顆粒溶解素的表達和製備方法

2023-09-17 04:36:05

專利名稱：顆粒溶解素的表達和製備方法
技術領域：
本發明屬於生物技術領域；更具體地，本發明涉及顆粒溶解素的表達和製備方法。
背景技術：
天然的顆粒溶解素(Granulysin, GNLY) 存在兩種形式，即15kDa形式和9kDa形式。目前商業化的顆粒溶解素只有15kDa形式(如ProSpec、Abnova和NovusBiologicals)，而且都含有較大的tag，可能會影響其生活學活性。ー些研究人員克服這個困難，嘗試了大腸桿菌、乳酸克魯維酵母、昆蟲細胞進行表達15kDa顆粒溶解素，發現僅昆蟲細胞可以表達15kDa顆粒溶解素，但是產量非常低(小於lmg/L)。目前研究中使用的9kDa顆粒溶解素大多來源於大腸桿菌表達系統，蛋白在表達過程中會易於形成包涵體，由於顆粒溶解素的蛋白序列中存在較多的ニ硫鍵，其在後續復性較為困難；此外，還可以通過體外轉錄/翻譯表達系統和YT細胞脫顆粒提取獲得9kDa顆粒溶解素，但是得率非常低。綜上所述，目前兩種形式的顆粒溶解素的來源仍然非常有限，這可能由於顆粒溶解素蛋白對於宿主具有細胞毒作用，一些真核或病毒表達系統(例如釀酒酵母，昆蟲細胞)易於受其毒性制約，導致細胞生長不好，表達效率非常低。經過對各種表達系統的篩選，意外地發現採用畢赤酵母表達系統來表達顆粒溶解素蛋白，不僅表達量非常高，表達穩定，並且蛋白可以獲得正確摺疊加工，生物活性非常理想。同時，本發明人還優化了蛋白的重組表達エ藝以及優化了蛋白的純化工藝。

發明內容
本發明的目的在於提供顆粒溶解素的表達和製備方法。在本發明的第一方面，提供一種重組表達顆粒溶解素的方法，所述方法包括(I)提供表達載體，所述的表達載體中含有顆粒溶解素的表達盒；(2)將(I)的表達載體轉化畢赤酵母,培養轉化有所述表達載體的重組畢赤酵母，從而表達顆粒溶解素。在另ー優選例中，所述的表達載體線性化後轉化畢赤酵母。在另ー優選例中，所述的表達盒包括以下操作性連接的元件A0X I啟動子，釀酒酵母a-Factor信號肽編碼基因，顆粒溶解素，終止子。在另ー優選例中，所述的顆粒溶解素選自全長顆粒溶解素(即15kDa顆粒溶解素)，或在全長顆粒溶解素首尾兩端截短的片段；較佳地，所述的首尾兩端截短的片段分子量為9kDa (即9kDa顆粒溶解素)。在另ー優選例中，在釀酒酵母a-Factor信號肽編碼基因與顆粒溶解素基因之間,還包括蛋白酶酶切位點；或在顆粒溶解素的基因與終止子之間，還包括蛋白純化標籤的編碼基因。在另ー優選例中，所述的蛋白酶酶切位點是kex2蛋白酶酶切位點。在另ー優選例中，所述的蛋白純化標籤是HIS標籤。
在另ー優選例中，所述的顆粒溶解素的基因具有SEQ ID NO: I或SEQ ID N0:2所示的核苷酸序列。在另ー優選例中，步驟(2)中，表達顆粒溶解素時，調節培養基的pH在3.0-8. 0 ;和/或調節溫度為10-32で。在另ー優選例中，表達顆粒溶解素時，調節培養基(包括初始培養基以及表達過程中培養基)的PH在3. 8-5. 5 ;更佳地為4-5。在另ー優選例中，表達顆粒溶解素時，調節溫度為23_31°C ;最佳地，調節溫度為25-30 °C。在另ー優選例中，步驟(2)中，表達顆粒溶解素時，先以甘油為碳源進行重組畢赤酵母的培養，待重組畢赤酵母溼重超過150g/L(較佳地180g/L)時，加入甲醇進行誘導培養，整個培養過程持續60-100小時(較佳地70-90小時；更佳地80小時)。在另ー優選例中，步驟(2)中，表達顆粒溶解素時，首先使用含有4%(w/v)甘油且PH5的BSM培養基培養重組畢赤酵母菌體，培養溫度30°C ;等到溶氧急劇上升時，進行甘油流加(較佳地，流加量是18±3ml/hr/升；更佳地,流加量是18. 15ml/hr/升)，待重組畢赤酵母溼重超過150g/L(較佳地180g/L)時停止流加甘油；隨後加入甲醇進行誘導培養。在另ー優選例中，流加的甘油中，每升50%w/v甘油溶液含有12ml的PTM1，PTM1成分為硫酸銅-5H206. 0g，碘化鈉0. 08g，硫酸錳-H2O 3. 0g，鑰酸鈉_2H20 0. 2g，硼酸0. 02g,氯化鈷0. 5g，氯化鋅20. 0g，硫酸亞鐵-7H2065. Og,生物素0. 2g，硫磺酸5. Oml0在另ー優選例中，在顆粒溶解素的表達盒中，所述的顆粒溶解素的基因(5』或3』端)還連接ー純化標籤的編碼基因；且，步驟(2)之後，還包括從培養基中分離顆粒溶解素的步驟，包括先採用親和層析柱(與純化標籤相應的親和層析柱，例如純化標籤6XHIS對應Ni柱)對培養上清進行純化；之後採用陽離子交換柱進行純化。在另ー優選例中，所述的純化標籤是HIS標籤(如包含6-12個HIS的標籤);所述的親和層析柱是Ni柱；所述的陽離子交換柱選自(但不限幹)陽離子交換柱S、SP、CM、MMC、adhere o在另ー優選例中，所述的陽離子交換柱是CM柱；更佳地，為HiTrap CM FF柱。在另ー優選例中，在親和層析柱純化與陽離子交換柱純化之間，還包括除鹽的步驟；較佳地，使用膜過濾系統超濾除鹽(例如應用Labscale TFF system和Pellicon XL 50進行除鹽)。本發明的其它方面由於本文的公開內容，對本領域的技術人員而言是顯而易見的。


圖l、9_kD和15-kD GNLY蛋白的結構以及用於畢赤酵母(P. pastoris)表達的pPIC9K-GNLYs-His表達質粒的構建。其中，(A)9_kD和15-kD GNLY蛋白的結構示意圖。(B) GNLY表達載體部分結構的示意圖。圖2、9_kD GNLY搖瓶培養和優化表達。(A)篩選高表達克隆，其中，1-8 :克隆編號，ctr :GS115/pPIC9K対照。、
