脅迫－誘導的啟動子及其使用方法

2023-10-11 12:30:09

專利名稱：脅迫－誘導的啟動子及其使用方法
技術領域：
本發明涉及一種獲自水稻的脅迫-誘導的啟動子及其使用方法。
現有技術植物具有耐受機制以應付自然界中不同類型的環境脅迫，例如脫水、高溫、冷凍或鹽脅迫。近年來，因為已在分子水平上闡明了脅迫耐受機制，因此可以利用生物技術的方法生產了脅迫耐受植物。例如，業已表明當細胞暴露於脅迫條件下，細胞中會誘導產生脅迫蛋白，例如LEA蛋白、水通道蛋白或能夠作用於可混溶溶質的合酶，從而保護細胞免於上述脅迫的影響。因此，已有研究嘗試過將大麥LEA蛋白的基因或菸草解毒酶的基因、作用於滲透調節物質(如，糖、脯氨酸或甜菜鹼)的合酶的基因等導入到宿主植物中。也有嘗試過利用編碼擬南芥(Arabidopsis thaliana)w-3脂肪酸脫氫酶的基因、藍綠藻D9-脫氫酶的基因，或類似的細胞膜脂類修飾酶的基因的研究。在上述研究中，一個基因與花椰菜花葉病毒的35S啟動子連接並導入植物中。但是，重組植物的脅迫耐受水平不穩定，並且導入基因的表達水平也很低。因此，這些都無法應用於實際應用中。
另一方面，研究發現，脅迫耐受機制與幾種基因關係錯綜複雜(Shinozaki K，Yamaguchi-Shinozaki K.Plant Physiol.1997年10月；115(2)327-334頁)。相應地，已有研究嘗試了將編碼轉錄因子並且同時激活上述幾種基因表達的基因連接到一個組成型啟動子上並導入植物中，從而增強植物的脅迫耐受力(Liu等，The Plant Cell，1998，101391-1406)。但是，當幾種基因同時激活時，宿主植物的能量被導向於基因產物的合成或由基因產物產生的胞內代謝。相應地，植物自身生長變得延緩或生長矮小。
相反地，本發明人從擬南芥中分離出編碼與脅迫應答元件結合併且特異性激活該元件下遊基因轉錄的轉錄因子的基因DREB1A、DREB1B、DREB1C、DREB2A和DREB2B(JP專利公開(未審查申請)No.2000-60558)。他們報導在一個植物中導入與一個脅迫誘導的rd-29A啟動子連接的基因能夠產生不影響植物生長的脅迫耐受植物(JP專利公開(未審查申請)No.2000-116260)。
所述rd-29A啟動子獲自雙子葉植物擬南芥。其也能夠在單子葉植物中起作用，但是活性水平較低。相應地，在單子葉植物中具有高水平活性的脅迫-誘導的啟動子已經成為很多研究的目標。

發明內容
本發明的目的是發現一種在象水稻這樣的單子葉植物中能有效發揮作用的脅迫-誘導的啟動子並提供一種利用該啟動子的新的環境脅迫耐受植物。
本發明人進行了集中的研究以求達到上述目的。結果，他們從水稻基因組中已成功地分離了一種強脅迫-誘導的啟動子。他們還發現單子葉植物的環境脅迫耐受力通過使用該啟動子可得到顯著提高。從而完成了本發明。
具體而言，本發明涉及一種獲自水稻的脅迫-誘導的啟動子。更具體地，該啟動子由DNA(a)或(b)組成(a)由SEQ ID NO1或10所示的核苷酸序列組成的DNA；或(b)在嚴謹條件下，與能與由SEQ ID NO1或SEQ ID NO10所示的核苷酸序列組成的DNA互補的核苷酸序列組成的DNA雜交、並表達脅迫-誘導的啟動子活性的DNA。
於此所用的術語「脅迫」是指脫水脅迫、低溫脅迫或鹽脅迫。
本發明提供了一種包含上述啟動子的重組載體。在根據本發明的啟動子的控制下，該載體可包含其它結構基因或者調節基因。特別優選的是，該載體包含用於增強脅迫耐受性的結構基因和/或調節基因。
用於增強脅迫耐受性的優選的結構基因的實例包括，P5CS基因，其是一種脯氨酸合成的關鍵酶(Yoshiba Y.等.，1999，BBRC 261)，和用於肌醇半乳糖苷合成的AtGol S3基因(Taji T.等.，2002，Plant J，29417-426)。
用於增強脅迫耐受性的優選的調節基因的例子包括，擬南芥來源的DREB轉錄因子基因(JP專利公開(未審查的申請)No.2000-60558)，水稻來源的OsDREB轉錄因子基因(JP專利申請No.2001-358268，Dubouzet等.，Plant J.出版中)，以及NCED基因，其是一種植物激素ABA生物合成的關鍵酶(Iuchi S.等.，2001，Plant J.27325-333)。
特別優選擬南芥來源的DREB轉錄因子基因和水稻來源的OsDREB轉錄因子基因。最優選水稻來源的OsDREB轉錄因子基因。
本發明提供了一種轉基因植物，其通過將本發明的載體導入到合適的宿主中而獲得。根據本發明的一個實施方案，所述轉基因植物通過將本發明的載體導入到一種宿主植物中而獲得。在這種情況下，該宿主植物優選是單子葉植物，該單子葉植物優選是水稻。
通過將本發明的啟動子導入到植物中，本發明進一步提供了一種用於增強植物脅迫耐受力的方法。本發明的啟動子表現出強的脅迫-誘導的啟動子活性，該活性從未在單子葉植物中被觀察到，因此本發明的啟動子更適於增強單子葉植物的脅迫耐受力。
附圖簡述


圖1表示當實施各種脅迫時，對a0022(LIP9)Northern分析的結果。
圖2表示a0022(LIP9)其啟動子區的核苷酸序列。
圖3表示GUS表達構建體的結構，其中Tg7代表g7終止子，HPT代表潮黴素磷酸轉移酶，Pnos代表Nos啟動子，以及Tnos代表Nos終止子。
圖4是一個顯示當實施脫水脅迫時，通過導入不同的連接到GUS基因的啟動子製備的轉基因菸草或水稻的GUS活性的圖。
圖5是一個顯示當實施鹽脅迫時，通過導入一種連接到GUS基因的LIP9啟動子製備的轉基因水稻的GUS染色結果的圖。
圖6顯示了通過Northern方法分析導入的基因和靶基因(LIP9(a0022)，WSI724(a0066)，和salT(a2660))在轉基因水稻和野生型水稻中表達水平的結果，其中「a，」「b，」和「c」各自分別代表一種轉基因植物品系。
圖7表示a0066(WSI724)其啟動子區的核苷酸序列。
圖8是一個顯示當實施脫水脅迫時，通過導入一種連接到GUS基因的WSI724啟動子製備的轉基因水稻的GUS活性的圖，其中右邊的條代表當實施脫水脅迫時的GUS活性，左邊的條代表對照。
圖9是一個顯示當實施脫水脅迫時，通過導入一種連接到GUS基因的WSI724啟動子製備的轉基因水稻的GUS染色結果的照片。
該說明書包括公開於日本專利申請No.2003-80847的說明書的部分或全部內容，其是本申請的優先權文件。
發明的實施方案本發明的啟動子是一種水稻來源的啟動子，其特異性地由諸如低溫、脫水或鹽脅迫的環境脅迫所誘導。
1.本發明啟動子的鑑定本發明的啟動子可鑑定如下。比較被實施脅迫和沒有被實施脅迫的植物，以及首先，篩選以顯著差異水平表達的基因(脅迫-誘導的基因)。隨後，基於基因組信息，篩選被認定為基因啟動子的序列。
以下描述了本發明啟動子的鑑定過程。
1.1mRNA的製備首先，製備用於篩選脅迫-誘導的基因的mRNA。
mRNA的來源可以是植物的局部，例如，葉子、莖、根或花朵，或者是植物整體。可選擇地，可使用由播種到例如GM培養基、MS培養基或#3培養基這樣的固體培養基上並無菌生長而獲得的植物。其來源可以是愈傷組織或是無菌生長的植物的培養細胞。
