血管活性胺結合分子的製作方法
2023-10-11 11:19:59
專利名稱：血管活性胺結合分子的製作方法
技術領域：
本發明涉及血管活性胺結合分子(VABM)及其在調節血管活性胺類作用中的用途。本發明特別涉及來源於寄生蟲蛋白或其衍生物的VABM。本發明還涉及血管活性胺的檢測與定量以及對由動物和人類中的寄生蟲引起，尤其是那些由家畜的外寄生蟲引起的疾病或損傷的控制。也涉及到血管活性結合分子在疾病和變態反應治療中的用途。本發明也涉及運用重組DNA技術生產VABM。
血管活性胺類如組胺和5-羥色胺是動物中(包括人類)炎症的介質及特定生理過程的調節物。組胺存在於肥大細胞及嗜鹼細胞的分泌顆粒中並經組氨酸脫羧作用形成。它還存在於麥角及植物中並可從組氨酸或枸櫞酸合成。
在人類中組胺的主要作用是刺激胃的分泌、收縮大多數平滑肌、刺激心臟、舒張血管以及增強血管通透性。除它在免疫反應及炎症過程中的調節作用外，組胺還調節機體內許多細胞因子(包括那些調節炎症的的細胞因子)的產生，並能夠幹擾細胞因子受體的表達。另外，組胺促進傷口癒合。
組胺最主要的病理生理作用是作為胃酸分泌的刺激物以及作為Ⅰ型超敏反應(例如蕁麻疹及枯草熱)的介質。組胺或其受體也可以直接或間接地參與自身免疫病，如關節炎或與腫瘤生長(Falus,1994)。
組胺通過作用於特定的組胺受體(其三個主要類型H1、H2、H3可通過選擇性拮抗物以及激動劑來鑑別)而產生作用。組胺H1和H2受體拮抗物在臨床上有用，但在目前主要用組胺H3受體拮抗物作為研究工具。
H1受體拮抗物(抗組胺類)被廣泛用於治療包括變應性鼻炎(枯草熱)、蕁麻疹、昆蟲叮咬以及藥物過敏性在內的變態反應。優選缺乏鎮靜藥或毒蕈鹼性受體拮抗藥活性的藥物。H1受體拮抗藥還被用作預防暈動病或其它噁心原因(包括嚴重的孕婦晨吐)的抗催吐藥。一些抗組胺類的毒蕈鹼性受體拮抗作用也許有助於療效，但也引起副反應。一些H1受體拮抗藥是十分有力的鎮靜藥因此或可用於這種作用。
H1受體拮抗物具有許多不良作用。當純粹用於抗組胺作用時，所有的CNS效應均是不希望有的。當用於其鎮靜藥或抗催吐作用時，一些CNS效應如頭暈、耳鳴以及疲倦是不想要的。多餘劑量能夠引起興奮並可在兒童中產生抽搐。外周抗毒蕈鹼作用一直是不受歡迎的。這些中最普通的是口乾，但視力模糊、便秘以及尿瀦留也可能發生。也已觀察到與藥物的藥理學功能無關的不想要的作用。因此雖然局部應用這些藥物後可以發生變應性皮炎，但胃腸紊亂也相當普遍。
H2受體拮抗物被頻繁用作胃酸分泌抑制劑。它們被用作治療消化性潰瘍的選擇藥物，用作佐林格-埃利森綜合症的二線藥物以及用於治療回流性食管炎。據報導不想要的效應包括腹瀉、頭暈、肌痛、一過性疹子以及血胃泌素過多症。一些H2受體拮抗物可在男性中引起男性女性型乳房，並在老年人中引起精神混亂。
除這些非期望的效應以外，一些組胺拮抗物如果與酒精或藥物共同服用會造成麻煩。例如，將抗組胺特非那定與抗生素、抗真菌藥聯用可能引起危及生命的副反應。
用於控制組胺作用的藥物並非常常奏效。它們的功效有限的原因也許與這些藥物的專一性僅僅針對一個亞類的組胺受體有關，特別是在某些疾病要求幹擾廣譜受體時。組胺結合分子(HBM)可以與所有的受體競爭組胺結合，因此也許更適於治療某些疾病。
激素血清素(也稱為5-羥色胺)不但是血管收縮劑還是神經遞質。它也能夠增強血管通透性，誘導毛細管擴張並導致非血管性平滑肌收縮。5-羥色胺存在於大腦和腸組織，並由松果體和血小板產生。涉及5-羥色胺的病理學方面包括血壓異常、偏頭痛、精神失常、呼吸系統疾病以及冠狀心臟病。5-羥色胺的激動劑和拮抗物用於治療一部分這些疾病，但也常常存在人們不希望的副反應。
