，則認為其與所述第二種化合物「特異性結合」 100 μ M或更小、優選50 μ M或更小、優選30 μ M或更小、優選20 μ M或更小、優選10 μ M或更小、優選5 μ M 或更小、更優選ι μ M或更小、更優選900ηΜ或更小、更優選800ηΜ或更小、更優選700ηΜ或更小、更優選600ηΜ或更小、更優選500ηΜ或更小、更優選400ηΜ或更小、更優選300ηΜ或更小、更優選200ηΜ或更小、甚至更優選IOOnM或更小、甚至更優選90ηΜ或更小、甚至更優選 80ηΜ或更小、甚至更優選70ηΜ或更小、甚至更優選60ηΜ或更小、甚至更優選50ηΜ或更小、 甚至更優選40ηΜ或更小、甚至更優選30ηΜ或更小、甚至更優選20ηΜ或更小和甚至更優選IOnM或更小。本文所用「患者」意指可從用本文所述靶結合部分毒素綴合物治療獲益的任何哺乳動物或鳥。優選「患者」選自實驗室動物(例如小鼠或大鼠)、家畜(包括例如豚鼠、兔、 驢、綿羊、山羊、雞、駱駝、馬、貓或狗)或包括人的靈長類。特別優選「患者」為人。本文所用「治療」疾病或病症意指實現以下一種或多種目的(a)減輕病症的嚴重程度；(b)限制或預防待治療的病症的症狀特徵的發展；(c)抑制待治療的病症的症狀特徵惡化；(d)限制或預防先前患有病症的患者的病症的復發；和(e)限制或預防先前有病症症狀的患者的症狀復發。本文所用"給予"包括體內給予以及直接給予離體組織，例如靜脈移植物。「有效量」是治療劑足以實現預期目的的量。給定治療劑的有效量會隨多種因素變化，例如藥物的特性、給藥途徑、接受治療藥的動物的大小和物種及給藥目的。可由技術人員按照本領域已建立的方法從經驗上確定每一單獨病例的有效量。「藥學上可接受的，，意指由聯邦或州政府管理機構批准，或在美國藥典或其它通用公認藥典中列出用於動物，更尤其是用於人。本發明實施方案現在將進一步闡述本發明。在以下段落中，更詳細地解釋了本發明的不同方面。除非明確指出與此相反，否則所解釋的每一個方面可與任何其它一個或多個方面組合。特別地，指出為優選或有利的任何特徵可與任何其它指出為優選或有利的特徵組合。在第一方面，本發明涉及一種用於治療患者的胰腺癌、膽管癌或結直腸癌的抗體毒素綴合物，其中所述綴合物包含(i)特異性結合上皮細胞黏附分子(EpCAM)表位的抗體或其抗原結合片段；(ii)鵝膏蕈毒素；和(iii)任選的連接體。在第一方面的一個優選實施方案中，抗體或其抗原結合片段選自雙抗體、四抗體、 納米抗體、嵌合抗體、去免疫化抗體、人源化抗體或人抗體。在第一方面的一個優選實施方案中，抗原結合片段選自Fab、F(ab，)2、Fd、Fv、單鏈Fv和二硫鍵連接的Fv (dsFv)。在一個優選實施方案中，EpCAM表位為人EpCAM表位。在第一方面的一個優選實施方案中，抗體或其抗原結合片段包含(a)huHEA125 重鏈的CDR3結構域(SEQ ID NO 22)；和/或(b) huHEA125輕鏈的CDR3結構域(SEQ ID NO: 25)。在一個特別優選實施方案中，抗體或其抗原結合片段包含SEQ ID N0:22和SEQ ID NO 25所示的這兩種CDR3結構域。優選抗體或其抗原結合片段另外包含以下一種或多種(a) huHEA125 重鏈的 CDR2 結構域(SEQ ID NO 21) ； (b)huHEA125 重鏈的 CDRl 結構域(SEQ ID NO 20) ； (c)huHEA125 輕鏈的 CDR2 結構域(SEQ ID NO 24)；禾口 (d)huHEA125 輕鏈的 CDRl 結構域(SEQ ID N0:23)。在一個優選實施方案中，抗體或其抗原結合片段包含huHEA125重鏈的 CDR3 結構域(SEQ ID NO 22)、CDR2 結構域(SEQ ID NO 21)和 CDRl 結構域(SEQ ID NO 20)。在一個優選實施方案中，抗體或其抗原結合片段包含huHEA125輕鏈的CDR3結構域(SEQ ID NO :25)、CDR2 結構域(SEQ ID NO 24)和 CDRl 結構域(SEQ ID NO 23)。在一個特別優選實施方案中，抗體或其抗原結合片段包含重鏈和輕鏈的CDR3結構域、CDR2結構域和CDRl結構域，即抗體或其抗原結合片段包含SEQ ID NO :20、21、22、23、24和25所示的胺基酸序列。在第一方面的一個優選實施方案中，抗體或其抗原結合片段包含huHEA125重鏈可變域(=VH) (SEQ ID NO 3)禾口 / 或 huHEA125 輕鏈可變域(=VL) (SEQ ID NO :12)。在一個特別優選實施方案中，抗體或其抗原結合片段包含huHEA125的VH結構域(SEQ ID NO 3)和 VL 結構域(SEQ ID NO 12) 二者。在第一方面的一個優選實施方案中，抗體或其抗原結合片段包含huHEA125重鏈 (可溶形式，SEQ ID NO 2)和/或huHEA125輕鏈(SEQ ID N0:11)。在一個實施方案中， huHEA125重鏈和/或huHEA125輕鏈相互獨立地各包含可達20(例如1、2、3、4、5、6、7、8、 9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20)個胺基酸交換、缺失或插入，其中這些胺基酸交換、缺失或插入可位於重鏈恆定域和/或輕鏈恆定域和/或重鏈可變域的框架區和/或輕鏈可變域的框架區中。在一個特別優選實施方案中，抗體為包含huHEA125兩條重鏈(SEQ ID NO 2)和huHEA125兩條輕鏈(SEQ ID NO 11)的完全IgG抗體，其中一條重鏈經由二硫鍵與一條輕鏈連接，兩條重鏈通過一個或兩個(優選兩個)二硫鍵彼此連接。在第一方面的一個優選實施方案中，抗體或其抗原結合片段包含huHEA125重鏈 (膜結合形式，SEQ ID NO 1)和/或huHEA125輕鏈(SEQ ID NO: 11)。在一個實施方案中， huHEA125重鏈和/或huHEA125輕鏈相互獨立地各包含可達20(例如1、2、3、4、5、6、7、8、 9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20)個胺基酸交換、缺失或插入，其中這些胺基酸交換、缺失或插入可位於重鏈恆定域和/或輕鏈恆定域和/或重鏈可變域的框架區和/或輕鏈可變域的框架區中。在一個特別優選實施方案中，抗體為包含huHEA125的兩條重鏈(SEQ ID NO 1)和huHEA125的兩條輕鏈(SEQ ID NO 11)的完全IgG抗體，其中一條重鏈經由二硫鍵與一條輕鏈連接，兩條重鏈通過一個或兩個(優選兩個)二硫鍵彼此連接。在第一方面的一個優選實施方案中，鵝膏蕈毒素選自α-鵝膏蕈鹼、鵝膏蕈鹼、Y-鵝膏蕈鹼、ε_鵝膏蕈鹼、鵝膏素、三羥鵝膏毒肽醯胺、鵝膏無毒環肽和一羥鵝膏毒肽羧酸(均示於圖1)以及其鹽、化學衍生物、半合成類似物和合成類似物。特別優選鵝膏蕈毒素為α-鵝膏蕈鹼、鵝膏蕈鹼和三羥鵝膏毒肽醯胺以及其鹽、化學衍生物、半合成類似物和合成類似物。在第一方面的一個優選實施方案中，鵝膏蕈毒素通過鵝膏蕈毒素3號胺基酸的 Sc-原子(見圖1)與抗體或可能存在的連接體Ll連接。