一種固定甲醛分解途徑關鍵酶及輔因子的方法及其應用的製作方法

2023-10-11 16:23:04

專利名稱：一種固定甲醛分解途徑關鍵酶及輔因子的方法及其應用的製作方法
技術領域：
本發明屬於酶工程技術領域，具體涉及一種用酶法治理甲醛汙染的方法，將兩種 具有催化活性和熱穩定性的酶蛋白——GSH-非依賴型甲醛脫氫酶(PADH)和甲酸脫氫酶 (FDH)固定在聚丙烯醯胺凝膠內部，製備成固定化酶，可用於分解和吸收氣體甲醛。
背景技術：
許多建築裝飾材料如人造板、膠粘劑、塗料、壁紙、家具等都能釋放甲醛，使甲醛變 成室內空氣汙染的主要氣體之一。甲醛由於存在板材內部，揮發期可長達3 15年，裝修 後一兩年內難以完全揮發掉。高濃度的甲醛對神經系統、免疫系統、肺和肝臟等都有毒害作 用，長期接觸甲醛的人，容易引起鼻腔、口腔、皮膚和消化道的癌症，還可能導致白血病。針 對甲醛的危害性，目前對於室內甲醛汙染的治理方法有汙染源的控制、通風控制、物理吸 附法、淨化處理法等，這些方法儘管在一定程度上有清除甲醛的作用，但都存在成本高、裝 置複雜、產生二次汙染、治標不治本等特點。目前的一些研究說明可用植物來治理氣體甲醛 汙染，這是一種簡單、有效、自然、環保的方法。但由於植物的正常生長需要光照，因此用植 物來治理氣體甲醛汙染的方法可能只適用於有光照的環境，對於沒有光照的黑暗環境如櫃 子、抽屜等無法使用。微生物在長期進化過程中，已經形成了很多應對甲醛毒害和代謝甲醛的機制，微 生物代謝甲醛的機制有同化和異化作用兩類機制，甲醛的同化作用可通過核酮糖單磷酸途 徑、核酮糖二磷酸途徑、絲氨酸途徑進行，最終將甲醛同化成細胞的組成成份；甲醛的異化 作用通過依賴不同輔因子的氧化途徑進行，最終被甲醛分解成co2。在甲醛異化途徑中涉 及的關鍵酶種類較少，且所涉及的酶結構較為簡單、甲醛的分解產物是無毒的CO2,因此將 甲醛分解途徑的關鍵酶固定後可以用來治理甲醛汙染，用酶法來治理甲醛汙染不僅具有經 濟、環保、不產生二次汙染等優點，還可以克服用植物治理甲醛汙染方面的不足，酶被固定 化後仍然保持有生物活性，很適合在沒有光照的環境裡使用。由於酶的特殊理化性質，在催化過程中往往是以游離酶形式作用於底物。因為酶 在水溶液中放置時間長後極容易失活，所以利用水溶性酶來治理室內甲醛汙染不切實際且 在應用上也會有很大的局限性。將分解甲醛的關鍵酶固定在載體基質上製備成固定化酶， 固定化酶既能保持酶的催化活性又能提高酶分子結構的穩定性，因而可克服游離酶的一些 不足之處，可更好的應用於甲醛汙染治理，是一種較為實際可行的方法。上世紀70年代以 來，酶固定化技術發展迅猛，開發了很多固定酶的方法，目前關於酶的固定化方法主要有吸 附法、共價結合法、交聯法和包埋法四種。吸附法是最早出現的較為簡單的酶固定化方法，主要是利用離子鍵、物理吸附等 作用，將酶固定在纖維素、瓊脂糖等多糖或多孔玻璃、離子交換樹脂等載體上。該法工藝簡 便、條件溫和，但對酶的吸附力弱，在不適pH、高鹽濃度、高底物濃度以及高溫條件下酶容易 從載體上脫落，並汙染催化反應產物，因此在實際應用中受到限制。共價結合法是指將酶共價結合到載體上，主要是通過一些酶的功能基團如氨基、羧基、酚基、疏基、羥基、咪唑基、吲哚基共價結合到載體上。儘管利用該方法可使酶與載 體牢固結合，但由於共價反應較為激烈，酶活力損失較大，製備的固定化酶回收率及活性較 低、工藝複雜。交聯法是指將游離酶的胺基酸殘基與雙功能試劑(如戊二醛)或多功能試劑(如 苯-2-異氰-4-異琉氰)反應而被固定化。