一種耐高溫、高比活植酸酶基因及其克隆和表達的製作方法

2023-10-11 07:47:14

專利名稱：一種耐高溫、高比活植酸酶基因及其克隆和表達的製作方法
技術領域：
一種耐高溫、高比活植酸酶基因及其克隆和表達，本發明屬於微生物基因工程領域，更具體地說是通過基因工程方法克隆出具有耐高溫、高比酶活並能夠在高溫下保持長時間活性的植酸酶基因。
背景技術：
植酸(phytic acid)化學名稱為環己六醇六磷酸酯，又稱六磷酸肌醇，是由一分子的肌醇和六分子的磷酸組成。分子式為C6H18O24P6，分子量為660.08。
植酸廣泛存在於植物中，特別是在穀類、豆類和油料作物種子中含量豐富。植物籽實中的磷主要是以植酸磷的形式貯存。植酸容易同許多二價金屬離子，如Ca2+、Mg2+、Fe2+、Zn2+、Mn2+、Cu2+等結合形成植酸鹽(複合鹽或者是單鹽)，降低自由離子的濃度。
植酸酶(myo-inositol hexakisphosphate phosphohydrolase；EC 3.1.3.8)是一類可以水解植酸的酸性磷酸酶，能催化分解植酸生成無機磷酸和肌醇。這一性質使得植酸酶在飼料工業中具有很重要的應用意義。植物來源組分在飼料中佔很大的比重，而植物中的磷元素又主要是以植酸的形式存在。有些穀物、油料作物中的植酸含量甚至高達1％～3％。由於單胃動物消化道中缺乏分解植酸的酶系，因此植酸不能被單胃動物分解生成無機磷，而是隨著糞便被排出體外，進入到環境中。這樣既造成磷元素的大量浪費，需要人們在飼料中額外添加磷元素，司時大量的磷元素被排放到環境中，加劇了環境汙染。此外，植酸還是強抗營養因子，能螯合Ca2+、Fe2+、Zn2+等金屬離子形成難溶性植酸鹽絡合物，能與帶正電荷的蛋白質、維生素等形成難溶複合物，影響蛋白質、維生素的吸收並降低了飼料的營養價值。作為單胃動物的飼料添加劑，植酸酶的飼餵效果已經得到充分的確證它可使植物性飼料中磷的利用率提高60％，減少了飼料中無機磷的添加量，動物糞便中無機磷排出量減少40％，減輕了環境的磷汙染量；植酸酶還能解除植酸對金屬離子和蛋白質的螯合作用，提高單胃動物對金屬離子尤其是微量金屬離子的吸收，提高蛋白質的利用率。
植酸酶大多是單亞基糖蛋白，其糖基組成及比例為甘露糖∶半乳糖∶N-乙醯葡萄糖胺＝9∶1∶3，分子量一般在40～120kDa，它們的最適pH範圍在4.5～6.0，最適溫度在45～60℃之間。現已知的植酸酶有3種類型，肌醇六磷酸-3-磷酸水解酶(3-Phytase，EC3.1.3.8)、肌醇六磷酸-6-磷酸水解酶(6-Phytase，EC 3.1.3.26)和非特徵性的正磷酸單酯磷酸水解酶(EC 3.1.3.2)。通常所說的植酸酶是指肌醇六磷酸-3-磷酸水解酶，編碼它的基因稱之為phyA(Wyss 1999，Appl.Environ.Microbiol)。PhyA的高級結構中有5對二硫鍵。二硫鍵的作用主要是參與酶活性中心空間結構的形成，因此任何破壞二硫鍵的變性劑都將導致酶活力的喪失。此外，二硫鍵還與植酸酶的耐熱性有關。PhyA的晶體結構由一個大的α』結構域和一個較小的α結構域組成。α』結構域的中心是一個由6個相對應的胺基酸序列組成的β摺疊片。α結構域中則共有14個α螺旋構成。在兩個結構域的內表面有一很深的凹套，凹套中有酶活性中心的必需胺基酸——Arg58和His59，它們是植酸酶活性位氣保守序列RHG×R×P中的前兩個胺基酸。酶蛋白分子共有19個Arg。RHG×R×P序列中Arg58直接涉及其酶活性，Arg58在其晶體結構中的位置也與它的功能相吻合。底物結合部位RHG×R×P中的Arg58被認為是維持酶活所必需的殘基，即底物結合部位利用其帶正電荷的殘基與帶有負電荷的底物通過靜電吸附作用形成具有特定構象的ES複合物，再藉助催化部位功能，將底物水解。酶活力的喪失是由於底物結合部位中RHG×R×P的精氨酸R基被修飾。微生物中PhyA的晶體結構與鼠的低分子酸性磷酸酶的晶體結構有很高的相似性，說明它屬於組氨酸族酸性磷酸酶。微生物中PhyB雖然屬於組氨酸酸性磷酸酶家族，也有活性位點保守序列RHG×R×P，但它的最適底物不是植酸鹽，因而只能看作是具備植酸酶活性的酸性磷酸酶。細菌植酸酶編碼基因phyC較短，基因全長1152，編碼383個胺基酸，N端前26個胺基酸為信號肽，所編碼的酶蛋白分子量也較小，它的核苷酸序列及編碼的胺基酸序列與phyA和phyB及已報導的磷酸酶基因沒有同源性，也不具有phyA和phyB編碼的胺基酸序列活性位點RHG×R×P保守序列，說明它不屬於組氨酸酸性磷酸酶家族。phyA基因含1個內含子，2個最適pH；phyB基因含3個內含子，1個最適pH。
植酸酶作用於植酸，植酸分子上的磷酸基團逐個切下，形成中間產物IP5、IP4、IP3、IP2，終產物為肌醇和磷酸。按作用起始位點的不同，植酸酶可分為兩類3-植酸酶(EC 3.1.3.8)和6-植酸酶(EC 3.1.3.26)。3-植酸酶先從植酸的第3碳位點開始水解酯鍵釋放無機磷，然後依次水解其他位點的酯鍵，這類酶需要二價鎂離子作為輔基，主要存在於微生物中。6-植酸酶則先從植酸的第6碳位點開始水解酯鍵，這類酶主要存在於植物中。植酸酶並不能徹底分解肌醇磷酸酯，要徹底分解肌醇磷酸酯，則需要酸性磷酸酶的幫助。植酸酶作用機理研究最透徹的是假單胞菌植酸酶，此外對麥麩植酸酶、無花果麴黴植酸酶的作用機理也有初步了解。理論上1g植酸完全分解可釋放出281.6mg無機磷。