(B)利用BMMY培養基搖瓶培養，pH值的優化。(C)利用BMMY培養基搖瓶培養，溫度的優化。(D)利用BMMY培養基搖瓶培養，甲醇誘導濃度的優化。圖3、9_kD GNLY P. pastoris 的發酵過程曲線。⑷培養過程中，發酵體系中溶氧、甲醇流加量、溫度、pH的變化。(B)培養過程中，菌體溼重(WCW)和0D600值的變化。(C)培養過程中，隨著誘導時間增加，蛋白表達情況。圖4、9_kD GNLY 的純化。 (A)從發酵上清液中純化9-kD GNLY。CS :澄清的上清，FT :流出液(flowthought)；E :洗脫液，M :蛋白分子量標記。(B)使用梯度緩衝液B從CM-FF中洗脫9_kD GNLY。(C)應用SDS-PAGE比較還原與非還原狀態下的9_kD和15_kD GNLY。圖5、15-kD GNLY的潛在的0_糖基化位點預測。(A) 5-kD GNLY的潛在的O-糖基化位點預測。87S、89S、142T :潛在0-糖基化位點。(B)利用LC-MS搜索肽段。圖6、GNLY的殺傷大腸桿菌XL-10和革蘭氏陽性金黃色葡萄球菌NCTC8325的生物學活性測試。(A) 9-kD GNLY 的 CFU 測試；(B) 15-kD GNLY 的 CFU 測試；(C)9-kD GNLY的上下兩條電泳條帶所對應蛋白的抑菌活性比較；以不同量的GNLY處理後，進行細菌克隆的計數。
具體實施例方式本發明人經過深入的研究，通過在多種宿主細胞進行表達研究，發現採用畢赤酵母來表達顆粒溶解素蛋白或蛋白片段，可實現蛋白的高表達，且良好地保留蛋白的生物活性。本發明人的新發現解決了現有技術中難以高效表達顆粒溶解素蛋白的技術難題，並為顆粒溶解素的生產提供了一種簡單而穩健的發酵エ藝。在此基礎上完成了本發明。由於目前研究中使用的9kDa顆粒溶解素大多以大腸桿菌表達系統進行重組表達，蛋白在表達過程中會易於形成包涵體，由於顆粒溶解素的蛋白序列中存在較多的ニ硫鍵，其在後續復性較為困難；由於顆粒溶解素蛋白對於細胞具有毒性，一些真核或病毒表達系統(例如釀酒酵母，昆蟲細胞)易於受其毒性制約，導致細胞生長不好，表達效率非常低。經過對各種細胞的表達篩選，意外地發現採用畢赤酵母表達系統來表達顆粒溶解素蛋白，不僅表達量非常高，表達穩定，並且蛋白可以獲得正確摺疊加工，生物活性非常理想。同吋，本發明人還優化了蛋白的重組表達エ藝以及優化了蛋白的純化工藝。顆粒溶解素顆粒溶解素(GNLY蛋白)是ー種毒性分子，具有廣譜的抗病原微生物及殺傷腫瘤細胞作用，其作用機制涉及神經醯氨和Caspase依賴和非依賴途徑,並與其ニ級結構及所帶正電荷胺基酸相關。由於其廣譜的抗病原微生物作用及對正常宿主細胞的低毒性，它在消除耐藥性病原微生物方面是ー種很有吸引力的生物製劑。
作為本發明的優選方式，所述的顆粒溶解素或其活性片段的核苷酸序列可以與SEQ ID NO: I或SEQ ID N0:2所示的序列基本上相同。編碼顆粒溶解素或其活性片段的編碼序列也可以是SEQ ID NO: I (表達15kDa形式的顆粒溶解素)或SEQ ID NO: 2 (表達9kDa形式的顆粒溶解素活性片段)所示的編碼區序列的簡併的變異體。如本文所用，「簡 並的變異體」在本發明中是指編碼的蛋白質胺基酸序列與SEQ ID NO: I或SEQ ID N0:2所編碼的胺基酸序列相同，但核苷酸序列與SEQ IDNO: I或SEQ ID NO:2所示序列有差別的核酸序列。例如，可以對SEQ ID NO: I或SEQ IDNO: 2進行酵母細胞偏好的密碼子優化，更佳地，進行畢赤酵母細胞偏好的密碼子優化。這些密碼子優化的序列也被包含在本發明中。本發明的顆粒溶解素或其活性片段的核苷酸序列通常可以用PCR擴增法、重組法或人工合成的方法獲得。對於PCR擴增法，可根據本發明所公開的有關核苷酸序列，尤其是開放閱讀框序列來設計引物，並用市售的cDNA庫或按本領域技術人員已知的常規方法所製備的cDNA庫作為模板，擴增而得有關序列。還可用人工合成的方法來合成有關序列。目前，已經可以完全通過化學合成法來得到編碼本顆粒溶解素(或其活性片段)的DNA序列。然後可將該DNA序列引入表達載體和細胞中。表達系統本發明也涉及包含本發明的顆粒溶解素或其活性片段的編碼基因的表達載體，以及用本發明的載體經基因工程轉化產生的宿主細胞。本發明所述的表達載體是適用於畢赤酵母細胞表達的表達載體，其中含有顆粒溶解素的表達盒。如本文所用，所述的「表達盒」是指包含有表達目的多肽(本發明中為顆粒溶解素或其活性片段)所需的所有必要元件的基因表達系統，通常其包括一下元件啟動子、編碼多肽的基因序列，終止子；此外還可選擇性包括信號肽編碼序列等；這些元件是操作性相連的。作為本發明的優選方式，所述的表達盒包括以下操作性連接的元件A0X I啟動子，釀酒酵母a-Factor信號肽編碼基因，顆粒溶解素或其活性片段的基因，終止子。較佳地，在釀酒酵母a-Factor信號肽編碼基因與顆粒溶解素或其活性片段的基因之間，還包括蛋白酶酶切位點，從而用於後續將信號肽與顆粒溶解素表達產物分離；或在顆粒溶解素或其活性片段的基因與終止子之間，還包括蛋白純化標籤的編碼基因，從而有利於後續的純化操作。多種蛋白純化標籤可應用於本發明的方法，例如，所述的蛋白酶酶切位點是kex2蛋白酶酶切位點，或所述的蛋白純化標籤是6XHIS。將所述的表達載體轉化畢赤酵母，培養轉化有所述表達載體的重組畢赤酵母，從而可表達顆粒溶解素。較佳地，所述的表達載體先進行線性化，之後轉化畢赤酵母。用重組DNA轉化宿主細胞可用本領域技術人員熟知的常規技術進行。