在可用於本發明的優選鵝膏蕈毒素中，所述3號胺基酸為異亮氨酸、Y-羥基異亮氨酸或Y，δ-二羥基異亮氨酸。在第一方面的優選實施方案中，鵝膏蕈毒素通過與鵝膏蕈毒素3號胺基酸的 δ C-原子結合的氧原子與抗體或可能存在的連接體Ll連接。進一步優選鵝膏蕈毒素通過酯鍵、醚鍵或尿烷鍵與抗體或可能存在的連接體Ll連接。在這些實施方案中，優選3號胺基酸為Y，S-二羥基異亮氨酸。在第一方面的優選實施方案中，抗體通過抗體中存在的氨基與鵝膏蕈毒素或可能存在的連接體Ll連接。在第一方面的一個優選實施方案中，連接體Ll為任選取代的烷基、雜烷基、烯基、 雜烯基、炔基、雜炔基、環烷基、雜環烷基、芳基、雜芳基、芳烷基或雜芳烷基。在第一方面的另外的優選實施方案中，連接體Ll包含二硫鍵。在第二方面，本發明涉及一種抗體毒素綴合物，其包含(i)特異性結合上皮細胞黏附分子(EpCAM)的抗體或其抗原結合片段，其中所述抗體或其抗原結合片段包含(a) huHEA125重鏈，其中所述重鏈選自(al)SEQ ID NO 1的重鏈膜結合形式，其中SEQ ID NO:3所示的重鏈可變域VH包含位於VH框架區中的0-10 (例如0、1、2、3、4、5、6、7、8、9或10) 個胺基酸交換、0-10(例如0、1、2、3、4、5、6、7、8、9或10)個胺基酸缺失和/或0_10 (例如0、
1、2、3、4、5、6、7、8、9或10)個胺基酸插入，SEQID NO :26所示的重鏈恆定域包含0_10 (例如 0、1、2、3、4、5、6、7、8、9 或 10)個胺基酸交換、0-10 (例如 0、1、2、3、4、5、6、7、8、9 或 10)個胺基酸缺失和/或0-10(例如0、1、2、3、4、5、6、7、8、9或10)個胺基酸插入；和(a2) SEQ ID NO :2的重鏈可溶形式，其中SEQ ID NO :3所示的重鏈可變域VH包含位於VH框架區中的 0-10(例如 0、1、2、3、4、5、6、7、8、9 或 10)個胺基酸交換、0-10 (例如 0、1、2、3、4、5、6、7、8、 9或10)個胺基酸缺失和/或0-10(例如0、1、2、3、4、5、6、7、8、9或10)個胺基酸插入，SEQ ID NO :27所示的重鏈恆定域包含0-10(例如0、1、2、3、4、5、6、7、8、9或10)個胺基酸交換、 0-10(例如 0、1、2、3、4、5、6、7、8、9 或 10)個胺基酸缺失和 / 或 0-10 (例如 0、1、2、3、4、5、6、 7、8、9或10)個胺基酸插入；和(b) SEQID NO :11的huHEA125輕鏈，其中SEQ ID NO: 12所示的輕鏈可變域VL包含位於VL框架區中的0-10(例如0、1、2、3、4、5、6、7、8、9或10)個胺基酸交換、0_10(例如0、1、2、3、4、5、6、7、8、9或10)個胺基酸缺失和/或0_10(例如0、1、
2、3、4、5、6、7、8、9或10)個胺基酸插入，SEQID NO :28所示的輕鏈恆定域CL包含0_10 (例如 0、1、2、3、4、5、6、7、8、9 或 10)個胺基酸交換、0-10 (例如 0、1、2、3、4、5、6、7、8、9 或 10)個胺基酸缺失和/或0-10(例如0、1、2、3、4、5、6、7、8、9或10)個胺基酸插入；(ii)鵝膏蕈毒素；和(iii)任選的連接體。在第二方面的一個優選實施方案中，抗體或其抗原結合片段包含(a)huHEA125 重鏈，其中所述重鏈選自(al)SEQ ID NO 1的重鏈膜結合形式，其中SEQ ID NO :3所示的重鏈可變域州包含位於￥!1框架區中的0-10(例如0、1、2、3、4、5、6、7、8、9或10)個胺基酸交換、0-10 (例如0、1、2、3、4、5、6、7、8、9或10)個胺基酸缺失和/或0-10 (例如0、1、2、3、 4、5、6、7、8、9或10)個胺基酸插入；和(a2) SEQ ID NO :2的重鏈可溶形式，其中SEQ ID NO: 3所示的重鏈可變域VH包含位於VH框架區中的0-10 (例如0、1、2、3、4、5、6、7、8、9或10) 個胺基酸交換、0-10 (例如0、1、2、3、4、5、6、7、8、9或10)個胺基酸缺失和/或0-10 (例如
0、1、2、3、4、5、6、7、8、9或 10)個胺基酸插入；和(b) SEQ ID NO :11 的 huHEA125 輕鏈，其中 SEQ ID NO :12所示的輕鏈可變域VL包含位於VL框架區中的0-10(例如0、1、2、3、4、5、6、 7、8、9或10)個胺基酸交換、0-10 (例如0、1、2、3、4、5、6、7、8、9或10)個胺基酸缺失和/或 0-10(例如 0、1、2、3、4、5、6、7、8、9 或 10)個胺基酸插入。在第二方面的一個優選實施方案中，抗體或其抗原結合片段包含(a)huHEA125 重鏈，其中所述重鏈選自(al)SEQ ID NO 1的重鏈膜結合形式，其中SEQ ID NO :3所示的重鏈可變域VH包含位於VH框架區中的0-10(例如0、1、2、3、4、5、6、7、8、9或10)個胺基酸交換、胺基酸缺失和/或胺基酸插入，SEQ ID NO 26所示的重鏈恆定域包含0_10 (例如0、
1、2、3、4、5、6、7、8、9或10)個胺基酸交換、胺基酸缺失和/或胺基酸插入；和(a2)SEQ ID NO :2的重鏈的可溶形式，其中SEQ ID NO :3所示的重鏈可變域VH包含位於VH框架區中的0-10 (例如0、1、2、3、4、5、6、7、8、9或10)個胺基酸交換、胺基酸缺失和/或胺基酸插入， SEQ ID N0:27所示的重鏈恆定域包含0-10(例如0、1、2、3、4、5、6、7、8、9或10)個胺基酸交換、胺基酸缺失和/或胺基酸插入；和(b)SEQ ID NO :11的huHEA125輕鏈，其中SEQ ID NO 12所示的輕鏈可變域VL包含位於VL框架區中的0-10 (例如0、1、2、3、4、5、6、7、8、9或 10)個胺基酸交換、胺基酸缺失和/或胺基酸插入，SEQ ID NO 28所示的輕鏈恆定域CL包含0-10 (例如0、1、2、3、4、5、6、7、8、9或10)個胺基酸交換、胺基酸缺失和/或胺基酸插入。在第二方面的一個優選實施方案中，抗體或其抗原結合片段包含(a)huHEA125 重鏈，其中所述重鏈選自(al)SEQ ID NO 1的重鏈膜結合形式，其中SEQ ID NO :3所示的重鏈可變域州包含位於￥!1框架區中的0-10(例如0、1、2、3、4、5、6、7、8、9或10)個胺基酸交換，SEQ ID而26所示的重鏈恆定域包含0-10(例如0、1、2、3、4、5、6、7、8、9或10)個胺基酸交換；和(a2)SEQ ID NO :2的重鏈的可溶形式，其中SEQ ID NO :3所示的重鏈可變域 VH包含位於VH框架區中的0-10(例如0、1、2、3、4、5、6、7、8、9或10)個胺基酸交換，SEQ ID NO 27所示的重鏈恆定域包含0-10 (例如0、1、2、3、4、5、6、7、8、9或10)個胺基酸交換；和 (b)SEQ ID NO :11的huHEA125輕鏈，其中SEQ ID NO 12所示的輕鏈可變域VL包含位於VL 框架區中的0-10(例如0、1、2、3、4、5、6、7、8、9或10)個胺基酸交換，SEQ ID N0:28所示的輕鏈恆定域CL包含0-10 (例如0、1、2、3、4、5、6、7、8、9或10)個胺基酸交換。在第二方面的一個優選實施方案中，抗體或其抗原結合片段包含(a)huHEA125 重鏈，其中所述重鏈選自(al)SEQ ID NO 1的重鏈膜結合形式；和(a2) SEQ ID NO 2的重鏈的可溶形式；和(b)SEQ ID NO 11的huHEA125輕鏈。在第二方面的一個優選實施方案中，抗體或其抗原結合片段選自嵌合抗體、去免疫化抗體、人源化抗體或人抗體。在第二方面的一個優選實施方案中，抗原結合片段選自 Fab、F(ab，)2 禾口 FcL在第二方面的一個優選實施方案中，抗體為huHEA125或其抗原結合片段。在第二方面的一個優選實施方案中，抗體或其抗原結合片段與人EpCAM特異性結
