Egfr外顯子19多態性檢測試驗用寡核苷酸及其用途的製作方法
2023-10-11 16:02:39
專利名稱：Egfr外顯子19多態性檢測試驗用寡核苷酸及其用途的製作方法
技術領域：
本發明涉及EGFR外顯子19多態性檢測試驗用寡核苷酸及其用途。
背景技術：
表皮生長因子受體(Epidermal Growth Factor Receptor EGFR)被認為在肺癌中起重要的作用，並且在肺癌治療領域中使用著以抑制EGFR的功能為目的的藥劑。作為這樣的藥劑，已知非小細胞肺癌患者的治療中使用的吉非替尼或厄洛替尼等EGFR酪氨酸激酶抑制劑，除肺癌之外正嘗試將這些藥劑應用於腺癌。但是，在某些範圍的患者中，有時不能充分獲得EGFR酪氨酸激酶抑制劑的效果。另外，在另一範圍的患者中，有時雖然對EGFR酪氨酸激酶抑制劑初期具有反應，但是隨後藥劑不能達到所期待的或者更好的效果。
因此，在使用EGFR酪氨酸激酶抑制劑時，為了預測其效果而嘗試探索了預測因素，並發現了 EGFR基因突變是重要的因素(非專利文獻1、2)。作為與藥劑的感受性相關的突變，例如，已知EGFR的第790位和第858位的取代突變、EGFR基因的外顯子19中的缺失突變等(非專利文獻1、2)。尤其是，所述EGFR基因的外顯子19中的缺失突變已知有在所述外顯子19中缺失連續數個鹼基 十幾個鹼基的多個突變型。另一方面，近年來，作為檢測基因多態性的檢測試驗，進行著利用熔解曲線分析(Tm分析)的檢測。在該方法中，在通過PCR法擴增含有突變的區域之後，使用被螢光染料標記了的核酸探針進行熔解曲線分析，並基於熔解曲線分析的結果來分析鹼基序列的突變(例如，參見專利文獻I)。另外，作為簡便且靈敏度和可靠性優良的多態性檢測方法，已知一種多態性檢測方法，包括在同一反應體系中使用突變型引物和野生型(正常型)引物來優先擴增含有突變型鹼基的核酸序列(參見專利文獻2)。現有技術文獻專利文獻專利文獻I :日本專利特開2002-119291號公報專利文獻2 :國際公開第2010/001969號小冊子非專利文獻非專利文獻I PLoS Medicine，2005 年，Vol. 2，No. 3，ρ· 225-235非專利文獻2 :Journal of Clinical Oncology, 2005 年，Vol. 23, No. 11，p. 2513-2520
發明內容
發明要解決的問題但是，EGFR外顯子19的突變中如上所述存在各種突變。因此，在使用針對每個突變的引物的檢測試驗中，需要在反應液中含有許多對突變型特異的引物。製作許多弓I物存在設計變複雜的可能性，另外，同時使用多個引物有可能導致PCR反應本身不能進行。另夕卜，在存在多個突變的情況下，若沒有含有充分比率的突變則有時無法檢測。因此，本發明的目的在於提供一種為了在檢測EGFR外顯子19的多態性的檢測試驗中簡便且靈敏度良好地檢測相應多態性而有用的多態性檢測試驗用寡核苷酸及其用途。解決問題的手段本發明為如下所述。[I] 一種EGFR外顯子19多態性檢測試驗用寡核苷酸，其為從包括下述(Pl)和(P』 )的組中選擇的至少一種寡核苷酸 (PD寡核苷酸，其3』末端側被進行了延長抑制處理，並且其相對於含有序列編號I所示的鹼基序列的至少第115位 第123位鹼基的鹼基長9 80的鹼基序列具有至少80%以上的同一'丨生；以及(ΡΓ )寡核苷酸，其3』末端側被進行了延長抑制處理，並且其與含有序列編號I所示的鹼基序列的至少第115位 第123位鹼基的鹼基長9 80的鹼基序列的互補鏈在嚴謹條件下雜交。