植酸酶廣泛存在於自然界中，在動物、植物、微生物中均有發現。據報導目前註冊的植酸酶蛋白序列接近200種，其中大部分是從自然界發現的，也包括許多人工改造過的，還不斷有新的天然酶被發現。然而能應用於飼料工業的天然植酸酶並不是很多。這主要是以下兩因素起到了限制作用一、飼餵單胃動物的植酸酶的最適pH值最好能與動物消化系統如胃、腸等器官的pH環境一致，這樣才有利於被攝入的植酸酶較好的發揮作用。據報導(韓正康，1991)，豬胃中食糜pH值在1.8～3.6之間，十二指腸食糜pH值在3.9～7.0之間。雞的胃糜pH則在4.5～4.8之間，十二指腸在5.7～6.0之間。因此，當植酸酶的最適pH範圍越寬，對豬、雞等動物消化道pH環境適應性越強。二、飼料加工過程中的熱處理，如制粒、膨化等工藝對植酸酶的活性有直接影響，許多植酸酶不能經受比較高的加工溫度(通常是75℃～93℃)，因而也限制了它的應用(王紅寧2000，凹川農業大學學報)。
目前植酸酶的研究重點為微生物來源的植酸酶，尤其是真菌來源的植酸酶已經有許多的報導，像Aspergillus ficuum，A.fumigatus，A.niger，A.terrus，A.oryzae，Emericella nidulans，Mycleiophthora thermophila，Thermomyces lanuginose(Berka 1998，Appl.Environ.Microbiol；Mitchell 1997，Microbiology)等等。與植物來源的植酸酶相比，微生物植酸酶具有較大的pH值範圍，有的pH值在2.5～5.5之間，與單胃動物的腸胃生理條件接近。而植物來源的植酸酶作用pH值在5.0～7.5之間，且耐熱性能不好，在飼料加工過程中不能耐受80℃制粒溫度(Simons 1990，Br JNutr)。現在用於工業生產植酸酶的微生物主要是黑麴黴、無花果麴黴、米麴黴等，它們能分泌較高活性的胞外酶，並且作用pH在酸性範圍內。這些酶在37℃時具有較好的酶活性，但也不大能經受制粒時的高溫。而從嗜溫微生物M.thermophila，A.terreus等分離到的高溫植酸酶最適溫度在70～80℃，雖然有很好的耐溫性，但它在37℃(植酸酶在動物體內的作用溫度)時酶的活性極低，沒有使用價值。所以如何使得酶能短暫的耐高溫且在動物正常體溫下具有高酶活性是目前包括植酸酶在內的飼用酶製劑急需解決的一個問題。此外，飼餵單胃畜禽的植酸酶屬酸性植酸酶，並不適用於淡水養殖的鯉魚科魚類，因為鯉魚科魚類無胃，只有pH呈中性的腸道，要使添加在魚飼料中的植酸酶發揮作用必需使用最適pH為中性的中性植酸酶。目前開發中性植酸酶也成為研究的熱點。近年報導的芽孢桿菌植酸酶具有近乎中性的最適pH值，酶活性高，熱穩定性好，有可能廣泛應用於魚類飼料(Choi 2001，J Protein Chem)。
植酸酶的研究已有近40年歷史。20世紀70年代中期，限制養殖業的磷排洩量成為歐共體成員國實施的環境保護議會指引的核心內容之一。歐洲開始致力於尋找全面解決無機磷汙染的方案。直到1980年，荷蘭Wageningen大學找到植酸酶基因，Gist-brocades公司(DSM的前身)確認了植酸酶的功能，植酸酶的開發成為可能。德國巴斯夫(BASF)和Gist-brocades率先利用基因轉移技術，於1989年首次成功地用A.niger工業化規模生產商品植酸酶。1990年獲得歐洲飼料添加劑管理機構的全面批准認可，酶他富(Natuphos)為商品名上市。從此，各國以大學、研究所和各類商業研究機構為主紛紛投入了大量的人力物力資源從事開發研究。如今，在國際市場上至少已有幾家公司生產的近10個品種，在中國國內至少有3～5家企業已經開發出植酸酶產品。還有更多的企業和研究機構正在從事植酸酶的開發工作。
對植酸酶的研究開發大致有兩條途徑一、通過傳統的遺傳學方法對已有的菌株進行改良以獲得性能更優良的菌株；二、通過基因工程的手段克隆性能優良的植酸酶基因並將其導入到合適的宿主體內得到優良的重組菌。以上兩種途徑都有成功的例子報導。如1994年Marisa等人對無花果麴黴NRLL3115進行紫外誘變，選育出產酶量為野生型菌株3.3倍的突變株。1997年陳紅歌等人對黑麴黴MAO21進行紫外、亞硝基胍誘變獲得一株植酸酶高活性菌株，其酶活力是原始菌株的3.6倍。1991年Van Gorcom等將無花果麴黴的植酸酶基因phyA在澱粉葡萄糖苷酶的啟動子的控制下，克隆到黑麴黴CBS513.88中表達，產酶量提高1400倍。1998年姚斌等將篩選的高產植酸酶的黑麴黴的植酸酶基因克隆到畢赤氏酵母中，表達量比原菌株高3000倍(朱靖環2002微生物學雜誌)。並同時開發了利用生物反應器大規模、低成本生產飼料添加劑植酸酶的工藝。但是，該植酸酶存在一個不容忽視的缺陷不能耐受較高的溫度，在加工過程中酶活力單位大量喪失(Kim 1998，Enz Microbial Tech)。從A.fumiga分離的植酸酶能夠耐受90～100℃高溫，而且能在較寬的pH範圍內降解植酸，因此具有很大的市場潛力(Vall Loon1998，Appl Environ Microbiol)。根據A.fumigatus的植酸酶基因序列，用化學合成和體外基因重排等技術在酵母中高效表達了此酶，酶活力為130,000u/ml。表達量是野生型基因的13倍。經高密度發酵，蛋白表達量為每升5.6g。但此酶的不足之處是經過基因重排後重組植酸酶的比酶活也僅為23,000u/mg(中國發明專利02136531.8)，僅為野生型A.niger植酸酶的四分之一。

發明內容
本發明的目的是尋找一種耐高溫、高比活的植酸酶及其編碼基因，並利用酵母中表達製備該植酸酶的方法。
本發明提供了一種來源於粗糙脈孢菌(Neurospora crassa)AS 3.1604中的耐熱性、高比活植酸酶基因序列及其相應的胺基酸序列。提供了含有N.crassa AS3.1604植酸酶基因的克隆載體pUC-Ncphy和在酵母中表達的表達載體pP-Ncphy。利用本發明成果，可以用於植酸酶工業化生產的基因工程菌的構建和現有植酸酶基因的分子改造，提高微生物發酵法生產植酸酶的水平和質量，還可以用於動植物的基因轉化，達到改善物種品質的目的。