當宿主是真核生物如畢赤酵母時，可選用如下的DNA轉染方法電轉化、磷酸鈣共沉澱法、顯微注射、脂質體包裝等；較佳地選用電轉化。表達和純化方法由於顆粒溶解素是ー種具有毒性的蛋白，其對宿主會產生傷害，因此現有技術中還沒有找到ー種適合於進行高效重組表達的較佳方案。大腸桿菌的原核表達形成包涵體，這可使得顆粒溶解素對宿主的毒性較小，但是包涵體面臨後續的復性純化問題，表達效率低、步驟複雜，且獲得的蛋白活性不理想。釀酒酵母等一些真核細胞在表達顆粒溶解素的同時，受其毒性侵害，無法獲得高的表達產量。因此，本發明人進行了大量的細胞篩選，最終確定採用畢赤酵母表達，其對於顆粒溶解素有一定的耐受能力，並通過優化表達、純化方法，使得其廣量大大提尚。為了提高顆粒溶解素或其活性片段的表達量，本發明人還進行了エ藝條件方面的優化。作為本發明的優選方式，表達顆粒溶解素時，調節初始培養基以及發酵過程中培養基的pH在3. 0-8. 0 ;更佳地，調節初始培養基的pH在3. 8-5. 5，更佳地為4_5。這種弱酸性的PH值環境，可獲得較高的蛋白表達量。作為本發明的優選方式，表達顆粒溶解素時，調節溫度為10_32°C ;較佳地，調節溫度為23-31°C ;最佳地，調節溫度為25-30°C。而較低的溫度可影響顆粒溶解素的表達。考慮到顆粒溶解素是具有殺細胞毒性的蛋白這ー特性，本發明人採取了先進行重組畢赤酵母菌體生長培養，在菌體生長到足夠多時再進行誘導表達的發酵策略，從而最大程度地降低其對宿主細胞的毒性。因此，作為本發明的優選方式，表達顆粒溶解素時，先以 甘油為碳源進行重組畢赤酵母的培養，待重組畢赤酵母溼重超過150g/L(較佳地180g/L)時，加入甲醇進行誘導培養，整個培養過程持續60-100小時；較佳地70-90小時；更佳地80小吋。更多的培養時間對於蛋白表達量的増加不顯著。在發酵培養結束後，還可包括步驟從發酵培養基中分離顆粒溶解素。從培養產物中分離或純化顆粒溶解素可採用本領域技術人員熟知的技術。例如可採用硫酸銨沉澱、離子交換、凝膠過濾法純化；或採用親和層析法純化，這些方法均包含在本發明中。然而，為了提高純化的效率，本發明人還進行了純化工藝的優化。作為本發明的優選方式，在顆粒溶解素的表達盒中，所述的顆粒溶解素或其活性片段的基因還連接ー純化標籤的編碼基因；從而，在純化時包括先採用親和層析柱(與純化標籤相應的親和層析柱，例如純化標籤6 X HIS對應Ni柱)對培養上清進行純化；之後採用陽離子交換柱進行純化。由於顆粒溶解素的等電點比較高，因此通過陽離子交換柱純化之後，純度比Ni柱純化進ー步提高。在本發明的實施例中，採用這種兩步法的純化方法，使得 9kDa GNLY56mg/L, 15kD GNLYc 純化後可達 130mg/L。純化標籤的選擇是本領域技術人員易於作出的，常用的純化標籤例如HIS-tag(如 6XHIS)，GST-Tag，FLAG-Tag，HA-Tag，Myc-Tag等。純化標籤的選擇與親和層析柱中親和介質的選擇是關聯或對應的，這種關聯或對應是本領域技術人員的常規知識。作為本發明的優選方式，所述的純化標籤是6XHIS ;所述的親和層析柱是Ni柱；所述的陽離子交換柱可以是S、SP、CM、MMC, adhere等，例如，陽離子交換柱是CM柱；更佳地，為HiTrapCM FF 柱。作為本發明的優選方式，在親和層析柱純化與陽離子交換柱純化之間，還包括除鹽的步驟。較佳地,使用Labscale TFF system和Pellicon XL 50進行除鹽。顆粒溶解素的純化的其它步驟例如上清液的獲得、樣品澄清等可採用本領域技術人員熟知的常規技術進行。通過親和層析柱純化與陽離子交換柱純化，本發明人分離獲得了分子量略有不同的顆粒溶解素9kDa或15kDa蛋白。經分析，這種分子量的差異可能體現在其糖基化修飾的不同。但是，這種糖基化修飾的不同並不影響蛋白的抑菌活性。
利用本發明提供的方法，顆粒溶解素表達量超過100mg/L，通過兩步純化，純度可以達到95%以上。抑菌實驗表明，9kDa和15kDa兩種形式的顆粒溶解素都具有抑制細菌生長的活性，並具有劑量依賴的關係，且9kDa形式的顆粒溶解素抑菌活性遠高於15kDa顆粒
溶解素。本發明的主要優點在幹首次提供了 ー種簡単，但是穩健的發酵調控方式，利用畢赤酵母表達9kDa和15kDa兩種形式的顆粒溶解素，並 進行了一系列的搖瓶表達條件優化，並且發酵條件下表達量高達100mg/L，顯著高於之前文獻報導的方法。酵母表達的兩種形式的顆粒溶解素均具有良好的抑菌活性，呈現劑量依賴；且9kDa的抑菌活性明顯高於15kDa的顆粒溶解素；而現有技術的文獻報導認為15kDa的顆粒溶解素不具有抑菌活性。提供了一種純化方法，先通過親和層析捕獲蛋白，再使用離子交換層析的方法分離兩種不同修飾的顆粒溶解素。下面結合具體實施例，進ー步闡述本發明。應理解，這些實施例僅用於說明本發明而不用於限制本發明的範圍。下列實施例中未註明具體條件的實驗方法，通常按照常規條件如J.薩姆布魯克等編著，分子克隆實驗指南，科學出版社，2002中所述的條件，或按照製造廠商所建議的條件。除非另外說明，否則百分比和份數按重量計算。I.材料菌株與質粒P. pastoris 菌株 GS115、大腸桿菌 XLlO 感受態、pPIC9K 載體購自 Invitrogen 公司；pMD18_T載體購自Takara公司。