在該篩選過程中，觀察給予脅迫的植物和沒有給予脅迫的植物之間基因表達水平的差異。因此，有必要為每種植物來製備mRNA。實施脅迫的適宜方法取決於所利用的植物類型。通常，脫水脅迫能夠通過2-4星期不給植物澆水來實施。低溫和冷凍脅迫能通過在15至-10℃下培養植物1-10天來實施。鹽脅迫能通過在100-600mM NaCl中培養植物1小時-7天來實施。例如，就水稻來說，將溶液培養的水稻暴露於低溫脅迫(10至-4℃)，鹽脅迫(150-250mM NaCl中)和脫水脅迫(乾燥的狀態)中。
用液氮凍融給予脅迫和沒有給予脅迫的植物，並在研臼中研磨，等等。從所產生的研磨材料中，採用乙二醛法、硫氰酸胍和氯化銫法，氯化鋰和尿素法、蛋白酶K和脫氧核糖核酸酶法，或類似的方法，提取粗RNA組分。接著，從該粗RNA組分中，可以通過採用寡dT-纖維素、攜帶多U-瓊脂糖的瓊脂糖2B親和柱的方法或類似方法，或者分批的方法，能獲得poly(A)+RNA(mRNA)。如果需要，獲得的mRNA可以通過蔗糖密度梯度離心或類似的方法進一步分級分離。
1.2脅迫-誘導的基因的篩選脅迫-誘導的基因的篩選是基於被給予脅迫和沒有被給予脅迫的植物基因表達水平差異的比較。用於基因表達水平比較的方法沒有特別的限制，且可使用方法的具體例子包括傳統方法，例如RT-PCR、實時PCR、扣除、差異顯示、示差雜交以及交叉雜交。
利用諸如基因晶片以及cDNA微陣列的固相樣品的方法特別適用於實施篩選過程，因為該方法能夠同時定性並定量檢測幾千到幾萬個基因的表達。
(1)cDNA微陣的製備在篩選過程中使用的cDNA微陣列沒有特殊的限制，只要將單子葉植物(如水稻)的cDNA，即啟動子的檢測靶點，點在其上即可。可以利用現有的微陣列，或可使用常規方法製備點陣(如，The Plant Cell(2001)1361-72，Seki等)。
當製備cDNA微陣列時，首先應製備目的植物的cDNA文庫。可通過常規方法構建cDNA文庫，使用方法(1)製備的mRNA作為模板。要被點加的cDNA無特殊限制，只要其來源於單子葉植物。從隨後基因組資料庫分析簡化的觀點考慮，來源於像水稻這樣具有高級基因組分析的單子葉植物是優選的。植物可在正常狀態下(未處理)。然而，優選暴露於像脫水、鹽或低溫這樣的脅迫下的植物。
當建立cDNA文庫時，首先利用一個商售的試劑盒(如，ZAP-cDNA合成試劑盒，Stratagene)進行mRNA的反轉錄和單鏈cDNA的合成。然後，利用合成的單鏈cDNA作為模板合成雙鏈cDNA。隨後，將一個含有合適限制酶切位點的連接物添加到所合成的雙鏈cDNA上，然後將該雙鏈cDNA插入到λ噬菌體載體的克隆位點上。利用商售試劑盒(如，Gigapack III Gold包裝提取物(Stratagene))在體外對合成的DNA進行包裝，使之感染E.coll宿主，再進行擴增。因此可獲得目的cDNA文庫。
一旦製備了cDNA文庫，就用PCR擴增該cDNA或其具有高度特異性的區域(如，在3』端的不包含重複序列的UTR區)以產生要被固定在微陣列上的探針。當通過重複該過程獲得所有目的基因的探針時，可利用商售點樣器(如，由Amersham製造的)將這些探針點加到載玻片上。這樣就獲得了目的cDNA微陣列。
(2)基因表達水平的檢測當標記有合適試劑的樣品mRNA(或cDNA)在微陣列上與cDNA探針雜交時，可通過cDNA微陣列獲得的信號強度檢測基因表達水平。一般而言，基因的表達水平優選確定為與合適的對照可比較的一個值，或是考慮到微陣列上點加的cDNA探針數量上的差異，在兩個要被比較的樣品之間的表達水平的比率。就本發明篩選過程而言，來自未實施脅迫(沒有處理)的植物的mRNA作為對照，則獲自實施脅迫的植物的mRNA的相對表達水平可通過它們的比例關係而得到測定。
檢測按如下進行。對照和樣品的mRNAs(或其cDNA)用不同的螢光染料(如Cy3和Cy5)進行標記，並與陣列上的cDNA探針雜交。例如，從實施脅迫的植物中提取mRNA並在Cy5標記的dCTP存在下進行反轉錄以製備Cy5標記的cDNA。隨後，從未實施脅迫(未被處理)的植物中提取mRNA，並用同樣的方法製備Cy3標記的cDNA。將相等數量的Cy5標記的cDNA(樣品)和Cy3標記的cDNA(對照)混合，然後將產物與陣列上的cDNA雜交。Cy3可用於標記樣品，Cy5可用於標記對照物。可選擇地，也可使用其它合適的標記反應物。
利用螢光信號探測器讀取所獲得的螢光強度並隨後轉化為數值。該數值等同於樣品的基因表達水平相對於對照的比率。任選地，對於每個樣品將掃描儀讀取的螢光強度進行誤差調整或方差歸一化。在每種樣品中都普遍表達的基因如管家基因的基礎上，可進行歸一化。此外，確定用於可靠性的閾值界限以除去低相關性數據。
(3)脅迫誘導基因的篩選基於陣列分析結果，脅迫誘導基因被指定為在實施脅迫和未實施脅迫的植物中以顯著差異水平表達的基因。於此所用的術語「顯著差異」是指，例如，在1000或者更高的強度水平上，兩種植物之間的差異在3倍或3倍以上。
(4)通過Northern印跡法分析表達對如上所選擇的基因進一步進行Northern分析及類似的分析。因此，證實了基因表達水平增加與脅迫耐受水平增強相關。例如，將植物暴露於以如上所描述的方式進行的如鹽、脫水、溫度的不同水平的脅迫下。然後，從植物中提取RNA並通過電泳分離。將所分離的RNA轉移到硝酸纖維素膜上，並與特異於該基因的標記的cDNA探針雜交。如此，其表達水平可得到檢測。
如果所選基因表達水平以脅迫依賴方式增加，可確定該基因是脅迫誘導的。從水稻cDNA文庫篩選的脅迫誘導基因的例子包括本發明的a0022(LIP9SEQ ID NO2)和a0066(WSI724SEQ ID NO8)。a0022和a0066是固定在微陣列上的cDNA的標識號。
1.3啟動子序列的篩選(1)基因資料庫的篩選隨後，利用檢測軟體(如Blast)，在現有的基因資料庫(如，DDBJ資料庫)中尋找脅迫-誘導的基因的啟動子序列。至於像水稻這樣的植物，其基因組大部分已被破譯，可利用現有的資料庫尋找所有控制特異性脅迫誘導基因的啟動子序列。來自高度同源於脅迫-誘導的基因(cDNA)的基因組基因的上遊區域中被認作啟動子的區域選擇作為啟動子序列。例如，基於脅迫誘導基因的基因組信息，將假定為這些基因的一個起始密碼子位點的上遊大約1到2kb區域推測為一個啟動子區域。
在一些常用的脅迫-誘導的啟動子的序列中，所含有的順式(cis)元件與啟動子活性相關，例如脫水應答元件(DRE)、脫落酸應答元件(ABRE)以及低溫脅迫應答元件。當一個脅迫-誘導的轉錄因子結合至順式元件時，激活了前述啟動子，在啟動子控制下的脅迫-耐受-給予基因被允許得到表達。相應地，如果尋找到包含在上遊區域的順式元件，該區域很有可能是脅迫-誘導的啟動子。
因此，獲得了高度同源於前述a0022(LIP9SEQ ID NO2)的基因的基因組信息，並從該基因的上遊1.1kb區域中篩選到一個推測的LIP9啟動子序列(SEQ ID NO1)。類似地，從高度同源於a0066(WSI724SEQ ID NO8)的基因的上遊區域中篩選到一個推測的WSI724啟動子序列(SEQ ID NO10)。