利用該法可得到酶蛋白單位濃度較高的固定化 酶，但反應條件劇烈，酶活回收率低，主要應用在酶膜和免疫分子膜的製備中。包埋法是將酶定位於聚合物材料的格子或微膠囊結構中，從而實現酶的固定，而 底物仍能滲入格子或微囊內與酶相接觸。此法較為簡便，酶分子僅僅是被包埋起來，本身不 參與化學結合反應，反應條件溫和，生物活性破壞少，酶活力回收率較高。但由於存在擴散 等限制問題，因此對大分子底物不適用，主要方式包括微囊包埋法和凝膠包埋法兩種。微囊包埋法是以物理方法將酶包埋於半透性聚合體膜內，形成直徑為1-100 μ m 的微囊，只有底物和產物分子能以自由擴散的方式通過半透膜。常以乙基纖維素、聚乙烯等 作為微囊材料，一些雙功能基團試劑如戊二醛、鞣酸等可增加酶的穩定性。凝膠包埋法是指將酶包埋在交聯的不溶性凝膠空隙中的方法。將酶和單聚物混 合，加入引發劑促使單聚物聚合，從而製成凝膠固定化酶。其中交聯聚丙烯醯胺凝膠包埋法 是首先被採用的包埋技術，由於利用聚丙烯醯胺凝膠包埋法對酶蛋白進行固定，能夠很好 的保存酶活性。已經有多種酶如胰蛋白酶、木瓜蛋白酶、β —澱粉酶、過氧化氫酶、胰凝乳 蛋白酶、β-葡萄糖苷酶都通過此法得到了固定，近年來，又有人使用天然材料如藻酸鹽和 卡拉膠進行包埋固定化研究。來自惡臭假單胞菌的甲酸脫氫酶(formaldehydedehydrogenase, ECl. 2. 1. 46， PADH)是目前發現的一種不依賴谷光甘肽(GSH)的甲醛氧化酶。與GSH依賴的甲醛脫氫 酶不同，在有輔因子NAD+存在時PADH可以直接把游離甲醛直接氧化生成甲酸(Ando等， J. Biochem, 1979,85 1165-1172)。甲酸脫氫酶(formate dehydrogenase,EC 1. 2. 1. 2，FDH) 可以把甲酸氧化最終生成CO2 (Labrou和Rigden, Biochem. J. 2001,354 :455_463)，但是迄 今為止，國內外還沒有研究開發利用酶來治理甲醛汙染的方法。

發明內容
本發明的目的是提供一種簡便的方法快速固定PADH和FDH及輔因子NAD+，酶被固 定後氣體甲醛仍然能與酶蛋白相互作用，固定化的酶可以應用於氣體甲醛汙染的治理，將 甲醛最終分解為無毒的CO2,固定化反應過程簡單，成本較低，易重複使用。為了實現本發明的上述目的，本發明提供了如下的技術方案一種固定甲醛分解途徑關鍵酶及其輔因子的方法，將甲醛分解途徑中的兩個關鍵 酶及輔因子NAD固定在聚丙烯醯胺凝膠內部，製備成固定化酶，可用於分解和吸收甲醛。上述方法中兩個關鍵酶是兩種具有催化活性和熱穩定性的酶蛋白——GSH-非依 賴型甲醛脫氫酶(PADH)和甲酸脫氫酶(FDH)。上述方法中固定化酶的製備是在12%的聚丙烯醯胺基質溶液中，加入PADH重組 蛋白和FDH重組蛋白及足夠量的輔因子NAD+，室溫下緩慢攪拌；攪拌後使酶蛋白、輔因子與 丙烯醯胺載體基質均勻混合，再加入適量10%過硫酸胺APS和TEMED使丙烯醯胺單體完全 交聯成聚合物，將混合液迅速灌入制膠器內，室溫下放置3-4h，使之徹底凝固。
把上述方法中製備好的固定化酶凝膠切成膠條，置入吸收和分解甲醛的裝置內， 可用於分解和吸收氣體甲醛。


圖1測定固定化酶吸收甲醛的裝置；圖2固定化酶對氣體甲醛的吸收曲線。
