一種基於多聚ARNA在溶液中合成cDNA的方法

2023-10-11 00:49:19 3

專利名稱：：一種基於多聚ARNA在溶液中合成cDNA的方法
技術領域：
：本發明涉及高通g:分離和)ii一:全血中mRNA。更特別地，本發明涉及用f分離和擴增mRNA的方法和設各，其使用附著到固定寡聚(dT)的多孔板上的白細胞濾器的組合。
背景技術：
：分子生物學領域的研究顯示可以從對其核糖核酸(RNA)的研究巾推導出細胞的遺傳起源和功能活性。這種信息可以在臨床實踐中用於診斷感染、檢測細胞表達致癌基因的出現、檢測家族性疾病、監測寄主防禦機制的狀態以及確定HLA類型或者特性的其它標記。RNA以—種功能不同的形式存在核糖體RNA(rRNA)、轉運RNA(tRNA)和信使RNA(mRNA)。然而穩定的r:RM和tRNA參與翻譯的催化過程，m:RM分了攜帶遺傳信息。總RNA中由只有大約丄5X的mRNA、大約丄5%的UNA以及大約80X的rRNA組成。mRNA是重要的診斷工具,特別是當其用於定量觀測基因的上調或者下調時。人的外周血是用TmRNA分析非常好的臨床來源。例如，對血中特異性嵌合mRNA的監測可以暗示不正常細胞的出現，並且應用於慢性骨髓細胞性白血病(CM:L)的分子檢測(KawasakiE,S,，ClarkS,S,，CoyneM,Y,,Smiths,D.，Cha卿linR,，Witte0,N,和McCormickF.P,1988年，Diagnosisofchronicmyeloidandacutelymphocyticleukemiasbydetectionofleukemia—specificmRNAsequencesamplifiedinvitro,Proc,Natl.Acad,Sci,美國85:56985702，Pachma皿K.，ZhaoS.，SchenkT,，Kantarjian:H,,El-NaggarA,K.，S丄c丄l丄anoM.J,，GuoJ.Q.，Arl丄nghausR,B.和AndreefTM,200丄年，卜:xpressionofbciablemRNAindividuaichronicmyelogenousleukaemiaceilsasdotormincdbyinsituamplification，Br,J,Haematol,112:749-59)。通過監測癌特異性m:RNA可以檢測微轉移的癌細胞，例如對直腸癌監測癌胚抗原(CEA)、對前列腺癌監測前列腺特異抗原(PSA)和對甲狀腺癌監測甲狀腺球蛋白(WingoS,T,，Ri卿lM,D,，AndersonJ,S.，PatelA.D.，LukesY.I).，DjuhY.Y.，SolomonB.，Nicholson:[).，Balducci-SilanoP.L.，LevineM.A.,FrancisG.L.禾UTuttleR.M.1999年，Quantitativereversetranscription—PCRmeasurementofthyrog:LobulinmRNAi叩eripheralbloodofhealthysubjects,Clin,Chem,45:785-89)以及對黑色素瘤監測酪氨酸酶(PelkeyT.工，3FriersonH.F,Jr.禾UBrimsD.E,1996年，Molecularandi咖皿ologicaldetectionofcirculatingtumorcellsandmicrometastasisfromsolidtumors，Clin,Chem,42:丄3698i)。而目.，由於這些癌特異性mRNA水平在治療後發牛改變，特異mRNA的定量在後續治療過程中提供了有用的指標。由T與白細胞(大約5000白細胞ZuL)相比，血液含有大量的無核紅細胞(大約5百萬細胞/UL)，岡此通常將從全血巾分離粒細胞或者淋巴細胞作為m:RNA分析的第一步來進行。然而，由於在不同樣品中白細胞特異業群回收的不一致，因此分離白細胞的數目由每個樣品所確定，並將結果表達為每個白細胞mRNA的量，而不是每pL血mRM的量。而且，mRNA的量可以在冗長的分離過程中改變。儘管沒:丫l-方法來從血中分離癌細胞，但基因擴增技術nj以對特異性mRNA水平進行鑑定和定量，甚至從大量不同的基因中，這使全血在可以得到基因特異性引物和探針時成為mRNA分析的理想材料。由於缺乏標準化，科學團體i.l..:面臨研究所與研究所之間以及實驗與實驗之間在基因表達分析方面有差異的巨大問題。儘管目前的基因擴增技術提供丫對模板DNA的完全定量，但由於缺少每個樣品巾RNA回收率和d)M合成率的信息，這些數值不能被轉換成該基因在原材料中的量。總RNA常被用作mRNA定量的標準化標記，並且通常結果表達為每ug總RNA某因的量。然而，必須要強調的是總RNA不能代表iiiR裡，因為mRNA的片斷只佔總R裡的15%，而且即使在總RNA相同的情況下mRNA的量也會變化。總RNA或者mRNA的產量也會隨著所採用的方法而廣泛變化。一且提取了:RNA,下一步是合成cDNA，其自身會引起不確定性，因為現有的方法不能說明是否在每次實驗中每個RNA模板都形成了cDNA的單拷貝。為了避免上面的問題,廣泛使用通過將冃標基因數據與看家基因或rRNA的數據進行比較的相對定量。然而，對照基因的量通常是不穩定的，可能在實驗中發生變化。而且，這種變化代表了臨床巾的嚴重問題，岡為每個臨床樣木通常是在時間的不同點進行分析。通常很難從全血中分離純mRNA,因為全血含有人量RNA酶(來fi粒細胞)和無核紅細胞。儘管可以得到各種用於全血應用的RNA提取力'法(deVriesT,J,，FourkourA.,PuntC.J.，RuiterD.J,禾UvanMuijenG.N.2000年，Analysisofmelanomacellsinperiphe:ralbloodbyreversetranscription—polymerasecheiinre;actionfortyrosinaseandMART—丄afLermononucletircellcollectionwithcellpreparationtubes:acomparisonwiththewhoiebloodguanidiniumisot.hiocyanateRNAisolationmethod,MclanomaRcsoarch10:11926JohanssonM,,PisaE,K,，TomanonV.，ArstrandK.禾卩Kag'edalBL2000年，Quantitativeanalysisoftyrosinasetranscriptsinblood,Clin,Chem,46:92127;WingoS,T,，RingelM,D,，AndersonJ,S,，PatelA,D.，LukesY,D.,DjuhY,Y.,SolomonB,，NicholsonI),，Balducci-SilanoP丄，LevineM.A.,FrancisG丄禾UTuttleR.M.1999年，Quantitativereversetranscription—PCRmeasurementofthyroglobulinmRNAinperipheralbloodofhealthysubjects,Clin.Chem.45:785-89)，但是該檢驗是勞動密集型的，需要多輪離心，以及仃細的操作,這在去除核酸酶活性中是必須的。因此，需耍.,巾用T分離和定量全血中大量mRNA的快速簡單方法和設備。特別地，需要具有可重複回收和完全連續操作來擴增基岡的高通^、全血衍生m:RNA處理技術。