[2]根據[I]所述的多態性檢測試驗用寡核苷酸，所述多態性檢測試驗用寡核苷酸為從包括能夠與EGFR外顯子19的鹼基序列雜交的下述(P2)和(P2』 )的組中選擇的至少一種寡核苷酸(P2)寡核苷酸，其3』末端側被進行了延長抑制處理，並且其相對於含有序列編號I所不的喊基序列的至少第104 123位喊基的喊基長20 80的喊基序列具有至少80%以上的同一性；以及(P2』 )寡核苷酸，其3』末端側被進行了延長抑制處理，並且其與含有序列編號I所示的鹼基序列的至少第104位 第123位鹼基的鹼基長20 80的鹼基序列的互補鏈在嚴謹條件下雜交。[3]根據[2]所述的多態性檢測試驗用寡核苷酸，其中，所述(P2)或(P2』 )的寡核苷酸在從5』末端起數第I 3位的位置具有與所述第104位的鹼基對應的鹼基。[4]根據[2]所述的多態性檢測試驗用寡核苷酸，其中，所述(P2)或(P2』 )寡核苷酸在5』末端具有與所述第104位的鹼基對應的鹼基。[5]根據[I] [4]中任一項所述的多態性檢測試驗用寡核苷酸，其中，所述多態性檢測試驗用寡核苷酸的鹼基長為25 50。[6]根據[I] [4]中任一項所述的多態性檢測試驗用寡核苷酸，其中，所述多態性檢測試驗用寡核苷酸的鹼基長為26 42。[7]根據[I] [6]中任一項所述的多態性檢測試驗用寡核苷酸，其中，所述3』末端側的延長抑制處理為磷酸基的添加。[8]根據[I] [7]中任一項所述的寡核苷酸，其中，所述多態性檢測試驗用寡核苷酸的鹼基序列上的鹼基用螢光染料標記。[9] 一種多態性檢測方法，用於檢測EGFR外顯子基因的多態性，包括使用至少一種[I] [8]中任一項所述的多態性檢測試驗用寡核苷酸來檢測EGFR外顯子19的多態性。[10]根據[9]所述的多態性檢測方法，包括準備可含有具有序列編號I所示的鹼基序列的單鏈核酸的核酸試樣；使所述多態性檢測試驗用寡核苷酸和所述單鏈核酸接觸，來獲得含有該多態性檢測試驗用寡核苷酸和該單鏈核酸並且該單鏈核酸的核酸擴增被抑制的雜交體；以及對該多態性檢測試驗用寡核苷酸和該單鏈核酸接觸時或者接觸後的所述核酸試樣進行核酸擴增。[11]根據[10]所述的多態性檢測方法，其中，在能夠與含有作為靶標的EGFR外顯子19的多態性位點的核酸雜交的探針的存在下進行所述核酸擴增。[12]根據[11]所述的多態性檢測方法，其中，所述探針相對於所述多態性檢測試驗用寡核苷酸的鹼基序列具有45%以上的同一性。[13]根據[11]或12所述的多態性檢測方法，其中，所述探針是在未與靶標序列雜交時發出螢光而與該靶標序列雜交時螢光強度減少的探針。[14] 一種EGFR酪氨酸激酶抑制劑的藥效判定方法，包括通過[9] [13]中任一項所述的多態性檢測方法來檢測EGFR外顯子19中的多態性；以及基於所述檢測結果來判定對EGFR酪氨酸激酶抑制劑的耐受性或EGFR酪氨酸激酶抑制劑的藥效。 [15] 一種EGFR多態性檢測試驗用試劑盒，包含至少一種[I] [8]中任一項所述的多態性檢測試驗用寡核苷酸。[16]根據[15]所述的EGFR多態性檢測試驗用試劑盒，還包含能夠與含有作為靶標的EGFR外顯子19的多態性位點的核酸序列雜交的探針。[17]根據[16]所述的EGFR多態性檢測試驗用試劑盒，其中，所述探針相對於所述多態性檢測試驗用寡核苷酸的鹼基序列具有45%以上的同一性。[18]根據[15] [17]中任一項所述的EGFR多態性檢測試驗用試劑盒，還包含能夠擴增含有作為所述靶標的EGFR外顯子19多態性位點的核酸序列的引物對。發明效果通過本發明，能夠提供為了在檢測EGFR外顯子19的多態性的檢測試驗中簡便且靈敏度良好地檢測相應多態性而有用的多態性檢測試驗用寡核苷酸及其用途。
