一種從藻體表面去除多糖和外源微生物的方法與流程
2023-10-11 05:19:49 2
本發明涉及一種從藻體表面去除多糖和外源微生物的方法，屬於藻體分離領域。
背景技術：
：藻體和微生物之間存在密切關係，微生物不僅附著在藻體的表面，還寄身於藻體的細胞內部。對於具有粘附性的外源微生物，藻類的表面為其生活和附著提供了生存條件，藻類分泌的糖類、脂類等代謝產物又能被細菌吸收利用，給細菌的生存提供營養。藻體脫落的部分也可以被外源微生物降解。反之，外源微生物能夠產生一些胞外產物，如生長因子、維生素等，為藻類的生長發育做出貢獻。因此，藻類與外生細菌之間既相互利用又拮抗，二者通過相互作用進行雙向選擇。關於藻體和細菌之間的複雜關係，目前研究的主要方向有(a)藻類與藻際環境中微生物的相互關係：miranda等人在2013年的一篇研究中做了全面的研究並提出一個猜想：微生物產生藻類，以紫菜屬物種為研究對象，並推測和紫菜共存的一些細菌可能對於維持其形態結構和一些營養物質的生成存在不可或缺的作用。同時也有研究學者發現在綠藻和褐藻中也存在外源微生物影響藻體形態的現象。(b)藻類附生菌所產生的生物活性物質：許多學者致力於藻體附著外源微生物活性物質如毒素、抑菌物質和抗生素等等。（c）藻類附生菌的種群組成：為了研究藻類附生種群的類型，利用平板分離和16s擴增鑑定種群多樣性（4）無菌藻種的獲得：通過添加抗生素來抑制外源微生物的生長而獲得無菌材料，或者是通過反覆衝洗獲得無菌材料。隨著測序技術的發展，基因組學的研究逐漸成為熱門領域，然而對於海洋生物來說，外源微生物的存在成為制約其基因組學發展的一大障礙。許多學者致力於藻類無菌化的培養，然而比較成功的技術手段尚未見到相關報導。在藻類無外源微生物dna汙染的高質量dna製備過程中，仍然存在很大的問題：1、目前的研究來看，藻類的dna樣本是一個高度複雜的樣本，即提取的dna中存在藻體本身的dna同時也存在大量外源微生物的dna，在基因組的拼接組裝過程中很難利用生物信息學技術將外源微生物的dna片段徹底去除，因此會影響基因組拼接組裝的準確性，從而影響後續基因組特性的分析；2、藻類無菌材料的獲得和維持是非常困難的，即使加入抗生素，也很難去除所含的細菌，推測某些細菌為其內共生微生物。現有技術中對於無菌藻株的獲得和維持仍然存在很大的問題。例如在利用抗生素抑制外源微生物的汙染，有的物種長期加入抗生素就會產生抗性或者是不同的物種需要添加不同的抗生素類型。即使獲得無菌的藻株，在無菌培養的過程中也很難維持。也有研究者利用超聲波的方法反覆衝洗樣品，但這個技術的可重複性和操作性比較差。即使是除菌效果的檢測，單純的依靠平板培養也是不可靠的，因為90%的細菌是不可培養的。因此在目前藻類基因組項目的實施過程中，我們可以看到，一些學者是加入抗生素處理，而更多的是在獲得基因組信息以後，從序列入手，包括和已有的外源微生物進行比對，根據相似性去除外源微生物的序列。或者是根據測序的覆蓋度來剔除外源微生物的序列。這兩種技術手段都存在弊端，有可能剔除不乾淨或者是將自己本身的基因組序列剔除掉。因此，在進行項目之前，就應該尋找一種從材料上解決外源微生物汙染的方法。技術實現要素：為了克服上述現有技術的不足，本發明一種從藻體表面脫除多糖和外源微生物的方法，該方法結合藻類的特性，探索出一種降低藻類外源微生物汙染的方法，其主要包括振蕩前準備預處理、機械振蕩、藻體孵育三個步驟，其不僅可以去除粘附在藻體表面的多糖，而且可以有效防止藻體表面附著的外源微生物的汙染。總之，通過機械振蕩的方法，可以有效的解決叢藻類表面多糖和細菌的問題，促進藻類基因組工作的開展。