發明內容本發明公開了一種直接分離和定量全血中mRNA的有效高通量方法和設備，其具有可重複的回收，其使用附著到同定寡聚WT)的多孔板上的白細胞濾器的組合。本發明一方面包括一種卨通一.t#全血中mRNA的方法，其包括步驟(a)收集全血；(b)通過過濾從全血中去除江細胞和II'IL液組分以生產過濾膜上的白細胞；(c)對白細胞進行細胞裂解以獲得含m:RNA的裂解物；(d)將裂解物轉移到固定寡聚(dT)的板k以捕獲mRNA;以及(e)對mRNA進行定量。在該方法的一個優選實施方式屮，在收集白細胞之前對全血施加抗凝血劑。可以將多個過濾膜疊在一起來提高所捕獲o細胞的產量。使用裂解緩衝液對捕獲在過濾膜上的白細胞進行裂解以從白細胞中釋放mRNA。可以使用離心、真空吸引、正壓或者乙醇清洗然後真空吸引來完成將裂解物轉移到固定寡聚(dT)的板上。通過產牛d)NA並用PCR擴增該d)NA來對mRNA進行定量。特別優選的實施方式使用TaqManPCR來定量mRNA。本發明另-'方面包括使用人工對照RNA作為通用標準。在優選的實施方式中，檢測每個樣品巾標準RNA的回收使得基岡擴增的結果可以用來確定每u1全血巾存在的mRM量。本發明實施方式導致樣品和實驗之間的低變化係數。在優選的實施方式中，在回收RNA、合成d)NA以及定量的過程屮，變化可以被最小化。使用標準化的對照RNA可以進行更有效的檢驗、定量以及比較檢測。本發明另一方面包括一種進行卨通S:全血中mRNA的設備，其中該設備包括(a)多孔板，其含有多個樣品傳輸孔，在孔下方捕獲白細胞的過濾器，以及在濾器下含有固定的寡聚(dT)的mRNA捕獲帶；和(b)真空盒，其用於容納過濾板以在板和盒之間形成密封。在該設備的優選實施方式中，白細胞被捕獲在多個^疊在-'起的過濾膜上。在該設備的另一優選實施方式巾，真空盒用於容納真空源。在該設備的另一優選實施方式中，在真空盒和多孔板之間插入多孔支持物。本發明另一方面包括一種試劑盒，其包括用於進行高通量定量全血屮iiiR裡的設備、肝素、低滲緩衝液和裂解緩衝液。本發明另一方面包括一種用f進行高通量定量全血中mRNA的全自動系統，其包括將血樣品、低滲緩衝液和裂解緩衝液施加到設備的遙控設備；自動真空吸引儀、離心機以及自動PCR儀。圖1是高通量mRNA設備的分解圖；圖2顯示高通量mRNA設備的多孔板，其包括白細胞過濾器和固定寡聚(dT)的過濾器孔；圖3是表不在過濾板上捕獲新鮮和冷凍血液樣品白細胞效率的圖表；圖4是表示淸洗血液數目對mRNA定量影響的圖表；圖5是表示細胞裂解前對過濾板的最終處理對m定缺彩響的圖表；圖6是表示裂解緩衝液如何抑制RNA酶的圖表；圖7是表示用於mRNA定量的反轉錄酶最佳濃度的圖表；圖8是表示用於PCR以捕獲mRNA的cDNA的最佳量的圖表；圖9是表示本發明雜交動力學的圖表；圖10是表不每孔所使用全血體積和mRNA定量之間平行關係的圖表；圖ii是表示硫氰酸胍最佳濃度的圖表；圖12是表示蛋白酶K最佳濃度的圖表；圖13A13D是表示檢驗有效性的圖表；圖14A1.4D是表示回收合成的摻標(spiked)RNA的圖表；圖15表示由特異性反義引物(NNN)和固定的寡聚(dT)合成cDNA;圖16是表示使用和不使用變性特異性引導的:RNA回收的圖表；圖17是表示使用和不使用特異性引物對RNA擴增的圖表；圖18A表不本發明典型的捕獲mRNA的不意；圖i8B是表示各種雜交性能的圖表；圖18C是表示各種捕獲總RNA和多聚(A)RNA的方法效率的圖表；圖18D是表示PCR循環最佳數目的圖表；圖18E是表示用於捕獲RNA的裂解緩衝液最佳範闈的圖表；圖19A是表示PCR循環數目相對各種抗凝血劑的圖表；圖19B是表示PCR循環數目相對存儲時間的圖表；圖19C是表示PCR循環數目相對雜交溫度的圖表；圖19D是表不PC:R循環數目相對雜交時間的圖表；圖i9E是表示PCR循環數目相對MMLV單位的圖表；圖19H是表示PCR循環數冃相對每孔cDNAPi的圖表；圖20A是表示摻標的標準RNACt值的圖表；圖20B是表示摻標的標準RMCt回收百分率的圖表；圖20C是表示抑制劑dA20Ct值的圖表；圖20D是表示抑制劑dA20抑制百分率的圖表；圖20E是表示每U1血Ct值的圖表;圖20F是表不每li1血mRNA回收的圖表；圖2iAE表示對每個對象mRNA的回收；圖21A是表示在各種對象中標準RNA回收百分率的圖表；圖21B是表示在各種對象中所回收的每U1血CD4mRNA的圖表；圖21C是表示在各種對象巾所回收的每U1血p21mRNA的圖表；圖21D是表示在各種對象中所回收的每U1血FasLmRNA的圖表；圖21E是表示在各種對象屮所回收的每P1血LTC4SmRNA的圖表；圖22A是表示在全血中體外誘導的mRNA的圖表；圖22B是表不在體外剌激前的血儲存的圖表；圖22C是通過對剌激和載休對照二者分別顯示mRNA分子/mL血，表示在各種對象中HasLmRNA的體外誘導的圖表，；圖22D是通過對剌激和載體對照二者分別顯示mRNA分子/mL血，表示在各種對象巾p21mRM的體外誘導的圖表；圖22E是與圖22C相同的通過旋轉直至回歸線成水平的圖表；圖22F是與圖22D相同的通過旋轉直至冋歸線成水平的圖表；圖22G是與圖22C相同的通過顯不每個對象的倍數增加的數據；圖22H是與圖22D相同的通過顯示每個對象的倍數增加的數據。具體實施例方式木發明允許進行較大體積未製備全血的分析，提供分析單獨從白血細胞得到的mRNA的有效方法，去除rRNA和tRNA，提供穩定的mRNA回收並容易適合自動化。本發明提供了靈敏的定量系統,其包括使用即時PCR的完全定量，以及變化係數在2025%範圍內優異的可重複性。而且，本發明適合各種疾病目標(表I)。表Itableseeoriginaldocumentpage7本發明不限定於任何特定的機械結構。然而，圖1和2表示用於完成本發明高通量mRNA定量的優選結構。真空盒10形成該結構的基礎。真空盒可以由任何充分結實足以忍受真空吸引的材料製成；『fr]優選fill]一;t性塑料材料。真空盒被改裝成接收真空源來進行真空吸引i2。過濾器塞i4寶P什H'T盒的真空吸引儀轉接器之間。真宇盒iO優選具有突出物16來與多孔過濾板40或AH」選擇的多孔支持物2相配。在真空盒上部內可選擇設有多孔支持物20以便支持多孔過濾板40。密封墊30優選包括矽基橡膠或者其它軟艱料，位於多孔支持物的頂端。在密封墊的l:面，有多孔過濾板40，其包括多樣品孔46、在樣品傳遞孔下面的多個捕獲白細胞過濾器42、以及在濾器下面的mRNA捕獲帶44。mRNA捕獲帶的孔屮含有固定的寡聚(dT)。—個優選的實施方式涉及從全血中簡單、可重複和高通量定量mRNA的方法。快速實驗方案使取血後mRNA的二級誘導或降解最小化，同時96孔過濾板和微板的使用使得nj以同時進行96個樣品操作。在程序中最小化的操作提供了非常小的樣品與樣品間的變化，其中變化係數(CV)值小於3%，即使在使用PCR作為定量方法的時候。在-寸實施方式中，該方法包括製備真空盒。在-寸優選實施方式中，在真空盒中加入血胞囊例如聚丙烯酸酯聚合物基質(RedZ，Safetec)以固化血液。接著在真空盒中放入多孔支持物。然後將由矽基橡膠或其它軟塑料製成的密封墊放於多孔板支持物的頂部。將過濾器塞(X-695),60uFilterPlugH:DPE,PorexProductsGroups)放置在真空盒的真空吸引儀轉接器內。在這個實施方式中，該方法包括製備過濾板。使用玻璃纖維膜或者白細胞過濾膜來捕獲o細胞。為了簡化檢測，使用玻璃纖維膜或者o細胞過濾膜來構迂-孔過濾板，以能夠同時處理多個血樣。在美國專利No,4，925，572和4，880，548中麼、J|了川來捕獲白細胞過濾器的實施例，其所公開的內容在這裡引入作為參考。通常採用將白細胞吸附在過濾器表面作為去除白細胞的機制。由於給定重量纖維的表面與纖維的直徑成反比，因此,預期更細的纖維將具有更高的能力，並且如果所使用纖維直徑更小，達到期望效率所必需的纖維重量將更小。大還:通常使用的纖維包括聚酷、聚醯胺和丙烯酸樹脂，其進行輻射枝接，由於其對在所需接枝水平的y-射線所引起的降解有充分抗性，並且具有可獲得單體進行反應的結構。PBT已經成為用於開發本發明產品的主要樹脂，並且是實施例屮所使用的樹脂。然而，需要注意的是發現其它樹脂可以纖維化或者收集作為1.5微米或更小的纖維墊或者網，以及臨界溼潤表面張力被調節到最優範圍內的產品nj以很好的適合製造相同效率但更少白細胞損失的設備。相似的，適當處理的玻璃纖維對於製造有效設備是有用的。當使用PBT基過濾器時，a)4mRNA的吸附是玻璃纖維基過濾器的4倍。過濾板置於真空盒內。在另--優選實施方式中，多個過濾膜被^疊在-'起來提高從全血中捕獲白細胞的量。在-^個優選實施方式中，過濾板置於板支持物和密封墊l:。在另一實施方式巾，過濾板用塑料膠帶(Bio-Rad223-9444)密封，並且該膠帶被切割使得允許以希望數目的孔進入。在另一實施方式屮，用低滲緩衝液(20pL5mMTris，pH7.4)對加入樣品的每個孔進行清洗。該方法優選包括收集血、將血加到多孔過濾板以及去除紅細胞和其它非0細胞組分。在一個優選實施方式中，全血被吸入含有抗凝血劑的血收集管中，其提高了白細胞的過濾效率。抗凝血劑，肝素，在提高白細胞過濾效率方面是特別有效的。在-一個優選實施方式中，血樣品被冷凍，這去除了某些破壞mRNA的RNA酶。用低滲緩衝液對孔進行清洗。一旦血被加入到過濾板上期望數目的孔中，將血過濾通過過濾膜。可以通過本領域技術人員任何已知的技術來實施過濾，例如離心、真空吸引或者正壓。在--個特別優選的實施方式中，在將血樣品加入到過濾板孔中後開始真空吸引(使J1:j6cmHg)。ltj低滲緩衝液(12X，20uL5mMTris，pH7.4)對每個孔清洗多次。在另一優選的實施方式中，使用乙醇(1X，200uL100%乙醇)對含W樣品的每個孔進行清洗,其是在真空吸引過程中T燥過濾膜並顯著提高捕獲白細胞的效率。在另一實施方式中，採用真空(20cmHg進行大於2分鐘)。