I=I O在第二方面的一個優選實施方案中，鵝膏蕈毒素選自α-鵝膏蕈鹼、鵝膏蕈鹼、Y-鵝膏蕈鹼、ε_鵝膏蕈鹼、鵝膏素、三羥鵝膏毒肽醯胺、鵝膏無毒環肽和一羥鵝膏毒肽羧酸(均示於圖1)，以及其鹽、化學衍生物、半合成類似物和合成類似物。特別優選鵝膏蕈毒素為α-鵝膏蕈鹼、鵝膏蕈鹼，和三羥鵝膏毒肽醯胺，以及其鹽、化學衍生物、半合成類似物和合成類似物。在第二方面的一個優選實施方案中，鵝膏蕈毒素通過鵝膏蕈毒素3號胺基酸的 S C-原子(見圖1)與抗體或可能存在的連接體L2連接。在可用於本發明的優選鵝膏蕈毒素中，所述3號胺基酸為異亮氨酸、Y-羥基異亮氨酸或Y，δ-二羥基異亮氨酸。在第二方面的優選實施方案中，鵝膏蕈毒素通過與鵝膏蕈毒素3號胺基酸的 δ C-原子結合的氧原子與抗體或可能存在的連接體L2連接。進一步優選鵝膏蕈毒素通過酯鍵、醚鍵或尿烷鍵與抗體或可能存在的連接體L2連接。在這些實施方案中，優選3號胺基酸為Y，S-二羥基異亮氨酸。在第二方面的優選實施方案中，抗體通過抗體中存在的氨基與鵝膏蕈毒素或可能存在的連接體L2連接。在第二方面的一個優選實施方案中，連接體L2為任選取代的烷基、雜烷基、烯基、 雜烯基、炔基、雜炔基、環烷基、雜環烷基、芳基、雜芳基、芳烷基或雜芳烷基。在第五方面的另外的優選實施方案中，連接體L2包含二硫鍵。在第三方面，本發明涉及用於醫藥的第二方面的綴合物。在第四方面，本發明涉及用於治療患者癌症的第二方面的綴合物，其中所述癌症選自胰腺癌、膽管癌、乳腺癌和結直腸癌。在第五方面，本發明涉及用於製備用於治療患者癌症的藥物組合物的第二方面的綴合物，其中所述癌症選自胰腺癌、膽管癌、乳腺癌和結直腸癌。在第五方面，本發明涉及一種靶結合部分毒素綴合物，其包含(i)靶結合部分； (ii)鵝膏蕈毒素；和(iii)任選的連接體L3 ；其中鵝膏蕈毒素通過鵝膏蕈毒素3號胺基酸、 優選通過鵝膏蕈毒素3號胺基酸的δ C-原子(見圖1)與靶結合部分或可能存在的連接體 L3連接。在可用於本發明的優選鵝膏蕈毒素中，所述3號胺基酸為異亮氨酸、γ-羥基異亮氨酸或Y，S-二羥基異亮氨酸。在第五方面的一個優選實施方案中，鵝膏蕈毒素通過與鵝膏蕈毒素3號胺基酸的S C-原子結合的氧原子與靶結合部分或可能存在的連接體L3連接。進一步優選鵝膏蕈毒素通過以下方式與靶結合部分或可能存在的連接體L3連接酯鍵，優選呈鵝膏蕈毒素-O-C (0) -L3-靶結合部分或鵝膏蕈毒素-O-C (0)-靶結合部分形式，更優選呈鵝膏蕈毒素-δ C-O-C (0)-L3-靶結合部分或鵝膏蕈毒素-δ C-O-C(O)-靶結合部分形式，最優選呈鵝膏蕈毒素-δ CH2-O-C(O) -L3-靶結合部分或鵝膏蕈毒素-δ CH2-O-C(O)-靶結合部分形式；醚鍵，優選呈鵝膏蕈毒素-0-L3或鵝膏蕈毒素-0-靶結合部分形式，優選呈鵝膏蕈毒素-δ C-0-L3-靶結合部分或鵝膏蕈毒素-δ C-O-靶結合部分形式，更優選呈鵝膏蕈毒素-δ CH2-0-L3-靶結合部分或鵝膏蕈毒素-δ CH2-O-靶結合部分形式；或尿烷鍵，優選呈鵝膏蕈毒素-0-C(0)-NH-L3-靶結合部分或鵝膏蕈毒素-O-C(O)-NH-靶結合部分形式， 優選呈鵝膏蕈毒素_ δ C-O-C(0)-NH-L3-靶結合部分或鵝膏蕈毒素-δ C-O-C(O)-NH-靶結合部分形式，即鵝膏蕈毒素_ S CH2-O-C(0)-NH-L3-靶結合部分或鵝膏蕈毒素-δ CH2-O-C (O)-NH-靶結合部分形式。在這些實施方案中，優選3號胺基酸為Y，δ-二羥基異亮氨酸。在第五方面的優選實施方案中，存在連接體L3，且綴合物具有以下結構之一⑴鵝膏蕈毒素-SC-0-C(0)-L3-C(0)-NH-靶結合部分；(ii)鵝膏蕈毒素-SC-0-L3-C(0)-NH-靶結合部分；或(iii)鵝膏蕈毒素-SC-0-C(0)-NH-L3-C(0)-NH-靶結合部分，優選⑴鵝膏蕈毒素-δ CH2-O-C(0) -L3-C(0) -NH-靶結合部分；(ii)鵝膏蕈毒素-δ CH2-0-L3_C(0) -NH-靶結合部分；或(iii)鵝膏蕈毒素_ δ CH2-O-C(0)-NH-L3-C(O)-NH-靶結合部分。在第五方面的一個優選實施方案中，靶結合部分通過靶結合部分中存在的氨基與鵝膏蕈毒素或可能存在的連接體L3連接。在第五方面的一個優選實施方案中，鵝膏蕈毒素選自α-鵝膏蕈鹼、鵝膏蕈鹼、Y-鵝膏蕈鹼、ε_鵝膏蕈鹼、鵝膏素、三羥鵝膏毒肽醯胺、鵝膏無毒環肽或一羥鵝膏毒肽羧酸(均示於圖1)，以及其鹽、化學衍生物、半合成類似物和合成類似物。特別優選鵝膏蕈毒素為α-鵝膏蕈鹼、鵝膏蕈鹼，和三羥鵝膏毒肽醯胺，以及其鹽、化學衍生物、半合成類似物和合成類似物。在第五方面的一個優選實施方案中，連接體L3為任選取代的烷基、雜烷基、烯基、 雜烯基、炔基、雜炔基、環烷基、雜環烷基、芳基、雜芳基、芳烷基或雜芳烷基。在第五方面的另外的優選實施方案中，連接體L3包含二硫鍵。在第五方面的一個優選實施方案中，靶結合部分與存在於腫瘤細胞上的表位特異性結合。特別優選靶結合部分與上皮細胞黏附分子(EpCAM)的表位特異性結合。在第五方面的一個優選實施方案中，靶結合部分選自(i)抗體或其抗原結合片段；(ii)抗體樣蛋白；和(iii)核酸適配體。在一個優選實施方案中，抗體或其抗原結合片段選自雙抗體、四抗體、納米抗體、嵌合抗體、去免疫化抗體、人源化抗體或人抗體。在一個優選實施方案中，抗原結合片段選自Fab、F(ab' )2、Fd、Fv、單鏈Fv和二硫鍵連接的 Fv(dsFv)。在一個優選實施方案中，抗體或其抗原結合片段包含(a)huHEA125重鏈的膜結合形式(SEQ ID NO 1)或 huHEA125 重鏈的可溶形式(SEQ ID NO 2)；和 / 或(b)huHEA125 輕鏈(SEQ ID NO :11)。在第六方面，本發明涉及用於醫藥的第五方面的靶結合部分毒素綴合物。在第七方面，本發明涉及用於治療患者的癌症的第五方面的靶結合部分毒素綴合物，其中所述癌症選自胰腺癌、膽管癌、乳腺癌、結直腸癌、肺癌、前列腺癌、卵巢癌、胃癌、腎癌、惡性黑色素瘤、白血病和惡性淋巴瘤。