一種抑制豬繁殖與呼吸症候群病毒增殖的microRNA及其應用的製作方法

2023-10-11 18:03:39 1

專利名稱：一種抑制豬繁殖與呼吸症候群病毒增殖的microRNA及其應用的製作方法
技術領域：
本發明涉及ー種抑制豬繁殖與呼吸症候群病毒(PRRSV)增殖的microRNA及其應用。
背景技術：
豬繁通與呼吸綜合症(porcinereproductive and respiratory syndrome, PRRS)，又稱為豬藍耳病，是由PRRS病毒(PRRS virus，PRRSV)引起的豬的ー種高發傳染病，可引起母豬的繁殖障礙、各年齡豬發生呼吸道症狀以及仔豬死亡，此外還可以導致免疫抑制從而誘發繼發感染，對全世界的養豬業都造成了巨大的經濟損失。該病在1987年首次發現於美國，而後迅速傳播到加拿大及歐洲各地，如今這種疾病已經傳播到世界各地。尤其是
2006年下半年以來，我國25個省份爆發了由毒力變異的高致病性PRRSV毒株(H-PRRSV)為主要病原的「豬高熱病」(HP-PRRS)，本病的傳染性極強，一旦感染，會引起妊娠母豬早產、流產、死胎、弱胎和木乃伊胎，導致公豬種用性能下降，加劇病情，死亡率升高，給我國的養豬業造成嚴重的經濟損失。PRRSV屬於動脈炎病毒科動脈炎病毒屬,根據病毒抗原的抗原性、基因組及致病性差異，PRRSV可分為2個型，即歐洲型(I型，以LV株為代表)和美洲型(II型，以VR2332株為代表)。目前在我國流行的主要是II型毒株。該病毒的基因組大約長15. 4k bp,含有至少10個開放閱讀框0RFla/lb，0RF2a/2b, 0RF3-4, 0RF5/5a, 0RF6-7,分別編碼病毒的非結構蛋白 nspl-14, Gp2a/E, Gp3, Gp4, Gp5/Gp5a，M 和 N 蛋白。疫苗接種是當前預防PRRS的最普遍方法，國內外已有商業化的PRRS疫苗，包括弱毒疫苗和滅活疫苗。但是，弱毒疫苗在提供免疫保護的同時，還會持續散播疫苗病毒，使得病毒在豬場中循環存在，可能發生重組變異等，存在著毒力返強等不安全性問題，有時甚至引發PRRS爆發。而滅活疫苗存在著免疫劑量大、免疫次數多、免疫產生周期長，不能對非疫苗株型的病毒侵染提供免疫保護等缺點，不太適合仔豬免疫，而仔豬帶毒是豬場PRRSV持續存在的重要原因。所以，研發有效抑制PRRSV感染的方法就顯得尤為重要。microRNAs (miRNA)是ー種大小約21-23個鹼基的單鏈小分子RNA，是由具有髮夾結構的約70-90個鹼基大小的單鏈RNA前體(pre-miRNA)經過Dicer酶加工後生成。它通過與其目標mRNA分子的3』端非編碼區域(3』UTR)互補匹配導致該mRNA分子的翻譯受到抑制，通過抑制靶基因的翻譯過程或促使靶基因的mRNA降解。miRNA的合成和作用機制如下在細胞核內編碼miRNA的基因轉錄成pri-microRNA (pri-miRNA) wri-miRNA在一種DroshaRNase的作用下，剪切為約70個核苷酸長度，具有莖環結構的miRNA前體(pre-miRNA)。pre-miRNA在Ran-GTP依賴的核質/細胞質轉運蛋白Exportin 5的作用下,從核內運輸到胞質中。在Dicer酶(雙鏈RNA專ー性RNA內切酶)的作用下，miRNA前體被剪切成21-25個核苷酸長度的雙鏈miRNA。起初，成熟miRNA與其互補序列互相結合成所謂miRNA:miRNA*雙螺旋結構(miRNA*是miRNA的反向互補序列);隨後，雙螺旋解旋，其中一條結合到RNA誘導的基因沉默複合物(RNA-induced silencing complex, RISC)中，形成非對稱RISC複合物(asymmetric RISC assembly),該複合物會結合到目標祀mRNA上。在大多數情況下(例如在動物中)，複合物中的單鏈miRNA與靶mRNA的3』 UTR不完全互補配對，從而阻斷該基因的翻譯過程。

發明內容