試劑Yeast nitrogen base (YNB)購自 BD 公司；RPMI_1640 培養基購自 Hyclone 公司；胎牛血清購自Gibco公司；酵母抽提物和蛋白腖購自0X0ID公司；BCA蛋白檢測試劑盒購自Pierce公司；d_Sorbitol、d-biotin、質粒抽提試劑盒、PCR產物回收試劑盒、膠回收試劑盒、DNA聚合酶、T4DNA連結酶、限制性內切酶、蛋白marker和PAGE配製相關試劑購自上海生エ；細胞分離液 Ficoll-Hypaque*-購自 Solarbio 公司；G418 和 EndoglycosidaseH (Endo H)購自Sigma-Aldrich公司；EZ-ECL化學發光檢測試劑盒購自BiologicalIndustries 公司；in his-tag mouse mAb 購自 Abmart 公 ロ」；二手幾 anti-mouse IgG-HRP 購自 BioLegend 公司；SV Total RNA Isolation System 購自 Promega 公司；Turbo 逆轉錄酶購自北進原平皓公司；含矽泡敵購自江蘇賽歐信越消泡劑有限公司。BMMY培養基、BMGY培養基、MGY培養基、BSM培養基等配製參見Invitrogen公司畢赤酵母表達手冊■，幾種主要成分分別購自Yeast Nitrogen Base (YNB)購自BD公司；Yeastextract和Trypton購自0X0ID公司；其他化學試劑購自上海生エ和國藥集団。儀器電子分析天平和pH計購自梅特勒-託利多公司；鏇潤振蕩儀購自ScientificIndustries公司；電泳儀，垂直電泳槽、水平電泳槽、凝膠成像系統購自天能公司；半乾轉膜儀、電轉儀購自Bio-Rad公司；化學發光檢測儀購自UVITEC公司；高壓滅菌鍋購自Hirayama 公司；臺式冷凍離心機(Centrifuge 5810R、Centrifuge 5415R)購自 eppendorf公司；超淨工作檯、搖床、恆溫培養箱購自上海智誠公司；PCR儀購自德國Biometra公司；微量移液器購自法國Gilson公司；細胞培養箱購自Themo公司；AKTA explorer^LabscaleTFF System 和 Pellicon XL(5kDa)購自 Millipore 公司。BioFlo 115 Benchtop Fermentor 購自 New Brunswick Scientific 公司；FlexStand system 矛ロ 0. 45 y m microfiltration cartridge 購自 GE healthcare ；LTQ linearIT MS 購自 Thermo ；EttanTM MDLC HPLC system 購自 GE healthcare。溶液Ni 柱結合緩衝液300mM NaCl,20mM Tris-HCl, pH7. 5 ；Ni 柱洗滌緩衝液40mM 咪唑，300mM NaCl,20mM Tris-HCl, pH7. 5 ；Ni 柱洗脫緩衝液400mM 咪唑，300mM NaCl,20mM Tris-HCl, pH7. 0 ； Buffer A 20mM 憐酸，pH7. 0 ；Buffer B 1M NaCl，20mM 磷酸，pH7. 0。PTMl 液硫酸銅-5H206. Og,碘化鈉 0. 08g,硫酸錳 _H203. Og,鑰酸鈉 _2H20 0. 2g，硼酸0. 02g,氯化鈷0. 5g，氯化鋅20. Og,硫酸亞鐵-IW2O 65. Og,生物素0. 2g，硫磺酸5. Oml，用純化水定容至I升，過濾後室溫保存。引物GNLY的RT-PCR弓丨物如下PMD18T-GNLY-Fw CTCCTTGCAGCCATGCTCCTG(SEQ ID NO:3)；PMD18T-GNLY-Rv GAGGGGACCTGTAGAAGGTATAC(SEQ ID NO:4)。a-Factor 引物Pl-Fw ATGGATCCAAACGATGAGATTTC(SEQ ID NO:5)；P2-9-Rv GACAGGTCCTGTAGTCACGGCCTCTTTTCTCGAGAGATACCC(SEQ ID NO :6)；P2-15-Rv GTAGTACTCAGGGCTCAGACGTCTTTTCTCGAGAGATACCC(SEQ ID NO:7)。GNLY P3-9-Fw CTCGAGAAAAGAGGCCGTGACTACAGGACCTGTC(SEQ IDNO:8)；P3-15-Fw CTCGAGAAAAGACGTCTGAGCCCTGAGTACTAC(SEQ ID NO:9) P4-9-Rv CTGAATTCTCAATGGTGATGGTGATGATGCCTGAGGTCCTCACAGATCTGCTGGGCAG(SEQ IDNO:10)；P4_15_Rv :CTGAATTCTCAATGGTGATGGTGATGATGGAGGGGACCTGTAGAAGG(SEQ ID NO: 11)。II.實驗方法顆粒溶解素cDNA克隆的構建I、PBMCs 總 RNA 的提取使用Promega 的 SV Total RNA Isolation System試劑盒從PBMC 細胞中(PBMC 中含有約10%的NK細胞，含有GNLY的mRNA)抽提總RNA，具體操作步驟參見試劑盒說明書。2、RT-PCR
(I)在一個 RNase-free 的 Ep 管中加入下列試劑I ii I oligo (dT) 12-18 (500 U g/ml) ；2ng-5 u g 總 RNA ;1 y IlOmM dNTP Mix(dATP, dGTP, dCTP 和 dTTP 均為 IOmM)；加入RNase-free的去離子水使總體積達到12ii I。(2)將上述混合物於65°C加熱5分鐘，立即放冰上，稍稍離心。(3)加入下列試劑4 u 15 XFirst-Strand Buffer ；2 U 10. IM DTT ； I u I Turbo 逆轉錄酶(200 單位)；lul RNase OUT Recombinant Ribonuclease Inhibitor(40 單位/U I)。37°C孵育50分鐘，然後70°C孵育15分鐘使體系失活，得到總cDNA。3、顆粒溶解素cDNA的PCR擴增和pMD18_T克隆的構建(I)以上步cDNA為模板，使用基因特異性的引物PMD18T-GNLY-FW和PMD18T-GNLY-RV來擴增目的基因，切膠回收特異片段。