在第八方面，本發明涉及一種藥物組合物，其包含第一方面或第二方面的抗體毒素綴合物或者第五方面的靶結合部分毒素綴合物，並還包含一種或多種藥學上可接受的稀釋劑、載體、賦形劑、填充劑、粘合劑、潤滑劑、助流劑、崩解劑、吸附劑；和/或防腐劑。第五到第七實施方案的靶結合部分在優選實施方案中是蛋白質，尤其是抗體。蛋白質尤其是抗體包含允許偶聯鵝膏蕈毒素的若干胺基酸。優選胺基酸具有游離氨基、羥基或羰基，包括LyS、Gln、Glu、Asp、Asn、Thr和Ser。因此，一個蛋白質分子可偶聯多於一個的鵝膏蕈毒素分子。每分子的鵝膏蕈毒素數目增加亦將增加毒性。因此，在一個優選實施方案中，第一到第四實施方案的抗體和第五到第七實施方案的靶結合部分與鵝膏蕈毒素的比率為1個蛋白質分子比1-15個鵝膏蕈毒素分子(優選1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、 14或15個)。為計算比率的目的，在IgG等二聚體(dimmer)情況下認為該二聚體為一個分子。若靶結合部分不是蛋白質，優選相似的比率。特別優選第八方面的藥物組合物可以全身性給予的藥物形式使用。這些包括胃腸外藥物，尤其包含注射劑和輸注劑。注射劑配製為安瓿或所謂即用型注射劑形式，例如即用型注射器或一次性注射器和除此之外的多次抽取的可穿刺瓶。可以以皮下(S. C)、肌內 (i.m.)、靜脈內(i.v.)或皮內(i.e.)施用形式給予注射劑。特別是可生產作為晶體混懸液、溶液、納米顆粒或膠體分散體系(例如水溶膠)的各自合適的注射製劑。可進一步產生作為濃縮物的注射製劑，其可用水性等滲稀釋劑溶解或分散。亦可製備等滲溶液、脂肪乳劑、脂質體製劑及微乳劑形式的輸注劑。與注射劑相似，亦可製備呈用於稀釋的濃縮物形式的輸注製劑。在住院病人和非臥床病人治療二者中，注射製劑亦可以固定輸注形式施用，例如通過微型泵。將以下物質加到胃腸外藥物製劑中是可能的例如清蛋白、血漿、膨脹劑、表面活性物質、有機稀釋劑、影響PH的物質、絡合物質或聚合物質，尤其是作為影響本發明靶結合部分毒素綴合物吸附到蛋白質或聚合物的物質，或亦可加入它們旨在降低本發明靶結合部分毒素綴合物吸附到注射器械或包裝材料等材料(例如塑料或玻璃)上。可將本發明靶結合部分毒素綴合物與胃腸外製品中的微載體或納米顆粒結合，例如與基於聚(甲基)丙烯酸酯、聚乳酸、聚乙醇酸(polyglycolate)、聚胺基酸或聚醚氨酯的細緻分散的顆粒結合。亦可將胃腸外製劑改變為長效製劑，例如，若將本發明靶結合部分毒素綴合物分別以細緻分散的、分散的及混懸形式或作為藥物中的晶體混懸劑引入，則基於「多單位原理」；或若將本發明靶結合部分毒素綴合物包封入製劑中，例如片劑或隨後植入的棒中，則基於「單個單位原理」。這些在單個單位或多單位製劑中的植入物或長效藥物通常由所謂的生物可降解聚合物組成，所述聚合物例如乳酸和乙醇酸的聚酯、聚醚氨酯、聚胺基酸、聚(甲基)丙烯酸酯或聚糖。在製備配製為胃腸外製劑的本發明藥物組合物期間加入的輔料和載體，優選分別為消毒水(無菌水)；影響PH值的物質，例如有機或無機酸或鹼以及其鹽、用於調節pH值的緩衝物質；用於等滲的物質，例如氯化鈉、碳酸氫鈉、葡萄糖和果糖；表面活性劑(tenside 和surfactant)；以及乳化劑，例如聚氧乙烯失水山梨糖醇的脂肪酸偏酯(例如Tween )或例如聚氧乙烯的脂肪酸酯(例如Cremophor )，脂肪油例如花生油、大豆油或蓖麻油，脂肪酸的合成酯例如油酸乙酯、肉豆蔻酸異丙酯和中性油(例如Miglyol )；以及聚合物輔料等，例如明膠、右旋糖苷、聚乙烯吡咯烷酮；提高有機溶劑溶解度的添加劑，例如丙二醇、乙醇、N，N-二甲基乙醯胺、丙二醇；或形成絡合物的物質，例如檸檬酸鹽和脲；防腐劑，例如苯甲酸羥基丙酯和苯甲酸甲酯、苯甲醇；抗氧化劑，例如亞硫酸鈉；和穩定劑，例如EDTA。在一個優選實施方案中，當將本發明藥物組合物配製為混懸劑時，加入增稠劑以防止本發明靶結合部分毒素綴合物沉降，或加入表面活性劑及聚合物電解質以確保沉澱物的可重懸性和/或加入絡合物形成劑例如EDTA。亦可獲得活性成分與不同聚合物的複合物。這樣的聚合物的實例為聚乙二醇、聚苯乙烯、羧甲基纖維素、Pluronics 或聚乙二醇山梨醇脂肪酸酯。本發明靶結合部分毒素綴合物亦可以例如與環糊精的包合物的形式加入到液體製劑中。在特定的實施方案中，可加入分散劑作為另外的輔料。對於冷凍乾燥物的製備，可使用支架劑(scaffolding agent)，例如甘露醇、右旋糖苷、蔗糖、人清蛋白、乳糖、PVP 或多種明膠。在另一方面，本發明涉及一種治療有需要的患者的胰腺癌、膽管癌或結直腸癌的方法，所述方法包括給予患者有效量的第一方面的抗體毒素綴合物。在另一方面，本發明涉及一種治療有需要的患者的胰腺癌、膽管癌、乳腺癌或結直腸癌的方法，所述方法包括給予患者有效量的第三方面的抗體毒素綴合物。在另一方面，本發明涉及一種治療有需要的患者的胰腺癌、膽管癌、乳腺癌或結直腸癌的方法，所述方法包括給予患者有效量的第五方面的靶結合部分毒素綴合物。
實施例下面通過非限制性實施例來更詳細地說明本發明實施例1 比較抗體huHEA125和抗體毒素綴合物鵝膏蕈鹼_huHEA125之間的與靶細胞的結合親和力1. 1 嵌合抗體 huHEA125幾年前，發明人已建立了分泌抗EpCAM小鼠單克隆抗體HEA125的雜交瘤細胞系 (Moldenhauer等，1987 ；Momburg等，1987)。利用分子生物學技術重新構建該雜交瘤細胞系，以產生由小鼠可變域鉤住人κ恆定輕鏈和人IgGl恆定重鏈組成的抗體嵌合版本。得到的抗體huHEA125以高親和力(Kd = 2. 2xlO"9M)和高特異性與EpCAM-表達細胞結合。 huHEA125免疫球蛋白的基因序列和胺基酸序列如下所示
huHEA125 重鏈肽序列重鏈，膜結合形式(IGHV/IGHD/IGHJ/IGHG1；在 IGHGl 下劃線)(SEQ ID NO 1)EVKLLESGGGLVQPGGSLKLSCAASGFDFSRFWMTWVRQAPGKGLEWIGEINLDSSTINYTPSLKDKFI ISRDNAKNTLFLQMSKVRSEDTALYYCSRGISMDYffGQGTSVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKD YFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHT CPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNffYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRV YSYLTYLHQDffLNGKEYKCKYSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAV EffESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRffQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGLQLDETCAEA