一種河魨毒素陽性質控樣品及其製備方法和應用的製作方法
2023-10-11 09:47:19
一種河魨毒素陽性質控樣品及其製備方法和應用的製作方法
【專利摘要】本發明公開了一種河魨毒素陽性質控樣品的製備方法，步驟為將鮮紅鰭東方魨取肌肉組織後均質，測定其中河魨毒素的含量，驗證是否含有河魨毒素，若為陽性樣品，將含有毒素的陽性樣品用陰性樣品和分散劑稀釋混勻，繼續測定其中毒素的含量，達到要求後，將樣品分裝，適當溫度下保存，對樣品進行均勻性驗證和穩定性分析；若為陰性樣品，將河魨毒素標準溶液添加到陰性樣品中，加入分散劑混勻，測定其中河魨毒素的含量，達到要求後，將樣品分裝，適當溫度下保存，對樣品進行均勻性驗證和穩定性分析。本發明所述的質控樣品製備簡單，具有足夠的穩定性和均勻性；保存時間長，可用於實驗室質量控制。
【專利說明】一種河鈍毒素陽性質控樣品及其製備方法和應用
【技術領域】
[0001]本發明涉及一種河飩毒素(TetiOdotoxin，TTX)陽性質控樣品及其製備方法，屬於食品安全檢測【技術領域】。
【背景技術】
[0002]東方飩(包括紅鰭東方飩(Fugu rubripes)和暗紋東方飩(Fugu obscurus)等)是目前大規模人工養殖飩類魚種，魚肉中的蛋白和脂類含量豐富，去毒處理後即為珍貴的美味佳餚。為了監測不同季節河飩魚毒性，快速、準確地測定河飩魚組織中TTX含量，區分有毒河飩和無毒河飩,實時了解常見河飩魚的毒性差異及變化情況,十分必要建立一種快速便捷、靈敏度高、可操作性強的TTX檢測方法，而製備實用的河飩毒素陽性質控樣品，可在TTX檢測過程中與實際樣品同時檢測，以衡量河飩魚基質中河飩毒素檢測結果的可靠性，對提高河飩魚的食用安全性以便打開國內外河飩魚市場具有重要意義；也為食品安全、環境監測、衛生檢驗檢疫等方面的測量和研究工作提供技術支撐和量值溯源保障。
[0003]河飩魚肉味鮮美，營養豐富，生食、烹調、加工皆宜，但由於含有劇毒的河飩毒素(Tetrodotoxin, TTX)，至今不能成為大眾餐桌上的食品。河飩毒，即河飩體內含有的一種劇毒神經性毒素，亦存在於蠑螈、斑足蟾以及腹足類動物體內，是目前自然界中發現的最毒非蛋白物質之一，其毒性相當於劇毒藥品氰化鉀的1250倍，只需0.48mg即能致人死命，與石房蛤毒素、肉毒魚毒素合稱海洋三大公害毒素。隨著漁業的發展，近年來河飩魚中毒事件的屢見報端。在日本、中國大陸、臺灣省和一些東南亞國家食用河飩魚和腹足類動物的中毒事件時有發生，在中國尤其是食用小型腹足類動物織紋螺等中毒事件多有報導，並導致多人死亡而成為嚴重的公共衛生問題(P.A.Hwang et al，2007)。歐盟法規《Regulation853/2004/EC》和《Regulation854/2004/EC》規定有毒的河飩魚及類似品種禁止在歐盟市場銷售。
[0004]陽性質控樣品是一種與待測樣料相同或相似的，但帶有溯源性確認並具有規定測量不確定度標準值的材料，在貯存量值和傳遞量值方面具有實物量具的特性。因而陽性質控樣品對於保證檢測結果的可靠性和有效性，保證檢測標準在實驗室間得到有效實施具有重要作用。
[0005]目前已有河飩毒素標準物質，例如國家海洋局第三研究所研製的河飩毒素標準樣品(實為不含河純魚組織基質的提純標準品)，但河純毒素的基質標準樣品尚未見研究製備的報導，