(2)使用Taq酶對上步得到片段進行加A反應，回收後連接到pMD18_T載體，將連接產物轉化XLlO感受態；(3)挑選陽性克隆，PCR鑑定後送樣測試，所得陽性克隆命名為PMD18-T-GNLY ;其插入片段序列與NCBI上NM_006433. I序列完全一致。顆粒溶解素酵母表達載體的構建I、具有Kex2單ー蛋白酶酶切位點的a -因子(a -Factor)信號肽片段編碼序列的擴增以pPIC9k質粒為模板，在引物Pl-Fw和P2-9-RV的引導下進行PCR擴增，PCR反應條件為先94°C 2分鐘；然後94°C 30秒，55°C 40秒，72°C 30秒，共32個循環；最後72°C 10分鐘。反應結束後，對PCR產物進行1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，得到一條大小約255bp的條帶，與預期結果相符。用PCR產物回收試劑盒回收目的條帶，命名為「 a-Factor-9-」。2、9kDa GNLY 基因的擴增以質粒pMD 18-T-GNLY 為模板，在引物 P3_9_Fw 和 P4_9_Rv (後續擴增 15kDa GNLY基因時，採用引物P3-15-Fw和P4-15-Rv)的引導下進行PCR擴增，PCR反應條件為先940C 2分鐘；然後94°C 30秒，55°C 40秒，72°C 40秒，共30個循環；最後72°C 10分鐘。反應結束後，將得到的PCR產物進行1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，得到一條大小約240bp的條帶，與預期結果相符。用PCR產物回收試劑盒回收目的條帶，該片段命名為「_9kDa GNLY-」。3、含有信號肽的重組9kDa GNLY基因編碼基因的擴增以獲得的「a -Factor-9-」和「-9kDa GNLY-」為模板，在引物 Pl-Fw 和 P4_9_Rv (後續製備含有a-Factor信號肽的重組15kD GNLY基因時，採用引物PトFw和P4_15-Rv)的引導下進行PCR擴增，並通過引物在序列兩端分別添加上限制性內切酶BamH I和EcoR I識別位點。PCR反應條件為94°C 2分鐘；94°C 45秒，55°C 45秒，72°C I分鐘，循環32次；最後72°C 10分鐘。反應結束後，對PCR產物進行1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，得到一條大小約為500bp的條帶，與預期結果相符。用PCR產物回收試劑盒回收目的條帶，將該PCR產物的基因命名為「 a -Factor-9kD GNLY-His」。4、重組9kD GNLY的畢赤酵母表達載體的構建用限制性內切酶BamH I和EcoR I對上步獲得的PCR產物(a -Factor_9kDGNLY-His)進行雙酶切，再將酶切片段與經相同酶雙酶切的質粒pPIC9K用T4DNA連接酶進行連接，將連接產物轉化大腸桿菌DH5 a感受態細胞，篩選陽性重組子，提質粒，酶切鑑定，將鑑定後的陽性克隆命名為pPIC9K-9kD GNLY-His，並送上海生エ測序，測序結果顯示插入PPIC9K的BamH I和EcoR I的識別位點間的DNA序列與預期結果完全一致。5、重組15kDa GNLY的畢赤酵母表達載體的構建重組15kDa GNLY的畢赤酵母表達載體的構建過程與上述9kDa GNLY完全一致，不同之處僅在於對應使用引物列表中標記「15」字樣的引物替換標記「9」字樣的引物即可。所得測序正確的陽性克隆命名為pPIC9K-15kDa GNLY-His。重組9kDa或15kDa GNLY搖瓶表達條件優化⑴pH優化
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配製含有不同pH值(pH4. 0、pH5. 0、pH6. 0)的0. IM磷酸鉀緩衝液的BMMY培養基，誘導表達60h後,使用Western bloting檢測,姆個pH值平行2份。(2)溫度優化將使用BMMY培養基重懸的菌體均分成6份，置於20°C、25°C、30°C搖床各兩份，誘導表達60h後，使用Western bloting檢測。(3)甲醇濃度優化配製含有不同初始甲醇濃度(0. 5%(v/v)、1. 0%(v/v)、1. 5%(v/v))的BMMY培養基，誘導表達60h後,使用Western bloting檢測,姆個濃度平行2份。重組9kD或15kD GNLY的發酵表達(I) 一級種從凍存的工作菌種庫接種到5ml MGY培養基，30°C，250rpm培養36-48h至0D6QQ=2-6，此為發酵ー級種；(2) ニ級種從 I 級種接 Iml 到 200ml pH5. OBMGY 培養基中，30°C，250rpm 培養12-18h，至0D6QQ=2-6，此為發酵ニ級種；(3)發酵準備發酵罐組裝及相關試劑準備、滅菌等工作；⑷Batch階段將ニ級種接入含4L pH5. 0的BSM培養基(基礎鹽培養基)的14L發酵罐中，補充6ml/L的PTMl溶液，溫度控制在30°C，初始攪拌速度400rpm，通過補加氨水將pH維持在5. 