本發明的目的是提供ー種抑制豬繁殖與呼吸症候群病毒(PRRSV)増殖的microRNA及其應用。本發明提供的microRNA為序列表的序列I所示的單鏈RNA。本發明還保護序列表的序列2所示的DNA分子(編碼所述microRNA的DNA分子)。 含有所述DNA分子的重組載體、表達盒、轉基因細胞系或重組菌均屬於本發明的保護範圍。所述重組載體可為將功能DNA片段導入siSTRIKE U6載體得到的重組質粒；所述功能DNA片段包括如下三個兀件所述DNA分子、與所述DNA分子反向互補的DNA分子以及位於兩者之間的間隔序列。所述功能DNA片段具體可為將序列表的序列3自5』末端第4-57位核苷酸所示的單鏈DNA分子和序列表的序列4自5』末端第10-63位核苷酸所示的單鏈DNA分子退火形成的雙鏈DNA分子。所述重組載體具體可為將序列表的序列3所示的單鏈DNA分子和序列表的序列4所示的單鏈DNA分子退火形成的雙鏈DNA分子導入siSTRIKE U6載體得到的重組質粒。所述重組質粒中，所述功能DNA片段編碼的RNA形成具有莖環結構的miRNA前體。在Dicer酶的作用下，miRNA前體被剪切成雙鏈miRNA。隨後，雙螺旋解旋，其中一條(microRNA)結合到RNA誘導的基因沉默複合物中，形成非対稱RISC複合物，該複合物會結合到目標靶mRNA上，從而阻斷該基因的翻譯過程，最終抑制豬繁殖與呼吸症候群病毒增殖。本發明還保護ー種抑制豬繁殖與呼吸症候群病毒増殖的產品，它的活性成分為所述單鏈RNA、所述DNA分子、所述重組載體、所述表達盒、所述轉基因細胞系和所述重組菌中的至少ー種。本發明還保護所述單鏈RNA、所述DNA分子、所述重組載體、所述表達盒、所述轉基因細胞系和所述重組菌中的至少ー種在如下(a)或(b)或(C)或(d)中的應用(a)製備抑制豬繁殖與呼吸症候群病毒増殖的產品；(b)抑制豬繁殖與呼吸症候群病毒増殖；(C)製備抑制豬繁殖與呼吸症候群病毒感染的產品；(d)抑制豬繁殖與呼吸症候群病毒感染。以上任一所述抑制豬繁殖與呼吸症候群病毒増殖具體可體現為如下(I)、(2)和
(3)中的至少ー種(I)抑制豬繁殖與呼吸症候群病毒引起的細胞病變；(2)抑制細胞中豬繁殖與呼吸症候群病毒組成蛋白的表達；(3)抑制細胞中豬繁殖與呼吸症候群病毒粒子的產生(降低細胞培養上清中的豬繁殖與呼吸症候群病毒滴度，滴度具體可通過TCID5tl體現)。所述組成蛋白具體可為Gp5蛋白和/或N蛋白。所述(I)和/或(2)和/或(3)中，所述細胞具體可為MARC-145細胞。以上任一所述豬繁殖與呼吸症候群病毒可為II型豬繁殖與呼吸症候群病毒，具體可為VR2332毒株。
本發明提供的miCToRNA可以顯著降低豬繁殖與呼吸症候群病毒對細胞的損傷(即降低細胞病變)，有效抑制豬繁殖與呼吸症候群病毒的組成蛋白(以Gp5和N蛋白為代表)的合成，並極大地降低子代病毒粒子的產生。本發明為豬繁殖與呼吸症候群的治療和預防提供了依據。本發明提供的microRNA有望作為新型的抗豬繁殖與呼吸症候群病毒藥物，具有重大的價值。


圖I為光學顯微鏡下觀察細胞病變的照片。圖2 為 Western-Blot 結果。圖3為各個病毒液對於MARC-145細胞的TCID5tl結果。
具體實施例方式以下的實施例便於更好地理解本發明，但並不限定本發明。下述實施例中的實驗方法，如無特殊說明，均為常規方法。下述實施例中所用的試驗材料，如無特殊說明，均為自常規生化試劑商店購買得到的。以下實施例中的定量試驗，均設置三次重複實驗，結果取平均值。MOI (multiplicity of infection,感染複數)病毒顆粒數/細胞數。ATCC即美國模式培養物集存庫(American type culture collection),網址為 http://www.atcc. org八siSTRIKE U6載體(自身帶有粘性末端；具有氨苄抗性)=Promega公司，C7290。Lipofectamine 2000 (購於 Invitrogen, Cat. No. 11668-027,按說明書操作)。細胞裂解液(購於 Promega, E194A)。