本發明通過下述技術方案實現上述技術效果：一種從藻體表面脫除多糖和外源微生物的方法，其具體包括下述步驟：1）振蕩前準備：向研磨管內加入孔徑為25-50目的石英砂0.05-0.15質量份，鋼珠0.05-0.15質量份、玻璃珠0.05-0.15份，然後在再向研磨管中加入0.1質量份的藻體，向其中加入1體積份的無菌海水，混合均勻得到振蕩材料；2）機械振蕩：將載有藻體的振蕩材料在振蕩儀上進行機械振蕩，控制振蕩轉速在5000-6000rpm之間，振蕩時間為5-30s；3）藻體孵育：振蕩完成後將材料取出置於0.05%吐溫80緩衝液中孵育4-8min，使用無菌海水進行衝洗3-4次，然後將藻體置於無菌海水中，使用紗布過濾去除藻體表面的粘液，即可得到脫除多糖和外源微生物的藻體。上述所述的從藻體表面脫除多糖和外源微生物的方法中，所述步驟1中的振蕩材料中包括25-50目的石英砂0.1質量份，鋼珠0.1質量份、玻璃珠0.1份。上述所述的從藻體表面脫除多糖和外源微生物的方法中，所述藻體孵育步驟中材料在0.05%吐溫80緩衝液中孵育時間為5min。上述所述的從藻體表面脫除多糖和外源微生物的方法中，所述步驟2中的振蕩速度為6500rpm，振蕩時間為20s。藻體在經過不同介質和強度的振蕩以後，由於藻體收到巨大的機械力很有可能造成細胞破裂，綜合藻體損失率、藻細胞成活率以及多糖及微生物的去除率可以發現，本發明實施例1對應的藻體損失率最低，藻細胞成活率以及多糖及微生物的去除率最高，為本發明的最佳實施例，即本發明所述工藝的最佳處理條件為：步驟1中的振蕩材料中包括25-50目的石英砂0.1質量份，鋼珠0.1質量份、玻璃珠0.1份；藻體孵育步驟中材料在0.05%吐溫80緩衝液中孵育時間為5min；步驟2中的振蕩速度為6500rpm，振蕩時間為20s。本發明所述的從藻體表面脫除多糖和外源微生物的方法不僅可以去除粘附在藻體表面的多糖，而且可以有效防止藻體表面附著的外源微生物的汙染。總之，通過機械振蕩的方法，可以有效的解決叢藻類表面多糖和細菌的問題，促進藻類基因組工作的開展。附圖說明圖1為處理前後藻體表面附著細菌的掃描電鏡檢測情況，左圖為處理之前，右圖為處理之後,。圖2外源微生物去除之前藻體dna中gc含量與contig深度分布圖。圖3為外源微生物去除之後藻體dna中gc含量與contig深度分布圖。具體實施方式以下通過具體實施例進一步描述本發明，但所述領域技術人員應能理解，所述實施例並不以任何方式限定本發明專利保護的範圍。實施例1本發明從藻體表面脫除多糖和外源微生物的方法一種從藻體表面脫除多糖和外源微生物的方法，其具體包括如下步驟：1）振蕩前準備：稱取孔徑25-50目的0.1g石英砂、0.1g的鋼珠、0.1g的玻璃珠加進研磨管；然後稱取0.1g藻體加進研磨管，加入1ml無菌海水；2）機械振蕩：以上加入不同研磨介質的材料通過不同的振蕩強度和時間進行機械振蕩，轉速為500rpm的轉速，振蕩時間20s；振蕩完成以後，將材料從研磨管中取出放在培養皿中；3）藻體孵育：振蕩完成後將材料取出置於0.05%吐溫80緩衝液中孵育5min，使用無菌海水進行衝洗3-4次，然後將藻體置於無菌海水中，使用紗布過濾去除藻體表面的粘液，即可得到脫除多糖和外源微生物的藻體。藻體在經過不同介質和強度的振蕩以後，由於藻體收到巨大的機械力，很有可能會造成細胞破裂，因此把藻體拿出來以後放在在0.05%吐溫80緩衝液中孵育以保持細胞的滲透壓穩定，從而維持細胞的活性；進行後續實驗之前，應該把藻體拿出來在比重為1.030的海水中初步衝洗3次，去除緩衝液的影響。研磨完以後的材料，可觀察到無菌海水的表面形成了一層粘液，這就表明已經將藻體表面的多糖已經剝離下來，同時也會將附著的細菌剝離下來。為了進一步分開藻體和剝離下來的表面多糖，用滅菌海水在燒杯中充分衝洗材料，然後用紗布過濾去除，將藻體葉片留在紗布上，含有多糖和細菌的溶液被過濾掉，通過多次的反覆衝洗和過濾，將藻體的剝離多糖（含細菌）徹底出去。