具體實施例方式下面結合附圖，用本發明的實施例來進一步說明本發明的實質性內容，但並不以 此來限定本發明。實施例1 PADH的重組蛋白和FDH的重組蛋白及其輔因子NAD的固定化在30ml的反應體系中加入如下溶液30%丙烯醯胺12ml，1. 5mol/L(pH7. 5)磷酸 鉀緩衝液7. 8ml，無菌水7. 9ml, PADH重組蛋白1. 5mg、FDH重組蛋白2. 25mg, 1 OOmmo 1/L輔 因子NAD+2ml，室溫下緩慢攪拌20min使酶蛋白、輔因子與丙烯醯胺載體基質均勻混合後，加 入10%過硫酸銨(APS)O. 3ml, TEMED 0. 012ml，緩慢攪拌2min使丙烯醯胺單體完全交聯成 聚丙烯醯胺後，將混合液迅速灌入已經裝好的制膠器內，室溫下放置3-4h，使聚丙烯醯胺徹 底凝固，小心剝開凝膠，用乾淨的手術刀將其切成長5cm、寬1cm、厚0. 5cm左右的膠條，置入 6ml空層析柱內。同時也製備一塊不加酶蛋白的膠，切成相同大小的膠條後置入相同的空層 析柱內，作為測定固定化酶吸收氣體甲醛效果分析的負對照，空柱下端用蓋子封口，上端用 一密閉不透氣的膠塞封口，膠塞可插入針頭，以便注入氣體甲醛(圖1A)。實施例2 固定化酶對甲醛的吸收效果分析用注射器在裝有固定化酶膠條的層析管和對照管(空白管)上端同時注入6ml氣 體甲醛，管的出口連接手持式甲醛測定儀(圖1B)，測得管內氣體甲醛起始濃度為0. 47ppm, 每隔Ih對管內剩餘甲醛濃度進行測定。以管內剩餘甲醛濃度為縱坐標，以測定時間為橫 坐標作甲醛吸收曲線如圖2所示。結果說明與空白管相比，固定化酶對甲醛確實具有吸收 效果，尤其在起始的3h內甲醛下降速度較快，由最初的0. 47ppm下降到0. 32ppm，注入的氣 體甲醛有32%被吸收，在5h-10h內甲醛濃度下降幅度開始變緩，最終管內甲醛剩餘濃度為 0. 28ppm，氣體甲醛經過固定化酶作用之後濃度下降了 40%。相比之下空白管甲醛濃度則幾 乎沒有太大變化，IOh之後濃度仍為0. 43ppm。這些結果顯示酶蛋白經過聚丙烯醯胺凝膠固 定之後仍具有酶活性，表明選用聚丙烯醯胺凝膠作為基質不僅能同時固定兩種酶及其輔因 子NAD+，而且能夠保留酶的活性，可用於分解氣體甲醛。
權利要求
一種固定甲醛分解途徑關鍵酶及輔因子的方法，將甲醛分解途徑中的兩個關鍵酶及輔因子NAD固定在聚丙烯醯胺凝膠內部，製備成固定化酶，可用於分解和吸收甲醛。
2.如權利要求1所述的方法，其特徵在於兩個關鍵酶是兩種具有催化活性和GSH-非依 賴型甲醛脫氫酶(PADH)和甲酸脫氫酶(FDH)。
3.如權利要求1所述的方法，其特徵在於固定化酶的製備方法是在12%的聚丙烯醯胺 基質溶液中，加入PADH重組蛋白和FDH重組蛋白及足夠量的輔因子NAD+，室溫下緩慢攪拌； 攪拌後使酶蛋白、輔因子與丙烯醯胺載體基質均勻混合，再加入適量10%過硫酸胺APS和 TEMED使丙烯醯胺單體完全交聯成聚合物，將混合液迅速灌入制膠器內，室溫下放置3-4h， 使之徹底凝固。
4.如權利要求1所述的方法，其特徵在於分解和吸收氣體甲醛可選用含有固定化酶的 凝膠，將其切成膠條，置入吸收和分解甲醛的裝置上。
全文摘要
本發明公開了一種固定甲醛分解途徑關鍵酶及輔因子的方法。將甲醛分解途徑中的兩個關鍵酶及輔因子NAD固定在聚丙烯醯胺凝膠內部，製備成固定化酶，可用於分解和吸收氣體甲醛。
文檔編號C12N11/04GK101914516SQ20101022471
公開日2010年12月15日 申請日期2010年7月13日 優先權日2010年7月13日
發明者張婧, 陳麗梅 申請人:昆明理工大學