本發明的技術方案以來源於所有麴黴屬的植酸酶基因的高度保守區序列為基礎，經過同源比對N.crassa OR74A全基因組序列，從中獲得一段與黑麴黴phyA有40％同源性的未知基因功能的區域。通過PCR技術，以N.crassa AS 3.1604染色體DNA為模板，以NC-phy801，5』-ACCGGAATTCATGCTACGAGTACTATCCCCAAATCC-3』和NC-phy901，5』-ACCGGAATTCccgcttcggtAATTCGCAGC-3』為引物擴增出植酸酶成熟肽基因並去除5』端的內含子。在擴增片段兩端引入EcoR I酶切位點，回收1.5kb的植酸酶基因片段，EcoR I酶切，插入pUC19，獲得pUC-Ncphy；正向插入到pPIC9K載體，構建成耐高溫、高比活植酸酶基因的酵母表達載體pP-Ncphy。pUC-Ncphy用於序列測定，pP-Ncphy用於轉化酵母和含植酸酶基因Ncphy重組酵母的構建。
基因Ncphy的核苷酸序列如下atgctacgag tactatcccc aaatccagca tcatgcgaca gcccagagct tggttaccaa60tgtaactcag agacaaccca cacatggggt caatactcgc ccttcttctc cgtcccgtcg120gaaatctccc cctccgttcc cgagggttgc cgcctcacct ttgcccaagt tctttctcgc180cacggcgctc gcttcccaac tcccggaaaa gccgccgcca tctccgccgt tctcaccaag240atcaaaacct ccgccacctg gtacgccccc gacttcgagt tcatcaaaga ctacaactat300gtcctcggcg tcgaccacct cactgccttt ggcgagcaag agatggtcaa ctcgggcatc360aaattctacc aacgctacgc ttccctcatc cgggactaca ctgacccaga atccctcccc420tttatccgtg cctcggggca ggagcgcgtc attgcctcag ctgagaactt caccactggg480ttctactctg ccctccttgc cgacaagaac ccaccccctt cctccctccc gcttccccgc540caggagatgg tcatcatctc cgaatcgccc acggccaaca acaccatgca ccacggtctc600tgccgcgcct ttgaggactc caccaccggc gatgcggccc aggcgacctt tatagctgcc660aatttcccgc ccatcaccgc gcggttgaat gcgcagggtt tcaaaggcgt cactctttcc720gacacggacg tgctctcgct catggatctc cgcccctttg acaccgtcgc ttacccgccc780tcctcctctc tcaccacctc gtcctctccc tcggggggaa gcaagctctc ccccttttgc840
tcccttttta ccgctcaaga ctttaccgtg tacgactacc tccagtccct cggcaagttc900tacggctacg gcccgggtaa ttctctggct gccacgcagg gggtggggta cgtgaacgag960cttttggctc gcctcacggt ttccccggtg gtggataaca cgaccaccaa ttccacgctg1020gacgggaacg aggacacgtt tccgctgagt aggaacagga cggtgtttgc ggatttcagt1080catgataatg atatggtggg gatcttgact gctttgagaa tctttgaggg ggtggatgcg1140gagaagatga tggataatac gaccataccg agagagtacg gggagactgg cgatgatccg1200gcaaatttga aagagaggga gggcttgttc aaggttggtt gggtggtgcc atttgcggcg1260agggtgtatt ttgaaaagat gatttgtgat ggggatggga gtggagagat ggttcagagc1320gaggaggaac aggacaagga gttggtgagg atcttggtta acgatagagt ggttaaacta1380aatggatgtg aggccgatga gttggggagg tgtaagttgg ataaatttgt agagagtatg1440gagtttgcta ggaggggtgg agattgggac aagtgttttg cttag 1485其中， 為人工加入的轉錄啟始密碼子， 為終止密碼子。