(2)脅迫-誘導的啟動子功能的確定隨後，通過脅迫實施時啟動子活性的改變來確定所推測的啟動子序列的功能。
最初，基於上文所推測的啟動子序列製備引物。使用基因組DNA作為模板進行PCR，克隆啟動子。隨後，將一個報告基因連接到啟動子下遊以產生一個報告質粒。然後，將所產生的報告質粒導入到植物中，接著研究對植物(優選其T2代)實施脅迫時報告基因的表達。報告基因的例子包括β-葡糖醛酸糖苷酶(如，GUSpBI121，Clontech)、螢光素酶基因以及綠螢光蛋白基因。優選GUS，因為其活性可通過數值來顯示且其表達可通過染色進行肉眼觀察。
1.4本發明的啟動子基於上述，發現水稻基因組來源的LIP9啟動子序列(SEQ ID NO1)是一種脅迫-誘導的啟動子，它們以脫水-、低溫-或鹽脅迫-依賴方式得到高表達。
如上所述，LIP9啟動子為所有類型的脅迫所特異性誘導。其結構和功能特徵描述如下。
1)LIP9啟動子在其結構中包含與脫水脅迫誘導相關的2個DRE順式元件(圖2)。
2)在允許OsDREB1基因(日本專利申請號2001-358268)過表達的植物中，LIP9的表達水平是高的，所述OsDREB1基因是一種水稻來源的轉錄因子，其結合DRE順式元件並激活位於其下遊基因的轉錄。
3)LIP9啟動子包含與OsDREB1蛋白結合的DRE序列。因此，推測對於OsDREB基因的過表達而言，LIP9啟動子是最適合的。
此外，WSI724基因是OsDREB基因的靶點。該推測是基於WSI724啟動子在其結構中包含2個DRE序列這樣的事實所作出，也是基於當實施脅迫時a0066的表達譜而作出的(該表達譜是通過脫水、鹽以及低溫脅迫所誘導的，以及低溫的誘導速率是低於脫水和鹽的)。
本發明的啟動子並不限於由如SEQ ID NO1或10所示的核苷酸序列組成的DNA。本發明的脅迫-誘導的啟動子包括，在嚴謹條件下，能與由SEQ ID NO1或SEQ ID NO10所示的核苷酸序列組成的DNA互補的核苷酸序列組成的DNA雜交的DNA，只要該DNA具有脅迫誘導啟動子的活性。在「嚴謹條件」下，是指雜交在30-50％甲醯胺中，於37℃至50℃，在6xSSC中進行，優選在50％甲醯胺，於42℃，在6xSSC中進行。
2.重組載體本發明的重組載體包括本發明的啟動子。該載體可包括其它功能性結構基因或本發明的啟動子下遊的調節基因。優選的基因實例包括用於增強脅迫耐受性的結構基因和/或調節基因。術語「功能性」指在本發明啟動子控制下，其它結構基因或調節基因適宜表達的一種狀態。
由增強脅迫耐受性的結構基因編碼一種蛋白，該蛋白在增強植物對於像脫水、低溫或鹽脅迫的環境脅迫耐受中發揮作用。這些蛋白的實例包括LEA蛋白；水通道蛋白；作用於可混溶溶質的合酶；菸草解毒酶；作用於滲透調節物質(如，糖、脯氨酸或甜菜鹼)的合酶；編碼擬南芥w-3脂肪酸脫氫酶和藍綠藻D9-脫氫酶的基因，它們是細胞膜脂類修飾酶；P5CS，其是一種脯氨酸合成的關鍵酶；以及用於肌醇半乳糖苷合成的AtGolS3基因。
用增強脅迫耐受性的調節基因調節脅迫-誘導的啟動子活性以及用於產生脅迫耐受性的基因的表達，從而增強植物中的脅迫耐受性。這樣的調節基因例子包括擬南芥來源的轉錄因子，例如DREB1A、DREB2A、DREB1B和DREB1C基因(JP專利公開(未審查的申請)號.2000-60558)；水稻來源的轉錄因子，例如OsDREB1A、OsDREB1B、OsDREB1C、OsDREB1D和OsDREB2A基因轉錄因子(日本專利申請號2001-358268)；以及NCED基因，其是植物激素ABA生物合成的關鍵酶。
當本發明的啟動子包含一個特異性順式元件時，結合該順式元件並增強其啟動子活性的轉錄因子的基因特別優選地連接於該啟動子的下遊。
如上所述，本發明的LIP9啟動子其結構中包含2個DRE序列。因此，優選將DREB或OsDREB基因(例如，OsDREB1A、OsDREB1B、OsDREB1C、OsDREB1D、OsDREB2A或OsDREB2B基因)連接到LIP9啟動子下遊。最優選OsDREB基因。
因為WSI724啟動子也包含2個DRE序列，因此推測其是OsDREB的靶點，優選將DREB或OsDREB基因(例如，OsDREB1A、OsDREB1B、OsDREB1C、OsDREB1D、OsDREB2A或OsDREB2B基因)連接到WSI724啟動子下遊。最優選OsDREB基因。
通過連接(插入)本發明的啟動子或啟動子和其它調節基因或結構基因到(至)合適的載體上，構建得到本發明載體以致其具有功能性。要被插入啟動子的載體沒有特殊限制，只要其能夠在宿主中複製即可。例如，質粒DNA、噬菌體DNA或類似可被使用的。質粒DNA包括用於大腸桿菌(E.coli)宿主的質粒，例如，pBR322、pBR325、pUC118和pUC119；用於枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)宿主的質粒，例如pUB110和pTP5；用於酵母宿主的質粒，例如，YEp13、YEp24和YCp50；以及用於植物細胞宿主的質粒，例如，pBI221和pBI121。噬菌體DNA包括λ噬菌體和類似的噬菌體。此外，也可使用動物病毒載體，例如，逆轉錄病毒或牛痘病毒載體，或也可使用昆蟲病毒載體，例如杆狀病毒載體。
通過用合適的限制酶切割純化的DNA並接著插入到用於連接的合適載體的限制性酶切位點或多克隆位點，可將本發明的啟動子插入到載體中。
如果需要，本發明的重組載體可包含一個剪接信號、poly(A)添加信號、選擇標記、核糖體結合序列(SD序列)等等。選擇性標記的實例為二氫葉酸還原酶基因、氨苄青黴素耐受基因，新黴素耐受基因等等。
3.轉基因植物可通過將本發明的重組載體導入宿主中以便啟動子活性能夠表達來製備本發明的轉基因植物。宿主並無具體限制，只要本發明的啟動子能在其中起作用即可。宿主優選為植物，特別優選為象水稻這樣的單子葉植物體。
當植物或植物細胞用作為宿主時，例如，使用從水稻、玉米、小麥、擬南芥，菸草或胡蘿蔔確立的細胞或製備自這些植物的原生質體。用於將重組載體導入植物的方法包括Abel等的方法，該方法利用了聚乙二醇(Abel，H.等，Plant J.5421-427，1994)，以及電穿孔。
4.脅迫耐受性轉基因植物(1)製備轉基因植物將用於增強耐受脅迫性的結構基因和/或調節基因導入植物，使之置於本發明的啟動子的控制之下。從而，能夠製備得到對環境脅迫耐受性增強了的功能性轉基因植物，所述環境脅迫是例如低溫、冷凍或脫水的脅迫。特別優選的宿主植物的實例是單子葉植物。
用於將本發明的啟動子等導入宿主植物的方法包括間接導入法例如農桿菌感染法以及直接導入法例如粒子槍法、聚乙二醇法、脂質體法和顯微注射法。迄今為止，使用農桿菌感染法從象水稻這樣的單子葉植物製備得到轉基因植物是很困難的。但是，加入乙醯丁香酮可使農桿菌感染水稻。因此，使得農桿菌感染法可用於單子葉植物。
本發明下文中將描述用農桿菌製備轉基因植物。