QDGELDGLWTTITIFISLFLLSVCYSAAVTLFKVKWIFSSWELKQTLVPE^(匪 IGQAP肽序列重鏈，分泌形式(SEQ ID NO :2)EVKLLESGGGLVQPGGSLKLSCAASGFDFSRFWMTWVRQAPGKGLEWIGEINLDSSTINYTPSLKDKFI ISRDNAKNTLFLQMSKVRSEDTALYYCSRGISMDYWGQGTSVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKD YFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHT CPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRV VSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAV EWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK肽序列(IGHV/IGHD/IGHJ= VH 結構域；框架區 FR1、FR2、FR3 和 FR4 下劃線)(SEQ ID NO 3)EVKLLESGGGLVQPGGSLKLSCAASGFDFSRFffMTffVRQAPGKGLEfflGEINLDSSTINYTPSLKDKFI ISRDNAKNTLFLQMSKVRSEDTALYYCSRGISMDYffGQGTSVTVSS核酸序列(按照IMGT-命名法註解，IGHV/IGHD/IGHJ ； IGHD下劃線；IGHJ雙下劃線)FRl (SEQ ID NO 4)GAAGTGAAGCTTCTCGAGTCTGGAGGTGGCCTGGTGCAGCCTGGAGGATCCCTGAAACTCTCCTGTGCA GCCTCACDRKSEQ ID NO 5)GGATTCGATTTTAGTAGATTCTGGFR2(SEQ ID NO 6)ATGACTTGGGTCCGGCAGGCTCCAGGGAAAGGGCTAGAATGGATTGGAGAACDR2(SEQ ID NO 7)ATTAATCTAGATAGCAGTACGATAFR3(SEQ ID NO 8) AACTATACGCCATCTCTAAAGGATAAATTCATCATCTCCAGGGACAACGCCAAAAATACGCTGTTCCTG CAAATGAGCAAAGTGAGATCTGAGGACACAGCCCTTTATTACTGTCDR3(SEQ ID NO 9)TCAAGA GGTATTTCTATGGACTACFR4(SEQ ID NO 10)TGGGGTCAGGGAACCTCAGTCACCGTCTCCTCAhuHEA125 輕鏈肽序列輕鏈(IGKV/IGKJ/IGKC；在 IGKC 下劃線)(SEQ ID NO 11)DILLTQSPAILSVSPGERVSFSCRASQSIGISLHWYQQRPSDSPRLLIKYASESISGIPSRFSGSGSGT DFTLSINSVESEDIADYYCQQSNIffPTTFGAGTKLELKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKV QffKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC肽序歹Ij(IGKV/IGKJ = VL 結構域；框架區 FRl、FR2、FR3 和 FR4 下劃線)(SEQ ID NO 12)DILLTQSPAILSVSPGERVSFSCRASQSIGISLHWYQQRPSDSPRLLIKYASESISGIPSRFSGSGSGT DFTLSINSVESEDIADYYCQQSNIffPTTFGAGTKLELK核酸序列(按照IMGT-命名法註解，IGKV/IGKJ ；IGKV下劃線；IGKJ雙下劃線)FRl (SEQ ID NO 13)GACATCTTGCTGACTCAGTCTCCAGCCATCCTGTCTGTGAGTCCAGGAGAAAGAGTCAGTTTCTCCTGC AGGGCCAGTCDRl (SEQ ID NO 14)CAGAGCATTGGCATAAGTFR2(SEQ ID NO 15)TTACACTGGTATCAGCAAAGACCAAGTGATTCTCCAAGGCTTCTCATAAAGCDR2(SEQ ID NO 16)TATGCTTCTFR3(SEQ ID NO 17)GAGTCAATCTCTGGGATCCCTTCCAGGTTTAGTGGCAGTGGATCAGGGACAGATTTTACTCTTAGCATC AACAGTGTGGAGTCTGAAGATATTGCAGATTATTACTGTCDR3(SEQ ID NO 18 CAACAAAGTAATATCTGGCCAAC CACGFR4(SEQ ID NO 19)
TTCGGTGCTGGGACCAAGCTGGAGCTGAA A1. 2 對照抗體 Xolair 對照抗體Xolair (Omalizumab，針對人IgE免疫球蛋白的人IgGl抗體)由 Novartis, Germany 生產。1.3α-鵝膏蕈鹼抗體綴合物的合成1.3. Ia-鵝膏蕈鹼-戊二酸的合成將在真空中經P4O10乾燥的3. Omg(3. 3 μ mol) a -鵝膏蕈鹼溶解於0. 25ml無水吡啶中，並與0. Iml吡啶中的0.9π^(79μπιΟ1)戊二酐在室溫黑暗處反應M小時。通過加入 7ml無水二乙醚使肽沉澱，離心，用二乙醚再次洗滌固體並離心。通過該反應獲得α -鵝膏蕈鹼衍生物，其中札=-OH(在圖1中)被R1 =-O-C (0) - (CH2) 3-C00H 取代。1.3.2α-鵝膏蕈鹼-戊二酸N-羥基琥珀醯亞胺酯的合成
將3. ^ig的α-鵝膏蕈鹼戊二酸(3. 3μπι01)溶解於0. 05ml無水二甲基甲醯胺 (DMF)中，並加入溶於0.01ml DMF中的2. 4mg(7當量)的N-羥基琥珀醯亞胺。在加入0. Olml DMF中的1. 2mg 二環己基碳二亞胺後，使反應繼續在室溫進行16小時。將所形成的晶體與溶液分離，通過加入細1無水二乙醚使肽沉澱。離心後再用細1醚洗滌沉澱並離心。將固體溶於0. Iml 二甲基甲醯胺中，並立即用於與抗體溶液反應。1.3.3α-鵝膏蕈鹼-戊二酸_huHEA125的合成將3. Omg α -鵝膏蕈鹼-戊二酸N-羥基琥珀醯亞胺酯的0. Iml溶液加入到 5ml PBS中的IOmg hu_HEA125抗體中，並在緩慢旋轉下於5°C在黑暗中反應。16小時後， 將溶液施用到用PBS平衡的S印hadeXG25柱(120x 1. 5cm)上，並收集蛋白質流分。用 13. 500cm-1 · Μ—1的鵝膏蕈毒素摩爾消光係數從蛋白質溶液相對於含有同樣濃度的天然抗體的空白在310nm處的吸收差異，來分光光度測定鵝膏蕈鹼的載量。該製品的α _鵝膏蕈鹼IgG比率為大約8。