該方法包括細胞裂解以及mRNA雜交到固定在mRNA捕獲帶內的寡聚(dT)上。將裂解緩衝液應用到過濾板孔(40uL/'孔)，進行孵育(室溫下進行20分鐘)以從被捕獲的白細胞巾釋放出mRNA。在一個優選的實施方式中，將多孔過濾板密封在塑料包中並進行離心(IECMultiRF，2000轉/分鐘，4C進行1分鐘)。接著再加入裂解緩衝液(20uL/孔)，接下來進行離心(誦ultiRF，3000轉/分鐘，4-C進行5分鐘)。接著從離心機屮去除多孔過濾板並進行孵育(室溫下2小時)。根據優選的實施方式，裂解緩衝液包括去汙劑、鹽、pH:緩衝液、硫氛酸胍和蛋白酶K。裂解緩衝液的優選實施方式含有至少一種去汙劑,但可以含有一種以....匕去汙齊U。本領域技術人員可以利用具有不M強度的去汙劑濃度的fH組合來得到各種類型細胞不同膜的不同水平的裂解。例如，I:GEPALCA-630是比N-月桂肌氨酸(N-Laurosarcosine)弱的去汙劑，在一個實施方式中，單獨IGEPALCA-630足以裂解細胞質膜。在另--實施方式中，強去汙劑例如N-月桂肌氨酸可以與一種或者更多種弱去汙劑結合使用來優化對細胞核膜的裂解。去汙劑優選足以裂解至少細胞質膜。另一優選的實施方式包括足以裂解細胞核膜的去汙劑，因為顯著量的mRNA殘餘在細胞核中。在某些情況下，希望只檢測細胞質mRNA，而其它情況下希望檢測細胞質和細胞核中的mWA。裂解緩衝液的強去汙劑優選包括但不限TN-月桂醯肌氨酸、S.D.S、脫氧膽酸鹽和十六烷基三甲基溴化銨。弱去汙劑包括IGEPALCA-630、N-癸醯基-N-甲基葡糖胺、辛基-P-D-吡喃型葡萄糖苷或者其它本領域技術人員已知的去汙劑。裂解緩衝液屮可以使用.052%的去汙齊U。-一個特別優選的裂解緩衝液實施方式含:丫/0.5XN-月桂醯肌氨酸。另-一個優選的裂解緩衝液實施方式含有0,12%IGEPALCA-630。特別優選的實施方式含有0,1%IGEPALCA-630。鹽和螯合劑的組合也可以作為裂解劑。例如75uMNaCI和24PMNa-KI)TA可'以作為裂解劑。裂解劑的實施方式可以含有其它本領域技術人員已知的其它裂解劑。裂解緩衝液的鹽作為mRM-寡聚(d':[')雜夂劑。按照木領域技術人員可以確定的，優選具有不超過4XSSC的嚴格程度(與其力:補DNA序列雜交在--起的嚴格程度)。裂解緩衝液的其它實施力'式包括NaCl或者其它本領域技術人員已知的鹽。優選裂解緩衝液貯液的pH緩衝液維持在7.08.OpH。一個實施方式含仃ImMlmM:Tris:HCl，pH7.'1。在特別優選的實施方式中，pH:緩衝液含有].OmMTrisHCl，PH7.4。裂解緩衝液的其它優選實施方式含有本領域技術人員已知的PH緩衝液，其包括具有.03%H22的.1M檸檬酸鹽—磷酸鹽，pH5.。根據裂解緩衝液特別優選的實施方式，硫氰酸胍作為RNA酶失活劑。我們發現，在現有技術中通常使用的硫氰酸胍不具有有效的濃度。岡此，優選的，硫氰酸胍的濃度大於1.4M。硫氰酸胍濃度可以高到IOM，更優選不高於2M。然而，如圖11所示，濃度超過1,7M時,裂解緩衝液的效率降低了。因此，優選實施方式使用大約i.4大約i.75:M:的硫氰酸胍。一個優選的實施方式含W1.71.8M硫氰酸胍。按照下面實施例4所描述的，工作裂解緩衝液nj以從貯液中製備，其具有1.791M硫氛酸胍的精確濃度。在將其它試劑加入到裂解緩衝液時，硫氰酸胍的濃度被稀釋。將55ml的其它試劑加入到iml實施例4中的緩衝液時，優選的裂解緩衝液含有大約1.61大約1.71M的硫氰酸胍。這樣，優選的實施方式含有濃度在大約1.6大約1.7M的硫氰酸胍。特別優選的實施方式進一步含有2mg/ml的蛋白酶K作為:RNA酶失活劑。裂解緩衝液的--一個優選實施方式含有200ug/ml20mg/ml的蛋白酶K。另一優選實施方式含有200pg/ml1,mg/ml的蛋白酶K。另一優選實施方式含有200uKml500ug/ml的蛋O酶K。十二烷基硫酸鈉也可以作為RNA酶失活劑。另一實施方式含丫]0.110%的2-巰基乙醇作為RNA酶失活劑。一個特別優選的實施例包括1%2-巰^t乙醇。RNA酶失活劑的其它實施方式可以優選包括本領域技術人員已知的降低RNA酶中一硫健的材料。裂解緩衝液的優選實施方式進一步含有螯合Mg2+和C的&曰、劑。一個優選的實施方式含有0,1mM5mMEDTA。特別優選的實施方式含有1mMEDTA。裂解緩衝液貯液的其它優選實施方式含有木領域技術人員已知的螯合劑，其包括但不限於EDTM:P、2，3-二巰基丙醇和EGTA。裂解緩衝液的優選實施方式可以含l7tRNA，其來自各種來源並含:fj—其以抑制非特異性血衍生DNA和RNA吸附到過濾板上。另外，t:RNA的存在防止血衍生:RNA的降解。在優選實施方式中，工作裂解緩衝液的LRNA包括i0mg/ml大腸桿菌(E.coli)LRNA。其它實施方式可以含有來自任何本領域技術人員已知來源的tRNA。裂解緩衝液的優選實施方式可以含有來自廣泛多種來源的DNA,其被加入以抑制非特異性血衍生DM和RM吸附到過濾板k。工作裂解緩衝液的DNA包括lOmg/ml的超聲降解的鮭魚精子DNA。在其它實施方式中，可以使用來fi其它生物的DNA。裂解緩衝液特別優選的實施方式可以含有摻標對照RM來計算目標mRNA在原始樣品中的精確量。在本發明的實施方式之前，難以將一個實驗的結果與其他實驗的結果進行比較，因為研究所與研究所之間的變化和缺少標準化。然rfn，在本發明的優選實施方式中，通過將利用TaqMan檢驗所得到的數值除以每個樣品中摻標對照RNA劑量的回收百分率，來確定冃標的精確量。F面描述並在實施例5中示範了這樣的粘確C^,裂解緩衝液的優選實施方式每個孔中含有101Xo'。，更優選lXo°1X,個摻標RNA的拷貝。在優選實施方式中，所使用對照RNA的量至少足以被檢測，但不能多到顯著地幹涉需要定量的目標mRNA的量。在優選實施方式中，加入到裂解緩衝液中的對照RNA是多聚(A)+RNA。在特別優選實施方式屮，其屮檢測樣品是人血，對照RM與人血屮存在的RNA不同源。在某些優選實施方式中，對照RNA的序列與目標mRNA的同源性小於90%，或者與目標mRNA在K度上有大f10%的差異。在其它優選實施方式中，對照RNA的序列與目標mRNA的同源性小於85%，或者與目標mRNA在長度上有大於5%的差異。在進-一歩實施方式中，對照,A的序列與冃標mRNA的同源性小於75%，或者與冃標mRNA在長度....匕有大於2%的差異。在可以替代的實施方式中，對照RNA的序列與目標mRNA的M源性小丁'65%，或者與目標mRNA在長度l:有大於1%的差異。在一個實施方式中，對照RNA可以優選地通過PCR方法擴增模板寡聚核苷酸來製備。因此，可以使用正向引物(SEQIDNos:10、11、15和8)、反向引物(SEQIDN:9、16禾P9)以及TaqMan探針(FAM-SEQIDNO13-TA:M:RA、F雄-SEQIDN017-TAMM和FAM-SEQIDNO12-TAMM)來擴增各種對照RNA寡聚核昔酸。可替代的實施方式包括使用多個不同的需要定量的目標DiRM。進一步的實施方式包括使用多個對照RNA。該方法包括對mRNA進行定量，在優選實施方式中需要由mRNA合成cDNA和使用PCR擴增cDNA。在-'個優選實施方式中，使用裂解緩衝液(150ul/孔X3次，手工)和清洗緩衝液(150u1/孔X3次，手工或者BioTekftG4)對多孔過濾板進行清洗。接著，將cDNA合成緩衝液加入到多孔過濾板(40u1/孔，手工或者顆6)。將Axymat(AmgenAM-96-PCR-RD)放置在多孔過濾板上，接著將其放在熱塊(37C，VWR)上並孵育(>90分鐘)。然後，將多孔過濾板進行離心(2000轉Z分鐘,4C下1分鐘)。將PCR引物加入384孔PCR板，將cDNA從多孔過濾板轉移到384孔PCR板。對:PCR板進行離心(2000轉/分鐘，4C下丄分鐘)，開始即時PCR(TaqMan/SYBER)。如下面實施例6所述，另一優選實施方式包括在mRNA雜交或者d)NA合成過程中應用特異性反義引物。寡聚(dT)和特異性引物(NNNN)M時在多聚-ARNA的不M位置引導cDNA的合成(圖15)。如圖15所示，特異性引物(NNNN)和寡聚(d':[')在擴增過程巾引起cDNA的形成。即使通過在95。C對每個孔加熱2分鐘將特異性引物衍生的cDNA去除，由加熱變性程序(使用T叫Man定量PCR)所得到特異性CMcDNA的量也與由未加熱陰性對照中所得到的量相似(圖16)。不希望被任何解釋或者理論所限制，這種結果一個可能的解釋就是在擴增過程中寡聚((JT)衍牛的cDNA可以杼換引物衍牛的d)NA(圖i5)。這是特別方便的，因為加熱變性程序被完全排除。