為了驗證本發明處理工藝對於表面附著多糖和微生物的處理效果，對處理前後的藻體表面的細菌和微生物進行了驗證。1.處理前後藻體表面附著細菌的掃描電鏡檢測圖1為處理前後藻體表面附著細菌的掃描電鏡檢測情況（左圖為處理之前，右圖為處理之後）。掃描電鏡觀察結果顯示，除菌之前藻體的表面會由於多糖的存在，附生細菌聚集在藻體表面形成一層菌膜。這些附著細菌在經歷掃描電鏡樣品的製備過程中的多次清洗，也很難去除，因此證明這些細菌是牢固粘附在藻體的表面，如果用這樣的材料去進行藻類基因組的研究，勢必會影響研究結果的準確性。結掃描電鏡觀察結果顯示，藻體的表面由于振蕩作用和反覆衝洗，藻體表面的菌膜已經被全部剝離，只有藻體本身的細胞表面結構，說明藻體表面的細菌已經得到很好的去除。2.利用高通量測序技術鑑定未處理前後藻體總dna成分鑑定為了進一步驗證外源微生物處理前後dna的複雜成分，我們採用ctab法提取基因組dna（未處理的材料），構建了基因組文庫，並進行高通量測序工作，圖2外源微生物去除之前藻體dna中gc含量與contig深度分布圖。從k-mer分布圖可以看出，k-mer個數與深度關係分布圖異常，自左向右出現多了峰圖。初步推斷該藻類樣品可能存在嚴重的外源微生物汙染。構建contig覆蓋度及gc含量的分布圖，結果顯示gc含量分布在20-80%之間，不符合該物種gc分布的特徵；contig覆蓋度分為1-55,56-399，及400-600三個不同的區域，也是出現分布不集中的現象。將這三個不同的區域的contig與現有的ncbinucleotidedatabases資料庫進行blast比對，結果顯示：覆蓋度在1-55區間及400-600區間內的contig主要比對到海洋菌類（roseobacter，ruegeria,erythrobacter等）。覆蓋度在55-399區間內的contig，主要比對到藻類序列以及兩種少量的海洋菌類(roseobacter，lacinutrix)。進一步證明了藻類dna成分的複雜性。經過機械振蕩以後同樣提取了總dna，進行高通量測序。圖3為外源微生物去除之後藻體dna中gc含量與contig深度分布圖。結果顯示：contig深度和gc含量分布圖比較集中，證明dna的成分比較單一。且經過和資料庫的比對，細菌的比例極低。說明通過本實驗達到了降低藻類外源微生物汙染的效果，樣品可以滿足下一步基因組工作的需求。實施例2-實施例8本發明從藻體表面脫除多糖和外源微生物的方法申請人發現，藻體在經過不同介質和強度的振蕩以後，由於藻體收到巨大的機械力，很有可能會造成細胞破裂，這顯著影響著後續實驗的實驗效果，為此有必要對本發明的工藝進行進一步優化。表1實施例2-實施例8所述處理工藝表2本發明所述方法對去除效果和藻體細胞成活率的影響藻體損失率（%）細胞成活率（%）多糖去除率（%）微生物去除率（%）實施例15.3195.398.799.4實施例28.6290.194.596.7實施例310.2686.793.698.1實施例48.1488.694.797.6實施例56.2392.495.396.3實施例69.1891.896.895.8實施例77.2490.497.896.9實施例85.8488.998.695.2由表2所述的處理結果來看，實施例1對應的藻體損失率最低，藻細胞成活率以及多糖及微生物的去除率最高，為本發明的最佳實施例，即本發明所述工藝的最佳處理條件為：步驟1中的振蕩材料中包括25-50目的石英砂0.1質量份，鋼珠0.1質量份、玻璃珠0.1份；藻體孵育步驟中材料在0.05%吐溫80緩衝液中孵育時間為5min；步驟2中的振蕩速度為6500rpm，振蕩時間為20s。當前第1頁12