圖I的(A)為核酸混合物的熔解曲線的示例，圖I的(B)為微分熔解曲線的示例；圖2的⑷ ⑶為本發明實施例I涉及的試樣的熔解曲線；圖3的(A) ⑶為本發明實施例2涉及的試樣的熔解曲線；圖4的⑷ ⑶為本發明實施例3涉及的試樣的熔解曲線；圖5的㈧ ⑶為本發明比較例I涉及的試樣的熔解曲線；圖6的㈧和⑶為本發明比較例2涉及的試樣的熔解曲線；圖7的⑷ ⑶為本發明比較例3涉及的試樣的熔解曲線；圖8的㈧和⑶為本發明比較例4涉及的試樣的熔解曲線；圖9的⑷ (E)為本發明實施例4涉及的試樣A E的熔解曲線；圖10的(A) (E)為本發明實施例4涉及的試樣F J的熔解曲線；圖11的(A) (E)為本發明的實施例5和比較例5涉及的試樣5_1 5_5的熔解曲線。
具體實施方式
本發明涉及的EGFR外顯子19多態性檢測試驗用寡核苷酸(以下有時僅稱為「多態性檢測試驗用寡核苷酸」)是一種寡核苷酸，其3』末端側被進行了延長抑制處理，並且是相對於含有序列編號I所不的喊基序列的至少第115位 第123位喊基的喊基長9 80的鹼基序列具有相同的鹼基長並且同源的序列，即是從包括下述(PD和(P』 )的組中選擇的至少一種EGFR外顯子19多態性檢測試驗用寡核苷酸。(Pl)寡核苷酸，其3』末端側被進行了延長抑制處理，並且相對於含有序列編號I所不的喊基序列的至少第115位 第123位喊基的喊基長9 80的喊基序列具有至少80 %以上的同一'I"生; (ΡΓ )寡核苷酸，其3』末端側被進行了延長抑制處理，並且與含有序列編號I所示的鹼基序列的至少第115位 第123位鹼基的鹼基長9 80的鹼基序列的互補鏈在嚴謹條件下雜交。本發明涉及的多態性檢測試驗用試劑盒包含所述EGFR外顯子19多態性檢測試驗
用寡核苷酸。本發明涉及的EGFR基因多態性檢測方法包括使用至少一種所述EGFR外顯子19多態性檢測試驗用寡核苷酸來檢測EGFR外顯子19的多態性。本發明涉及的EGFR酪氨酸激酶抑制劑的藥效判定方法包括通過所述EGFR外顯子19多態性檢測方法來檢測EGFR基因中的多態性；以及基於所述檢測結果來判定對EGFR酪氨酸激酶抑制劑的耐受性或EGFR酪氨酸激酶抑制劑的藥效。通過本發明，具有相對於序列編號I所示的EGFR基因的特定的一部分具有相同的鹼基長並且同源的鹼基序列、即具有至少80%以上的同一性和/或可與該特定的一部分鹼基序列的互補鏈在嚴謹條件下雜交的序列、並且3』末端側被進行了延長抑制處理的寡核苷酸，由於與可含有多態性的野生型EGFR外顯子19的鹼基序列的該一部分具有高親和性，因此比突變型EGFR外顯子19的核酸更優先並且牢固地與野生型EGFR外顯子19的核酸雜交。另外，所述多態性檢測試驗用寡核苷酸由於3』末端側進行了延長抑制處理，因此在與野生型EGFR基因的核酸雜交之後，即使應用DNA聚合酶也不延長。所述多態性檢測試驗用寡核苷酸為優選用於EGFR外顯子19多態性檢測試驗的寡核苷酸。在將所述多態性檢測試驗用寡核苷酸用於EGFR基因多態性檢測試驗的情況下，所述多態性檢測試驗用寡核苷酸由於與其類似性高而與野生型EGFR基因核酸雜交。當在雜交了的野生型EGFR基因核酸和與該雜交了的區域對應的區域內含有缺失或單核苷酸多態性的突變型(多態性)EGFR基因核酸混合存在的環境下進行了核酸擴增等處理時，野生型基因的核酸序列的擴增由於多態性檢測試驗用寡核苷酸的存在而被抑制。