因此，十分需要血管活性胺類的有效拮抗物，其中所述拮抗物不產生偏離其治療人類及動物疾病適用性的副反應。
也需要在例如食品、各種體液(如血漿或尿)或細胞培養上清液中定量檢測組胺，以便監測如特定變應原的作用，或對某種變態反應確定特定的拮抗治療。目前所運用的系統(放射免疫測定和ELISA)採用抗組胺或對抗組胺衍生物的抗體。但是，組胺的免疫原性並不十分強，使得難以產生對其高親和性的抗體，並且大多數目前所運用的定量系統並非十分靈敏，或者需要對待測組胺進行修飾(例如醯化作用或甲基化作用)。在類似這些的檢測中用HBM取代抗體將為未修飾組胺的測定提供一個高靈敏度系統。
HBM優於抗組胺抗體的另一優點在於，在研究某些生物學過程時，它們能夠用作例如從細胞培養物中去除游離(未結合)組胺形式的研究工具。由於在大多數細胞上存在抗體受體，因此抗體可能干擾這些細胞發揮正常功能。
眾所周知，例如蜱的吸血性外寄生蟲可產生許多生物活性蛋白，這類蛋白免疫調節宿主對寄生蟲嗜食反應的並因此促進寄生蟲吸血。這些免疫調節蛋白包括產生於蜱血淋巴和唾液中並結合於有脊椎動物宿主免疫球蛋白上的免疫球蛋白結合蛋白(IGBP)(Wang和Nuttall,1995)。它們還包括錐蝽長紅獵蝽的唾液攜帶一氧化氮血的血紅素蛋白(nitrophorin)，該蛋白除攜帶一氧化氮外，還能夠結合組胺(Ribeiro和Walker,1994)。免疫調節蛋白還可由其它吸血性寄生蟲產生，這些寄生蟲例如為蚊子和水蛭以及產生毒液的動物，如蛇和蜘蛛。
我們已發現例如蜱的吸血性外寄生蟲產生能夠結合於血管活性胺類、特別是組胺和5-羥色胺的蛋白質。這些蛋白質在下文中稱為血管活性胺結合蛋白(VABP)。
我們已從蜱中分離到四種VABP，在此將其命名為MS-HBP1、FS-HBP1、FS-HBP2和D.RET6，它們彼密切相關。這些蛋白質是全新的，並未顯示與任何以前所描述的蛋白質有明顯相同之處。編碼這些蛋白質或其片段的DNA序列可被用來從相同或不同種中分離相同家族中的其它相關蛋白質。
本發明提供血管活性胺結合蛋白(VABP)，其解離常數小於10- 7M，它們特異性結合於血管活性胺類，且與MS-HBP1、FS-HBP1、FS-HBP2及D.RET6屬於同一蛋白家族。
如果在單獨的四種VABP序列對比中作為相似殘基完全保守的40％或更多胺基酸，在該蛋白被包括在該序列對比中時仍然作為相同殘基完全保守，則該蛋白被認為屬於該家族，所述VABP的序列對比採用GCG』S堆集法則(威斯康辛軟體包程序手冊，1994；間隙產生補償值=2.50；間隙擴張補償值=0.05)獲得]。作為VABP家族成員的還包括那些來源於吸血節肢動物的以親和力結合於組胺的蛋白質，其特徵在於其解離常數小於10-7M，並含有序列基元D/EAWK/R及Y/CE/DL/IW。
本發明的VABP包括天然的生物學變異體(如衍生VABP的種內的等位基因變異體或在地域性變異體)。
本發明還包括與血管活性胺結合蛋白、或與VABP屬於同一蛋白家族的蛋白質功能相當的其衍生物或其片段。本發明的VABP，衍生物及片段在下文中稱為血管活性胺結合分子(VABM)。
根據本發明的VABP是強的特異性血管活性胺結合物，其解離常數低於10-7M。先前所描述的高親和性組胺或5-羥色胺受體是形成組胺或5-羥色胺靶細胞膜部分的蛋白質(Falus 1994)。因此它們與本發明的非膜結合蛋白不同。