根據以上核苷酸序列，N.crassa AS 3.1604的植酸酶的胺基酸序列如下Met Leu Arg Val Leu Ser Pro Asn Pro Ala Ser Cys Asp Ser Pro1 5 10 15Glu Leu Gly Tyr Gln Cys Asn Ser Glu Thr Thr His Thr Trp Gly20 25 30Gln Tyr Ser Pro Phe Phe Ser Val Pro Ser Glu Ile Ser Pro Ser35 40 45Val Pro Glu Gly Cys Arg Leu Thr Phe Ala Gln Val Leu Ser 50 55 60 Thr Pro Gly Lys Ala Ala Ala Ile Ser65 70 75Ala Val Leu Thr Lys Ile Lys Thr Ser Ala Thr Trp Tyr Ala Pro80 85 90Asp Phe Glu Phe Ile Lys Asp Tyr Asn Tyr Val Leu Gly Val Asp95 100 105His Leu Thr Ala Phe Gly Glu Gln Glu Met Val Asn Ser Gly Ile110 115 120Lys Phe Tyr Gln Arg Tyr Ala Ser Leu Ile Arg Asp Tyr Thr Asp125 130 135Pro Glu Ser Leu Pro Phe Ile Arg Ala Ser Gly Gln Glu Arg Val140 145 150
Ile Ala Ser Ala Glu Phe Thr Thr Gly Phe Tyr Ser Ala Leu155 160 165Leu Ala Asp Lys Asn Pro Pro Pro Ser Ser Leu Pro Leu Pro Arg170 175 180Gln Glu Met Val Ile Ile Ser Glu Ser Pro Thr Ala Asn Thr185 190 195Met His His Gly Leu Cys Arg Ala Phe Glu Asp Ser Thr Thr Gly200 205 210Asp Ala Ala Gln Ala Thr Phe Ile Ala Ala Asn Phe Pro Pro Ile215 220 225Thr Ala Arg Leu Asn Ala Gln Gly Phe Lys Gly Val Thr Leu Ser230 235 240Asp Thr Asp Val Leu Ser Leu Met Asp Leu Arg Pro Phe Asp Thr245 250 255Val Ala Tyr Pro Pro Ser Ser Ser Leu Thr Thr Ser Ser Ser Pro260 265 270Ser Gly Gly Ser Lys Leu Ser Pro Phe Cys Ser Leu Phe Thr Ala275 280 285Gln Asp Phe Thr Val Tyr Asp Tyr Leu Gln Ser Leu Gly Lys Phe290 295 300Tyr Gly Tyr Gly Pro Gly Asn Ser Leu Ala Ala Thr Gln Gly Val305 310 315Gly Tyr Val Asn Glu Leu Leu Ala Arg Leu Thr Val Ser Pro Val320 325 330Val Asp Thr Thr Thr Ser Thr Leu Asp Gly Asn Glu Asp335 340 345Thr Phe Pro Leu Ser Arg Arg Thr Val Phe Ala Asp Phe Ser350 355 360His Asp Asn Asp Met Val Gly Ile Leu Thr Ala Leu Arg Ile Phe365 370 375Glu Gly Val Asp Ala Glu Lys Met Met Asp Thr Thr Ile Pro380 385 390
Arg Glu Tyr Gly Glu Thr Gly Asp Asp Pro Ala Asn Leu Lys Glu395 400 405Arg Glu Gly Leu Phe Lys Val Gly Trp Val Val Pro Phe Ala Ala410 415 420Arg Val Tyr Phe Glu Lys Met Ile Cys Asp Gly Asp Gly Ser Gly425 430 435Glu Met Val Gln Ser Glu Glu Glu Gln Asp Lys Glu Leu Val Arg440 445 450Ile Leu Val Asn Asp Arg Val Val Lys Leu Asn Gly Cys Glu Ala455 460 465Asp Glu Leu Gly Arg Cys Lys Leu Asp Lys Phe Val Glu Ser Met470 475 480Glu Phe Ala Arg Arg Gly Gly Asp Trp Asp Lys Cys Phe Ala485 490 494該植酸酶由494個胺基酸殘基組成，從蛋白質一級結構分析，含有6個糖基化位點 和一個近氨基端活性中心保守序列 本發明的有益效果1、本發明的植酸酶具有明顯的高比酶活，比酶活為125,000u/mg。是黑麴黴野生型植酸酶的1.2倍，A.fumigatus重組植酸酶的5.1倍。
2、本發明的植酸酶具有明顯的耐高溫性能，80℃和20 min，保留58％的酶活。同等條件下，黑麴黴植酸酶僅保存28％的酶活。
3、本發明的植酸酶具有廣pH有效性和穩定性，在pH2.0～8.0之間有植酸酶活性，在pH3.5～9.5之間，有較好的pH穩定性。
4、本發明的植酸酶對環境因子具有較好的抗性，Mg2+、Ca2+、Al3+、Fe2+、Co2+、Zn2+和EDTA等對其酶活影響很小。


圖1構建成的細菌克隆植酸酶載體。
圖2酵母表達植酸酶載體。