MARC-145細胞購於美國模式培養物集存庫ATCC，CRL-12231 (編號為CRL-12231TM (LN 14832 MARC145 CELL LINE(MONKEY KIDNEY))) (http://www. atcc.orR/ATCCAdvancedCatalORSearch/ProductDetails/tabid/452/Default. aspx ATCCNum=CRL-12231&Template=patents);公眾也可從中國科學院微生物研究所獲得；參考文獻Yu, Μ. , X. Liu, L. Sun, C. Chen, G. Ma, Y. Kitamura, G. F. Gao and ff. Liu, 2010. Subcellularlocalization and topology of porcine reproductive and respiratory syndromevirus E protein. Virus Res 152,104-114. XPRRSV 病毒 VR2332 毒株購於 ATCC (VR-2332 ) (http://www. atcc. org/ATCCAdvancedCataloRSearch/ProductDetaiIs/tabid/452/Default. aspx ATCCNum=VR-2332&Te即late=animalViroloRy);公眾也可從中國科學院微生物研究所獲得；參考文獻Yu, Μ. , X. Liu, L. Sun, C. Chen, G. Ma, Y. Kitamura, G. F. Gao and ff. Liu, 2010. Subcellularlocalization and topology of porcine reproductive and respiratory syndromevirus E protein. Virus Res 152, 104-114. X實施例I、設計抑制豬繁殖與呼吸症候群病毒増殖的miCToRNA基於對豬繁殖與呼吸症候群病毒全序列的分析，設計並篩選，得到SSC-miR-26a序列，為抑制豬繁殖與呼吸症候群病毒増殖的miciORNA。在Sanger資料庫(http://microrna. sanger. ac. uk/sequences/)中查閱線蟲cel-let-7序列(作為陰性對照)，該陰性對照已經通過BLAST比對所有豬、人、大鼠及小鼠的基因組序列以及microRNA序列。ssc-miR-26a (序列表的序列 I) :5』 -UCGGAUAGGACCUAAUGAACUU-3』。
ssc-miR-26a 的編碼序列(序列表的序列 2) :5』 -TCGGATAGGACCTAATGAACTT-3』。cel-let-7 :5』 -UGAGGUAGUAGGUUGUAUAGUU-3，。cel-let-7 的編碼序列5』 -TGAGGTAGTAGGTTGTATAGTT-3』。實施例2、重組表達載體的構建一、ssc_miR-26a表達載體的構建 I、分別合成序列表的序列3所示的單鏈DNA分子和序列表的序列4所示的單鏈DNA分子。序列表的序列3如下(5，一 3』):ACCTCGGATAGGACCTAATGAACTTCTTCCTGTCAAAGTTCATTAGGTCCTATCCGATTTTC(I)(II)(I)為ssc-miR_26a的編碼序列，(II)為(I)的反向互補序列。序列表的序列4如下(5，一 3』)TGCAGAAAATCGGATAGGACCTAATGAACTTTGACAGGAAGAAGTTCATTAGGTCCTATCCGAT2、將序列表的序列3所示的單鏈DNA分子和序列表的序列4所示的單鏈DNA分子退火，形成帶有粘末端的雙鏈DNA分子。3、將步驟2得到的帶有粘末端的雙鏈DNA分子與siSTRIKE U6載體連結，得到SSC-miR-26a表達載體(重組質粒甲)。根據測序結果，對重組質粒甲進行結構描述如下在siSTRIKE U6載體的粘性末端插入了帶有粘末端的雙鏈DNA分子(由序列表的序列3所示單鏈DNA分子和序列表的序列4所示單鏈DNA分子退火後形成)。