本發明的VABP與以上所討論的已知免疫調節蛋白無關，而是具有不同的作用方法。本發明的VABP從外源器官中分泌至哺乳動物宿主動物中，並作為該宿主炎症和免疫應答的調節物發揮功能。在吸血性外寄性蟲中，這樣的炎症和免疫應答反而會抑制寄生蟲吸血。這種功能獲自VABP特異性結合於血管活性胺類的能力。
本發明的VABP可來源於吸血性寄生蟲以及產生毒液的動物，如毒蛇和毒蜘蛛。本發明VABP優選來源於吸血性外寄生蟲。最優選的是，它們來源於蜱類。
如前所述，本發明還包括功能性相當的VABP衍生物和片段。用於此處的「功能性相當」是表明所述衍生物和片段保留結合血管活性胺類的能力，或者它們含有可以用於導向膜的疫苗開發的如上所定義的VABP蛋白家族的表位。可以通過單個或多個胺基酸置換、添加、插入和/或缺失，或者通過例如以去糖基化或糖基化方式化學修飾一個或多個胺基酸，從天然VABP獲得這些衍生物和片段。
例如，一種衍生物可以包括其氨基端或羧基端與VABP相融合或者已添加到VABP內部的額外蛋白質或多肽。額外多肽的目的可以是有助於所述VABM的檢測、表達、分離或純化，或者可以是賦予所述VABP所期望的額外特性。潛在的融合夥伴的例子包括β-半乳糖苷酶、穀胱苷肽-S-轉移酶、螢光素酶、多組氨酸標記、T7聚合酶片段以及分泌信號肽。
本發明的VABM可以採用公知的分子生物學及蛋白質化學技術來製備。例如，所述VABM可用化學肽合成法製備。該技術對於生成用作免疫原的VABP來源的短肽特別有用。VABM也可以用公知的基因工程技術如Sambrook等1989等所述的定點誘變或隨機誘變製備。VABM還可以用合成法製備，即運用有機化學技術，產生在結構和功能上模仿任何VABP家族成員的組胺結合位點的分子。
本發明的VABM可以通過在宿主細胞中表達以重組形式製備。這類表達方法本領域技術人員眾所周知的，並且Sambrook等人(1989)對其中的許多方法都進行了詳述。可為所選擇的宿主挑選適合的表達載體。該載體可以包含一個操作性地連接於表達控制序列的編碼VABM的重組DNA分子，所述表達控制序列由宿主轉錄機制所識別。
適合的宿主包括常用的如大腸桿菌的原核生物種類、或者能夠使之表達高水平重組蛋白且能夠容易大量生長的真核酵母。體外生長的細胞系也合適，特別是運用病毒驅動的表達系統時，如涉及使用昆蟲細胞為宿主的杆狀病毒表達系統。VABM也可以在體內表達，例如在昆蟲幼蟲或哺乳動物組織中。
按照再一方面，本發明提供在哺乳動物中這種VABM的用途，以結合於組胺並由此調節其作用並控制其病理效應。
本發明還包括將本發明的VABM作為抗炎藥物的用途。首先，所述VABM可作為包括一種或多種惰性載體的藥用組合物提供。所述VABM可以組成該藥用組合物的唯一活性成分，或者可以形成治療包的部分，如作為針對昆蟲、蛇或蠍子叮咬，或針對皮炎引起的皮膚表面用藥的乳膏的一個組分。所述蛋白還可用作乳膏、油類、粉劑或丸劑中組胺或組胺相關化合物的載體分子，以供接合組分緩釋。
本發明還包括本發明VABM在組胺水平(例如在血、鼻灌洗液、組織或食品中)定量方面的用途。所述VABM可以與檢測工具一起作為試劑盒的一部分，所述檢測工具(例如放射標記的組胺、抗VABM抗體或如鹼性磷酸酶、過氧化物酶或螢光素酶的酶類)允許準確定量待測樣品中的組胺。這種試劑盒與放射免疫測定、閃爍親近測定或ELISA試劑盒相類似，將VABM作為結合分子取代直接導向組胺或導向組胺類似物的抗體。本發明的一個方面包括加入本發明VABM的這種試劑盒。
本發明VABM還能夠用於血管活性胺類的檢測。任何本領域常用的技術均可用於這種檢測方法，可以包括印跡技術(Towbin等，1979)，凝膠阻滯或親和層析的運用。可以使用完整的VABP，或為了探測低物只用活性結合片段。在另一個實施方案中，為了有助於檢測，將所述VABM與另一種蛋白質(如鹼性磷酸酶、螢光素酶或過氧化物酶)以基因工程方式或合成方式相融合。