而且，為不同冃的加入多種反義引物，可以從殘餘的cDNA擴增出每種基因，將GonoPlatc內寡聚(dT)衍生的cDNA貯存以用丁'將來。木發明的另一優選實施方式包括進行高通還:定.S來自全血mRNA的設備。該設備包括多孔過濾板，其含有多個樣品傳輸孑L、在樣品傳輸孔下方捕獲白細胞的過濾器、以及在濾器下方的niMA捕獲帶，其含有固定在niRM捕獲帶的孔屮的寡聚(d':[')。為了提高白細胞的收集效率，將多個過濾膜層疊在一起。將多孔板安裝在真空盒上，其適合容納過濾板並在多孔板和真空盒之間形成密封。在該設備的一個優選實施方式中，真空盒適合容納真空源以進行真空吸引。在另-一優選實施方式中，多孔支持物置--丁良個'盒內，在多孔過濾板的下方。在該設備的一個優選實施方式中，將可以由軟塑料例如矽^枚膠製成的密封墊插入多孔支持物和多孔過濾板之間。儘管許多傳統的擴增技術可以與木發明結合使用，但木發明特別優選的實施方式包括使用全血衍生RNA和對照RNA進行即時定量PCR(TaqMan)。Holland等人的PNAS88:72767280(1.991)描述了一種T叫Man檢驗的檢驗。在聚合酶鏈式反應產物檢測系統屮採用Taq聚合酶的5'到3'核酸外切酶活性以伴隨擴增產生特異性可檢測的信號。一種寡聚核苷酸探針，3'末端不能延伸，5'末端被標記，並被設計成在目標序列內部雜交，將該探針引入到聚合酶鏈式反應檢驗中。在擴增過程中，探針與聚合酶鏈式反應產物鏈中之一的退火產生了適合核酸外切酶活性的底物。在擴增過程中，Taq聚合酶的5'到3'核酸外切酶活性把探針降解成更小的片段，其可以與未降解的探針區別開。這種檢驗是敏感和特異性的，並且相對於更多麻煩的檢測方法有顯著的改進。Gelfand等人的美國專利No,5，210，015和Holland等人的PNAS88:72767280(1991)描述了這種檢驗的一個版本，在這裡引用作為參考。進-一歩，Fisher等人的美國專利No,5，491，063提供了TaqMan型檢驗。Fisher等人的方法提供了一種反應，其導致被發射光標記所標記的單鏈寡聚核苷酸探針的剪切，其中該反應是在出現DNA結合化合物時進行的，該化合物與標記相—Ef—作用以修飾標記的發射光。該方法利用標記探針的發射光變化，其來自於探針的降解。該方法通常可以應用於利用導致寡聚核-ff酸探針剪切的反應的檢驗，特別的，可以應用TM源擴增/檢測的檢驗，其中雜交的探針隨著引物的延伸而被剪切。提供了同源擴增/檢測的檢驗，其可以同時進行擴增目標累積的檢測和目標序列的序列特異性檢測。Fisher等人的美國專利No.5，491，063在此引入作為參考。TaqMan檢測的檢驗為經典的PCR檢驗提供了多種優點。'宵先，T叫Man檢測將PCR的靈敏性和目標序列中存在的內部寡聚核苷酸序列的雜交結合在一起。經過PCR，樣品不需要必須在瓊脂糖凝膠上分離，並目.取消了用來確定PCR產物同一性所必須的後續SouLheiii印跡和雜交步驟。這些附加的PCR後確認步驟可以容易地連續多天以進行精確的鑑定。使用TaqMan系統，在2.5小時內完成該檢驗。進-'步,檢驗步驟中所採用的方法使有效地處理大一的樣品並沒有夂叉汙染成為可能，岡此其適合遙控取樣。其結果是，使用T叫Man檢驗可以在非常短的時間內處理人量的檢測樣品。TaqMan系統的另-一個優點是用於多元化的潛力。由於可以使用不同的螢光報告子染色劑來構建探針，因此在相同的PCR反應中可以結合幾種不同的:H:[v系統，這樣降低了在每個檢驗是單獨進行的情況下會發生的勞力成本。快速和最終數據的優點結合勞力和成本效率使得使用本發明特異性引物的TaqMan檢測系統成為用於監測mv存在的有利的系統。在優選的實施方式中，通過簡單的為每個目標改變引物和探針，可以對各種mRNA進行定量。岡為肝素含有細胞外Ca2+，這是發揮最大生物學活性的重要岡素之一，岡此可以在全血中對藥物作用進行分析，而不需要分離白細胞。在本發明優選的實施力'式屮，使用已知量摻標標準:RNA來確定給定樣品總效率的能力來自於無關於劑量和無關於序列的實施方式。使用已知量的對照RNA可以將PCR檢測轉化為原始樣品中目標DiRNA的量。隨著時間對個體的大樣品進行這樣的計算，以確定每ul全血中各種基因mRNA存4:的通常範閨。將本發明的實施方式用於在給定時間檢測個休全血時，表明存在暗示疾病的mRNA的結果，其水平落在止常範圍之外，發出疾病存在的信3。本發明的實施方式用丁'檢測各種疾病的檢驗。例如，通過在許多樣品中誘導mRNA到最大希望的水平，檢測給定樣品的mRNA，並檢測樣品的mRM水平以確定其是否降到最大水平以下，從而來檢測暗示疾病的mRNA。相似的，本發明的實施方式可以用於確定醫療領域的效率。相似的，本發明的實施方式可以用於氧化壓力測試，其屮對使州不同量抗氧化劑的人樣品的mRNA水平進行互相比較。另一優選的實施方式涉及一忡卨通gg全血中mRNA的試劑盒。該試劑盒包括高通量定量全血中mRNA的設各、含月l素的lfll收^'R'、ftX灣緩衝液和裂解緩衝液。另一優選的實施方式涉及一種川f卨通^',i:#全血中mRNA的全自動系統，其包括向設備加入血樣、低滲緩衝液和裂解緩衝液的遙控設備；自動真空吸引儀和離心機，以及自動PC:R儀。實施例實施例1對本發明方法的各種方案進行測試並將其用於定量全血的肌動蛋白mRNA和CD4m醒。檢測三種抗凝血劑ACD、EDTA和肝素，其中肝素導致了最大比例的白細胞保留。白血球吸附(I.eukosort)膜已經用於輸血中的ACD血，即使將M層膜同日寸使用，也通過了大約1540%的白細胞。對EDTA血進行測試，發現其能力和白細胞保留與ACD的相似。然而，特別注意的是1%肝素血液中的白細胞被捕獲在白血球吸附膜I:。對來自肝素血液白細胞的100X捕獲表現了使用本發明mRNA定量的有效性。這些數據說明使用肝素血最適合m:RNA的精確定量，而ACD血對於需要大體積血和較小定量結果的應ltj是有jlj的。對使用冷凍血和新鮮血樣品的結果進行了比較。如圖3所說明的，從新鮮血洩漏細胞中回收了比冷凍樣品洩漏細胞多的CMmRNA。還測試了玻璃纖維過濾器全血保留的效率，相對於raT-基過濾膜的保留值。如表Ii所示，即使在使用低滲緩衝液(5niMTris，pH7.4)對膜進行清洗的時候，玻璃纖維膜只接受40uL的全血。然而，如表II所示，白血球吸附過濾器接受丫.M著地比玻璃纖維過濾器較大量的全血。表11,擴增全血中P-肌動蛋白mRNAtableseeoriginaldocumentpage13VWR)並孵育(>90分鐘)。然後離心多孔過濾板(2000轉Z分鐘,4C下1分鐘)。將PCR引物加入到3M-孔PCR板，並將c:[)NA從多孔過濾板轉移到384-孔PCR板。圖8說明用於PCR的最佳cDNA值為2uL/孔。對PCR板進行離心(2000轉/分鐘，4C下丄分鐘)，然後開始即時'PCR(T叫Mati/SYBBR)。本發明的方法具有卨'm隠特異性；使用T叫ManqPCR對CMmRNA進行擴增達到'/無法檢測的DM濃度(<10拷貝/孔)。如圖9所示，木發明達到m脂A定.S變化的低係數。與傳統的變化係數大約300%的mRNA定量變化係數相比，雜交兩個小時可以達到小於13%的變化係數。而且，如圖IO所示,線性結果表示所捕獲的m:RNA的量與每孔全血的體積有接成比例，這使得本發明是定量mRNA的仃效和可重複方法。實施例2將50uL肝素化的冷凍人血應用到白血球吸附過濾板。對每個孔進行真空處理並使用150pL5mMTrispH7.4和150uL1%的乙醇進行清洗12次。接著，將40uI,含有1.7071.856M硫氰酸胍的裂解緩衝液加入到孔中。在室溫下孵育15分鐘後，將過濾板置於GenePlatek並以2000轉/分鐘在4C下離心1分鐘。再加入20uL裂解緩衝液，樣品離心5分鐘。在將GenePlate孵育2小時後，使用100uL裂解緩衝液對每個孔進行清洗3次，接著應rtj3次150uL清洗緩衝液(liiiMTrispH:7,4,ImMEDTApH:8,0,0,5:M:NaCl)。在GenePlate內合成cDNA，並使用2uLcDNA用於TaqMan檢驗以定量CD4。圖11中表示了i亥結果。實施例3將5PIJ幹素化的冷凍人血應用到白血球吸附過濾板。對每個孔進行真空處理並使用150uL5mMTrispH7,4和150uL100%的乙醇進行淸洗12次。接著，將40uL含有1.791.M硫氰酸胍和0.5mg/ml蛋白酶K的裂解緩衝液加入到孔巾。在室溫下孵育15分鐘後，將過濾板置於GenePlate上並以2000轉./分鐘在4C下離心1分鐘。再加入20uL裂解緩衝液並再離心5分鐘。在將GenePlate孵育2小時後，使用100UL裂解緩衝液對每個孔進行清洗3次，接著應用150uL清洗緩衝液(lOmlTrispH7,4,1mMEDTApH8.O，O.5MNaCl)3次。