0左右，初始DO 90%以上，隨著菌體的生長DO會逐漸下降並維持平衡，將平衡控制在30-40%之間；(5)轉化期當DO開始急速上升時意味著原有培養基中甘油耗盡，需要持續補充含有12ml/L PTMl的50%甘油溶液，流速為12ml/h/L，這個過程維持2_3h至DO達到40或溼重在180g/L附近；(6)甲醇誘導階段當溼重達到180g/L附近時，停止甘油流加，溶解氧會迅速上升，隨後開始按「Invitoogen發酵(畢赤酵母發酵)手冊三步法」流加含有12ml/L PTMl的甲醇溶液(三步法包括三個流加速度，由先到後甲醇流加量分別是3. 6ml/hr/L、7. 3ml/hr/L、10. 9ml/hr/L)。溫度控制在25°C;攪拌速度IOOOrpm左右，DO控制在20-40%之間(平均約30%)，到發酵後期需要通純氧維持DO穩定。發酵持續60h左右終止。重組9kD或15kD GNLY的純化(I)固液分離發酵結束之後，使用NaOH緩緩地將發酵液pH調節到7.5，IOOOOg, 20min離心，收集上清液；(2)樣品的澄清使用 Flex Stand system 和 0. 45 U m microfiltrationcartridge將上步獲得上清液進ー步過濾；
(3)蛋白的捕獲使用XK26/20column和Ni-agarose組裝Ni-柱(親和層析柱)，結合緩衝液平衡後，直接上樣上步澄清樣品，流速700ml/h ;上樣結束之後先用結合緩衝液衝洗5個柱體積，再用洗滌緩衝液衝洗5個柱體積，最後用洗脫緩衝液洗脫目的蛋白；(4)除鹽使用Labscale TFF system和Pellicon XL50對上步洗脫下來的蛋白進行Buffer置換,置換兩個樣品體積的Buffer A ;置換之後0. 45 y m濾膜過濾備用；(5)精細純化使用 AKTA Explorer System,將 Buffer A 平衡 HiTrap CM FF_5ml柱，直接上樣上步除鹽並過濾後的樣品，上樣完成之後，先用Buffer A衝洗，再分別用30%Buffer B、60% Buffer B、80% Buffer B 洗脫樣品，最 後用 100% Buffer B 再生柱子，並用ddH20和20%乙醇衝洗並保存柱子；(6)保存將上步各濃度Buffer B洗脫下來的蛋白，用PBS置換緩衝液之後凍存備用。重組9kD或15kD GNLY的鑑定I、LC-MS 鑑定(I) SDS-PAGE在還原條件下分離上述60%B洗脫下來的GNLY，分別切膠回收上下兩條帶，還原並燒基化之後用trypsin酶切消化；(2)消化後的肽段使用 Thermo LTQ linear IT MS 和 Ettan MDLC HPLC system聯用分析；(3)相關參數LC 分離方式C18 Reversed Phase Capillary Column流動相溶液A 0. l%(v/v)甲酸溶於ddH20 ；B :100%乙腈離子類型正離子質譜方法Data_DependentMS/MS蛋白修飾extra57Da on Cys,及 extra 16Da on Met檢索方法SEQUEST;P印tide filter 1+, I. 9 ；2+,2. 50 ；3+,3. 752、資料庫預測N/0-糖基化位點使用ExPASy SIB Bioinformatics Resource Portal 資料庫相關軟體預測N/0-糖基化位點，其中N-糖基化位點預測連結http://www. cbs. dtu. dk/services/NetNGlyc/ ;0_ 糖基化位點預測連結http://www. cbs. dtu. dk/services/YinOYang/。重組9kDa或15kDa GNLY的活性檢測(l)5ml LB培養基大腸桿菌菌株XL-10或金黃色葡萄球菌NCTC-8325單菌落，250rpm，37°C培養至OD600=O. 6 0. 8 (約2_3h)，此時E. coli處於對數生長期；(2)取步驟I)中的Iml菌液,於室溫1500g離心5min ；(3)棄上清，用 Iml (含 0. 03%LB 的 IOmM PPB)的重懸；(4)測量重懸菌液的0D_值，用(含0. 03%LB的IOmM PPB)調整菌液濃度至2 XlOVml (以OD600=I時，菌液濃度為5 XlOVml計算)；(5)對於每個檢測的蛋白質濃度n，準備100 U I濃度為2n的顆粒溶解素的溶液與IOOu I的稀釋後(步驟(4))的菌液混合；顆粒溶解素儲液濃度為270uM(2. 7mg/ml，BCA定
量)；(6) 37 °C 100_160rpm 搖菌鮮育 3h ；
(7)取30 ill孵育後的菌液用(含0. 03%LB的IOmM PPB)稀釋至300 U I,塗LB板；(8)置37°C培養箱中培養18 24h，待克隆清晰可見；(9)統計各板上克隆的數目並計算CFU。III.實施例 實施例I、GNLY表達載體的構建GNLY全長145個胺基酸，其中包括預測的信號肽，位於胺基酸第1_22位。在殺傷性T細胞和NK細胞中，GNLY以15kDa的形式合成，然後首位剪切後形成9kDa的形式(如圖 1A)。