本發明還包括將本發明VABM作為結合在支持體上的組胺結合實體的用途，所述組合接合實體可用來去除、分離或提取組胺(從機體組織、血液或食品)。該支持物可以包括任何適合的惰性材料，如凝膠、磁珠或其它小珠、微球體、結合柱或樹脂。
本發明也包括VABP用作研究炎症、炎症相關過程或其它血管活性胺類生理學效應的工具的用途，所述生理學效應如在胃潰瘍形成過程中組胺的作用或組胺在免疫反應中的作用。例如，為了研究組胺或5-羥色胺在細胺培養物或有炎症的動物組織中的重要性，可將所述VABM用於這些系統中組胺或5-羥色胺的排除。
後生動物寄生蟲，特別是節肢動物和蠕蟲，也是傳染病及在人類醫學藥和獸醫醫學中具有主要影響的其它有害效應的來源。對節肢動物和蠕蟲寄生蟲的控制主要依賴於化學藥品如殺蟎劑和抗蠕蟲劑的運用。也曾試圖使用通過運用疫苗技術的免疫學控制方法。在鑑別某些保護性抗原為潛力疫苗候選者方面已取得一些成功，但是迄今僅有幾種最終形成了商業化成果，最值得注意的是用於牛肺蠕蟲胎生網尾線蟲和牛蜱微小牛蜱的疫苗。儘管取得了這些發展，然而還繼續需要用於後生動物寄生蟲的疫苗以及特別是用於可以跨越節肢動物和/或蠕蟲屬的大範圍而使用的疫苗。
因此本發明還提供了按以上所定義的VABP作為後生動物寄生蟲疫苗的免疫原、特別是在控制節肢動物和其它後生動物寄生蟲引起的疾病中用作保護性免疫原的用途。適用於接種疫苗的候選者包括如牛、山羊、綿羊、狗、貓的家畜及需要受保護抵抗後生動物寄生蟲(特別是蜱類)的其它動物。所述疫苗可以包括在本領域技術中所熟知類型的佐劑。
含有本發明VABM編碼核苷酸序列的核酸分子構成本發明的又一方面。這些分子包括DNA、cDNA和RNA，以及合成的核酸種類。
編碼四種特定VABP的cDNA通過實施例在本文中公開，它們的胺基酸序列示於
圖1至圖4(核苷酸和胺基酸以其標準的單子母縮字形式給出)。
根據本發明，優選核酸分子含有與圖1至圖4和圖6的核苷酸序列中的任何一個VABM或任何VABM編碼部分、任何一個序列相同或互補的核苷酸序列，或含有簡併的或與其大致同源的或與所述序列相雜交的序列。「大致同源」的意思是序列顯示至少60％序列同源性。根據本發明的核酸序列可以是單鏈或雙鏈DNA、cDNA或RNA。所述核酸序列最好是DNA。
包括在本發明範圍內的「雜交序列」是指那些雜交序列，它們在非嚴格條件下(6×SSC/50％甲醯胺，室溫)結合併在低嚴格條件下(2×SCC，室溫；或2×SSC,42℃)或高嚴格條件下(如2×SSC,65℃(其中SSC=0.15M NaCl、0.015M枸櫞酸鈉，pH7.2))漂洗。
本發明還包括含有本發明DNA序列的克隆載體和表達載體。這種表達載體將加入在框架內與本發明的核酸分子連接的適合的轉錄和翻譯控制序列，例如增強子元件、啟動子-操縱子區、終止序列、mRNA穩定序列、起始密碼子和終止密碼子或核糖體結合位點。
另外，使得重組蛋白從特定宿主中分泌也許是便利的。據此，這種載體的其它組分可以包括編碼分泌信號及加工序列的核酸序列。
根據本發明的載體包括質粒和病毒(包括噬菌體和真核病毒)。許多這類載體和表達系統是本領域所熟知的並有所報導。尤其適合的病毒載體包括基於杆狀病毒、腺病毒及牛痘病毒的載體。
多種技術已公知並可用來將根據本發明的載體導入原核細胞或真核中。文獻(Sanbrook等，1989)中已充分描述了適合的轉化或轉染技術。在真核細胞中，根據所述系統的需要，表達系統或者為瞬時的(如附加體)或者為長久的(染色體整合)。