在GenePlate內合成c醒,並使用2PLd)NA用fTaqMan檢驗以定量CD4。圖丄2中表示了該結果。實施例4裂解緩衝液ll::液.5%N-月桂醯肌氨酸4XSSClmMTrisH:C1，p:H7,41mMEDTA0,1%IG:EPALCA—630丄.79丄M硫氰酸胍工作裂解緩衝液裂解緩衝液貯液lml2-巰基乙醇10PL超聲降解的鮭魚精子DM(10mg/ml)10uL大腸桿菌-t.RNA(lOmg/ml)蛋白酶K(20mg/ml貯液)10uL25uL(最終.5mg/ml)實施例5製備對照隠為了合成對照隠，使用T7-止:向引物(S卜:Q11)NO3、5和6)以及dT切反向引物(T40-SEQIDNO1和T4。-SEQIDNO7)對模板寡聚核—ff酸(SEQIDNO2和4)以及來自K562細胞的c:[)NMRNMure，Irvine,CA)進行擴增，其分別通過30個95。C變性30秒、55。C退火20秒，然後72。C延遲20秒的循環。寡聚核苷酸是從IDT(Coralville，IA)或者Proligo(:Boulder，C)購買的。序列如下SEQIDNO1:5'-GGGTGCTGTGCTTCTGTGAAC-3''，SEQIDNO2:5'-GCCCCCTCACTCCCAMTTCCAAGGCCCAGCCCTCACACATTGTTCACAGAAGCACAGCACCC-3'，S卜:QIDNO3:5'-GT'AATACGACTCACTAT'AG(;GGGACAGCCCCCTCACTCCCAAA-3'，SEQIDNO4:5'-GAAGCGTGTGTCACTGTGTGTTTCCAAGGCCCM〗CCCTCACACATTGTTCACAGAAGCACAGCACCC-3''，SEQIDNO5:5'—GTAATACGACTCACTATAGGGGGACGGAAGCGTGTGTCACTGTGTGT-3''，SEQIDNO6:5'-GTAATACGACTCACTATAGGGGGACGCATTCCGCTGACCATCAATA-3'，S卜:QII)NO7:5'—T'CCAACGA(;C(;(;CTTCAC—:V。通過體外轉錄系統(T7RiboMaxExpress,Promoga)在37。C下進行30分鐘來從純化的PCR產物合成:RNA，接著用DNA酶處理15分鐘兩次。將純化的RM產物懸浮在無核酸酶的水中，並以rRNA作為標準通過RiboGreen(MolecularProbes)檢驗來確定其濃度。通過毛細管電泳晶片(iChip,H:itachiChemical，日本東京)來分析其質量。收集白細胞從健康的成年志願者收集靜脈血樣。由指定的供應商獲得玻璃纖維過濾板(RNAture)和白血球吸附膜(PallLifeSciences,AnnArbor,MI)。tilWhatman-Polyflltronics(Cl丄fton，NJ)製造定製的96-孔白血球吸附過濾板。由於認為人血樣是傳染的材料，因此設計了一次性真空管，並由Ambritt.Bngineering(SantaAna,CA)製造定製的產品。將過濾板置T.'次性真空管上並用200uL磷酸緩衝鹽水(PBS:I:nvitrogen，carlbad，CA)清洗兩次。停止真空後，接著向過濾板施加新鮮或者化凍的血樣(達到200liLZ孔)。在將所有的樣品分配入過濾板中後，開始14cmllg的真空過濾，接著用PBS清洗(200PL/孔)12次。最後一次清洗後，繼續真空5分鐘以使膜完全千燥並從膜去除殘餘量的ras。裂解細胞和製備mRNA將過濾板置f空白微孔板上，接著應用'10PL裂解緩衝液(RNAture,Irvine,CA)，其含有反向引物(終濃度為25nM)、作為定量標準的合成隠、1Ug/mL鮭魚精子隱(Bppendorf'-5Prime,West.bury，NY)、lug/mL大腸桿菌(E,coli)t.RNA(Sigma)、500ug'/mL蛋白酶K(Piorcc,Rockford，IL)以及1:100稀釋的2-巰基乙醇(BioRad，:Hercules，CA)。將樣品在室溫下孵育1.個小時。在某些實驗中(圖14C14D)，將各種濃度的寡聚dA加加入到裂解緩衝液中。接著將過濾板置於固定寡聚(dT)的微孔板上(GenePlate，RNA-ture),接著在650Xg下離心1分鐘。然後加入20uL裂解緩衝液，接著在1450Xg下離心5分鐘。進行該步驟後，在GenePlate每個孔中裂解緩衝液的休積大約為50uL。將GenePlate進行孵育後，使用i00uL淸澈的裂解緩衝液對該板進行清洗3次，然後用150PL清洗緩衝液清洗3次(H)mMTrispH7.4，ImM卜:DT'A,.5MNaCI)。合成cDNA通過加入30uLcDNA緩衝液在GcncPlato內合成cDNA，其含有1XRT緩衝液、0.5m:MdNTP、15申.位的rRNasin和37.5竿.位的M:MLV反轉錄酶(:Promega)。將該樣品在37'C孵育2小時。由於反向引物加入到裂解緩衝液中，cDNA合成反應中不包括引物。合成c:[)NA後，將50uL無核酸酶的水加入到每個孔屮，並使ltj2uL進行下面所述的Taq:M:an檢驗。TaqMan即時:PCR通過PrimerExpress2,0版(ABI，FosterCity,CA)設計對照RNA用的引物和T叫Man探針。對於bcr-abl，我們使用公開的序列。在某些實驗中，使用HYB模擬器(RNAture)來設計反向引物。使用止:向引物(S卜:QH)NOl、11、15和8)、反向引物(SEQIDNO9禾卩16)以及TaqMan探針(FAM-SEQIDNO13-TAMM，FAM-SEQIDNO17-TAMRA和FAM-SEQIDN01.2-TAMRA)來擴增對照RNA。為了確定血樣巾CD4mRNA的量，在PCR板的不同孔中分析CD4和對照RNA，而不是在-一個孔中進行多個PCR。對於P-肌動蛋白，使用可商業獲得的引物和探針(ABI)。將下列物質混合入384孔PCR板(ABI)屮2uLcDNA、5uLTaqMan通用主混和(mastermix)(ABI)、1uL5uM的正向引物、1UL5uM的反向引物以及l"L2uM的TaqMan探針。在ABIPRISM7900HT(AB]:)中進行PC:R，1個循環90°Ci0分鐘，接著進行45個循環的90°C20秒、接著55°C20秒和最後的60°Ci分鐘。使用SDS2.版(則對數據進行分析。在某些實驗中，直接在GenePlate(pticon，MJRos痕h)內進行TaqMan檢驗。使用寡聚核甘'酸(SEQIDNO2、4和14)以及PCR產物作為對照RM的定量標準。序列如下SEQIDNO8:5'-AAATGCCACACGGCTCTCA-3'SEQIDNO9:5'-CAAGTGTCTTCGTGTCGTGGG-,'SEQIDNO10:5'-AGCCC'CCTCAC'TCCC'AAA-3'SEQIDNO11:5''-AGCCCCCTCACTCCCAAA-3'SEQIDNO丄2:5'-CAGTGGCTAGTGGTGGGTACTCAATGTGTACTT-3's卜:qii)no13:5''-c薩；gccca(;ccctcacaca-3'SEQIDNO14:5''-CAGGGACAAATGCCACACGGCTCTCACCAGTGGCTAGTGTACTCA雄TGTACTTTTGGGTTCACM蒸;C濕GCACCCAGGG-,'■，SEQIDNO15:5''-CCACTGGATTTAAGCAGAGTTCAA-:3'SEQIDNO16:5'-TCCAACGAGCGGCTTCAC-3'SEQIDNO17:5''—C'AGCGGCC'AGTAGCATCTGAC'TTTGA—3'。分析數據使用每個基因的標準曲線來確定PCR產物的量。然後將TaqMan結果乘以稀釋係數(X40:80uLcDNA中取出2"L用於PCR，並Xi,67:從50"L裂艦德油液/孔合成3PLd)NA)。進一歩通過將回收的摻標RNA除以預先確定的摻標RNA的g(通常為每孔107個拷貝)，從而確定每個樣品摻標RNA的回收率。對TCMmRNA，將1<^皿皿結果乘以稀釋係數，除以體積，再除以相同樣品巾摻標RM的回收率。將每個血樣施加到過濾板的3個孔中(3份)，每個孔得到每個基因的單cDNA和單PCR。檢驗心效性圖13A表示了雜交動力學，其中在室溫下2小時後雜交達到平穩期。圖l:犯中描述了血劑量依賴性，其中CMmRNA檢測為0.05uL,並以對數級線性提高到200uL。我們也發現雜交效率在i525。C之間顯著變化(圖i3C)。如圖i3D所示，CMmRNA在肝素化血中非常穩定，並大部分在37TT卩7小時或者4,C過夜而不改變。這說明Cl)4可以是全血中基因表達分析的良好對照。