要被導入植物的重組載體可通過下述方法製備而成用合適的限制性酶對包含本發明的啟動子和用於增強脅迫耐受的結構基因和/或調節基因的DNA進行切割，如有必要，在切割後的DNA上連接一合適的接頭，然後將該DNA插入可用於植物細胞宿主的克隆載體中。二元載體型質粒，如pBI2113Not、pBI2113、pBI101、pBI121、pGA482、pGAH和pBIG，或中間載體型質粒如pLGV23Neo、pNCAT和pMON200可用作為克隆載體。
當使用二元載體型質粒時，目的基因要插入到二元載體的兩鄰接序列(LB、RB)之間。所得到的重組載體在大腸桿菌中擴增。然後通過凍融、電穿孔等方法將擴增後的重組載體導入根癌農桿菌C58(Agrobacterium rumefaciens C58)、LBA4404、EHA101、C58C1RifR、EHA105等中。將所得到的農桿菌用用於轉化植物。
在本發明中，除上述方法外，還可用三元偶聯法(Nucleic AcidsResearch，128711，1984)來製備要導入植物中的農桿菌。具體而言，將包括目的基因的含質粒大腸桿菌、輔助性含質粒大腸桿菌(如pRK2013)以及農桿菌混合併在含利福平和卡那黴素的培養基上培養。因此，可得到待感染到植物體中的結合子農桿菌。
對於在植物體內表達外源基因等而言，應該將植物終止子等置於結構基因的下遊。可用於本發明的終止子序列的具體實例包括花椰菜花葉病毒來源的和胭脂氨酸合成酶基因來源的終止子。終止子不限於上述的終止子，只要已知它們在植物體中能夠發揮作用即可。
為了有效地篩選目的轉基因細胞，優選使用可有效篩選的標記基因。可用選自下列基因的一個或多個基因作為篩選標記卡那黴素耐受(NPTII)基因、可賦予植物對抗生素潮黴素耐受性的潮黴素磷酸轉移酶(htp)基因、可賦予雙丙氨膦耐受性的膦絲菌素醯基轉移酶(bar)基因等。本發明的啟動子和篩選標記基因可一起插入到同一載體中。可選擇地，它們可各自插入不同的載體中。
如果用上述方法製備的農桿菌感染植物，那麼就可製得目的轉基因植物。
將該轉基因植物播種在含足量抗生素的培養基上，然後篩選獲得含目的啟動子和基因的植物。將篩選得到的植物轉移到含BonsolNo.1、黑土或類似成分的罐中，並進行進一步的培養。通常來說，基因都是以類似的方式導入宿主植物的基因組中。但是，由於導入的基因在基因組上的位置不同，會使得導入基因的表達情況隨之變化。這種現象稱之為「位置效應」。通過使用來自導入基因的DNA片段作為探針通過Northern印跡法對轉基因植物進行分析，有可能篩選出那些其中導入基因更高表達的轉基因植物。
(2)脅迫耐受性的確認轉基因植物及其後代中是否整合了本發明所述啟動子或結構基因和/或用於增強脅迫耐受性的調節基因，可以採用下述方法對其確認從這些植物的細胞及組織中提取DNA，並用本領域常規方法PCR或Southern分析對導入的基因進行檢測。
基因在轉基因植物中的表達水平及表達器官可以通過下述方法分析從植物細胞及組織中提取RNA，通過本領域常規方法RT-PCR或Northern分析檢測導入的基因的mRNA。可選擇地，導入基因的轉錄產物可通過使用抗該產物的抗體或類似物經Western印跡法進行直接分析。
已經導入了本發明所述啟動子的轉基因植物對於環境脅迫的耐受性可以通過下述方法評估將該轉基因植物栽培在一裝有土壤的罐中，所述土壤中含有蛭石、珍珠巖、Bonsol等或用溶液培養植物，將該植物暴露於不同類型的環境脅迫下，然後檢測植物的存活情況。環境脅迫包括低溫、脫水及鹽脅迫。例如，對脫水脅迫的耐受性可通過讓植株無水生長2-4周，然後檢測其存活情況來評價。對低溫和冷凍脅迫的耐受性可以通過讓植物在15至-10℃下生長1-10天，在20-35℃下生長2天-3周，然後測定其存活比率來評價。對鹽脅迫的耐受性可通過，例如，讓植物在100-600mM NaCl中生長1小時-7天，在20-35℃下生長1-3周，然後測定存活比率來評價。因此，使用本發明的啟動子能顯著增強脅迫耐受性而不阻礙植物的生長(特別是單子葉植物)。
(3)優選的轉基因植物的實例本發明優選的轉基因植物的實例是通過將包含連接LIP9或WSI724啟動子下遊的功能性OsDREB基因的載體導入象水稻或小麥這樣的單子葉植物中所製備的一種植物。因為LIP9啟動子包含2個DRE區域，因此OsDREB基因可通過與順式元件結合以有效地發揮脅迫耐受的作用。同樣地，WSI724啟動子包含2個DRE區域，因此，可增加OsDREB基因的表達水平並增強植物的脅迫耐受性。
實施例根據下列實施例，本發明得到更詳細的描述，但是，本發明的技術範圍不為此所限。
脅迫-誘導的水稻基因的鑑定使用cDNA微陣列及Northern分析搜索脅迫-誘導的水稻基因。
1.水稻cDNA微陣列的製備將在培養液中生長2-3周的水稻種子(Nihonbare)經受脫水、鹽或低溫脅迫。通過室溫下空氣乾燥來實施脫水脅迫，通過在250mMNaCl溶液中培養實施鹽脅迫，通過在4℃下培養實施低溫脅迫。將已用每一種脅迫處理過的水稻用液氮冷凍。通過硫氰酸胍及氯化銫法從冷凍樣品中提取總RNA，並用寡聚(dt)-纖維素柱製備mRNA。利用所得到的mRNA作模板用HybriZAP-2.1雙雜交cDNA Gigapack克隆試劑盒(Stratagene)合成cDNA，並將得到的cDNA插入並克隆到HybriZAP-2.1噬菌粒載體的EcoRI-XhoI切割位點上。使用GigapackIII Gold包裝提取物(Stratagene)包裝該噬菌粒DNA。所得到的含cDNA的λ噬菌體顆粒被用於感染宿主大腸桿菌，然後擴增這些噬菌體顆粒，並隨後以噬菌體懸液方式回收這些噬菌體。
對cDNA克隆的核苷酸序列進行測序以篩選出約1500個單獨的克隆。通過PCR擴增所篩選的克隆並用GTMASS系統(Nippon Laserand Electronic Laboratory)將其印在聚-L-賴氨酸-包被的顯微載玻片(型號S7444，Matsunami)上。然後，通過UV交聯將克隆固定以製備水稻cDNA微陣列(The Plant Cell，2001，1361-72Seki等)。
2.微陣列分析以與上文相同的方法對水稻植株實施脫水、鹽或低溫脅迫或用100μM脫落酸處理(5小時或10小時)，分別從這些植株以及未受脅迫的水稻植株(未經處理)中提取mRNA。以來自未經處理水稻植株的mRNA作為對照，並用來自已經各種脅迫或脫落酸處理的水稻植株的mRNA作為樣品。通過用Cy3和Cy5雙重螢光標記的方法進行cDNA微陣列分析。作為微陣列分析的結果，強度為1000或更高的基因以及具有表達水平比對照高3倍的基因被選作為侯選的脅迫-誘導的基因。因此，a0022(LIP9SEQ ID NO2)和a0066(WSI724SEQ ID NO8)被選作為脅迫-誘導的基因。
3.通過Northern雜交進行表達分析通過Northern雜交分析上文中所選擇的基因的特徵性表達。首先，將水稻植株暴露於脫落酸、脫水、低溫、鹽或水脅迫，然後每隔0、1、2、5和10小時從施加了脅迫的水稻中完成取樣。脫落酸、脫水、低溫或鹽脅迫分別以與1中相同的方法施加，用將植株浸沒於純水中的方法施加水脅迫。從每一樣本中製備總RNA，進行電泳，並通過Northern方法觀察每一基因的表達。結果見
圖1。
由