1.4結合競爭分析在競爭實驗中通過流式細胞術分析了鵝膏蕈鹼_huHEA125綴合物對未綴合的 huHEA125抗體的結合。如以上1. 3. 1-1. 3. 3節所述合成α -鵝膏蕈鹼-huHEA125綴合物。在FACS緩衝液(含熱滅活胎牛血清和0. 疊氮化鈉的Dulbecco氏PBS)中洗滌Colo205靶細胞(結腸癌轉移)2次，計數並調整為每毫升hlO7個細胞。將50 μ 1細胞懸液加到96孔U形底微量滴定板的各孔中，用移液管加入50 μ 1/孔FITC-標記的huHEA125 抗體。將400 μ g/ml-10ng/ml終稀釋度的鵝膏蕈鹼_huHEA125或huHEA125的系列稀釋物一式三份以50 μ 1/孔的體積加入，並在冰上孵育1小時。隨後將板離心OOOOrpm下2分鐘)， 從細胞除掉上清液。用150 μ 1 FACS緩衝液重懸細胞，並再次離心。通過離心進行兩次洗滌步驟後，將細胞吸收到100 μ 1/孔的碘化丙啶溶液(在FACS緩衝液中1 μ g/ml)中，以使能夠區分死細胞。在 FAC^can 細胞計數器(Becton and Dickinson,Heidelberg,Germany) 上利用CellQuest軟體進行分析。如圖2所示，用漸增量的huHEA125_鵝膏蕈鹼綴合物或未修飾的huHEA125抗體競爭結合靶細胞顯示，貫穿競爭抗體或抗體綴合物的10ng/ml-400y g/ml濃度範圍的結合強度類似。因此，綴合步驟不顯著改變huHEA125-鵝膏蕈鹼與靶細胞的親和力。實施例2 通過間接免疫螢光檢測EpCAM抗原在不同癌細胞系上的表面表達將細胞系Capan-I、Colo205、0Z、MCF-7、BxPC-3 和 PC-3 首先與 huHEA125 或 Xolair 孵育。在洗滌後，通過FITC-標記的F(ab，)2山羊抗人IgG(H+L)作為第二步的試劑將第一抗體的結合可視化。結果示於圖3A (Capan-I)、圖;3B(ColO205)、圖3C (OZ)、圖 3D(MCF-7)、圖3E(BxPC-3)和圖3F(PC_3)中。各圖左邊灰色陰影柱狀圖顯示用對照抗體 Xolair 獲得的結果；各圖右邊具有白色區域的柱狀圖顯示用抗體huHEA125獲得的結果。實施例3 通過鵝膏蕈鹼和鵝膏蕈鹼/抗體綴合物誘導癌細胞增殖抑制3.1癌細胞系將以下癌細胞系用於生長抑制研究Capan-I、BxPC-3 人胰腺癌
MCF-7人乳腺癌
Colo205人結腸癌轉移
OZ人膽管癌
PC-3人前列腺癌3. 2增殖抑制測定通過摻入[3H]-胸苷測定鵝膏蕈鹼-IgG綴合物對細胞生長的抑制。在96孔平底組織培養微量滴定板的孔中以100 μ 1體積一式三份製備，2Χ10-5Μ-6χ10-13範圍內的鵝膏蕈鹼-huHEA125、鵝膏蕈鹼-Xolair和游離鵝膏蕈鹼在完全培養基(補充10%熱滅活FCS、2mM L-穀氨醯胺和ImM丙酮酸鈉的RPMI 1640)中的系列稀釋物。加入每孔50 μ 1體積的密度為hl04/ml的細胞。在潮溼氣氛下於37°C和5% CO2條件下孵育板72或96小時。在測定結束前的20小時加入1 μ Ci [3H]-胸苷。隨後用Tomtec細胞收穫器處理板，通過液體閃爍 if^ (ffallac BetaplatePerkinElmer Life and Analytical Sciences) 測定摻入的放射性，並以cpm表示。在胰腺癌細胞系Capan-I情況下，huHEA125_鵝膏蕈鹼免疫毒素以ΙχΚΓ^ΙχΙΟ,Μ 的鵝膏蕈鹼濃度誘導生長停滯，其如圖4中所示。在結腸癌症細胞系Colo205情況下，huHEA125_鵝膏蕈鹼免疫毒素以 1χ10-12-4χ10-ηΜ的鵝膏蕈鹼濃度誘導生長停滯，其如圖5中所示。在乳腺癌細胞系MCF-7情況下，huHEA125-鵝膏蕈鹼免疫毒素以lxl(T12-lX10-"M 的鵝膏蕈鹼濃度誘導生長停滯，其如圖6中所示。在膽管癌細胞系OZ情況下，huHEA125_鵝膏蕈鹼免疫毒素以ΙχΚΓ^ΙχΙΟ,Μ的鵝膏蕈鹼濃度誘導生長停滯，其如圖7中所示。在胰腺細胞系BxPC-3情況下，huHEA125_鵝膏蕈鹼免疫毒素以ΜΙΟ-^ΙχΙΟ,Μ的鵝膏蕈鹼濃度誘導生長停滯，其如圖8中所示。實施例4 利用兩種異種移植物小鼠腫瘤模型通過鵝膏蕈鹼/抗體綴合物體內抑制腫瘤生長將5-6周齡的免疫缺陷NOD/SCID小鼠用於所有實驗。將BxPC_3胰腺腫瘤細胞或PC-3前列腺腫瘤細胞(5xl06個在ΙΟΟμΙ PBS中)皮下移植到小鼠的右脅。10天後，當 BxPC-3腫瘤達到30-80mm3體積且PC-3腫瘤達到40-190mm3體積時，開始治療。動物接受 15mg/kg劑量的對照huHEA125mAb或50 μ g/kg鵝膏蕈鹼劑量的huHEA125_鵝膏蕈鹼綴合物 (huHEA125-Ama)。單次腹膜內注射給予抗體和綴合物。在開始治療後監測16天的腫瘤生長。每隔3天用測徑器從外部測量腫瘤大小。按照公式計算腫瘤體積V = π /6柏補*(3，其中a、b和c為三個維度上的直徑。數據表示為從給予抗體時間起的相對腫瘤大小/體積增加。荷有BxPC-3腫瘤的小鼠(n = 6)良好耐受50 μ g/kg鵝膏蕈鹼劑量的 huHEA125-Ama給予。小鼠體重未降低，肝酶(實驗的最後一天在血清中測量LDH、ALT、AST 和AP)亦未升高。腫瘤生長受到該劑量綴合物的強烈抑制。所有小鼠對治療有響應，從給予綴合物後的第7天開始腫瘤體積顯著縮小。在第16天隨訪結束時，50%小鼠中腫瘤完全消除。與此相比，在接受未綴合的huHEA125mAb的對照小鼠中，腫瘤體積增加約880% (圖 9)。在荷有PC-3腫瘤的小鼠情況中，良好耐受50 μ g/kg鵝膏蕈鹼劑量的 huHEA125-Ama。未觀察到小鼠體重降低。該劑量的綴合物強烈阻滯腫瘤生長。在給予huHEA125-Ama 10天後，腫瘤體積與開始治療時相似。與此相比，在接受未綴合的 huHEA125mAb的對照小鼠中，腫瘤體積增加約550%。由於對照組的大腫瘤體積，實驗在治療後第10天終止(圖10)。參考文獻Al-HajM. , Wicha M. S. , Benito-Hernandez A. , Morrison S. J. , Clarke Μ. F. Prospective identification of tumorigenic breast cancer cells (予頁期鑑定致瘤乳腺癌細胞).Proc. Natl. Acad. Sci. USA 100 (7)，3983-3988 (2003)Allard W. J.，Matera J.，Miller Μ. C.，Repollet Μ.，Connelly Μ. C.，Rao C.， Tibbe A. G., Uhr J. W. , Terstappen L. W. Tumor cells circulate in the peripheral blood of all major carcinomas but not in healthy subjects or patients with nonmalignant diseases (腫瘤細胞在所有主要癌的外周血液中循環，但在健康對象或無惡性病的患者中沒有).Clin. Cancer Res. 10 (20), 6897-6904 (2004)Baeuerle P. Α.