另一方面，由於多態性檢測試驗用寡核苷酸不與突變型EGFR基因的核酸序列雜交，因此突變型EGFR基因的核酸擴增不被抑制，突變型EGFR基因的核酸序列優先擴增。結果，試樣中比起野生型EGFR基因的核酸序列存在更多的突變型EGFR基因的核酸序列，從而能夠高靈敏度地檢測EGFR外顯子19的多態性。可與所述多態性檢測試驗用寡核苷酸雜交的野生型EGFR基因核酸是具有序列編號I所示的鹼基序列的互補序列的核酸。另外，通過本發明，由於如此能夠簡便且高靈敏度地檢測EGFR外顯子19的多態性，因此能夠簡便且高靈敏度地判定基於EGFR外顯子19多態性的、對EGFR酪氨酸激酶抑制劑的耐受性或EGFR酪氨酸激酶抑制劑的藥效。
本發明的「EGFR基因」具體是指EGFR外顯子19。本發明中的EGFR外顯子19是已公知的，其鹼基序列是指NCBI登錄號No. NT_033968 (版本NT_033968. 6)的4831717 4832003的序列。序列編號I的鹼基序列相應於EGFR外顯子19的核酸的鹼基序列的一部分。在本說明書中，特別將可與所述多態性檢測試驗用寡核苷酸雜交的野生型EGFR基因的鹼基序列的區域稱為「擴增抑制靶標區域」。在本說明書中，作為檢測對象的EGFR基因的多態性中，包括在野生型EGFR基因的對應序列中缺失了由多個連續的鹼基構成的區域的多態性，只要可以檢測，也可以包括缺失一個鹼基的多態性、鹼基連續一個或者兩個以上被其他的鹼基取代的多態性。此外，本發明中的作為檢測對象的EGFR基因的多態性只要其一部分中含有擴增抑制靶標區域，也可以同時含有兩個以上的多態性。在本發明中，「多態性檢測試驗」是指為了檢測特定的基因多態性而被使用的試驗，不拘泥於試驗、測定、檢測方法、評價方法、判定方法等表述，意指判定核酸試樣中的核 酸中是否含有具有多態性的突變型的一切行為。在本發明中，關於作為檢測對象的試樣中的試樣核酸、多態性檢測試驗用寡核苷酸、引物或者探針的每個的序列，基於它們的相互互補的關系所描述的事項，只要不特別指出，也適用於各個序列和相對於各序列互補的序列。在將本發明的事項適用於相對於各序列互補的該序列時，在本領域技術人員的技術常識的範圍內，由該互補的序列識別的序列，視為將說明書全體替換為與對應的本說明書中記載的序列互補的序列。在本說明書中，「模板核酸序列」意指在進行核酸擴增時被弓I物識別為模板並退火的鹼基序列。在本發明中，「Tm值」是指雙鏈核酸解離的溫度(解離溫度Tm)，一般定義為260nm處的吸光度達到吸光度總上升量的50%時的溫度。即，當加熱含有雙鏈核酸(例如雙鏈核酸DNA)的溶液時，260nm處的吸光度上升。這是因為雙鏈核酸DNA中的兩條雙鏈之間的氫鍵由於加熱而斷裂，解離成單鏈DNA (DNA的熔解)。並且，全部雙鏈核酸DNA解離成單鏈DNA時，其吸光度顯示為加熱開始時的吸光度(僅雙鏈核酸DNA的吸光度)的約I. 5倍左右，由此可以判斷熔解完成。Tm值基於該現象而設定。本發明中的Tm值只要不特別指出，均是指吸光度達到吸光度總上升量的50%時的溫度。在本發明中，關於寡核苷酸的序列，當稱為「從3』末端起數第I 3位」時是以寡核苷酸鏈的3』末端為第I位起數的。同樣地，當稱為「從5』末端起數第I 3位」時是以寡核苷酸鏈的5』末端為第I位數的。本說明書中「步驟」 一詞，不僅包含獨立的步驟，而且例如在不能與其他的步驟明確區別的情況下，只要達到了本步驟預期的效果，則包含在本術語之內。另外，在本說明書中，使用「 」表示的數值範圍表示分別包含「 」的前後記載的數值作為最小值和最大值的範圍。另外，在本發明中，組成物中的各成分的量，在所述組成物中存在多種相當於各成分的物質的情況下，只要不特別指出，是指組成物中存在的該多種物質的合計量。下面說明本發明。〈多態性檢測試驗用寡核苷酸〉