根據本發明的核酸分子也可以用於產生轉基因動物。這可通過在修飾體細胞或通過種系治療加入可遺傳的修飾而局部進行。
因此本發明也包括經轉化或轉染的原核或真核宿主細胞或含有如上所定義的本發明核酸分子的轉基因生物體。
本發明的再一方面提供製備本發明VABM的方法，包括在表達所述蛋白質的條件下培養含本發明核酸分子的宿主細胞，並將由此產生的蛋白質回收。
所有在文章中提到的資料均通過引用結合到本文中。
現在通過實施例，具體參考從蜱、尤其是從具尾扇頭蜱中分離的VABP，將本發明的各方面及實施方案加以詳述。應該認識到，可以修改細節而不偏離本發明範圍。
附圖簡述圖1是FS-HBP1的序列，表明測序引物及所採用的測序策略。
圖2是FS-HBP2的序列，表明測序引物及所採用的測序策略。
圖3是MS-HBP1的序列，表明測序引物及所採用的測序策略。
圖4是D.RET6的序列，表明測序引物及所採用的測序策略。
圖5是經考馬斯染色的12％SDS-PAGE凝膠，顯示已經在組胺結合柱上純化的蜱唾液腺提取物。純化之前(泳道A)和純化之後(泳道B；1=FS-BHP1,2=FS-HBP2)的雌性蜱的唾液腺提取物；純化之前(泳道C)和純化之後(泳道D；3=MS-HBP1)的雄性蜱唾液腺提取物。標明了分子量標記。
圖6表明用GCG威斯康辛軟體包的堆集(pileup)命令和整齊描繪(prettyplot)命令產生的所述VABP的四種cDNA推導胺基酸序列的序列對比。
圖7是經考馬斯染色的12％SDS-PAGE凝膠，顯示用重組法產生的VABP。泳道A，為rMS-HBP1；泳道B，為rFS-HBP2；泳道C，為rFS-HBP1。從頂部至底部，分子量標記標明為66、48.5、29、18.4及14.2kDa。
圖8是取自雌性及雄性蜱的唾液腺提取物的蛋白質印跡。
圖9顯示描繪純化VABP的組胺結合特性的飽和曲線和Scatchard圖。
圖10是描述在豚鼠迴腸上進行的收縮-抑制試驗的圖。所用的縮寫H=組胺(1.25nmol)；漂洗=Krebs溶液。加入約2nmol FS-HBP2；使用約4nmol(單體的量)MS-HPB1。
實施例蜱按Jones等(1988)的方法飼養蜱。除成年網紋革蜱(Dermacenterreticularis)在兔身上飼養以外，所有三個發育階段的具尾扇頭蜱和網紋革蜱均在Dunkin Hartley豚鼠身上飼養。在不進食時，所有的蜱均保持在21℃和85-90％的相對溫度下。實施例1蛋白質鑑別從已在豚鼠上飼養3天的雌性成年具尾扇頭蜱樣品中切取唾液腺。雄性蜱飼養4天。在磷酸緩衝鹽溶液(PBS；pH7.4)中均漿腺體，以10,000g離心3分鐘去除細胞碎片，然後將上清液上含有400ml組胺-瓊脂糖懸浮液(Sigma)的柱。未結合的蛋白質用含有5％甘油的10mlPBS從柱上洗出，然後用含100mM組胺的PBS(2ml)洗脫結合蛋白質。用centricon 3超濾裝置(Amicon)濃縮洗脫液。
將提取物在12％SDS-PAGE凝膠上電泳，鑑別來自雌性蜱的兩種主要蛋白質和來自雄性蜱的一種主要蛋白質(見圖5)。這些蛋白質被稱作磁性特異性組胺結合蛋白1和2(FS-HBP1和FS-HBP2)及雄性特異性組胺結合蛋白1(MS-HBP1)。從未在雌性組織中檢測到MS-HBP1，但在雄性唾液腺和蛹及幼蟲整個身體勻漿中清楚地存在MS-FBP1。實施例2基因克隆1)cDNA文庫的構建為了克隆編碼實施例中三種蛋白質的cDNA，構建了一個cDNA文庫。從已在豚鼠上飼養2天的20個雄性及20個雌性成年具尾扇頭蜱樣本中切取唾液腺。在乾冰中將腺體收集在Eppendorf管中。用FastTrack mRNA分離試劑盒(2nvitrogen)分離信使RNA。