禾口 Gires 0. EpCAM (CD326) finding its role in cancer (發現 EpCAM (CD326)在癌症中的作用).Br. J. Cancer 96 (3)，417-423 (2007)Balzar Μ. , Winter Μ. J. , de Boer C. J. , Litvinov S. V. The biology of the 17-1A antigen (Ep-CAM)(17-1A 抗原(Ep-CAM)的生物學).J. Mol. Med. 77(10)， 699-712(1999)Binz H. K. , Amstutz P. , Pliickthun A. Engineering novel binding proteins from nonimmunoglobulin domains (從非免疫球蛋白結構域工程改造新型結合蛋白).Nat Biotechnol. 23(10) :1257-1268(2005)Brody Ε. N.禾口 Gold L. ,Aptamers as therapeutic and diagnostic agents (作為治療劑和診斷劑的適配體)· J. Biotechnol. 74 (1) :5-13 (2000)Dalerba P.，Dylla S. J.，Park I. K.，Liu R.，Wang X.，Cho R. W.，Hoey Τ.， Gurney Α. , Huang Ε. H. ,Simeone D. Μ. ,Shelton Α. Α. ,Parmiani G. ,Castelli C. ,Clarke Μ. F. Phenotypic characterization of human colorectal cancer stem cells (人結直腸癌幹細胞的表型鑑定)· Proc. Natl. Acad. Sci. USA 104 (24)，10158-10163 (2007)Gastl G. , Spizzo G. , Obrist P. , Diinser Μ. , Mikuz G. Ep-CAM overexpression in breast cancer as a predictor of survival (Ep-CAM ^ ^ ^ ] 測)·Lancet 356 (9246)，1981-1982 (2000)Holliger P. , Prospero Τ. , Winter G. Diabodies 「 small bivalent and bispecific antibody fragments ( 「雙抗體」小的二價及雙特異性的抗體片段). Natl. Acad. Sci. U. S. Α. 90 (14)，6444-6448 (1993)Leuenberger, H. G. W, Nage 1, B.禾口 Kolbl, H.主編.『『A multilingualglossary of biotechnological terms (IUPAC Recommendations)" , Helvetica Chimica Acta, CH-4010 Basel, Switzerland)，1995
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SEQIDNO1 嵌合抗體huHEA125，1■鏈，且_結合形式
SEQIDNO2 嵌合抗體huHEA125，1I鏈，分泌形式
SEQIDNO3 嵌合抗體huHEA125，1I鏈，VH結構域
SEQIDNO4 嵌合抗體huHEA125，1I鏈，FRl區段
SEQIDNO5 嵌合抗體huHEA125，1I鏈，⑶Rl區段
SEQIDNO6 嵌合抗體huHEA125，1I鏈，FR2區段
SEQIDNO7 嵌合抗體huHEA125，1I鏈，⑶R2區段
SEQIDNO8 嵌合抗體huHEA125，1I鏈，FR3區段
SEQIDNO9 嵌合抗體huHEA125，1I鏈，⑶R3區段
SEQIDNO10嵌合抗體huHEA125，重鏈，FR4區段
SEQIDNO11嵌合抗體huHEA125，輕鏈
SEQIDNO12嵌合抗體huHEA125，輕鏈，VL結構域
SEQIDNO13嵌合抗體huHEA125，輕鏈，FRl區段
SEQIDNO14嵌合抗體huHEA125，輕鏈，⑶Rl區段
SEQIDNO15嵌合抗體huHEA125，輕鏈，FR2區段
SEQIDNO16嵌合抗體huHEA125，輕鏈，CDR2區段
SEQIDNO17嵌合抗體huHEA125，輕鏈，FR3區段
SEQIDNO18嵌合抗體huHEA125，輕鏈，CDR3區段
SEQIDNO19嵌合抗體huHEA125，輕鏈，FR4區段
SEQIDNO20嵌合抗體huHEA125，重鏈，CDRl結構域
SEQIDNO21嵌合抗體huHEA125，重鏈，CDR2結構域
SEQIDNO22嵌合抗體huHEA125，重鏈，CDR3結構域
SEQIDNO23嵌合抗體huHEA125，輕鏈，CDRl結構域
SEQIDNO24嵌合抗體huHEA125，輕鏈，CDR2結構域
SEQIDNO25嵌合抗體huHEA125，輕鏈，CDR3結構域
SEQIDNO26嵌合抗體huHEA125，重鏈，恆定域，膜結合形式
SEQIDNO27嵌合抗體huHEA125，重鏈，恆定域，分泌形式
SEQIDNO28嵌合抗體huHEA125，輕鏈，恆定域
權利要求
1.一種用於治療患者的胰腺癌、膽管癌或結直腸癌的抗體毒素綴合物，其中所述綴合物包含(i)特異性結合上皮細胞黏附分子(EpCAM)表位的抗體或其抗原結合片段；( )鵝膏蕈毒素；和(iii)任選的連接體Li。
2.權利要求1的綴合物，其中所述抗體或其抗原結合片段選自雙抗體、四抗體、納米抗體、嵌合抗體、去免疫化抗體、人源化抗體或人抗體。
3.權利要求1或2的綴合物，其中所述抗原結合片段選自Fab、F(ab')2、Fd、Fv、單鏈 Fv和二硫鍵連接的Fv (dsFv)。
4.權利要求1-3中任一項的綴合物，其中所述EpCAM表位為人EpCAM表位。
5.權利要求1-4中任一項的綴合物，其中所述抗體或其抗原結合片段包含(a)huHEA125重鏈的 CDR3 結構域(SEQ ID NO 22)；禾口 / 或(b)huHEA125輕鏈的 CDR3 結構域(SEQ ID NO 25)。
6.權利要求5的綴合物，其中所述抗體或其抗原結合片段另外包含以下一種或多種(a)huHEA125重鏈的 CDR2 結構域(SEQ ID NO 21)；(b)huHEA125重鏈的 CDRl 結構域(SEQ ID NO 20)；(c)huHEA125輕鏈的 CDR2 結構域(SEQ ID NO 24)；禾口(d)huHEA125輕鏈的 CDRl 結構域(SEQ ID NO 23)。