本發明人將9kDa和15kDa GNLY的編碼序列連接到釀酒酵母a -Factor信號肽3』末端，並僅保留kex2蛋白酶的酶切位點，最後通過BamH I和EcoR I酶切位點克隆到pPIC9K酵母表達載體中。這樣通過甲醇誘導AOX I啟動子驅動其下遊蛋白的表達。GNLY表達載體結構示意圖如圖IB所示。實施例2、GNLY表達菌株的篩選和搖瓶表達條件優化使用Sal I將pPIC9K-GNLYs_His線性化之後，電轉入畢赤酵母GS115菌株。分別從培養9kDa和15kDa GNLY表達菌株的YPDG平板上各挑選9個克隆進行誘導表達。使用Western blotting檢測這些克隆培養上清中GNLY表達的情況。以9kDa GNLY克隆表達為例，大多數的克隆均有效地表達出9_kD GNLY(如圖2A)，表達量最高的克隆命名為GS115/9kDa GNLY-His。Western blotting顯示酵母表達出來的9kDa GNLY分子量介於10_15kDa之間，且為分子量非常相近的兩條帶(15%gel)(為不同程度的糖基化修飾形式)。15kDa GNLY的表達量明顯比9kDa GNLY要高，且各表達克隆之間的差異並不明顯。為了給發酵表達提供一些基本的發酵參數指導，本發明人先在搖瓶水平對GNLY表達條件進行了初步優化，首先選用不同pH值BMMY對GS115/9kDaGNLY-His進行誘導表達。由圖2B可知，在弱酸性環境下(pH4.0或pH5.0)，9kDa GNLY表達量較高。本發明人也檢測了溫度對9-kD GNLY誘導表達的影響，發現低溫會影響9kDa GNLY的表達，溫度適宜在25-30°C，如圖2C。最後，還檢測了誘導的甲醇濃度對9kDa GNLY表達的影響，提高誘導的甲醇濃度，有利於9kDa GNLY的表達，甲醇濃度適宜在l_2%(v/v)如圖2D。實施例3、GNLY中試規模的發酵表達本發明人採用分批補料培養(fed-batch cultivation)法培養表達菌GS115/9_kDGNLY-His，並進行了方法流程的優化。本發明人首先使用含有4%(v/v)甘油的基礎鹽培養基(pH5. 0)在batch階段擴增菌體(後續調節pH使之維持pH5. 0)，培養溫度30°C。等到DO急劇上升時(約培養22小時)，batch階段結束，菌體溼重達到118. 7g/L。隨後進入轉換期即甘油流加期(流加量是18. 15ml/hr/升，流加的甘油中，每升50%w/v甘油溶液含有12ml的PTMl，PTMl是一種酵母生長需要的微量元素鹽溶液，成分為硫酸銅_5H20 6. OgJft化鈉0. 08g,硫酸錳-H2O 3. Og,鑰酸鈉-2H20 0. 2g，硼酸0. 02g,氯化鈷0. 5g，氯化鋅20. Og,硫酸亞鐵_7H20 65. Og,生物素0. 2g，硫磺酸5. Oml)，經過約4個小時的生長菌體溼重進一步增加，達到186.6g/L。此時停止流加甘油，菌體呼吸活力下降，DO迅速上升；隨後開始進行甲醇誘導，菌體呼吸活力恢復，DO開始逐漸下降。在甲醇誘導階段，因為菌體對甲醇有一個適應階段(3-4小時)，因此需要逐步提高甲醇濃度，避免甲醇過量積累對菌體產生毒性。發酵結束之後，菌體溼重達到512. 4g/L。儘管菌體溼重在誘導過程中一直在增加，但是蛋白的表達量在培養80小時基本達到平衡，不再累計。因此，在此時結束髮酵比較適合。表達菌GS115/9kDa GNLY-His整個發酵過程中，各參數的變化情況如圖3A-C。表達菌GS115/15kDa GNLY-His 的發酵過程基本同表達菌 GSll5/9kDaGNLY_HiS。實施例4、GNLY純化與鑑定以9-kD GNLY純化為例，發酵結束之後，經過離心和澄清，用BCA測定發酵液中總蛋白含量為I. 6g/L，並通過SDS-PAGE估算9kDa GNLY的濃度超過100mg/L。

經過兩步純化(Ni柱純化和HiTrap CM FF柱純化)實際獲得9kDa GNLY56mg/L，15kDa GNLYc純化後可達130mg/L，且內毒素含量低於0. lEU/iig蛋白。由於GNLY帶有his-tag，因此，將發酵液直接上樣Ni柱。洗脫之後經SDS-PAGE，為緊密兩連的兩條帶。同時由於9kDa和15kDa GNLY的等電點比較高(>9. 3)，因此通過陽離子交換柱CM-FF純化之後，純度進一步提高，但是依然為兩條分子量很接近的條帶，如圖4A。本發明人在用CM-FF做進一步純化時發現，這兩條帶可以通過不同濃度的高鹽緩衝液進行分離，如圖4B。通過比較還原與非還原狀態下的9kDa和15kDa GNLY發現，這兩條帶並非因為分子內二硫鍵錯配產生的，如圖4C。經過ExPASy資料庫N-糖基化預測軟體分析，9kDa和15kDa GNLY均沒有N-糖基化位點。經過該資料庫0-glycosylation預測軟體YinOYangl. 2預測，15-kD GNLY有三個0-糖基化位點，如圖5A。因此提示上下兩條帶是不同程度的0-糖基化造成的。為了排除上下兩條帶可能是由於蛋白降解造成的這一因素，本發明人從SDS-PAGE中將這兩條帶分別切下，酶切消化後用LC-MS檢測。質譜結果顯示，上下兩條帶均是GNLY。搜索到的肽段對應15kDa GNLY全長蛋白的位置如圖5B所示。幸運的是，本發明人從上下兩條帶中均檢測到了重組GNLY首位的肽段，提示上下兩條帶並非由於蛋白降解造成的。同時，本發明人還發現，兩次質譜均未檢測到由87位-117位之間的胺基酸組成的肽段，而這一段正是潛在的0-糖基化位點存在的地方。這一結果進一步支持了了上下兩條帶是不同程度的0-糖基化造成的這一結論。實施例5、GNLY活性檢測為了檢測酵母表達的GNLY具有生物學活性，特別是9kDa GNLY具有廣譜的殺菌活性，本發明人分別選用了革蘭氏陰性的大腸桿菌XL-10和革蘭氏陽性金黃色葡萄球菌NCTC-8325作為靶細胞，通過CFU法檢測GNLY的抑菌活性。實驗結果顯示，9kDa GNLY在較低的濃度下就對於XL-10和NCTC-8325的生長顯示出很強抑制效果，並具有劑量依賴的關係(如圖6A),15kDa GNLY也顯示出了一定的抑菌能力。但是9kDa GNLY抑菌能力明顯強於15kDaGNLY，如圖6A和6B。