圖13中的結果表達為基因數目的平均值±標準偏差。儘管循環極限(Ct)的CV小於1.2%，但在通過從對數級別轉化成線性級別而將Ct轉化成基因數目時，其實質性地提高。然而，如圖13所示，即使當起始材料為全血時，CV仍低到10:碼。定景本次研究中定景的目的是通過摻標對照RNA的使用來確定每個樣品的總檢驗效率,其被進一步用作計算原樣品中目標mRNA精確量的標準。該原理包括兩個假設:RM的回收是不依賴於劑量，以及該回收不依賴於種類。換句話說，在高拷貝數和低拷貝數mRNA之間，以及在不同序列的mRNA之間，回收率應該是相同的。這些假設不僅應用於mRNA純化步驟，而且應用T從細胞裂解到PCR的整個mRNA定量過程。為丫使第-、個假設有效，將不同說的多聚(A)i對照:RNA加入到裂解緩衝液中，並將其暴露到應用50uL血的白血球吸附膜上。在我們確認對照RNA沒有從單獨人血中擴增後，通過TaqMan檢驗來確定對照RNA的隨。如圖14A所示，在l5l9拷貝/孔的檢測範圍內，觀察到對照醒依賴於劑量的冋收。如果將相同的數據轉化成冋收率,這些數值將在大約20%處變得相似(圖14B)。圖MA和14B的數據是整個過程的總和，其包括mRNA純化和cDNA合成。在雜交平衡的情況下，解離常數(Kd)按照如下進行計算Kd=[隠]X[寡聚dT]/[隠:寡聚clT'];其中[隠]和[寡聚d'「]分別代表RNA和寡聚dT自由狀態的濃度，[RM:寡聚dT]代表與寡聚dT雜交的RNA的濃度。這意味著[RNA:寡聚d':[']是隨所應用RNA的&釘變化的。事實匕在用Yoyo-1.核酸染料檢測雜夂的RM時，[RNA:寡聚dT]是與所應用醒的量成比例提高的(Miura，Y,，Ichikawa，Y,，Ishikawa，T,，gura，M:,，deFries,R.,Shimada,H.，&Mitsuhashi,M.FluorometricdeterminationoftotalmRNAwitholigo(dT)immobilizedonmicrotiterplates.ClinC'hem.42，17586-1，1996年)。然rfi]，因為圖14B中對照RNA是每個孔中總mRNA非常小的一部分，因此其實際上不影響這個範閨內M的數值。當合成cDNA的歩驟中含有引物時，我們將面對種類內和種類間重複性的問題。然而，通過在雜交過程中加入引物，重複性提卨'，說明即使在弓I物序列不M的情況下，cDNA也是從預雜交的引物中被M等合成。儘管回收率本身可以在依賴樣品巾mRNA量的個體之間變化，但是圖1.4A和14B說明來自一個濃度的回收率可以應用到在相同樣品的其它濃度中。為了t》;則第二個假設，即M收不依賴種類，雜交被裂解緩衝液屮的寡聚dA競爭性抑制，其中-'種合成的多聚(A)—;—RNA。如圖14B所示，冋收的RNA在-:種摻標RNA以及目標原有CI)lm廳屮變化，因為我們特意使用了不同量的醒。然rff]所有RNA都被3X1012丄0"拷貝/孔的寡聚dA所抑制(圖i4C)。有意思的是，在將相同的數據轉化成目前的總百分率時，所有四種RNA表現了與大約3X112個拷貝/孔的IC5。非常相似的抑制曲線。這說明，在我們系統中mRNA的純化是寡聚(A)特異性並且不依賴序列。如圖14C所述，即使在應用1is個寡聚dA拷貝時，某些非特異活性仍然保留。然而，如圖14D所示，這種非特異性活性小於總活性的5%。這樣，非多聚(A)序列似乎在該檢驗中沒有發揮重要的作用。因為圖14B和14C是mRNA定量全部歩驟的總和，因此，這^同表示，即使在序列不相同的情況'卜'，目標基因的檢驗效率與摻標合成的RM相同。這同日」說明將T叫Man檢驗所得到數值除以每個樣品中摻標對照RNA單劑量的回收百分率，從而獲得目標mRNA的精確量。如圖13和14所示，檢驗中的變化為大約12%。為了估計檢驗之間變化，除了來自相M個體的新鮮或者冷凍血外,還使用相NJ的冷凍部分進行7個不NJ的實驗。在每個實驗巾，使用不同的過濾板和GenePlate，並製備用於裂解、d)M合成和PC:R的新鮮材料。如下面表III所示，對照RNA的回收率為429%。當不考慮對照RNA的回收，我們比較CM量的時候,這些數值會廣泛地變化。然而，在用每個樣品屮回收率調整後，數值會變得很相似，旦:中檢驗間的CV是714%。表111摻標:RNA回收和CD4mRNA記g:的總結tableseeoriginaldocumentpage18*:拷貝數=1'(AXCt+B)**:第一次後兩天，從相同個體取出的第二次血圖13A13D證明了檢驗的有效性。對來fi50uL肝素化人全血(圖13A、:B和D)或者合成對照RNA(圖13C)的cDNA進行T叫Man檢驗。圖13A表示雜交動力學。血等分在-80i:冷凍。在不同的時間對同樣的血等分進行化凍，並應用到過濾板上以調整雜交雜交長度在室溫下從30270分鐘。圖i3B表示劑量反應。使用PBS進行i0、i00和i000倍稀釋，並將52uL的樣品應用到過濾板。圖13C表示雜交溫度。在4、15、25和37。C下進行雜交2個小時。圖13D表示肝素化全血的穩定性。將血樣保存在4"C或者37"C下不同的時間長度，將每個樣品進行申.獨冷凍。將樣品同時解凍並將其應用到過濾板。數據表達為平均值±標準偏差。圖14A141)代表合成的摻標RNA的回收。在圖14A和14-B屮，將0個RNA34的拷貝應用到每個孔。在進行mRNA純化和cDNA合成後，通過T叫ManPCR確定對照醒的量。圖1'1A表不回收的對照隱的量相對f加入的對照RNA的*(拷貝數)。圖14B表示回收百分率，其按下式算出%回收率=回收的對照RNA/加入的對照RNAXl。圖14C和14D表示在有寡聚dA存在時的回收百分率。將50uL肝素化血應用到白血球吸附過濾板後，將含有各種量對照RNA34(□)、對照RNA36(O)和對照bcr-abl(△)與015個寡聚dA2。拷貝施加到每個孔中。在mRNA純化和cDNA合成後，通過TaqManPCR確定對照RNA的量。圖14C表示冋收的RNA的量(拷貝數)相對於寡聚dA2。的量。在圖MD中，總百分數按照下式算出%總數=回收的含有寡聚dA2。RNA的量/回收的不含有寡聚dA2。RNA的量X100。實施例6將50uL肝素化人血應用到附著4^白血球吸附膜的過濾板。對血進行真空吸引並用150uL5m:MTris(pH:7,4)清洗12次。接著將過濾板置於GenePlateI-—，並將40uL裂解緩衝液(含有或者不含CM的反義引物)應用到每個孔。通過離心將細胞裂解物從過濾板轉移到GenePlate。使用40uL裂解緩衝液承::g該過程一次。將GenePlate在室溫孵育2小時後，使用100uL裂解緩衝液對每個孔潔冼3次，然後-:次應用150uL清洗緩衝液。通過加入cDNA合成緩衝液和適當的酶在GenePlate每個孔i|!合成d)NA。在37°C孵育2小時後，使用i50"L9(TC的水將每個孔淸洗三遍。接著通過TaqMan即時PCR對GenePlaLe內的CD4mRNA進行檢測。為'/使寡聚(dT)替代被特異引導(被NNNN)的cDNA的假設有效，在GonoPlato中使用或者不使用特異性引物來合成c:[)M。接著，直接從Genen:Plate中擴增CD4基岡。如圖17所示，由兩個樣品擴增CM。這暗示上遊cDNA被從固定的寡聚(dT)衍生的cDNA替代。實施例7整體方案如圖18A所示，將全血應用到過濾板以捕獲0細胞(1)。在用磷酸緩衝鹽水(PBS:Invitrogen)清洗過濾板後，去除了紅細胞和細胞質組分。這個過程比傳統的密度梯度分離外周l(l單核細胞(P腿C)是更簡單和更高通量的。如圖i8B所示，(標準隠(O)、Cl)'l、p21(i)、卜'asL和白細胞二亞乙基M胺Oukotrien)C4合成酶mRNA(LTC4S)(■))過濾板的雜交性能比密度梯度方法稍好。在PBMC中，白細胞三亞乙基四胺C4合成酶mRNA(LTC4S)mRM顯著地少，可能岡為去除了粒細胞。然而，在:PBMC巾，p21mRNA顯著地高，因為在長分離工藝中的二級誘導(圖22)。比較了另--種方法，其中將全血進行離心，並沉澱懸浮在低滲溶液(lmM:隨)3、15mMNH:4C1、，14-mMEDTA,pH7,2)屮以使紅細胞破裂，然後立刻離心以沉澱O細胞(圖18B:低滲)。然而，C'D4、p21、FasL和LTC4S的水平都比過濾板方法中的低。如圖iSA(II)所示，下-一歩是將裂解緩衝液應用到過濾板上並將裂解物轉移到固定寡聚(dT)的微孔板以純化mWA。為了評價該步驟，採用了二種其它的方法來進行比較。將苯酚/異氰酸胍(Trizol，Invitrogon)(圖18C:P/GI)或者試劑盒供給的裂解緩衝液(RNeasy，Qiagen)(圖18C:Silica)應用到過濾板的每個孔，接著根據產品的說明書手冊由離心柱(矽)沉澱固A(P/GI)或者洗脫RNA。