所述多態性檢測試驗用寡核苷酸是一種EGFR外顯子19多態性檢測試驗用寡核苷酸，其為從包括下述(Pl)和(P』 )的組中選擇的至少一種寡核苷酸(PD寡核苷酸，其3』末端側被進行了延長抑制處理，並且其相對於含有序列編號I所示的鹼基序列的至少第115位 第123位鹼基的鹼基長9 80的鹼基序列具有至少80%以上的同一性；(ΡΓ )寡核苷酸，其3』末端側被進行了延長抑制處理，並且其與含有序列編號I所示的鹼基序列的至少第115位 第123位鹼基的鹼基長9 80的鹼基序列的互補鏈在嚴謹條件下雜交。所述多態性檢測試驗用寡核苷酸需要是與含有序列編號I所示的鹼基序列的至少第115 123位鹼基的預定區域的鹼基序列具有至少80%以上的同一性、或者與該預定區域的鹼基序列的互補鏈在嚴謹條件下雜交的序列。通過含有第115位 第123位的鹼基，例如能夠高靈敏度地檢測具有在序列編號I所示的鹼基序列的第115位或其之後缺失一個或多個鹼基的多態性。此外，序列編號I所示的第115位的鹼基對應於EGFR外顯子19的 第744位的密碼子的3』側的鹼基。所述Pl寡核苷酸的相對於所述預定區域的鹼基序列的同一性需要是至少80%以上。另外，從檢測靈敏度的觀點來說，可以為85%以上、可以為90%以上、可以為95%以上、另外可以為96%以上、可以為97%以上、可以為98%以上、可以為99%以上。所述ΡΓ寡核苷酸為與所述序列編號I所示的鹼基序列中的所述預定區域的鹼基序列的互補鏈在嚴謹條件下雜交的序列。雜交可以根據公知的方法或者基於公知方法的方法，例如Molecular Cloning3rd (J. Sambrook et al. , Cold Spring Harbor Lab. Press, 2001)中記載的方法等來進行。該文獻通過參考被併入本說明書中。嚴謹條件是指形成特異性雜交體但不形成非特異性雜交體的條件。典型的嚴謹條件例如可以舉出在鉀濃度約25mM 約50mM以及鎂濃度約I. OmM 約5. OmM中進行雜交的條件。作為本發明的條件的示例，可以舉出在Tris-HCl (pH8. 6)、25mM的KCl以及I. 5mM的MgCl2下進行雜交的條件,但不限於此。此外，嚴謹條件被記載在Molecular Cloning3rd (J. Sambrook et al. , Cold Spring Harbor Lab. Press, 2001)中。該文獻通過參考被併入本說明書中。本領域技術人員可以通過改變雜交反應、雜交反應液的鹽濃度等來容易地選擇上述條件。另外，本發明中的所述Pl或所述ΡΓ寡核苷酸還包括在所述Pi或所述ΡΓ寡核苷酸被插入、缺失或者取代了 I個或2個以上的鹼基的寡核苷酸。所述被插入、缺失或者取代了鹼基的多態性檢測試驗用寡核苷酸只要顯示出與所述Pl或所述ΡΓ寡核苷酸同等程度的作用即可，在插入、缺失或取代了 I個或2個以上的鹼基的情況下，該插入、缺失或取代的位置無特別限定。作為插入、缺失或者取代的鹼基的數量可以舉出I個鹼基或2個鹼基以上，所述鹼基的數量根據多態性檢測試驗用寡核苷酸總體的長度而不同，例如可以為I個鹼基 10個鹼基、或者I個鹼基 5個鹼基、或者I個鹼基 3個鹼基。所述多態性檢測試驗用寡核苷酸所具有的鹼基序列的第I位鹼基的位置不限於序列編號I的第115位的位置，例如既可以是序列編號I所示的鹼基序列的第60位 第115位的任何鹼基，也可以是第100位 第110位的任何鹼基，也可以是第102位 第106位的任何鹼基。