進一步分析表明，9kDa GNLY的上下兩條條帶，即9kDa GNLY-上肽段和9kDa GNLY-下肽段這兩條帶所對應的蛋白在抑菌活性上無明顯區別(如圖6C)。討論重組9kDa GNLY有廣譜的抗菌活性，能夠殺死革蘭氏陰性菌、革蘭氏陽性、甚至可以在體外直接殺死結核分支桿菌。此外，GNLY還與腫瘤、瘧疾、麻風、移植、皮膚病和生殖併發症等有廣泛的臨床相關性。最近，還有一些研究使用GNLY作為佐劑經行疫苗研究和開發。越來越多的證據表明，GNLY是一個具有臨床應用潛力和開發價值的蛋白分子。本發明首次利用畢赤酵母表達系統成功地表達出了 9kDa GNLY和15kDa GNLY,並利用a-因子分泌肽，將GNLY分泌到培養上清中，便於後續的純化工作。搖瓶水平的表達條件優化顯示，GNLY在偏酸性培養基中表達量較高，可能與其在酸性環境下細菌裂解活性較低或酸性環境下中性蛋白酶活性較低有關。在發酵研究中，本發明人首先嘗試了一種簡單的發酵策略，即甘油培養階段和甲醇的恆定流速的誘導階段。整個發酵過程總體比較穩定，菌體溼重穩步增加，目的蛋白也在持續累積。由於本發明人手頭沒有抗GNLY的抗體， 因此為了方便前期篩選和鑑定工作，本發明人在蛋白的C端添加了 his-tag，也方便了純化工作。同時本發明人還利用GNLY等電點比較高的特點，在親和層析之後，通過陽離子交換柱進一步純化，純度可到95%以上(不區分上下兩條帶)，即使區分上下兩條帶也可達到90%以上純度。然而有文章報導，帶有his-tag可能會影響蛋白的活性，因此在某些的特殊情況下，本發明人完全可利用畢赤酵母表達系統製備不帶任何tag的重組GNLY,純化也比較簡單。活性實驗證實9kDa GNLY具有良好的抑菌活性，其對於革蘭氏陰性菌的殺傷能力強於革蘭氏陽性菌，可能與革蘭氏陽性菌具有莢膜有關，莢膜能一定程度上阻礙GNLY與細菌細胞膜接觸，降低GNLY對菌體的傷害。15kDa GNLY也顯示出一定的抑菌能力，但是明顯比9kDa GNLY要弱。這個結果與之前報導15kDa GNLY在體外沒有抑菌能力並不完全一致。已經證實，GNLY通過電荷作用結合到細菌細胞膜上，通過改變膜的通透性殺死細菌。因此，本發明人認為9kDa GNLY和15kDa GNLY都具有殺菌活性，只是15kDa GNLY殺菌活性明顯低於 9kDa GNLY。綜上所述，本發明人利用畢赤酵母表達系統，成功表達出了具有生物活性的GNLY。同時利用簡單穩健的發酵策略，可大量製備高純度、低內毒素的GNLY。為GNLY的科學研究和臨床應用奠定了堅實的基礎。在本發明提及的所有文獻都在本申請中引用作為參考，就如同每一篇文獻被單獨引用作為參考那樣。此外應理解，在閱讀了本發明的上述講授內容之後，本領域技術人員可以對本發明作各種改動或修改，這些等價形式同樣落於本申請所附權利要求書所限定的範圍。
權利要求
1.一種重組表達顆粒溶解素的方法，其特徵在於，所述方法包括 (1)提供表達載體，所述的表達載體中含有顆粒溶解素的表達盒； (2)將(I)的表達載體轉化畢赤酵母，培養轉化有所述表達載體的重組畢赤酵母，從而表達顆粒溶解素。
2.如權利要求I所述的方法，其特徵在於，所述的表達盒包括以下操作性連接的元件AOX I啟動子，釀酒酵母a-Factor信號肽編碼基因，顆粒溶解素，終止子。
3.如權利要求2所述的方法，其特徵在於，在釀酒酵母a-Factor信號肽編碼基因與顆粒溶解素基因之間，還包括蛋白酶酶切位點；或 在顆粒溶解素的基因與終止子之間，還包括蛋白純化標籤的編碼基因。
4.如權利要求2所述的方法，其特徵在於，所述的顆粒溶解素的基因具有SEQID NO: I或SEQ ID N0:2所示的核苷酸序列。
5.如權利要求I所述的方法，其特徵在於，步驟(2)中，表達顆粒溶解素時，調節培養基的pH在3. 0-8.0 ;和/或 調節溫度為10-32 °C。
6.如權利要求I所述的方法，其特徵在於，步驟(2)中，表達顆粒溶解素時，先以甘油為碳源進行重組畢赤酵母的培養，待重組畢赤酵母溼重超過150g/L時，加入甲醇進行誘導培養，整個培養過程持續60-100小時。
7.如權利要求6所述的方法，其特徵在於，步驟(2)中，表達顆粒溶解素時，首先使用含有按照質量體積比4%的甘油且pH5. 0的BSM培養基培養重組畢赤酵母菌體，培養溫度30°C;等到溶氧急劇上升時，進行甘油流加，待重組畢赤酵母溼重超過150g/L時停止流加甘油；隨後加入甲醇進行誘導培養。
8.如權利要求7所述的方法，其特徵在於，甘油的流加量是18±3ml/hr/升。
9.如權利要求I所述的方法，其特徵在於，在顆粒溶解素的表達盒中，所述的顆粒溶解素的基因還連接一純化標籤的編碼基因；且，步驟(2)之後，還包括從培養基中分離顆粒溶解素的步驟，包括先採用親和層析柱對培養上清進行純化；之後採用陽離子交換柱進行純化。
10.如權利要求9所述的方法，其特徵在於，所述的純化標籤是HIS標籤；所述的親和層析柱是Ni柱；所述的陽離子交換柱選自陽離子交換柱3、5 、011、麗(、&(11^1^。
全文摘要
本發明涉及顆粒溶解素的表達和製備方法。本發明人首次採用畢赤酵母來表達顆粒溶解素蛋白或蛋白片段，可實現蛋白的高表達，且良好地保留蛋白的生物活性。本發明解決了現有技術中難以高效表達顆粒溶解素蛋白的技術難題，為顆粒溶解素的生產提供了一種簡單而穩健的發酵工藝。
文檔編號C07K1/18GK102757977SQ20121025050
公開日2012年10月31日 申請日期2012年7月19日 優先權日2012年7月19日
發明者孫潔, 李光偉, 欒淦, 肖衛華, 郭雨剛, 鍾永軍 申請人:中國科學技術大學