ニ、cel-let-7表達載體的構建I、分別合成序列表的序列5所示的單鏈DNA分子和序列表的序列6所示的單鏈DNA分子。序列表的序列5如下(5，一 3』):ACCTGAGGTAGTAGGTTGTATAGTTCTTCCTGTCAAACTATACAACCTACTACCTCATTTTC(HI)(IV)(III)為cel-let-7的編碼序列，(IV)為(III)的反向互補序列。序列表的序列6如下(5，一 3』):TGCAGAAAATGAGGTAGTAGGTTGTATAGTTTGACAGGAAGAACTATACAACCTACTACCTCAT2、將序列表的序列5所示的單鏈DNA分子和序列表的序列6所示的單鏈DNA分子退火，形成帶有粘末端的雙鏈DNA分子。3、將步驟2得到的帶有粘末端的雙鏈DNA分子與siSTRIKE U6載體連結，得到cel-let-7表達載體(重組質粒こ)。根據測序結果，對重組質粒こ進行結構描述如下在siSTRIKE U6載體的粘性末端插入了帶有粘末端的雙鏈DNA分子(由序列表的序列5所示單鏈DNA分子和序列表的序列6所示單鏈DNA分子退火後形成)。實施例3、ssc-miR-26a對豬繁殖與呼吸症候群病毒増殖的抑制作用分別進行以下四組處理(平行試驗；每個處理進行三次重複)處理ー(PRRSV感染一 miR_26a):用MARC-145細胞鋪24孔板；當每孔細胞密度達到80%的時候，通過Lipofectamine 2000轉染實施例2構建的重組質粒甲(轉染劑量為Iug/孔)，37°C孵育24小時；然後感染PRRSV病毒VR2332毒株(感染劑量為1M0I)，37°C孵育72小時；處理ニ(PRRSV感染一陰性對照)用MARC-145細胞鋪24孔板；當每孔細胞密度達到80%的時候，通過Lipofectamine 2000轉染實施例2構建的重組質粒こ(轉染劑量為I μ g/孔)37°C孵育24小時；然後感染PRRSV病毒VR2332毒株(感染劑量為1M0I)，37°C孵育72小吋。處理三(PRRSV感染一陽性對照)用MARC-145細胞鋪24孔板；當每孔細胞密度達到80%的時候，加入與處理一等量的LipofectamineTM2000，37°C孵育24小時；然後感染PRRSV病毒VR2332毒株(感染劑量為1M0I) ，37°C孵育72小時。處理四(空白對照)用MARC-145細胞鋪24孔板；當每孔細胞密度達到80%的時候，加入與處理一等量的Lipofectamine 2000，37°C孵育96小時。完成上述處理後，分別取細胞培養上清(病毒液)和細胞。取細胞，先用PBS緩衝液洗3次，然後在光學顯微鏡下觀察細胞病變(Cytopathiceffect，CPE)，拍照存圖。見圖I。重組質粒甲能顯著減輕PRRSV感染造成的MARC-145細胞病變(根據microRNA的作用機理,是ssc_miR-26a發揮作用),而重組質粒こ無此功能。取細胞，先用PBS緩衝液洗3次，然後用100 μ I/孔細胞裂解液裂解細胞，通過Western-Blot方法檢測PRRSV的Gp5蛋白和N蛋白表達情況(以β-act in蛋白為內參)。Western-Blot檢測Gp5蛋白所用的ー抗為小鼠抗PRRSV的Gp5蛋白多抗(用於製備ー抗的抗原如序列表的序列的序列7所示，；製備方法參見文獻孫穎；馬豔；李彬；江雲波；肖少波；方六榮；陳煥春.「抗PRRSV GP5蛋白單克隆抗體的製備及鑑定《動物醫學進展》