[0006]由於河飩毒素的性質微溶於水(含在臟器中的毒素能溶於水)、乙醇，濃酸，易溶於稀酸，不溶於任何中性有機溶劑，包括乙醚、甲醇、乙醇、丙酮、N，N』-二甲基甲醯胺、二甲亞碸、苯、氯仿和乙腈等。這種不易溶於任何一種中性有機溶劑的物理化學特性，以及河飩魚組織複雜的基質效應的存在，使得河飩毒素的定量測定一直是食品檢測、生態學以及醫學研究領域的一個挑戰。為保證檢測結果的可靠性和有效性，目前亟待基體TTX陽性質控樣品的研製。
【發明內容】
[0007]本發明所要解決的技術問題是:提供一種基體TTX陽性質控樣品，所述的質控樣品具有足夠的穩定性和均勻性。
[0008]為解決上述技術問題，本發明採用的技術方案是:
[0009]本發明提供一種河飩毒素陽性質控樣品的製備方法，包括陽性樣品稀釋和陰性樣品標準物質添加兩種方案，包括下列步驟:將鮮紅鰭東方飩取肌肉組織後均質，測定其中河飩毒素的含量，驗證是否含有河飩毒素，若為陽性樣品，將含有毒素的陽性樣品用陰性樣品和分散劑稀釋混勻，繼續測定其中毒素的含量，達到標識含量要求後，將樣品分裝，適當溫度下保存，對樣品進行均勻性驗證和穩定性分析；若為陰性樣品，將河飩毒素標準溶液添加到陰性樣品中，加入分散劑混勻，測定其中河飩毒素的含量，達到要求後，將樣品分裝，適當溫度下保存，對樣品進行均勻性驗證和穩定性分析。
[0010]上述所述的河飩毒素陽性質控樣品的製備方法，具體包括下列步驟:
[0011](I)取鮮紅鰭東方飩取肌肉組織，均質機均質，均質過程中壓強為25-35Mpa，均質時間採用梯度時間法，共均質三次，每次的時間分別為15-20min、10-15min、5-10min ；
[0012](2)將均質好的樣品進行毒素測定，採用常規方法測定即可，根據是否含有毒素，製備方法分為陽性樣品稀釋和陰性樣品標準添加兩種；
[0013]1.陽性樣品稀釋:將含有毒素的陽性樣品用陰性樣品和分散劑稀釋混勻，分散劑重量佔陽性樣品和陰性樣品總重量的8-12%，稀釋混勻採用分步稀釋法，將陰性樣品和分散劑平均分成3-5份，加入一份陰性樣品和分散劑後均質一次，每次均質時間為3-5min ；
[0014]2.陰性樣品標準添加:將河飩毒素標準溶液添加到經測定不含河飩毒素的鮮紅鰭東方飩肌肉組織中，然後平均分3-5次加入分散劑混勻，每加一次分散劑均質一次，每次均質時間為3-5min，加入分散劑的總量佔陰性樣品總量的8-12%。
[0015](3)測定步驟(2)中樣品的毒素含量；
[0016](4)毒素含量達到標識含量要求後，將樣品分裝，適當溫度保存，對樣品進行均勻性驗證和穩定性分析。
[0017]優選的，步驟⑴中，肌肉組織在均質機中均質之前，將肌肉組織加熱到40_50°C，均質時均質溫度控制在30-40°C。肌肉組織在均質機中均質之前加熱和均質過程中保持一定溫度，可以更好的將毒素溶出。
[0018]所述分散劑為C18，石墨化碳、白炭黑、硅藻土中的一種或二種的組合。加入分散劑可有利於降低樣品基質粘度，便於TTX毒素均勻分散在基質中，使樣品穩定；也與樣品檢測過程中前處理過程保持一致，在樣品測定過程中具有吸附雜質，淨化提取液的特點。