為了合成cDNA及將其單向插入λZapⅡ載體，使用了Zap cDNA合成試劑盒(Stratagene)。在插入λ載體之前，在Sephacryl S-400(Pharmacia)柱上分級分離cDNA。用低分子量cDNA(大約100bp至2,000bp)構建DNA文庫(命名為d2-Ⅰ)。較高分子量組分被用於構建第二個文庫(d2-Ⅱ)。用Packagene(Promega)包裝提取物，按廠商的說明進行包裝。每個文庫的大約1.5×106個噬菌斑形成單位(PFU)在XL-1藍(XL-1 Blue)細胞(stratagene)上擴增。
用來自已在兔上飼養3天的成年雌性網紋革蜱的唾液腺mRNA構建其文庫。分離mRNA，按用於以上所述的d2-Ⅱ文庫的方法分離mRNA和構建cDNA文庫，不同之處在於採用了Zap表達(預消化載體)克隆試劑盒(Stratagene)代替λZapⅡ試劑盒。2a)d2-ⅡcDNA文庫的篩選從該文庫的一個組分中體內切下噬菌粒，並按Short等(1988)所述，將其用於在XLl-藍細胞(Stratagene)中產生雙鏈pBluescript SK(-)質粒。將菌落鋪在補充有5-溴-4-氯-3-吲哚基-β-D-吡喃半乳糖苷(X-Gal,Melford實驗室，英國)和異丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG,Novabiochem)的含氨苄青黴素的LB瓊脂平板上，進行藍色/白色菌落選擇。選擇來自白色克隆的大約75個質粒進行測序。通過用PvuⅡ消化並在1％瓊脂糖凝膠上電泳測定，插入的DNA大小的範圍為250個鹼基對至1000個鹼基對。
獲得了克隆FS-HBP1、FS-HBP2及MS-HBP1並進行了部分測序。然後通過噬斑影印膜(Sambrook等，1989)與洋地黃毒苷標記探針(Boehringer Mannheim)的DNA雜交，篩選d2-Ⅱ文庫的其它克隆。用來自原始克隆的純化插入片段以隨機引物標記法構建探針，並用與鹼性磷酸酶(Boehringer Mannheim)綴合的抗洋地黃毒苷抗血清檢測。對於每個原始克隆，分離並測序了3個額外的克隆。2b)網紋革蜱cDNA文庫的篩選首先，構建DNA探針。不是將革蜱屬文庫的一個組分插入Zap表達載體，而是用簡併引物5』-AAYGGNGARCAYCARGAYGCNTGGAA(正向)及5』-KTRTMRTCNGTNRYCCANARYTCRTA(反向)進行PCR。這些引物基於FS-HBP1、FS-HBP2及MS-HBP1的cDNA和蛋白質的保守域。
該PCR包括35個循環，於95℃30秒的解鏈步驟，於50℃30秒的引物-退火步驟及於72℃30秒的延伸步驟(Taq聚合酶購自PerkinElmet，脫氧核苷購自Pharmacia)。獲得了預期不小(400鹼基對左右)的單個DNA條帶，用洋地黃毒苷將其標記，以篩選該文庫(如上所述)。D.RET6是幾個陽性克隆之一。3)測序對FS-HBP1、FS-HBP2及D.RET6插入片段的整個編碼鏈或非編碼鏈進行測序。按Good和Feinstein(1992)的方法從過夜培養物中純化質粒，經鹼變性(Mierendorf和Pfeffer,1987)並用Sanger的雙脫氧介導的鏈終止反應法(Sanger和Coulson,1975)測序。測序策略示於圖1-4。3a)FS-HBP1如圖1所示，從鄰接pBluescript SK(-)多接頭區的T3(正向)和T7(反向)引物位點對原始克隆進行測序。另外，從T3位點處對亞克隆ⅩⅧa(包含原始插入片段的核苷酸221-770)及亞克隆ⅩⅧb(核苷酸509-770)進行測序(由圖中的T3a和T3b標明的反應)。從T7位點處對亞克隆ⅩⅧc(核苷酸1-221)和亞克隆ⅩⅧd(核苷酸1-509)進行測序(T7c和T7d)。