2007年第11期)，所用的ニ抗為辣根過氧化物酶標記山羊抗小鼠IgG(H+L)(購於碧雲天，A0216)。Western-Blot檢測N蛋白所用的一抗為小鼠抗PRRSV的N蛋白多抗(用於製備ー抗的抗原如序列表的序列的序列8所示；製備方法參見文獻夏向榮，李玉峰，姜平.「PRRSV重組N蛋白的抗原性分析及其特異性抗體製備」.《畜牧與獸醫》2003年第09期)，所用的ニ抗為辣根過氧化物酶標記山羊抗小鼠IgG(H+L)(購於碧雲天,A0216)。Western-Blot檢測β-actin蛋白所用的ー抗為β-actin小鼠單抗(購於碧雲天，AA128),所用的ニ抗為辣根過氧化物酶標記山羊抗小鼠IgG(H+L)(購於碧雲天,A0216)。Western-Blot結果見圖2。重組質粒甲能抑制PRRSV的Gp5蛋白和N蛋白的表達水平(根據microRNA的作用機理，是ssc-miR-26a發揮作用),而重組質粒こ無此功能。取病毒液測定對於MARC-145細胞的TCID5tl,通過Reed-Muench法(Reed, L.J. ;Muench, H. (1938). A simple method of estimating fifty percent endpoints. TheAmerican Journal of Hygiene 27:493 - 497.)計算病毒的 TCID5(I。結果見圖 3 (三次試驗的平均值)。圖3中，縱坐標為Ig (每毫升病毒液的TCID5tl值)。重組質粒甲能降低所感染的MARC-145細胞得到的病毒液中PRRSV病毒的滴度(根據microRNA的作用機理，是ssc-miR-26a發揮作用),而重組質粒こ無此功能。
權利要求
1.序列表的序列I所示的單鏈RNA。
2.序列表的序列2所不的DNA分子。
3.含有權利要求2所述DNA分子的重組載體、表達盒、轉基因細胞系或重組菌。
4.如權利要求3所述的重組載體，其特徵在於所述重組載體為將功能DNA片段導入siSTRIKE U6載體得到的重組質粒；所述功能DNA片段包括如下三個元件權利要求2所述DNA分子、與權利要求2所述DNA分子反向互補的DNA分子以及位於兩者之間的間隔序列。
5.ー種抑制豬繁殖與呼吸症候群病毒増殖的產品，它的活性成分為權利要求I所述單鏈RNA、權利要求2所述DNA分子、權利要求3或4所述重組載體、權利要求3所述表達盒、權利要求3所述轉基因細胞系和權利要求3所述重組菌中的至少ー種。
6.權利要求I所述單鏈RNA在如下(a)或(b)或(c)或(d)中的應用 Ca)製備抑制豬繁殖與呼吸症候群病毒増殖的產品； (b)抑制豬繁殖與呼吸症候群病毒増殖； (C)製備抑制豬繁殖與呼吸症候群病毒感染的產品； Cd)抑制豬繁殖與呼吸症候群病毒感染。
7.權利要求2所述DNA分子在如下(a)或(b)或(c)或(d)中的應用 Ca)製備抑制豬繁殖與呼吸症候群病毒増殖的產品； (b)抑制豬繁殖與呼吸症候群病毒増殖； (C)製備抑制豬繁殖與呼吸症候群病毒感染的產品； Cd)抑制豬繁殖與呼吸症候群病毒感染。
8.權利要求3或4所述重組載體在如下(a)或(b)或(C)或(d)中的應用 Ca)製備抑制豬繁殖與呼吸症候群病毒増殖的產品； (b)抑制豬繁殖與呼吸症候群病毒増殖； (C)製備抑制豬繁殖與呼吸症候群病毒感染的產品； Cd)抑制豬繁殖與呼吸症候群病毒感染。
9.權利要求3所述表達盒、轉基因細胞系或重組菌在如下(a)或(b)或(C)或(d)中的應用 Ca)製備抑制豬繁殖與呼吸症候群病毒増殖的產品； (b)抑制豬繁殖與呼吸症候群病毒増殖； (C)製備抑制豬繁殖與呼吸症候群病毒感染的產品； Cd)抑制豬繁殖與呼吸症候群病毒感染。
全文摘要
本發明公開了一種抑制豬繁殖與呼吸症候群病毒增殖的microRNA及其應用。本發明提供了序列表的序列1所示的單鏈RNA(microRNA)。本發明提供的microRNA可以顯著降低豬繁殖與呼吸症候群病毒對細胞的損傷(即降低細胞病變)，有效抑制豬繁殖與呼吸症候群病毒的組成蛋白(以Gp5和N蛋白為代表)的合成，並極大地降低子代病毒粒子的產生。本發明為豬繁殖與呼吸症候群的治療和預防提供了依據。本發明提供的microRNA有望作為新型的抗豬繁殖與呼吸症候群病毒藥物，具有重大的價值。
文檔編號C12N1/19GK102676519SQ20121013897
公開日2012年9月19日 申請日期2012年5月7日 優先權日2012年5月7日
發明者劉亭見, 李晶, 楊利敏, 牟身芸, 陳才偉 申請人:北京諾派生物科技有限公司