圖3重組酵母表達植酸酶的蛋白電泳圖譜。lane 1protein molecular weightmarkers comprising babbit phosphorylase b(97,400)，bovine serum albumin(66,200)，rabbit actin(43,000)，bovine carbonic anhydrase(31,000)，trypsin inhibitor(20,100)，henegg white lysozyme(14,400)；lane 2purified phytase；lane 3unpurified phytase；lane 4culture broth of the vector control圖4不同pH條件下，植酸酶的相對活力。
圖5重組酶的最適反應溫度。
圖6重組酶與商品酶熱穩定性的比較。
圖7重組酶pH穩定性的測定。
具體實施例方式
實施例1產植酸酶的N.crassa的初步篩選以本實驗室保藏或來自於中國菌種保藏管理委員會的共11株N.crassa為出發菌株。產酶培養基成分1.5％葡萄糖，0.3％蛋白腖，0.2％(NH4)2SO4，0.05％MgSO4·7H2O，0.05％KCl，0.003％FeSO4·7H2O，0.003％MnSO4·4H2O，pH5.7。培養條件接種適量N.crassa孢子到50mL產酶培養基中，28℃，200r/min搖瓶振蕩培養4d。培養液經過濾除去菌絲體，再8000r/min離心10min。吸取上清液，進行植酸酶酶活測定。植酸酶酶活測定方法按國家標準GB/T 18634-2002進行，植酸酶酶活性單位(u)定義為在37℃下，每分鐘分解植酸鹽釋放出1nmol無機磷酸所需要的酶量為1u。從中篩選出的中國菌種保藏管理委員會的N..crassa AS3.1604(詳見《菌種目錄資料庫》)。其發酵液中的植酸酶活最高，酶活為18.5u/mL。
實施例2N.crassa AS 3.1604植酸酶基因的克隆通過與黑麴黴、土麴黴等微生物植酸酶基因的高度保守區序列比對，發現N.crassa基因組中有一段編碼未知功能的多肽的核苷酸序列很可能是編碼植酸酶的基因。進一步Signal P V2.0程序推測N.crassa植酸酶信號肽序列，推測第88個胺基酸(第3個蛋氨酸)為起始密碼子。其中，氨基端的68胺基酸殘基為假基因編碼序列。故以如下寡核苷酸為引物NC-phy801，5』-ACCGGAATTCATGCTACGAGTACTATCCCCAAATCC-3』NC-phy901，5』-ACCGGAATTCCCGCTTCGGTAATTCGCAGC-3』通過PCR技術，以N.crassa AS 3.1604染色體DNA為模板，擴增出植酸酶成熟肽基因並去除5』端的內含子。
N.crassa AS 3.1604染色體DNA提取按如下方法進行。用過濾的方法收集菌絲，並用生理鹽水充分洗滌1～2次。置於5mL離心管中，最大轉速離心，去除殘餘的生理鹽水。將收集好的菌體置於5mL離心管中，每0.5g菌體加入1mL裂解緩衝液(50mmol/L Tris-HCl pH8.0，180mmol/L EDTA pH8.0，1％SDS(華美公司)，現配)，同時加入3/10總體積的石英砂，蓋緊離心管蓋，在漩渦振蕩器上振蕩5min～8min，每隔1min用力上下晃動離心管30s，使內容物混合均勻。65℃放置10min，加入600μL 7.5mol/L乙酸銨溶液，冰浴8min。以最大轉速離心5min，轉移上清至另一無菌的5mL離心管中，加入0.1倍體積的3mol/L的NaAc以及0.6倍體積的異丙醇，顛倒混勻，冰浴8min。室溫下以最大轉速離心收集沉澱，棄上清，用200μL TE溶解沉澱，加入適量RNA酶，65℃溫浴10min。取出，加入200μL氯仿∶異戊醇(24∶1)抽提一次，將上清轉入另一無菌的1.5mL離心管中，加入0.1倍體積的3mol/L的NaAc以及2.5倍體積的無水乙醇，以最大轉速離心8min收集染色體DNA，70％乙醇洗滌一次，待乙醇揮發完全，用適量TE溶液溶解沉澱。
採用PCR技術，以N.crassa AS 3.1604染色體DNA為模板，用引物NC-phy801，5』-ACCGGAATTCATGCTACGAGTACTATCCCCAAATCC-3』和 NC-phy901，5』-ACCGGAATTCCCGCTTCGGTAATTCGCAGC-3』進行PCR擴增。PCR的擴增條件為94℃變性10min，加入PyrobestTMDNA聚合酶(大連寶公司)1個單位，混勻加入礦物油約100□l，然後94℃變性1min，56℃退火1.5min，72℃延伸3min，經過30個循環後，再72℃延伸7min。
PCR擴增產物的兩端引入EcoR I酶切位點，回收1.5kb的植酸酶基因片段，EcoR I酶切，插入pUC19，獲得pUC-Ncphy，如圖1所示。pUC-Ncphy用於序列測定，對其插入的Ncphy採用Sanger鏈終止法進行核苷酸序列測定。
實施例3酵母表達植酸酶載體構建在擴增片段的兩端引入EcoRI酶切位點，回收1.5kb的植酸酶基因片段，EcoRI酶切，插入pUC19，獲得pUC-Ncphy，用EcoRI酶切pUC-Ncphy，切膠回收Ncphy片段，正向插入到pPIC9K載體(來自Invitrogen公司)的EcoR I位點，構建成酵母表達載體pP-Ncphy，如圖2所示。
實施例4表達植酸酶重組酵母的構建將活化的畢赤氏酵母菌株Pichia pastoris KM71(來自Invitrogen公司)於500ml YPD(1％酵母膏，2％蛋白腖，2％葡萄糖)中30℃培養18h，至OD600＝1.7，5000r/min離心收集菌體，先後用500ml，250ml預冷的無菌水洗菌體，離心去上清液，用20ml預冷的1mol/L山梨醇懸浮菌體。離心後菌體再用0.5ml預冷的山梨醇懸浮，作為感受態細胞用於電擊轉化。