7.權利要求1-6中任一項的綴合物，其中所述抗體或其抗原結合片段包含huHEA125的 VH 結構域(SEQ ID NO 3)和 / 或 huHEA125 的 VL 結構域(SEQ ID NO 12)。
8.權利要求1-7中任一項的綴合物，其中所述抗體或其抗原結合片段包含(a)huHEA125重鏈的膜結合形式(SEQID NO 1)或huHEA125重鏈的可溶形式(SEQ ID NO 2)；和 / 或(b)huHEA125輕鏈(SEQ ID NO :11)。
9.權利要求1-8中任一項的綴合物，其中所述鵝膏蕈毒素選自α-鵝膏蕈鹼、β-鵝膏蕈鹼、Y-鵝膏蕈鹼、ε_鵝膏蕈鹼、鵝膏素、三羥鵝膏毒肽醯胺、鵝膏無毒環肽或一羥鵝膏毒肽羧酸或者其鹽或類似物。
10.一種抗體毒素綴合物，其包含(i)特異性結合上皮細胞黏附分子(EpCAM)的抗體或其抗原結合片段，其中所述抗體或其抗原結合片段包含(a)huHEA125重鏈，其中所述重鏈選自(al)SEQ ID NO :1的重鏈的膜結合形式，其中SEQ ID NO 3所示的重鏈可變域VH包含位於VH框架區中的0-10個胺基酸交換、0-10個胺基酸缺失和/或0-10個胺基酸插入，和 SEQ ID NO 26所示的重鏈恆定域包含0_10個胺基酸交換、0_10個胺基酸缺失和/或0_10 個胺基酸插入；和(a2) SEQ ID NO :2的重鏈可溶形式，其中SEQ ID NO :3所示的重鏈可變域VH包含位於 VH框架區中的0-10個胺基酸交換、0-10個胺基酸缺失和/或0-10個胺基酸插入，和SEQ ID NO ,21所示的重鏈恆定域包含0-10個胺基酸交換、0-10個胺基酸缺失和/或0_10個胺基酸插入；禾口(b) SEQ ID NO 11的huHEA125輕鏈，其中SEQ ID NO 12所示的輕鏈可變域VL包含位於VL框架區中的0-10個胺基酸交換、0-10個胺基酸缺失和/或0-10個胺基酸插入，和SEQ ID NO 28所示的輕鏈恆定域CL包含0-10個胺基酸交換、0_10個胺基酸缺失和/或0_10 個胺基酸插入。( )鵝膏蕈毒素；和 (iii)任選的連接體L2。
11.權利要求10的綴合物，其中所述抗體或其抗原結合片段選自嵌合抗體、去免疫化抗體、人源化抗體或人抗體。
12.權利要求10或11的綴合物，其中所述抗原結合片段選自Fab、F(ab，)2和卩(1。
13.權利要求10-12中任一項的綴合物，其中所述抗體為huHEA125或其抗原結合片段。
14.權利要求10-13中任一項的綴合物，其中所述鵝膏蕈毒素選自α-鵝膏蕈鹼、 β -鵝膏蕈鹼、Y -鵝膏蕈鹼、ε -鵝膏蕈鹼、鵝膏素、三羥鵝膏毒肽醯胺、鵝膏無毒環肽或一羥鵝膏毒肽羧酸或者其鹽或類似物。
15.用於醫藥的權利要求10-14中任一項的綴合物。
16.用於治療患者癌症的權利要求10-14中任一項的綴合物，其中所述癌症選自胰腺癌、膽管癌、乳腺癌和結直腸癌。
17.—種靶結合部分毒素綴合物，其包含(i)特異性結合上皮細胞黏附分子(EpCAM)表位的靶結合部分； ( )鵝膏蕈毒素；和 (iii)任選的連接體L3;其中所述鵝膏蕈毒素通過鵝膏蕈毒素3號胺基酸的δ C-原子與所述靶結合部分或可能存在的所述連接體L3連接。
18.權利要求17的靶結合部分毒素綴合物，其中所述鵝膏蕈毒素通過與鵝膏蕈毒素3 號胺基酸的δ C-原子結合的氧原子與所述靶結合部分或可能存在的所述連接體L3連接。
19.權利要求17或18的靶結合部分毒素綴合物，其中所述鵝膏蕈毒素通過酯鍵、醚鍵或尿烷鍵與所述靶結合部分或可能存在的所述連接體L3連接。
20.權利要求17-19中任一項的靶結合部分毒素綴合物，其中存在所述連接體L3，所述綴合物具有以下結構之一(i)鵝膏蕈毒素-δ C-O-C (0) -L3-C (0) -NH-靶結合部分； ( )鵝膏蕈毒素_ δ C-0-L3-C (O)-NH-靶結合部分；或 (iii)鵝膏蕈毒素 _ δ C-O-C(0)-NH-L3-C(O)-NH-靶結合部分。
21.權利要求17-20中任一項的靶結合部分毒素綴合物，其中所述靶結合部分通過存在於所述靶結合部分中的氨基與所述鵝膏蕈毒素或可能存在的所述連接體L3連接。
22.權利要求17-21中任一項的靶結合部分毒素綴合物，其中所述鵝膏蕈毒素選自 α-鵝膏蕈鹼、β-鵝膏蕈鹼、Y-鵝膏蕈鹼、鵝膏蕈鹼、鵝膏素、三羥鵝膏毒肽醯胺、鵝膏無毒環肽或一羥鵝膏毒肽羧酸或者其鹽或類似物。
23.權利要求17-22中任一項的靶結合部分毒素綴合物，其中所述連接體L3為任選取代的烷基、雜烷基、烯基、雜烯基、炔基、雜炔基、環烷基、雜環烷基、芳基、雜芳基、芳烷基或雜芳烷基。
24.權利要求17-23中任一項的靶結合部分毒素綴合物，其中所述連接體L3包含二硫鍵。
25.權利要求17-24中任一項的靶結合部分毒素綴合物，其中所述靶結合部分與腫瘤細胞上存在的表位特異性結合。
26.權利要求17-25中任一項的靶結合部分毒素綴合物，其中所述靶結合部分選自 (i)抗體或其抗原結合片段；( )抗體樣蛋白；和 (iii)核酸適配體。
27.權利要求26的靶結合部分毒素綴合物，其中所述抗體或其抗原結合片段選自雙抗體、四抗體、納米抗體、嵌合抗體、去免疫化抗體、人源化抗體或人抗體。
28.權利要求26或27的靶結合部分毒素綴合物，其中所述抗原結合片段選自Fab、 F (ab，)2、Fd、Fv、單鏈 Fv 和二硫鍵連接的 Fv (dsFv)。
29.權利要求26-27的靶結合部分毒素綴合物，其中所述抗體或其抗原結合片段包含(a)huHEA125重鏈的膜結合形式(SEQID NO 1)或huHEA125重鏈的可溶形式(SEQ ID NO 2)；和 / 或(b)huHEA125輕鏈(SEQ ID NO :11)。
30.用於醫藥的權利要求17-29中任一項的靶結合部分毒素綴合物。
31.用於治療患者癌症的權利要求17-30中任一項的靶結合部分毒素綴合物，其中所述癌症選自胰腺癌、膽管癌、乳腺癌、結直腸癌、肺癌、前列腺癌、卵巢癌、胃癌、腎癌、惡性黑色素瘤、白血病和惡性淋巴瘤。
32.藥物組合物，其包含權利要求1-14中任一項的抗體毒素綴合物或權利要求17-29 中任一項的靶結合部分毒素綴合物，且還包含一種或多種藥學上可接受的稀釋劑、載體、賦形劑、填充劑、粘合劑、潤滑劑、助流劑、崩解劑、吸附劑和/或防腐劑。
全文摘要
本發明涉及腫瘤治療。在一個方面，本發明涉及可用於治療癌症的靶結合部分和毒素的綴合物。具體而言，毒素為鵝膏蕈毒素，靶結合部分(例如抗體)針對腫瘤相關抗原，例如上皮細胞黏附分子(EpCAM)。在另一方面，本發明涉及包含這種靶結合部分毒素綴合物的藥物組合物，以及這種靶結合部分毒素綴合物在製備這種藥物組合物中的用途。本發明的靶結合部分毒素綴合物和藥物組合物可用於治療癌症，尤其是腺癌，例如胰腺癌、膽管癌、乳腺癌和結直腸癌。
文檔編號A61K47/48GK102387815SQ201080016648
公開日2012年3月21日 申請日期2010年4月8日 優先權日2009年4月8日
發明者F·布雷特林, G·莫爾登豪爾, S·呂特高, 海因茨·福爾斯蒂奇 申請人:德國癌症研究中心, 海因茨·福爾斯蒂奇