圖1清楚可見，a0022基因的表達受脫落酸、脫水、低溫、或鹽脅迫誘導。具體而言，其表達為脫落酸、脫水或鹽脅迫所快速誘導。相反地，其表達為低溫脅迫所緩慢誘導。基於施加脅迫時的表達譜(該表達譜是通過脫水、鹽和低溫脅迫所誘導的，低溫誘導速率較脫水和鹽誘導為慢)，a0066基因是OsDREB的靶點。
啟動子序列的篩選1.水稻基因組資料庫的篩選使用Blast，從DDBJ水稻基因組資料庫中搜索實施例1中被選作為脅迫-誘導基因的a0022(LIP9SEQ ID NO2)的cDNA的同源位點。結果，在觀察到同一性的基因中，位於該基因從起始密碼子上遊向5』端方向的1.1kb序列選作為啟動子序列(SEQ ID NO1)。對a0066(WSI724SEQ ID NO8)也進行了類似的搜索，篩選到其啟動子序列(SEQ ID NO10)。
圖2顯示了LIP9啟動子區域的結構。由圖2清楚可見，LIP9其結構中包含2個DRE順式元件((A/G)CCGAC)。圖7顯示了WSI724啟動子區域的結構。也發現該WSI724啟動子其結構中包含2個DRE順式元件((A/G)CCGAC)。
2.克隆以所篩選到的啟動子序列為基礎，設計引物，利用水稻基因組DNA作為模板進行PCR，並進行克隆。引物序列和PCR所使用的條件如下用於LIP9啟動子的引物序列正向引物5』-CACGAAGCTTTCATCAGCTATTCATCAA-3』(SEQ ID NO3)反向引物5』-CCGGATCCTCGATCGATGGATTCAGCTA-3』(SEQ ID NO4)用於WSI724啟動子的引物序列正向引物5』-CCATTGGATCCAGCCGTGGAAGTCCAAC-3』(SEQ ID NO11)反向引物5』-GCCGGGGATCCTTGGCGCCTCTCTCTCT-3』(SEQ ID NO12)PCR條件95℃持續1分鐘，55℃持續1分鐘，68℃持續2分鐘，30個循環。
LIP9啟動子抗脅迫活性(1)製備轉基因植物用玉米的泛蛋白啟動子取代pBIG29APHSNot的啟動子位點以製備G-ubi質粒。用BamHI-HindIII切割G-ubi質粒並連接到以同樣方式切割的LIP9啟動子的片段上。將已整合入LIP9啟動子的質粒用BamHI-EcoRI切割並連接到從pBI221(Clontech)中用BamHI-EcoRI以同樣方式切割得到的Gus基因上，以製備GUS-表達構建體G-LIP9GUS(圖3)。通過電穿孔將質粒G-LIP9GUS導入農桿菌EHA105中，培養後用10％甘油洗滌，從而製備得到農桿菌EHA105(G-LIP9GUS)。以下列方式用該農桿菌EHA105(G-LIP9GUS)感染水稻來製備目的轉基因植物。
將水稻種子浸沒在70％乙醇中1分鐘，然後浸沒在2％次氯酸鈉中1小時消毒。接著用無菌水洗滌消毒後的種子，每種種子各取9粒播種在N6D固體培養基(每升中含3.98g CHU[N6]基礎鹽混合物(Basal Salt Mixture)(Sigma)、30g蔗糖、100mg肌醇、300mg酪蛋白胺基酸、2，878mg L-脯氨酸、2mg甘氨酸、0.5mg煙酸、0.5mg鹽酸吡哆醇、1mg鹽酸硫胺素、2mg 2，4-D以及4g Gellite，pH5.8)平板上，然後培養24天。如此，愈傷組織得到誘導。將大約20顆種子所形成的愈傷組織轉移到新的N6D固體培養基上，然後再培養3天。
將農桿菌EHA105(G-LIP9GUS)分別在含100mg/l利福平和含20mg/l卡那黴素的5ml YEP培養基(每升中含細菌培養用蛋白腖10g、細菌培養用酵母提取物10g、NaCl 5g、MgCl2·6H2O 406mg，pH7.2)中在28℃下培養24小時。用含20mg/l乙醯丁香酮的AAM培養基(每升中含10mg MnSO4·5H2O、3mg H3BO3、2mg ZnSO4·7H2O、250μgNa2MoO4·2H2O、25μg CuSO4·5H2O、25μg CoCl2·6H2O、750μg KI、150mg CaCl2·2H2O、250mg MgSO4·7H2O、40mg Fe-EDTA、150mgNaH2PO4·2H2O、1mg煙酸、10mg鹽酸硫胺素、1mg鹽酸吡哆醇、100mg肌醇、176.7mg L-精氨酸、7.5mg甘氨酸、900mg L-谷醯胺、300mg天冬氨酸和3g KCl，pH5.2)稀釋該農桿菌至O.D.660值為0.1。由此，製備得到20ml農桿菌懸液。
隨後，將農桿菌懸液加入培養了3天後的愈傷組織，然後混合1分鐘。接著，將該愈傷組織放置在消毒後的紙巾上以去除多餘的農桿菌懸液，然後在其上已放置了消毒後的濾紙的2N6-AS固體培養基(每升中含3.98g CHU[N6]基礎鹽混合物、30g蔗糖、10g葡萄糖、100mg肌醇、300mg酪蛋白胺基酸、2mg甘氨酸、0.5mg煙酸、0.5mg鹽酸吡哆醇、1mg鹽酸硫胺素、2mg 2，4-D、10mg乙醯丁香酮以及4gGellite，pH5.2)上培養，於黑暗處在25℃下培養3天。培養3天後，用含有500mg/l羧苄青黴素的3％蔗糖水溶液徹底洗滌該培養產物直至該產物無汙斑。將洗滌後的培養產物在含500mg/l羧苄青黴素和10mg/l潮黴素的N6D培養基上再培養1周。然後，將所得到的培養產物轉移到含500mg/l羧苄青黴素和50mg/l潮黴素的N6D固體培養基上再培養18天。然後，把該愈傷組織轉移到再分化培養基(每升含4.6g Murashige和Skoog植物鹽混合物(Plant Salt Mixture)(NihonPharmaceutical Co.，Ltd)、30g蔗糖、30g山梨醇、2g酪蛋白胺基酸、100mg肌醇、2mg甘氨酸、0.5mg煙酸、0.5mg鹽酸吡哆醇、0.1mg鹽酸硫胺素、2mg NAA、2mg激動素、250mg羧苄青黴素、50mg潮黴素以及8g瓊脂糖，pH5.8)。每隔一周將產物轉移到新的培養基上進行再分化。將那些芽體長到約1cm長的產物轉移到無激素培養基(每升含4.6g Murashige和Skoog植物鹽混合物(Nihon PharmaceuticalCo.，Ltd)、30g蔗糖、2mg甘氨酸、0.5mg煙酸、0.5mg鹽酸吡哆醇、0.1mg鹽酸硫胺素、50mg潮黴素以及2.5g Gellite，pH5.8)。將那些在無激素培養基上生長到約8cm的植物體轉移到裝有合成顆粒狀盆用土壤(Bonsol No.1，Sumitomo Chemical Co.，Ltd.)的盆中讓轉基因植物產生種子。
類似地，將rd29A啟動子(Nature Biotechnology1999，17287-291)、35S啟動子或salT啟動子(SEQ ID NO5)連接到GUS基因上遊以得到構建體。將所得到的構建體導入水稻和/或菸草中。
該salT啟動子是一種通過以與LIP9啟動子相同的方法進行篩選，分離自水稻基因組的脅迫誘導啟動子。固定在微陣列上salT啟動子cDNA的ID號為a2660。儘管salT啟動子在其結構中並不包含特定的順式序列，但證實了其表達是受脫落酸、脫水、低溫或鹽脅迫所誘導的(日本專利申請號2002-377316)。
(2)啟動子抗脫水脅迫活性將所獲得的GUS-表達轉基因水稻的T2代用溶液培養2周，並以與實施例1相同方式暴露於脫水脅迫。