大量抽提酵母表達載體pP-Ncphy，Nco I酶切線性化pP-Ncphy，片段加入50uL感受態細胞，冰浴5min，用Bio-Rad GenePulser電擊儀電擊，參數為2.5Kv，25uF。電擊結束後立即加入1.0ml預冷的1mol/L山梨醇，取200ul塗布於YNBG培養基(1.34％YNB培養基，2％葡萄糖)，30℃培養直至轉化子出現。用牙籤將轉化子點種到YNBG-G418(YNBG培養基中補加2mg/ml抗生素G418(購自Sigma公司))，良好生長的菌落通過酵母菌落PCR的方法鑑定轉化子，陽性重組酵母用於產植酸酶發酵試驗。
重組酵母菌菌株的高密度發酵將獲得的5株重組畢赤氏酵母分別接種於20mL YPD液體培養基，30℃振蕩培養至穩定期。離心收集菌體，轉入100mL MGY培養基(1.34％YNB，1％甘油，4×10-5％生物素)中30℃、200r/min劇烈振蕩培養48h，離心收集菌體，轉入30mL MM培養基(1.34％YNB，0.5％甲醇，4×10-5％生物素)液體培養基中30℃劇烈振蕩培養至7d，每隔12h進行植酸酶活性測定。重組菌發酵液酶活在1,000～13,000u/mL不等。其中，重組酵母Y79a最高產植酸酶水平為13,200u/mL。比野生菌株的產酶水平提高了710倍。
實施例5植酸酶的製備和純化8,000r/min×10min冷凍離心收集重組酵母Y79a的發酵液，裝入透析帶中透析脫鹽，透析帶懸浮在生理鹽水中，透析時保持溫度在4℃，透析2d後至發酵液基本透明無色。取透析後的發酵液15mL用Amico Ultrafitration-15(Biomax 10K；Millipore)在4500g轉速下離心25min，獲得終體積約為500μL的液體，濃縮倍數大約為30倍。然後以0.25M、pH5.5的乙酸鈉溶液為洗脫液，將得到的500μL的濃縮液通過Superdex 200 column(Pharmacia Biotech)進行分離。洗脫液分步收集，每管收集1mL液體。根據測得的蛋白質峰對應的試管編號，進行植酸酶活的測定。將具有酶活的洗脫液合開，上樣於陰離子交換層析柱DEAE-52，用0～1.0mol/L NaCl，0.25mol/L NaAc，pH6.0梯度洗脫。測出有明顯酶活的收集管，用Amico Ultrafitration-15(Biomax 10K；Millipore)濃縮後進行SDS-PAGE電泳。採用Bradford法測定蛋白質濃度，以牛血清白蛋白作為標準。重組菌發酵液比空載體對照明顯多出一條蛋白條帶。電泳圖譜結果見圖3，重組酶分離純化後達電泳均一，分子量接近60kDa，為單亞基蛋白。比酶活為125,000u/mg。
實施例6植酸酶酶學性質分析重組酶的最適pHpH緩衝液0.2mol/L甘氨酸-鹽酸緩衝液(pH2.0、2.5、3.0、3.5)，0.2mol/L乙酸鈉緩衝液(pH4.0、4.5、5.0、5.5)，0.2mol/L咪唑-鹽酸緩衝液(pH6.0、6.5)，0.2mol/L Tris緩衝液(pH7.0、8.0)。將重組酶純酶(28.3μg/mL)120μL稀釋到480μL，取40μL分別在pH2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、8.0測定酶活。計算相對酶活確定最適pH。測定條件下，重組酶的最適pH為3.5～5.5，pH5.5時酶活達到最大值。pH2.0～8.0之間具有活性(圖4)。
重組酶的最適反應溫度的測定將重組酶純酶(28.3μg/mL)120μL稀釋到480μL，取40μL分別在25、37、45、50、55、60、65、70、80℃溫度下測定酶活，計算相對酶活確定最適溫度。測定條件下，重組酶的最適溫度為60℃。25～70℃之間維持較好活性(圖5)。
重組酶對溫度的穩定性測定將重組酶純酶(28.3μg/mL)70μL稀釋到280□L，取15□L分別在30、40、50、60、70、80、90℃溫浴10、20、60min，立即取出，冰浴30min後在37℃測酶活。計算相對酶活比較重組酶對溫度的穩定性。重組酶對溫度的穩定性的研究表明重組酶在70～90℃加熱20min後，相對酶活仍然剩餘39～58％，與文獻報導的畢赤氏酵母表達的黑麴黴植酸酶相比要高些。
重組酶與商品酶熱穩定性的比較在80℃時，將重組酶與商品酶分別加熱5、10、15、20min立即取出，冰浴30min後在37℃測酶活，並計算相對酶活。重組酶在80℃加熱後出現了熱激活現象。重組酶與商品酶在80℃熱穩定性比較發現，當加熱到15、20min時重組酶比商品酶酶活下降幅度要小(圖6)。
重組酶pH穩定性的測定將重組酶純酶(28.3μg/mL)70μL稀釋到280μL，取15μL在pH2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0、9.5室溫放置24h。然後再在37℃、pH5.5的條件下測定酶活，計算相對酶活比較重組酶對pH的穩定性。該酶在pH3.5～9.5之間，穩定性較好(圖7)。
重組酶動力學參數Km與Vmax值的測定將重組酶純酶(28.3μg/mL)70μL稀釋到280μL，取20μL置於不同濃度(5、2.5、1.25、1、0.5、0.25mM)的底物植酸鈉中測定酶活，反應速度用每min生成的無機磷的量(μmol..表示，採用Lineweaver-Burk雙倒數作圖法計算Km與Vmax值。Km與Vmax值分別為228μM、128μmol/mg pro.min-1。
不同金屬離子對重組酶酶活的影響將20μL重組酶純酶(28.3μg/mL)分別加入到280μL 1mM濃度的Zn2+、Mn2+、Mg2+、Ca2+、Al3+等金屬鹽溶液中，室溫放置30min。再加200μL NaAc，至體積為500μL再測酶活，酶活測定方法同前，並計算相對酶活。Mg2+、Ca2+、Al3+、Fe2+、Co2+、Zn2+和EDTA等對其酶活影響很小。