所述多態性檢測試驗用寡核苷酸的鹼基長需要為與含有所述序列編號I所示的鹼基序列的至少第115位 第123位鹼基的鹼基長9mer 80mer的鹼基序列相同的9mer 80mer。在所述多態性檢測試驗用寡核苷酸的鹼基長為8mer以下或81mer以上時，不能期待目標的檢測靈敏度。多態性檢測試驗用寡核苷酸的鹼基長可以設為20mer 80mer,也可以設為IOmer 70mer,也可設為25mer 50mer,也可以設為26mer 42mer。鹼基長較短的多態性檢測試驗用寡核苷酸例如具有更可靠地抑制野生型核酸的核酸擴增從而檢測靈敏度變高的傾向。作為這樣的多態性檢測試驗 用寡核苷酸，例如可以為以序列編號I所示的鹼基序列的第60 115位的任一鹼基為第I位鹼基的IOmer 80mer的寡核苷酸,也可以為以第100 第110位的任一鹼基為第I位鹼基的25mer 50mer的寡核苷酸,也可以為以第102 第106位的任一鹼基為第I位鹼基的26mer 42mer的寡核苷酸。這種寡核苷酸例如具有更可靠地抑制野生型核酸的核酸擴增從而檢測靈敏度變高的傾向。作為這種多態性檢測試驗用寡核苷酸，例如可以舉出從包括下述(P2)和(P2』)的組中選擇的至少一種寡核苷酸。(P2)寡核苷酸，其3』末端側被進行了延長抑制處理，並且其相對於含有序列編號I所不的喊基序列的至少第104 123位喊基的喊基長20 80的喊基序列具有至少80%以上的同一'I"生;(P2』 )寡核苷酸，其3』末端側被進行了延長抑制處理，並且其與含有序列編號I所示的鹼基序列的至少第104位 第123位鹼基的鹼基長20 80的鹼基序列的互補鏈在嚴謹條件下雜交。如果所述P2或P2』寡核苷酸為含有序列編號I所示的鹼基序列的第104位 第123位鹼基的鹼基長20mer 80mer的鹼基序列，則P2或P2』寡核苷酸的第I位的鹼基可以是與序列編號I所示的鹼基序列的任何鹼基對應的鹼基。例如，P2或P2』寡核苷酸可以在從P2或P2』寡核苷酸的5』末端起數第I 3位的位置具有所述第104位的鹼基，也可以是5』末端側、即P2或P2』寡核苷酸的第I位的鹼基為所述第104位的鹼基。在從3』末端起第I 3位、尤其是在3』末端側具有所述第104位鹼基的寡核苷酸例如具有能夠更可靠地抑制野生型核酸的核酸擴增的傾向。所述P2』寡核苷酸中的嚴謹條件與所述ΡΓ寡核苷酸中的嚴謹條件相同。另外，本發明中的所述P2或所述P2』寡核苷酸中還包含所述P2或所述P2』寡核苷酸被插入、缺失或者取代了 I個或多個鹼基的寡核苷酸。所述P2或所述P2』寡核苷酸的鹼基序列中插入、缺失或取代的I個或2個以上的鹼基與所述Pl和P I』寡核苷酸的鹼基序列中插入、缺失或取代的I個或2個以上的鹼基相同。所述多態性檢測試驗用寡核苷酸還可以以檢測多態性檢測試驗用寡核苷酸或其互補鏈等為目的而被標記。作為多態性檢測試驗用寡核苷酸上附加的標記物質一般可以舉出螢光染料和螢光團等。標記物質一般被附加在寡核苷酸的鹼基上，但不限於此。附加了所述標記物質的鹼基只要是多態性檢測試驗用寡核苷酸的任意鹼基即可，可以是任何位置。通過將多態性檢測試驗用寡核苷酸的任何位置的鹼基作為用螢光染料標記的鹼基，具有可以有效地檢測有沒有與多態性檢測試驗用寡核苷酸雜交的核酸等的優點。所述多態性檢測試驗用寡核苷酸的3』末端側需要被進行延長抑制處理。這裡，「延長」是指由使用了 DNA聚合酶或RNA聚合酶等酶的核酸擴增處理引起的核苷酸鏈的延長。延長抑制處理只要是抑制了從寡核苷酸鏈的5』末端向3』末端的延長的處理則無特別限制，例如可以舉出對寡核苷酸鏈的3』末端側的核酸添加取代基或化合物。