就表達GUS的轉基因菸草而言，讓從T1代植株再生得到的植株在植物生長錐體中生長3-5周，將生長的葉片一分為二。其中一半作為對照測定，另一半在室溫下空氣乾燥，然後暴露於脫水脅迫下。
4-甲基傘形酮-β-D-葡萄糖苷酸降解導致螢光強度的變化，據此來分析轉基因水稻和菸草的GUS活性。圖4顯示了在施加脫水脅迫時導入不同啟動子的轉基因植株的GUS活性。
由圖4清楚可見，脅迫-誘導的salT或LIP9啟動子在單子葉植物，即水稻，中的活性水平比rd29A啟動子要高。具體而言，LIP9啟動子的活性大約比salT啟動子高兩倍。雖然，LIP9啟動子也在雙子葉植物菸草中表現出脅迫-誘導的啟動子活性，但是其活性較水稻為弱。
(3)啟動子抗鹽脅迫活性隨後，將其中已導入LIP9啟動子-GUS構建體的水稻整個植株浸沒入鹽水中，接著進行GUS染色。結果，整個植株都被染色(圖5)。在此基礎上，發現LIP9啟動子在施加了鹽脅迫的植株的所有部位中都能夠發揮作用。
WSI724啟動子抗脅迫活性以與實施例3相同的方式使用WSI724啟動子製備轉基因水稻，並研究其脅迫應答。
(1)製備轉基因植物用玉米的泛蛋白啟動子取代pBIG29APHSNot的啟動子位點以製備G-ubi質粒。用BamHI-HindIII切割G-ubi質粒並連接到以同樣方式切割的WSI724啟動子的片段上。用BamHI切下WSI724啟動子的PCR片段並平端化，連接到pBIG載體位點上，用SamI切割該載體以製備GUS-表達構建體(WSI724GUS)。隨後，通過電穿孔將WSI724GUS導入農桿菌EHA105中，培養後用10％甘油洗滌，從而製備得到農桿菌EHA105(WSI724GUS)。用該農桿菌EHA105(WSI724GUS)感染水稻來製備目的轉基因植物。
(2)啟動子抗脫水脅迫活性基於4-甲基傘形酮-β-D-葡萄糖苷酸降解所導致螢光強度的改變，以與實施例3相同的方式將GUS-表達轉基因水稻暴露於脫水脅迫中以測試其GUS活性。結果，在已施加脫水脅迫的轉基因水稻葉子中觀察到的GUS活性(在這裡葉子已被切下並允許放置24小時)高於在對照的葉子中所觀察到那些(在這裡上述葉子已被切下並接著馬上冷凍)。對已施加脫水脅迫(持續24小時)的轉基因水稻進行GUS染色，在根和葉子中都觀察到了GUS活性。
導入轉基因水稻的基因的表達，LIP9基因和WSI724基因以與實施例3相同的方式製備轉基因植物。通過在玉米泛蛋白啟動子或35S啟動子的控制下，將OsDREB1A基因(SEQ ID NO6)或DREB1C基因(SEQ ID NO8)導入水稻中以製備轉基因植物。通過Northern方法分析已導入轉基因植物的REB1C基因的mRNA水平以及LIP9(a0022)、WSI724(a0066)和salT(a2660)的mRNA水平，認為其表達為導入的基因所改變。
OsDREB1A基因(SEQ ID NO6)、DREB1C基因(SEQ ID NO8)、LIP9基因(a0022，SEQ ID NO2)、WSI724基因(a0066，SEQ IDNO8)以及salT基因(a2660，SEQ ID NO9)被作為探針(將涉及序列表中SEQ ID NOs6和7的編碼區序列作為探針)。作為對照，其中僅轉化了載體的水稻以相同的方式進行分析。
在含有30mg/ml潮黴素的0.1％苯菌靈(Benlate)溶液中篩選轉基因植物5天。然後，將植物轉移至含有Bonsol No.1的罐中並培養12天。以相同方法培養野生型水稻。提取每一植物的總RNA並進行電泳。以與實施例1相同的方式通過Northern方法分析每一基因的表達。結果示於圖6中，其中「a」、「b」和「c」分別代表一種轉基因植物品系。
在已導入OsDREB1A和DREB1C基因的轉基因水稻中，在啟動子區域具有DRE序列的LIP9基因的表達被發現得到誘導。相反，發現在啟動子區域沒有DRE序列的salT基因的表達與導入的基因(OsDREB1A或DREB1C)的表達不一致。同樣，在啟動子區域包含DRE序列並被推測是OsDREB靶點的WSI724基因的表達與為這些轉基因植物所誘導的LIP9一樣。
LIP9或WSI724啟動子包含DRE序列，且觀察到在OsDREB1A基因過表達的轉基因植物中LIP9或WSI724基因的表達水平是高的。LIP9和WSI724被認為是包括OsDREB1A的OsDREB基因的靶基因。因此，推測對於OsDREB基因過表達而言，LIP9和WSI724啟動子是最適合的。
pBE35SOsDREB1A、G-ubiOsDREB1A和G35S-ShΔOsDREB1A的製備按下述方法製備G-ubi和G35S-ShΔ。首先，用BamHI切割pBIG質粒(Nucleic Acids Research 18203，1990)，平端化，並連接，從而刪除該BamHI切割位點。然後，用HindIII和EcoRI切割該質粒。將得到的片段和一個通過相同方式切割pBE2113Not質粒得到的長約1.2kb的片段連接，從而製備得到pBIG2113Not質粒。
隨後，用HindIII和BamHI切割pBIG2113Not，並與以相同方式切割rd29A啟動子得到的一個片段(約0.9kb，Nature Biotechnology17287-291，1999)連接，從而製備出pBIG29APHSNot質粒。接著，用HindIII和SalI切割該pBIG29APHSNot質粒，然後與玉米的泛蛋白基因(Ubi-1)啟動子的一個片段(約2.0.kb，Plant Molecular Biology18675-689，1992)或者一個其中含有p35S-shΔ-stop的CaMV 35S啟動子和玉米蔗糖合成酶基因(Sh1)一部分內含子的片段(約1.6kb，Proceeding National Academy of Science USA 9615348-15353，1999)連接，這些片段是以同一方式切割得到的。從而，製得G-ubi質粒和G35S-ShΔ質粒。
用BamHI切割上述的pBE2113Not、G-ubi和G35S-ShΔ，並用Ligation High(Toyobo Co.，Ltd.)與同樣切割得到的編碼水稻轉錄因子的OsDREB1A基因片段連接。用以此得到的連接產物轉化大腸桿菌DH5α。培養轉基因大腸桿菌後，從中純化出質粒pBE35SOsDREB1A、G-ubiOsDREB1A和G35S-ShΔOsDREB1A。隨後，測定它們的核苷酸序列，並篩選具有結合至有義方向的OsDREB1A基因的那些。
將含有質粒pBE35SOsDREB1A的大腸桿菌DH5α、含有輔助質粒pRK2013的大腸桿菌HB101和農桿菌C58混合併在LB瓊脂培養基上於28℃培養24小時。刮下所產生的克隆並懸於1ml LB培養基中。將該懸液(10μl)加到含100mg/l利福平和20mg/l卡那黴素的LB瓊脂培養基中，並於28℃培養2天，從而獲得接合子農桿菌C58(pBE35SOsDREB1A)。通過電穿孔，將G-ubiOsDREB1A質粒和G35S-ShΔOsDREB1A質粒分別導入農桿菌EHA105中，並在培養後用10％甘油洗滌。因此，獲得了農桿菌EHA105(G-ubiOsDREB1A)和農桿菌EHA105(G35S-ShΔOsDREB1A).