權利要求
1.一種來源於粗糙脈胞黴(Neurospora crassa)AS 3.1604中的耐高溫、高比活植酸酶基因Ncphy，其核苷酸序列為atgctacgag tactatcccc aaatccagca tcatgcgaca gcccagagct tggttaccaa60tgtaactcag agacaaccca cacatggggt caatactcgc ccttcttctc cgtcccgtcg 120gaaatctccc cctccgttcc cgagggttgc cgcctcacct ttgcccaagt tctttctcgc 180cacggcgctc gcttcccaac tcccggaaaa gccgccgcca tctccgccgt tctcaccaag 240atcaaaacct ccgccacctg gtacgccccc gacttcgagt tcatcaaaga ctacaactat 300gtcctcggcg tcgaccacct cactgccttt ggcgagcaag agatggtcaa ctcgggcatc 360aaattctacc aacgctacgc ttccctcatc cgggactaca ctgacccaga atccctcccc 420tttatccgtg cctcggggca ggagcgcgtc attgcctcag ctgagaactt caccactggg 480ttctactctg ccctccttgc cgacaagaac ccaccccctt cctccctccc gcttccccgc 540caggagatgg tcatcatctc cgaatcgccc acggccaaca acaccatgca ccacggtctc 600tgccgcgcct ttgaggactc caccaccggc gatgcggccc aggcgacctt tatagctgcc 660aatttcccgc ccatcaccgc gcggttgaat gcgcagggtt tcaaaggcgt cactctttcc 720gacacggacg tgctctcgct catggatctc cgcccctttg acaccgtcgc ttacccgccc 780tcctcctctc tcaccacctc gtcctctccc tcggggggaa gcaagctctc ccccttttgc 840tcccttttta ccgctcaaga ctttaccgtg tacgactacc tccagtccct cggcaagttc 900tacggctacg gcccgggtaa ttctctggct gccacgcagg gggtggggta cgtgaacgag 960cttttggctc gcctcacggt ttccccggtg gtggataaca cgaccaccaa ttccacgctg 1020gacgggaacg aggacacgtt tccgctgagt aggaacagga cggtgtttgc ggatttcagt 1080catgataatg atatggtggg gatcttgact gctttgagaa tctttgaggg ggtggatgcg 1140gagaagatga tggataatac gaccataccg agagagtacg gggagactgg cgatgatccg 1200gcaaatttga aagagaggga gggcttgttc aaggttggtt gggtggtgcc atttgcggcg 1260agggtgtatt ttgaaaagat gatttgtgat ggggatggga gtggagagat ggttcagagc 1320gaggaggaac aggacaagga gttggtgagg atcttggtta acgatagagt ggttaaacta 1380aatggatgtg aggccgatga gttggggagg tgtaagttgg ataaatttgt agagagtatg 1440gagtttgcta ggaggggtgg agattgggac aagtgttttg cttag 1485
2.根據權利要求1所述基因Ncphy，其胺基酸組成為Met Leu Arg Val Leu Ser Pro Asn Pro Ala Ser Cys Asp Ser Pro1 5 10 15Glu Leu Gly Tyr Gln Cys Asn Ser Glu Thr Thr His Thr Trp Gly20 25 30Gln Tyr Ser Pro Phe Phe Ser Val Pro Ser Glu Ile Ser Pro Ser35 40 45Val Pro Glu Gly Cys Arg Leu Thr Phe Ala Gln Val Leu Ser 50 55 60 Thr Pro Gly Lys Ala Ala Ala Ile Ser65 70 75Ala Val Leu Thr Lys Ile Lys Thr Ser Ala Thr Trp Tyr Ala Pro80 85 90Asp Phe Glu Phe Ile Lys Asp Tyr Asn Tyr Val Leu Gly Val Asp95 100 105His Leu Thr Ala Phe Gly Glu Gln Glu Met Val Asn Ser Gly Ile110 115 120Lys Phe Tyr Gln Arg Tyr Ala Ser Leu Ile Arg Asp Tyr Thr Asp125 130 135Pro Glu Ser Leu Pro Phe Ile Arg Ala Ser Gly Gln