(作用原理GCB表面的碳原子之間皆為SP2雜化，有單電子對和活潑離子，並具有六邊形的微觀結構，使得它對於平面分子或者含有平面芳香環的分子具有強烈的吸附作用，能去除具有共軛結構的苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸和組氨酸等雜質；GCB表面總體表現為憎水性，可吸附非極性與弱極性化合物；其次表面存在一些極性位點使它能夠作為離子交換劑或吸附極性化合物，在本實驗的提取條件下可吸附河飩魚風味成分穀氨酸、精氨酸、天門冬酸等，表現為廣譜的吸附性能；C18也是一種非極性廣譜性淨化劑，能夠有效吸附提取非極性雜質；而硅藻土則具有篩分作用、深層過濾和通過分子間力(範德華力)、Zeta電位和離子交換作用達到吸附雜質的效果。)
[0019]優選的，步驟(4)毒素含量達到標識含量要求後，可繼續將樣品冷凍乾燥或烘乾，做成粉狀或溼粉狀或漿狀。
[0020]毒素的標識含量可標識為:1?10μ g/kg多個含量系列；樣品量分別相當於Ig樣品、2g樣品、3g樣品、4g樣品、5g樣品等，以便於與實際操作稱樣量一致。
[0021]優選的，樣品保存條件為4°C、低溫或超低溫保存。
[0022]本發明還提供一種利用所述的河飩毒素陽性質控樣品的製備方法獲得河飩毒素陽性質控樣品。(這一句是什麼意思？)
[0023]本發明所述質控樣品中基質河飩毒素(TTX)的天然來源包括自然生成的含毒河飩魚或織紋螺等生物機體，但不局限於這幾種。
[0024]所述質控樣品中河飩毒素(TTX)來源為河飩毒素(TTX)標準物質(包括天然提純和化學合成)。
[0025]本發明的有益效果是:
[0026]本發明所述的質控樣品製備簡單，具有足夠的穩定性和均勻性；保存時間長，可用於實驗室質量控制。所加入的分散劑具有分散、穩定、有助於分析檢測程序中前處理過程的提取淨化等功能。
【具體實施方式】
[0027]結合實施例對本發明作進一步具體描述，但不局限於此。
[0028]製備和配方實施例1 (空白基質標準添加法，配方為C18和石墨化碳粉末，此例中添加劑C18和石墨化碳比例為1:1)
[0029]I)取樣並初步檢測TTX含量取人工養殖的鮮紅鰭東方飩，剪開背部表皮取肌肉部分並避免取到血液和內臟，得到400g肌肉組織，用分析研磨機(IKA A11B25)均質後分析測定，結果為該樣品中不含有河飩毒素；2)加標混勻加入含有20 μ g TTX的標準溶液，混勻15min ；3)加入分散劑和穩定劑平均分3_5次加入分散劑(C18和石墨化碳粉末各20g)混勻，每加一次分散劑均質一次，每次均質時間為3-5min，加入分散劑的總量佔陰性樣品總量的10 %，充分混勻後用HPLC-MS/MS方法測定TTX含量，測定結果在可接受範圍內，再測定進行均勻性檢查；4)分裝、凍存、穩定性檢查準確稱取1.1Og樣品於50ml聚丙烯離心管中(相當於1.0Og河飩魚肉樣品)，加蓋密封，於-20攝氏度保存，以I個月，2個月，半年，一年為間隔進行穩定性考查。
[0030]製備和配方實施例2 (空白基質標準添加法，配方為C18和石墨化碳粉末，此例中添加劑C18和石墨化碳比例為2:1)
[0031]I)取樣並初步檢測TTX含量取人工養殖的鮮紅鰭東方飩，剪開背部表皮取肌肉部分並避免取到血液和內臟，得到400g肌肉組織，用分析研磨機(IKA A11B25)均質後分析測定，結果為該樣品中不含有河飩毒素；2)加標混勻加入含有20 μ g TTX的標準溶液，混勻15min ；3)加入分散劑和穩定劑平均分3_5次加入分散劑(C18和石墨化碳粉末分別26.7和