於此引證的所有出版物、專利和專利申請其全文併入本文作為參考。
工業實用性本發明提供了一種脅迫-誘導的啟動子，該啟動子可以在單子葉植物中發揮功效。該啟動子包含DRE序列。如果OsDREB基因或類似基因被連接以致其在該啟動子控制之下並導入植物中，因此，可製備得到具有潛在的脅迫耐受性的轉基因單子葉植物，如水稻。
序列表的獨立文本SEQ ID NO3-人工序列描述引物SEQ ID NO4-人工序列描述引物SEQ ID NO11-人工序列描述引物SEQ ID NO12-人工序列描述引物序列表110Japan International Research Center for Agricultural SciencesIncorporated Administrative Agency，National Agriculture and Bio-orientedResearch Organization120脅迫-誘導的啟動子及其使用方法130PH-2004-PCT140
141
150JP 2003-808471512003-03-2416012170Patent In 2.1版21012111066212DNA213水稻220
223發明人Shinozaki，Kazuko；Katsura，Koji；Ito，Yusuke4001tcatcagcta tcatcaaagc gaaggaaaga aagaaaaata aaaggaaaag aactggctgg 60aaattagaga agccccggac gactcgatct gggggtggca aattaatcag tgtgatcaac 120agggataact tatcccgtcc gaccaaatcc accaaccaaa ccaagacccg atttgttagg 180ctgtgaaaga cggatcagtg ggaccctgat ctacggaccc catatgtcac cgtccaggtc 240tctggatctc tcccgtcgtc ctaatcagac accgcgcgcg cggtgccgtc gctctcgagc 300cgtgtcccgc tcccaactcg tcacaaaagc gatcacagac tcttccttcc tctgctggga 360gagaagaaaa attggccgcg atgatgccga taaagaggaa aaagggatga gaatccgatg 420gaaaaaaact gatgttaatc tatcgctact gctgcgcact aagacgaatc gtatccgaac 480aagaaacgct tacgttactg ttcctaaatg gatcgctccg ctcatcactt aaccaaaaat 540cgattaggaa attgacggac agcgacgccc gaagccaagt gtctcgtcgc gtaggcgtcg 600aggcctcgaa gcagagggag cggagaggcg gacgcgccgc ccacgcctcc tctccctcgg 660tgacacggcc gtctggctcc acatggcgcc gacctctccc gatgcgtcca cccgtcccga 720ggcaccgcca cgtcggaacc agccggccgc cccacgcgat tgccgacacg cgtcgcggcg 780ccactggctc acccgctgcc tgcctctgcc tgccccccat ctcgtcgcca tttcccgccc 840acgcttcttg tcctcgcgtc gcctacgcgt acgtacgata caaacgccgc acctttcgat 900
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223人工序列描述引物4003cacgaagctt tcatcagcta ttcatcaa 28
210421128212DNA213人工序列220
223人工序列描述引物4004ccggatcctc gatcgatgga ttcagcta 2821052111608212DNA213水稻4005caacaaccac tactgaacac ggctaagtgt gtttcctctc ctcgaagatg tcgttattgc 60gttcttttct gctattccat acatatcaat ctctagagga acaccttact ctagctttca 120gacaagggac ggtggtaaat cacgtcgtat cctccatggg gtgtgctccg aaaaaccttc 180cctcatgcat tagagatcat gggtggaatt tagcgatggc acaccttatt tataatttag 240ttactctccg gcggtaccat ctgcttccgt ttgttgatcg atgctggcga tgatgtgtgt 300gagtatcgat caacagaatg atcggacgct atttttgggg tcgttttttt tcagcattga 360ggagggatga ggattgcttg caacatgcag gtgctgctca aaacaacggt taagcagata 420tccgtcaatt tgatagtaag atctgtaacg cgtggtcttt cgagctgaaa actatggact 480ctttgaaaca aagataatat tatattaaat tctattattc aaagatatct aaatatttag 540aaagatatta ataatgttat taaactttga cttacttaaa acaagtccaa aactgcatgt 600ccctaaatcg ccagaagata aggaacacct gtacccgtga taacagaggg gtatgaaatt 660tggacacgag gcttctttgg cagacgtggc gctgagtgag cttggctcgc ttggtcaaac 720tccgtgcagg gacattcagt tagctagcta gcagcattgt cgacaataag atagccttta 780aatgttagca ctcaccagct tgtcaaaaac caaggcttgg tgacggcggc ttcagaatga 840aggatagatg gataaatgtc tagaatatta taaagtccaa caaaagatgg agcacatgca 900tgaaagatta cgtacacgaa tgcagttgat acagtggatg ttaggcataa gaagcactat 960aaatagaggg tgcaatcccc attgccctac acaactacac aagtcgacta tcattacaag 1020gaaatttaag cgaccacgaa ggtatgaaag catagcagta ctctgcattt tttttttttg 1080atgttgttct agctagctct gcttaaggtt ttcctttctt tcgttctttg tttttttttt 1140gtaagctcaa ctagttgcat gcaatttaga ttttatcctt ttacagttgg aaaaacatcc 1200ctataaatat taccatgaat gcatagagat tcgaggaagc tacaaattgg acgactgatt 1260ccaaaaaaaa aaaaaaaatc agatggtcac atcattgcta ttgttttgtg aaagtacaaa 1320agcactcgtt cggattcaaa ttacttgtgc aaattaatta aaaaccatag aaatgatcat 1380gttaccccta cacatttcgg aaacaatacc atatatgtta gtgtgcgatc attcaaattg 1440