Glu Arg Val140 145 150Ile Ala Ser Ala Glu Phe Thr Thr Gly Phe Tyr Ser Ala Leu155 160 165Leu Ala Asp Lys Asn Pro Pro Pro Ser Ser Leu Pro Leu Pro Arg170 175 180Gln Glu Met Val Ile Ile Ser Glu Ser Pro Thr Ala Asn Thr185 190 195Met His His Gly Leu Cys Arg Ala Phe Glu Asp Ser Thr Thr Gly200 205 210Asp Ala Ala Gln Ala Thr Phe Ile Ala Ala Asn Phe Pro Pro Ile215 220 225Thr Ala Arg Leu Asn Ala Gln Gly Phe Lys Gly Val Thr Leu Ser230 235 240Asp Thr Asp Val Leu Ser Leu Met Asp Leu Arg Pro Phe Asp Thr245 250 255Val Ala Tyr Pro Pro Ser Ser Ser Leu Thr Thr Ser Ser Ser Pro260 265 270Ser Gly Gly Ser Lys Leu Ser Pro Phe Cys Ser Leu Phe Thr Ala275 280 285Gln Asp Phe Thr Val Tyr Asp Tyr Leu Gln Ser Leu Gly Lys Phe290 295 300Tyr Gly Tyr Gly Pro Gly Asn Ser Leu Ala Ala Thr Gln Gly Val305 310 315Gly Tyr Val Asn Glu Leu Leu Ala Arg Leu Thr Val Ser Pro Val320 325 330Val Asp Thr Thr Thr Ser Thr Leu Asp Gly Asn Glu Asp335 340 345Thr Phe Pro Leu Ser Arg Arg Thr Val Phe Ala Asp Phe Ser350 355 360His Asp Asn Asp Met Val Gly Ile Leu Thr Ala Leu Arg Ile Phe365 370 375Glu Gly Val Asp Ala Glu Lys Met Met Asp Thr Thr Ile Pro380 385 390Arg Glu Tyr Gly Glu Thr Gly Asp Asp Pro Ala Asn Leu Lys Glu395 400 405Arg Glu Gly Leu Phe Lys Val Gly Trp Val Val Pro Phe Ala Ala410 415 420Arg Val Tyr Phe Glu Lys Met Ile Cys Asp Gly Asp Gly Ser Gly425 430 435Glu Met Val Gln Ser Glu Glu Glu Gln Asp Lys Glu Leu Val Arg440 445 450Ile Leu Val Asn Asp Arg Val Val Lys Leu Asn Gly Cys Glu Ala455 460 465Asp Glu Leu Gly Arg Cys Lys Leu Asp Lys Phe Val Glu Ser Met470 475 480Glu Phe Ala Arg Arg Gly Gly Asp Trp Asp Lys Cys Phe Ala485 490 494含有6個糖基化位點 一個近氨基端活性中心
3.如權利要求1所述耐高溫、高比活植酸酶基因Ncphy的克隆，其特徵是採用PCR技術，以粗糙脈孢黴(Neurospora crassa)AS 3.1604染色體DNA為模板，以NC-phy801，5』-ACCGGAATTCATGCTACGAGTACTATCCCCAAATCC-3』和NC-phy901，5』-ACCGGAATTCCCGCTTCGGTAATTCGCAGC-3』為引物擴增出植酸酶成熟肽基因並去除5』端的內含子；PCR的擴增條件為94℃變性10min，加入PyrobestTMDNA聚合酶1個單位，混勻加入礦物油，然後94℃變性1min，56℃退火1.5min，72℃延伸3min，經過30個循環後，再72℃延伸7min。
4.如權利要求1所述耐高溫、高比活植酸酶基因Ncphy的表達，其特徵是在擴增片段兩端引入EcoRI酶切位點，回收1.5kb的植酸酶基因片段，EcoRI酶切，插入pUC19，獲得pUC-Ncphy；正向插入到pPIC9K載體，構建成耐高溫、高比活植酸酶基因的酵母表達載體pP-Ncphy。
全文摘要
一種耐高溫、高比活植酸酶基因及其克隆和表達，屬於微生物基因工程領域。本發明提供了來源於粗糙脈胞黴(N.crassa)AS3.1604編碼的一種耐高溫、高比活植酸酶基因Ncphy，提供了Ncphy的核苷酸序列和相應蛋白質的胺基酸序列，提供了含有Ncphy的克隆載體pUC－Ncphy和酵母表達載體pP－Ncphy，以及用酵母表達載體進行重組酵母的構建和重組酶的酶學性質。本發明可用於植酸酶工業化生產的基因工程菌的構建和現有植酸酶基因的分子改造，提高微生物發酵法生產植酸酶的水平和質量，還可以用於動植物的基因轉化，達到改善物種品質的目的。
文檔編號C12N15/11GK1616659SQ20041006495
公開日2005年5月18日 申請日期2004年10月13日 優先權日2004年10月13日
發明者王正祥, 周小玲 申請人:江南大學