作為這種為抑制延長而添加的取代基的例子，可以舉出磷酸基、ddNTP基等，作為為抑制延長而添加的化合物的例子，可以舉出螢光染料、2』，3』 ddA、2』，3』 ddC、2』，3』 ddG、2』，3』ddT等。作為寡核苷酸鏈的延長抑制處理，例如從可靠地抑制延長等觀點來說，可以是對3』末端側的核酸添加磷酸基的處理。被添加所述取代基或化合物的核酸的位置根據核酸的延長中所用的手段而不同，在使用DNA聚合酶或RNA聚合酶的情況下，可以為(脫氧)核糖的3位，但不限於此。 另外，所述多態性檢測試驗用寡核苷酸也可以含有用螢光染料標記的鹼基作為鹼基序列上的喊基。作為所述螢光染料無特別限制，例如可以舉出螢光素、磷光體、羅丹明、聚甲炔染料衍生物等，作為市售的螢光染料例如可舉出Pacific Blue、BODIPY FL、FluorePrime、Fluoredite、FAM> Cy3 和 Cy5、TAMRA 等。本發明涉及的多態性檢測試驗用寡核苷酸的示例如下所示。表中的「(P)」表示磷酸基。在序列編號I所示的鹼基序列中，Cmp-I為從第104位鹼基起40mer的寡核苷酸，Cmp-2為從第104位鹼基起29mer的寡核苷酸，Cmp_3為從第115位鹼基起28mer的寡核苷酸,Cmp-4為第89位鹼基起49mer的寡核苷酸,Cmp-5為第79位鹼基起47mer的寡核苷酸，Cmp-6為從第107位鹼基起36mer的寡核苷酸,Cmp-7為第104位鹼基起20mer的寡核苷酸，Cmp-8為從第104位鹼基起80mer的寡核苷酸，Cmp-9為從第63位鹼基起80mer的寡核苷酸，Cmp-IO為從第105位鹼基起39mer的寡核苷酸，Cmp-Il為從第106位鹼基起38mer長的寡核苷酸，Cmp-12為從第111位鹼基起33mer的寡核苷酸，Cmp-13為從第115位鹼基起29mer的寡核苷酸，Cmp-14第115位鹼基起IOmer的寡核苷酸，Cmp-15為第106位鹼基起78mer長的寡核苷酸。表I
權利要求
1.一種EGFR外顯子19多態性檢測試驗用寡核苷酸，其為從包括下述(Pl)和(P』)的組中選擇的至少一種寡核苷酸 (PD寡核苷酸，其3』末端側被進行了延長抑制處理，並且其相對於含有序列編號I所不的喊基序列的至少第115位 第123位喊基的喊基長9 80的喊基序列具有至少80%以上的同一性；以及 (Pr )寡核苷酸，其3』末端側被進行了延長抑制處理，並且其與含有序列編號I所示的鹼基序列的至少第115位 第123位鹼基的鹼基長9 80的鹼基序列的互補鏈在嚴謹條件下雜交。
2.根據權利要求I所述的多態性檢測試驗用寡核苷酸，所述多態性檢測試驗用寡核苷酸為從包括下述(P2)和(P2』 )的組中選擇的至少一種寡核苷酸 (P2)寡核苷酸，其3』末端側被進行了延長抑制處理，並且其相對於含有序列編號I所不的喊基序列的至少第104 123位喊基的喊基長20 80的喊基序列具有至少80%以上的同一性；以及 (P2』 )寡核苷酸，其3』末端側被進行了延長抑制處理，並且其與含有序列編號I所示的鹼基序列的至少第104位 第123位鹼基的鹼基長20 80的鹼基序列的互補鏈在嚴謹條件下雜交。
3.根據權利要求2所述的多態性檢測試驗用寡核苷酸，其中，所述(P2)或(P2』)的寡核苷酸在從5』末端起數第I 3位的位置具有與所述第104位的鹼基對應的鹼基。
4.根據權利要求2所述的多態性檢測試驗用寡核苷酸，其中，所述(P2)或(P2』)寡核苷酸在5』末端具有與所述第104位的鹼基對應的鹼基。