13.3g)混勻，每加一次分散劑均質一次，每次均質時間為3-5min，加入分散劑的總量佔陰性樣品總量的10%，充分混勻後用HPLC-MS/MS方法測定TTX含量，測定結果在可接受範圍內，再測定進行均勻性檢查；4)分裝、凍存、穩定性檢查準確稱取1.1Og樣品於50ml聚丙烯離心管中(相當於1.0Og河飩魚肉樣品)，加蓋密封,於-20攝氏度保存，以I個月，2個月，半年，一年為間隔進行穩定性考查。
[0032]配方實施例3 (配方為單一添加劑C18粉末)
[0033]I)取樣並初步檢測TTX含量取人工養殖的鮮紅鰭東方飩，剪開背部表皮取肌肉部分並避免取到血液和內臟，得到400g肌肉組織，用分析研磨機(IKA A11B25)均質後分析測定，結果為該樣品中不含有河飩毒素；2)加標混勻加入含有20 μ g TTX的標準溶液，混勻15min ；3)加入分散劑和穩定劑平均分3_5次加入分散劑(C1840g)混勻，每加一次分散劑均質一次，每次均質時間為3-5min，加入分散劑的總量佔陰性樣品總量的10%，充分混勻後用HPLC-MS/MS方法測定TTX含量，測定結果在可接受範圍內，再測定進行均勻性檢查；4)分裝、凍存、穩定性檢查準確稱取1.1Og樣品於50ml聚丙烯離心管中(相當於1.0Og河飩魚肉樣品)，加蓋密封，於-20攝氏度保存，以I個月，2個月，半年，一年為間隔進行穩定性考查。
[0034]配方實施例4
[0035]添加劑配方為C18粉末，添加劑配方為C18、石墨化碳和硅藻土比例為2:2 ;1，但不局限於此。
[0036]運用實施例1
[0037]樣品預處理
[0038]I)活河飩魚冷凍處死，去皮，取其肌肉部分去筋經均質制樣機充分粉碎。
[0039]2)稱取試樣(1.00±0.01)g於50mL聚丙烯離心管中，準確加入1%乙酸甲醇(I:99, v/v)溶液 5mL,均質 30s,於 50 °C 超聲提取 25min.8000r/min*5min 離心，轉移上清液至另一潔淨離心管中；殘渣用4mLl%乙酸甲醇溶液重複提取一次，合併上清液並於4°C 12000r/min離心5min,所得上清液待淨化；
[0040]3)取1.0mL上清液於2mL EP (Eppendorf)管中，加入IOOmg石墨化碳黑(GCB)和IOOmg C18粉末劇烈潤旋混合30s, 10000r/min離心5min,上層清液經0.22 μ m聚四氟乙烯-尼龍複合膜過濾後收集於塑料進樣小瓶HPLC-MS/MS測定。
[0041]陽性質控樣測定取50mL聚丙烯離心管包裝的河飩毒素陽性質控樣品(相當於河飩魚肉基質(1.00±0.01)g)，準確加入1%乙酸甲醇(I:99, v/v)溶液5mL，均質30s，於50°C超聲提取25min.8000r/min*5min離心，轉移上清液至另一潔淨離心管中；殘渣用4mLl%乙酸甲醇溶液重複提取一次，合併上清液並於4°C 12000r/min離心5min，所得上清液待淨化；其餘處理同1.23)
[0042]均勻性與穩定性檢驗
[0043]均勻性考察
[0044]按標準樣品工作導則(3)標準樣品定值的一般原則和統計方法(GB/T15000.3-2008/IS0Guide35:2006)5.8進行均勻性研究，按總樣本單元數N的2XN1/3隨機抽取樣本。