為了直接純化多聚(AVRNA，將裂解緩衝液應用到過濾板，並將裂解物轉移到固記S聚(dT)的微孔板(GenePlate，:RNAt.ure)(圖18C:dTMP)或者新的微管中，其含W寡聚(dT)纖維素(Invitrogen)(圖18C:dTC)。雖然在微管屮使川大別勺分離P:BM:C時，P/G]:、矽(Silica)禾Pd'TC方法表現了充分的性能，但是這些方法刈T過波:板休系不能很好地作用，其中只使用了50uL血(圖i8C)。而日.，如果在管中裂解細胞沉澱，機械強度(震蕩或者吹打(pipetting))的程度對於釋放mRNA是必須的，這個步驟會造成實質性變化。然而，使用過濾板方法，細胞分散在膜內，而且應用裂解緩衝液足以工作而不需要任何附加的機械力。由於裂解緩衝液優選含有引物的混合物，因此兩個獨立的雜交反應同時發生(圖18A)。一個發生在同定的同定寡聚(dT)和mRNA的多聚(A)尾端之間。另-一個雜交反應發生在特異性引物和mRNA的適當位置之間(圖18A(n))。儘管特異性引物的設計是關鍵的，但是充分雜交時間使檢驗比在cDNA合成過程中引物的雜交更可重複。首先出現好像d)NAiRNA複合體通過與固定的寡聚(dT)雜交停留在固體表面(圖18AH)。因此，通過在95i:加熱5分鐘從固體表面去除cDNA。然而，擴增基因的量與未熱處理對照的相比沒有變化(圖1.8D嵌入物)。為了檢測d)M-mRNA複合體是否被以某種方式從固體表面除去，在合成cDNA後，用水仔細地清洗微孔板，並直接用於PCR。然而，雜交步驟中使用或者不使用特異性引物都成功地擴增了目標基因(圖181))。這些數據表明特異性引物引導的d)M可以被寡聚(dT)引導的cDNA代替(圖18A(III、IV))。這使該系統^優勢，因為溶液中的cDNA川十朵岡o^，微孔板自身可以作為cDM庫用作有效、儲存和將來使用。為/確認在裂解和後續雜交過程中RNA的穩定性，使用水或者濃縮的嗜曙紅細胞提取物稀釋含有相同量標準R,的各種濃度裂解緩衝液。如圖18K所示，在將嗜曙紅細胞提取物懸浮在清洗緩衝液(lOmlTrispH7.4,1mME亂0.5MNaCl)中時，其自身大大地破壞了標準:RNA的定量，其中將雜夂嚴格性維持在沒有主要的裂解緩衝液組分。然而，當將嗜曙紅細胞提取物懸浮在裂解緩衝液中時，RNA被保留並且與其水稀釋溶液相似(圖18E)。寬範圍的最佳緩衝液濃度(70120%)使該體系耐用並且可至復。濃度高於140%的裂解緩衝液會顯著降低檢驗性能。^tMi進行研究以確定最佳和nJ重複的條件，其表現出如圖]9AF所不在5個不同目標RNA中相同的性能(標準RNA(O)、CD4(籲)、p2i(i)、FasL和白細胞二亞乙基M胺C4合成酶ni^A(I..TC4S)(■))。可重複條件對於後續基因'疋'tt部分是關鍵的。圖19中的每個數據點是來自單個典型實驗三份(每份50uL)血等分的平均值±標準偏差(s.d.)。但是每個實驗重複至少二到三次。首先，檢測三種典型的抗凝血劑。儘管肝素表現出比ACD和EDTA稍好的性能，但是三種抗凝血劑都是可接受的(圖19A)。由於ACD和EDTA螯合鈣,其是許多生物學活性的關鍵組分，因此肝素是這個使用全血進行體外刺激項g的抗凝血劑的選擇(圖22)。在血解凍後保持全血的穩定性是主要的考慮。因此，某些商用系統(PAXgene、PreAnalyUx)使用特定的即刻裂解細胞的血容器，並日.釋放的RNA穩定相對長時間。然而，大體積裂解物的操作使得整個體系有問題。而且，由於該項目的目標之一是在體外基因誘導之前和之後對mRNA進行定量(圖22AH)，因此肝素化全血貯存在4°C以及檢測在mRNA水平的變化。儘管四個正基岡(CD4、p21、FasL和LTC4S)的水平在血解凍後不穩定，但是一旦將血貯存在4E兩小時後，該水平都變得穩定和恆定(圖19B)。使用寡聚(dT)製備多聚(A)+m:RNA通常在室溫進行。然而，其性能在2030。C之間會變化(圖19C)。當使用短合成RNA時,在2023t:之間的變化是顯著的(圖19C)。因此，製備mRNA的步驟在4。CK進行。雜交的K度也是關鍵的。某些RNA(標準RNA和FasL)在兩小時後達到了穩定狀態，而其它需要四小時以上到八小時來穩定(圖i9D)。因此，在4"C——R4行製備mRNA的步驟過夜。通過切換到這種條件，實質....匕改善了檢驗與檢驗之間的變化。不使用任何附加的引物合成c:[)NM圖1.8D)。儘管短合成RNA和大還:RNA(CD4)需要少量的反轉錄酶，但其它RNA需要人約100單位的麗LV反轉錄酶拉達到穩定狀態(圖19E)。丫/趣的是，RNaseli-腿LV(S叩erscript，Invitrogen)與該體系中原來的麗LV相比表現出差的性能。在37t:孵育90分鐘以上對f所有檢測的:RNA的種類是充分的(數據未顯示)。溶液中的齒直接用於後續的TaqMan即時PCR。該檢驗對轉入PCR的c隱量的比例敏感。通常可以得到的緩衝液含有二硫蘇糖醇(DTT)，其抑制PCR。因此，如圖19F所示，最大的cDNA體積是2uL/10pL:PCR。通過從緩衝液巾去除DTT，c隱的體積提高到4uL/10liLPCR。皿本研究定量步驟的目標是通過利用已知量的摻標標準:RNA來確定每個樣品中總檢驗效率，^進-一歩用作將PCR結果轉化成原樣品中目標mRNA量的標準。這個原則依賴兩個假設具有不同豐度的相似DiRM樣品之間的效率是一致的(不依賴劑量)；以及不同mRNA序列之間的效率是相同的(不依賴序列)。為了確認第-一個假設，將不同量的合成RNA標準加入到裂解緩衝液中，其暴露到含有5iiL血的過濾板中。在確認標準RNA沒有由單獨人血中被擴增後，通過T叫ManPCR確認標準RNA的回收。如圖20A所示(標準:RNA(O)、CD4(籲)、p21.(i)、FasL和白細胞三亞乙基四胺C4合成酶mRNA(LTC4S)(■))，在測試的104109個分子孔的範圍內觀察到標準RNA不依賴於劑量的回收。由於與50uL血屮存在的總iiiRM量相比，標準RNA的這個範圍是充分小的，因此四種其它自身mRNA的水平保持不變(圖20A)。將相同的數據轉化成冋收百分率時，這些數值全部大約23%相似(圖20B)。在雜交的平衡條件K，解離常數(Kd)按照如卜'進行計算:Kd=[RNA]X[寡聚(dT)]./[RNA:寡聚(dT)]其中[RNA]和[寡聚(dT)]分別代表RNA和寡聚(d'T)自由狀態的濃度，[RNA:寡聚(dT)]代表與寡聚(dT)雜交的RNA的濃度。這意味著Kd在該系統中維持作為-'個穩定的數值，並且[RNA:寡聚(dT)]取決於應用的RM的量而變化。事實匕在用Yoyo-l.核酸染料檢測雜交的總RNA時，[RNA:寡聚(dT)]是與應用的RNA的量成比例提高的。這些數據也表示，由標準RNA的一個濃度得出的M收百分率可以應用到相同樣品內mRNA的任何濃度。對於第二個假設，使用或者不使用寡聚(dT)作為競爭性抑制劑來進行雜交。如圖20C中所不，所有5個目標醒的Ct值被每孔3Xl12以上分了的寡聚(d':[')顯著抑制，儘管這*RNA的表達水平都不同。有趣的是，當相同的數據轉化成抑制百分率時，所有的5個RNA表現出幾乎相同的抑制曲線,其具有大約3Xl13個分子/孔的IC5。(圖2D)。這說明該系統是多聚(A)特異性和不依賴序列的。如圖20C所示，即使在應用1015個分子寡聚(dA)(標準醒與CD4)後，仍保留某些非特異性活性。然而，如圖201)所示，當Ct數值(對數級)轉化成分子數目(線性級)時，這些非特異性活性是可以被忽略的。因此，非多聚(A)序列似乎在這個系統屮沒有發揮歪要的功能。因為圖20AD是對mRNA定量整個過程的總和，因此這些數據表示任何目標基因的總檢驗效率與摻標的標準RNA的效率是相同的。這對f多聚(A)+:RNA來說是特殊的，因為在傳統總:RNA純化方法中的K和短RNA之間存在實質性的標準偏差(數據未顯示)。下一歩是將每孔中RNA的量轉化成每UI,血RNA的說。如圖2K所示，叫個原來mRNA的Ct值兒乎線性降低，其依賴丁'應用血的體積。即使O,OOluL(l:105稀釋，毎孔100uL)血巾也可以檢測到大量mRM例如CIM(圖20E)。由於裂解緩衝液巾標準RNA的量是相同的，因此即使血體積變化很人時，標準RNA的回收也不變，如圖20E。在每孔人於100iiL血時，Ct值達到了穩定狀態(圖20E)，這表明來自過濾板的O細胞增加的洩漏。一曰.將相同的數據轉化成每PL血的量，該數值將在每孔350iiL血之間保持穩定(圖20F)，這對於所有四個原有mRNA是真實的(圖20F)。記^14:依賴於兩個絕對數值應用的標準RNA的數量，以及TaqManPCR中標準DNA模板的數量。