5.根據權利要求I至4中任一項所述的多態性檢測試驗用寡核苷酸，其中，所述多態性檢測試驗用寡核苷酸的鹼基長為25 50。
6.根據權利要求I至4中任一項所述的多態性檢測試驗用寡核苷酸，其中，所述多態性檢測試驗用寡核苷酸的鹼基長為26 42。
7.根據權利要求I至6中任一項所述的多態性檢測試驗用寡核苷酸，其中，所述3』末端側的延長抑制處理為磷酸基的添加。
8.根據權利要求I至7中任一項所述的多態性檢測試驗用寡核苷酸，其中，所述多態性檢測試驗用寡核苷酸的鹼基序列上的鹼基用螢光染料標記。
9.一種多態性檢測方法，用於檢測EGFR外顯子基因的多態性，包括使用至少一種權利要求I至8中任一項所述的多態性檢測試驗用寡核苷酸來檢測EGFR外顯子19的多態性。
10.根據權利要求9所述的多態性檢測方法，包括 準備可能包含具有序列編號I所示的鹼基序列的單鏈核酸的核酸試樣； 使所述多態性檢測試驗用寡核苷酸和所述單鏈核酸接觸，來獲得含有該多態性檢測試驗用寡核苷酸和該單鏈核酸並且該單鏈核酸的核酸擴增被抑制的雜交體；以及 對該多態性檢測試驗用寡核苷酸和該單鏈核酸接觸時或者接觸後的所述核酸試樣進行核酸擴增。
11.根據權利要求10所述的多態性檢測方法，其中，在能夠與含有作為靶標的EGFR外顯子19的多態性位點的核酸雜交的探針的存在下進行所述核酸擴增。
12.根據權利要求11所述的多態性檢測方法，其中，所述探針相對於所述多態性檢測試驗用寡核苷酸的鹼基序列具有45%以上的同一性。
13.根據權利要求11或12所述的多態性檢測方法，其中，所述探針是在未與靶標序列雜交時發出螢光而與該靶標序列雜交時螢光強度減少的探針。
14.一種EGFR酪氨酸激酶抑制劑的藥效判定方法，包括 通過權利要求9至13中任一項所述的多態性檢測方法來檢測EGFR外顯子19中的多態性；以及 基於所述檢測結果來判定對EGFR酪氨酸激酶抑制劑的耐受性或EGFR酪氨酸激酶抑制劑的藥效。
15.一種EGFR多態性檢測試驗用試劑盒，包含至少一種權利要求I至8中任一項所述的多態性檢測試驗用寡核苷酸。
16.根據權利要求15所述的EGFR多態性檢測試驗用試劑盒，還包含能夠與含有作為靶標的EGFR外顯子19的多態性位點的核酸序列雜交的探針。
17.根據權利要求16所述的EGFR多態性檢測試驗用試劑盒，其中，所述探針相對於所述多態性檢測試驗用寡核苷酸的鹼基序列具有45%以上的同一性。
18.根據權利要求15至17中任一項所述的EGFR多態性檢測試驗用試劑盒，還包含能夠擴增含有作為所述靶標的EGFR外顯子19多態性位點的核酸序列的引物對。
全文摘要
本發明提供EGFR外顯子19多態性檢測試驗用寡核苷酸及其用途，所述EGFR外顯子19多態性檢測試驗用寡核苷酸能夠簡便且高靈敏度地檢測EGFR外顯子19的多態性。一種作為下述(P1)或(P1』)的EGFR外顯子19多態性檢測試驗用寡核苷酸及其用途(P1)寡核苷酸，其3』末端側被進行了延長抑制處理，並且其相對於含有序列編號1所示的鹼基序列的至少第115位～第123位鹼基的鹼基長9～80的鹼基序列具有至少80％以上的同一性；(P1』)寡核苷酸，其3』末端側被進行了延長抑制處理，並且其與含有序列編號1所示的鹼基序列的至少第115位～第123位鹼基的鹼基長9～80的鹼基序列的互補鏈在嚴謹條件下雜交。
文檔編號G01N21/64GK102776276SQ20121013700
公開日2012年11月14日 申請日期2012年5月2日 優先權日2011年5月6日
發明者井口亞希 申請人:愛科來株式會社