[0045]按《GB/T5009.206-2007鮮河飩魚中河飩毒素的測定》和《高效液相色譜/串聯質譜法測定河飩組織中TTX》檢測，每個樣品重複測試2次，;採用方差分析法(F-檢驗)檢驗樣品的瓶間均勻性。樣品均勻性檢驗結果見表I。
[0046]表I河飩毒素陽性質控樣品均勻性檢驗結果(μ g/kg)[0047]
【權利要求】
1.河飩毒素陽性質控樣品的製備方法，包括對陽性樣品進行稀釋和對陰性樣品進行標準物質添加兩種製備方案，其特徵在於，包括下列步驟:將鮮紅鰭東方飩取肌肉組織後均質，測定其中河飩毒素的含量，驗證是否含有河飩毒素，若為陽性樣品，將含有毒素的陽性樣品用陰性樣品和分散劑進行稀釋混勻，繼續測定其中毒素的含量，達到標識含量要求後，將樣品分裝，適當溫度下保存，對樣品進行均勻性驗證和穩定性分析；若為陰性樣品，將河飩毒素標準溶液添加到陰性樣品中，加入分散劑混勻，測定其中河飩毒素的含量，達到標識含量要求後，將樣品分裝，適當溫度下保存，對樣品進行均勻性驗證和穩定性分析。
2.根據權利要求1所述的河飩毒素陽性質控樣品的製備方法，其特徵在於，具體包括下列步驟: (1)取鮮紅鰭東方飩取肌肉組織，均質機均質，均質過程中壓強為25-35Mpa，均質時間採用梯度時間法，共均質三次，每次的時間分別為15-20 minUO-15 min、5_10 min ； (2)將均質好的樣品進行毒素測定，採用常規方法測定即可，根據是否含有毒素，製備方法分為陽性樣品稀釋和陰性樣品標準物質添加兩種； 陽性樣品稀釋:將含有毒素的陽性樣品用陰性樣品和分散劑稀釋混勻，分散劑重量佔陽性樣品和隱形樣品總重量的8-12%，稀釋混勻採用分步稀釋法，將陰性樣品和分散劑平均分成3-5份，加入一份陰性樣品和分散劑後均質一次，每次均質時間為3-5min ； 陰性樣品標準物質添加:將河飩毒素標準溶液添加到經測定不含河飩毒素的鮮紅鰭東方飩肌肉組織中，然後平均分3-5次加入分散劑混勻，每加一次分散劑均質一次，每次均質時間為3-5min，加入分散劑的總量佔陰性樣品總量的8_12%， (3)測定步驟(2)中樣品的毒素含量； (4)毒素含量達到標識要求後，將樣品分裝，適當溫度保存，對樣品進行均勻性驗證和穩定性分析。
3.根據權利要求2所述的河飩毒素陽性質控樣品的製備方法，其特徵在於，步驟(I)中，肌肉組織在均質機中均質之前，將肌肉組織加熱到40-50°C，均質時均質溫度控制在30-40。。。
4.根據權利要求2所述的河飩毒素陽性質控樣品的製備方法，其特徵在於，所述分散劑為C18，石墨化碳、白炭黑、硅藻土中的一種或多種的組合。
5.根據權利要求2所述的河飩毒素陽性質控樣品的製備方法，其特徵在於，毒素含量達到標識要求後，將樣品冷凍乾燥或烘乾，做成粉狀或溼粉狀或漿狀。
6.根據權利要求2所述的河飩毒素陽性質控樣品的製備方法，其特徵在於:樣品保存條件為4°C、低溫或超低溫保存。
7.一種利用權利要求2所述的河飩毒素陽性質控樣品的製備方法獲得的河飩毒素陽性質控樣品。
8.權利要求7所述的河飩毒素陽性質控樣品在河飩毒素檢測過程中作為檢測質量控制應用。
【文檔編號】G01N1/28GK103983495SQ201410255502
【公開日】2014年8月13日 申請日期:2014年6月10日 優先權日:2014年6月10日
【發明者】曹文卿, 林黎明, 吳振興, 楊桂朋 申請人:山東出入境檢驗檢疫局檢驗檢疫技術中心