為了確保標準RNA產品的純度，在這個項目中使用RNA寡聚核——ff酸。儘管合成具有1.00個鹼基的:RNA寡聚核苷酸是難以達到的，但是這種長度是希望的，岡為:RNA寡聚核苷酸優選含有兩個引物位點、TaqMan探針位點和多聚(A)尾端。在本研究中的合成RNA是通過I)hariiiacon合成的，通過HPLC分析，具有86%的純度。HPLC純化的I)NA寡聚核苷酸也被用作T叫ManPCR的模板，因為擴增曲線的斜率(表示PCR效率)在寡聚核苷酸和cDNA之間是相同的。產生了具有每孔16l個分了寡聚核苷酸的標準曲線。在對PM濃度的貯液進行i061012倍稀釋時，出現了-一個問題。當使用TE或者水來作為稀釋劑時，標準曲線變化很大，特別是在少於l3個分子/孔的時候。在切換到含.1%20之間的無核酸酶水時，這個問題被完全消除。確定正常數值為了確定健康對象每UL血中mRNA的對照值，對來自52個個體(54個數據點，其中1個個體重複了3次)的CM、p21、FasL和LTC4S的水平通過15個不同的實驗檢測2個月以上。每個數據點來自於3個50uL全血的等分。如圖21A所示,標準R裡的冋收為3.56±0.49%(CV=13.7%)。儘管這個C'V比fl》允的免疫分析大得多，但因為其使用:PCR，還是可以接受的，其中一個循環差別代表產物g屮的兩倍。使用標準RM回收值，成功地將每個mRNA的數值轉化成每UL血的分子數，而不是依賴於i0———12摩爾或者i0———15摩爾。如圖21BE所示(標準RNA(0)、CM(籲)、p21(i)、FasL(命)和白細胞三亞乙基四胺C4合成酶mRNA(L':['C4S)(■))，CI)4、p21、FasL和LTC4SmRNA的對照水平分別是每UL全血.100，772±59，184(CV=58,7%)、1，692士858(CV=50,7%)、17，841±12，190(CV=68,3%)以及42，058±22，521(CV=53,5%)個分子。50%的CV意味著殘餘在TaqManPCR—個Ct內的正常數值。心意思的是，當平均值士ls.d.數值在每個圖中被遮蔽時，某些個體表達高數值(圖21B:E)。將表達高FasLm醒水平的個體重複3次(圖21D)。mRNA正常數值的確定結合低CV數值以及通過本發明優選實施方式，可獲得標準的確定可以用於檢測本領域技術人員已知各種疾病檢測的檢驗中。體外響應為'/評定作為模式系統白細胞對12-十四酸佛波酯-13-乙酸鹽(P脆)和鈣離子載體A23187(Cal)(Sigma)的響應，p21和FasLmRNA的水平進行定量(圖22，其中，對照剌激中的p21(△)、PMA+CAI剌激中的p21(i)、對照刺激中的FasL和PMA+CAI刺激屮的FasL)。在另一優選實施方式屮，分析對各種生物活性試劑刺激響應的各類型mRNA，其包括但不限於，例如放射線、紫外線、氧化壓力、臭氧、溫度、機械壓力、化學試劑、肽、激素、蛋白質、抗原、抗體、藥物、小分了化合物、有古材料、環境剌激、細胞-細胞間通訊、傳染性試劑以及過敏原。由於該系統使用肝素化的全血，而不是人造溶液中分離的A細胞的懸浮液，因此該結果反映了生理學--匕精確的條件。如圖22A所示，p21和FasLmRNA水平在PM和Cal的刺激後都快速上升，在90120分鐘後達到丫大約升高10倍的穩定狀態。p21的升高比FasL要快得多(圖22A)。通過在37tT下孵育，而沒有任何刺激，也會提高p21的水平，而FasL保持不變(圖22A)。有趣的是，即使在將肝素化全血貯存在4°CT21個小時，也可以觀察到響應(圖22B)，這提供了功能型分子分析的寬適應性。在分析mRM表達的上調或者'卜'調中，提高倍數是通常使用的參數。然而，如圖22CD所示，在PMA-Cal剌激後所誘導的p2i和FasLmRNA的量線性增長依賴於mRNA基礎水平的量。因此，即使當樣品比ii:常人群多2個標準偏差時(圖22C)，提卨倍數檢測也不能夠確定位T回歸線的非正常樣品(圖22G)。提高倍數檢測鑑定'/位T回歸線外(圖22D)的非正常樣品(圖22H)。圖22CD的兩個二維圖表清楚地區別了兩種情況巾正常和非正常的樣品。在圖22CII中，每個數據點是三次檢測的平均值。為了簡化圖表，沒有顯示標準偏差。然而，由於在X軸和Y軸平均值士2s.d.的遮蔽面積(圖22CD)含有左上角和右下角的開放空間，因此這些角落中的非正常樣品是難以確定的。通過將X軸旋轉移到回歸線(圖22EF)，將遮蔽面積最小化。這些圖表(圖22EF)提供了檢測正常人群外非正常樣品的更好方法。序列表I--l立化成工業株式會社日立化成研究巾心公司〈120>--------種基於多聚ARNA在溶液中合成cDNA的方法〈130〉0:I:JP0910586〈140>10/796，298〈14D2(M-03-09〈丄50〉丄0/698'967〈151>23-10-317〈170〉FastSEQforWindowsVersion4,0〈210>1〈211)21〈212>DNA人工序列〈220〉〈223>合成的寡聚核苷酸引物序列1gggtgctgtgcttctgtgaac21〈210>2〈211)63〈212>DNA人工序列〈220〉〈223>合成的寡聚核苷酸序列2g'ccccctcactcccaaattccaaggcccagccctcacacattg'ttcacag'aagcacagca60ccc63〈210>3人工序列〈223>合成的寡聚核苷酸引物序列〈400>3gtaatacgactcactatagggggacagccccctcactcccaaa43〈210>467〈2丄2〉腿〈213>人工序列〈223>合成的寡聚核苷酸序列〈400>4gaagcgtgtgtcactgtgtgtttccaaggcccagccctcacacattgttcacagaagcac60agcaccc675〈2丄丄〉47〈212>睡人工序列〈220>〈223>合成的寡聚核苷酸引物序列〈4.00>5gt肌tacgactcacta;tegggggacgg朋gcgtgtgtcactgtgtgt476〈2丄丄〉46〈212M)NA人工序列〈220>〈223>合成的寡聚核苷酸引物序列〈4.00>6gt肌tacggictcacta;tegggggacgcattccgctgaccatc肌ta467〈2丄丄〉丄8〈212>睡人工序列〈220>〈223>合成的寡聚核苷酸序列〈400>7tccaacgagcggcttcac〈2丄0〉8〈211>19DNA〈213>人工序列〈220>〈223>合成的寡聚核苷酸引物序列〈400>8aaatgccacacggctctca〈2丄0〉9〈211>21DNA〈213>人工序列〈220>〈223>合成的寡聚核苷酸引物序列〈400>9caagtgtcttcgtgtcg'tggg〈2丄0〉丄0〈211>18DNA〈213>人工序列〈220>〈223>合成的寡聚核苷酸引物序列〈400>10agccccctcactcccaaa〈2丄0〉丄丄〈211>18DNA〈213>人工序列〈220>〈223>合成的寡聚核苷酸引物序列〈400>11agccccctcactcccaaa〈2丄0〉丄2〈211>33DNA〈213>人工序列〈220>合成的寡聚核苷酸探針序列〈'1M2CfcigLggcUigLggLgggtticLcfcifciLgLgUicU〈21>1321〈212>:隱〈213>人工序列合成的寡聚核苷酸探針序列〈'1M3ccfcifciggcccagcccLctictica〈21>1489〈212>:隱〈213>人工序列合成的寡聚核苷酸序列100M4CfcigggfcicfcifcifciLgccfcicticggcLcLcfciccfcigLggcLtigLggLgggLticLctialgLgLticUttgggttCfiCfigfifigCfiCflgCfiCCCfiggg15〈211)24〈212>DNA<213〉人工序列〈223〉合成的寡聚核苷酸引物序列〈4Q0〉丄5CCflCtggfitt.tfifigCfiga.gttCfifi16〈211)18〈212>DNA<213〉人工序列合成的寡聚核苷酸引物序列〈4Q0〉丄6tccaacgagcggcttcac1817〈211)26〈212>DNA〈213〉人工序列〈223>合成的寡聚核苷酸探針序列<4〉17cagcggccagtagcatctgactttga2權利要求1.一種基於多聚ARNA在溶液中合成d)NA的方法，包括在RNA多聚A尾端和固定的寡聚(dT)雜交過程中應用特異性反義引物。全文摘要文檔編號C12N1/06GK101696442SQ20091014938公開日2010年4月21日申請日期2004年10月29日優先權日2003年10月30日發明者三橋將人申請人:日立化成工業株式會社;日立化成研究中心公司;