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221CDS222(69)..(782)4006CACACTCGAG CAGAGCAAAT ACAGTTCAGG AATCAGGAGC AAGCAGAAAC ACACACACAA 60ATCCGAAG ATG TGC GGG ATC AAG CAG GAG ATG AGC GGC GAG TCG TCG GGG 110Met Cys Gly Ile Lys Gln Glu Met Ser Gly Glu Ser Ser Gly1 5 10TCG CCG TGC AGC TCG GCG TCG GCG GAG CGG CAG CAC CAG ACG GTG TGG 158Ser Pro Cys Ser Ser Ala Ser Ala Glu Arg Gln His Gln Thr Val Trp15 20 25 30ACG GCG CCG CCG AAG AGG CCG GCG GGG CGG ACC AAG TTC AGG GAG ACG 206Thr Ala Pro Pro Lys Arg Pro Ala Gly Arg Thr Lys Phe Arg Glu Thr35 40 45AGG CAC CCG GTG TTC CGC GGC GTG CGG CGG AGG GGC AAT GCC GGG AGG 254Arg His Pro Val Phe Arg Gly Val Arg Arg Arg Gly Asn Ala Gly Arg50 55 60TGG GTG TGC GAG GTG CGG GTG CCC GGG CGG CGC GGC TGC AGG CTC TGG 302Trp Val Cys Glu Val Arg Val Pro Gly Arg Arg Gly Cys Arg Leu Trp65 70 75CTC GGC ACG TTC GAC ACC GCC GAG GGC GCG GCG CGC GCG CAC GAC GCC 350Leu Gly Thr Phe Asp Thr Ala Glu Gly Ala Ala Arg Ala His Asp Ala80 85 90GCC ATG CTC GCC ATC AAC GCC GGC GGC GGC GGC GGC GGG GGA GCA TGC 398Ala Met Leu Ala Ile Asn Ala Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Ala Cys95 100 105 110
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220
221CDS222(167)..(1171)4007gctgtctgat aaaaagaaga ggaaaactcg aaaaagctac acacaagaag aagaagaaaa 60gatacgagca agaagactaa acacgaaagc gatttatcaa ctcgaaggaa gagactttga 120ttttcaaatt tcgtccccta tagattgtgt tgtttctggg aaggag atg gca gtt175Met Ala Val1tat gat cag agt gga gat aga aac aga aca caa att gat aca tcg agg 223Tyr Asp Gln Ser Gly Asp Arg Asn Arg Thr Gln Ile Asp Thr Ser Arg5 10 15aaa agg aaa tct aga agt aga ggt gac ggt act act gtg gct gag aga 271Lys Arg Lys Ser Arg Ser Arg Gly Asp Gly Thr Thr Val Ala Glu Arg20 25 30 35tta aag aga tgg aaa gag tat aac gag acc gta gaa gaa gtt tct acc 319Leu Lys Arg Trp Lys Glu Tyr Asn Glu Thr Val Glu Glu Val Ser Thr40 45 50aag aag agg aaa gta cct gcg aaa ggg tcg aag aag ggt tgt atg aaa 367Lys Lys Arg Lys Val Pro Ala Lys Gly Ser Lys Lys Gly Cys Met Lys55 60 65ggt aaa gga gga cca gag aat agc cga tgt agt ttc aga gga gtt agg 415Gly Lys Gly Gly Pro Glu Asn Ser Arg Cys Ser Phe Arg Gly Val Arg70 75 80caa agg att tgg ggt aaa tgg gtt gct gag atc aga gag cct aat cga 463Gln Arg Ile Trp Gly Lys Trp Val Ala Glu Ile Arg Glu Pro Asn Arg85 90 95ggt agc agg ctt tgg ctt ggt act ttc cct act gct caa gaa gct gct 511Gly Ser Arg Leu Trp Leu Gly Thr Phe Pro Thr Ala Gln Glu Ala Ala100 105 110 115tct gct tat gat gag gct gct aaa gct atg tat ggt cct ttg gct cgt 559Ser Ala Tyr Asp Glu Ala Ala Lys Ala Met Tyr Gly Pro Leu Ala Arg120 125 130ctt aat ttc cct cgg tct gat gcg tct gag gtt acg agt acc tca agt 607Leu Asn Phe Pro Arg Ser Asp Ala Ser Glu Val Thr Ser Thr Ser Ser135 140 145cag tct gag gtg tgt act gtt gag act cct ggt tgt gtt cat gtg aaa 655Gln Ser Glu Val Cys Thr Val Glu Thr Pro Gly Cys Val His Val Lys150 155 160aca gag gat cca gat tgt gaa tct aaa ccc ttc tcc ggt gga gtg gag 703Thr Glu Asp Pro Asp Cys Glu Ser Lys Pro Phe Ser Gly Gly Val Glu165 170 175ccg atg tat tgt ctg gag aat ggt gcg gaa gag atg aag aga ggt gtt 751
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223人工序列描述引物40011ccattggatc cagccgtgga agtccaac282101221128212DNA213人工序列220
223人工序列描述引物40012gccggggatc cttggcgcct ctctctct28
權利要求
1.一種水稻來源的啟動子，由下列DNA(a)或(b)組成(a)由如SEQ ID NO1或10所示的核苷酸序列組成的DNA；或(b)在嚴謹條件下，與能與由SEQ ID NO1或SEQ ID NO10所示的核苷酸序列組成的DNA互補的核苷酸序列組成的DNA雜交並表達脅迫-誘導的啟動子活性的DNA。
2.根據權利要求1的啟動子，其中所述脅迫是脫水脅迫、低溫脅迫或鹽脅迫。
3.一種包含根據權利要求1或2的啟動子的重組載體。
4.根據權利要求3的載體，其中含有用於增強脅迫耐受性的結構基因和/或調節基因，以致在根據權利要求1或2的啟動子控制下其具有功能性。
5.根據權利要求4的載體，其中所述用於增強脅迫耐受性的結構基因和/或調節基因選自一種脯氨酸合成的關鍵酶P5CS基因，用於肌醇半乳糖苷合成的AtGolS3基因，擬南芥來源的轉錄因子DREB基因，水稻來源的轉錄因子OsDREB基因和，一種參與ABA合成的酶NCED基因。
6.根據權利要求5的載體，其中所述用於增強脅迫耐受性的結構基因和/或調節基因是水稻來源的OsDREB轉錄因子基因。
7.一種轉基因植物，其通過將根據權利要求3至6任一的載體導入宿主中而獲得。
8.根據權利要求7的轉基因植物，其中所述宿主是一種植物。
9.根據權利要求8的轉基因植物，其中所述宿主是一種單子葉植物。
10.一種通過將權利要求1或2的啟動子導入植物中以增強植物脅迫耐受性的方法。
全文摘要
該發明提供了一種在象水稻這樣的單子葉植物中能有效發揮作用的脅迫－誘導的啟動子，以及使用該啟動子的環境脅迫耐受植物。該啟動子來自水稻並由下列DNA(a)或(b)組成(a)由如SEQ ID NO1或10所示的核苷酸序列組成的DNA；或(b)在嚴謹條件下，能與由SEQ IDNO1或SEQ ID NO10所示的核苷酸序列組成的DNA互補的核苷酸序列組成的DNA雜交並表達脅迫－誘導的啟動子活性的DNA。上述環境脅迫耐受植物具有導入其中的上述啟動子。
文檔編號A01H5/00GK1795267SQ20048001431
公開日2006年6月28日 申請日期2004年3月2日 優先權日2003年3月24日
發明者筱崎和子, 桂幸次, 伊藤裕介 申請人:獨立行政法人國際農林水產業研究中心, 獨立行政法人農業·生物系特定產業技術研究機構