通過用PstⅠ消化原始克隆(在插入片段221位及上遊多接頭區中切割)，然後將其重新連接產生Ⅹⅷa；通過用XbaⅠ消化(在插入片段509位及上遊切割)產生Ⅹⅷb。用EcoRⅠ(在插入片段上遊切割)分別與PstⅠ和XbaⅠ消化，並將切下的片段重新連接回pBluescript(SK-)質粒中，獲得Ⅹⅷc及Ⅹⅷd。信號序列在圖中以粗體字母給出，信號切割位點以豎直箭頭(↑)標出。下劃線序列也是通過對所表達蛋白進行氨基端測序而獲得。3b)FS-HBP2圖2顯示FS-HBP2克隆的cDNA序列及推導出的胺基酸序列。從T3(正向)及T7(反向)引物位點處對原始克隆進行測序，同樣通過用HincⅡ對52-1進行消化(在254位切割，所示反應由T3b及T7a表示)獲得兩個亞克隆(52a和52b)。HincⅡ與XhoⅠ(在插入片段的多接頭下遊切割)聯用，構成52a(包含核苷酸1-254),HinclⅡ與SmaⅠ(在上遊切割)聯用構成52b(含有核苷酸254-793)。消化後用T4聚合酶(NewEngland Biolabs)平端化，並重新連接質粒。最後，我們使用與圖中下劃線序列相同或互補的正向(→)及反向(←)插入片段特異性引物。
聚腺苷酸尾以斜體表示，推定的聚腺苷酸化信號以下加雙線表示。信號序列以粗體字母給出，信號切割用豎直箭頭(↑)標明。下劃線序列也是通過對所表達的蛋白進行氨基端測序而獲得的。3c)MS-HBP1圖3顯示MS-HBP1克隆的cDNA序列及所推導的胺基酸序列。從鄰接pBluescript SK(-)多接頭區的T3(正向)及T7(反向)引物位點對該克隆進行測序。另外，我們使用與圖中下劃線序列相同或互補的正向(→)及反向(←)插入片段特異性引物。
三線表示推定的N-糖基化位點。斜體表示聚腺苷酸尾，雙線標明推定的聚腺苷酸化信號。信號序列以粗體字母給出，信號切割以豎直箭頭(↑)標明。下劃線序列也是通過對所表達蛋白質進行氨基端測序而獲得。3d)D.RET6圖4給出克隆D.RET6的cDNA序列和所推導的胺基酸序列。從鄰接pBK-CMV多接頭區的T3(正向)和T7(反向)引物位點及從與圖中下劃線序列相同或互補的正向(→)及反向(←)插入片段特異性引物對所述DNA插入片段進行測序。用粗體字母表示推定的信號序列，用豎直箭頭(↑)標明信號切割。3e)序列分析用GCG序列分析軟體(威斯康辛軟體包程序手冊，1994)分析序列數據。在國家生物技術信息中心(NCBI)運用BLAST網絡服務對蛋白數據資料庫進行檢索。
從cDNA推導出的VABP胺基酸序列的序列對比示於圖6。這通過運用GCG軟體的堆集命令和整齊描繪命令而產生。通過對所分泌的VABPS進行N末端測序測定，所述成熟蛋白起始於下劃線胺基酸(見下文)，提示其前面的區域代表信號序列。除去信號序列之後，對於計算的分子量，FS-HBP1為19,442,FS-HBP2為19,471,MS-HBP1為21,026,D.RET6為21,025。計算的等電點分別為4.0、3.9、5.0及4.6。
MS-HBP1與FS-HBP1有40％的同一性(57％相似性)，與FS-HBP2的同一性為43％(62％)，與D.RET6的同一性為32％(50％)。FS-HBP1與FS-HBP2有66％的同一性(78％相似性)，與D.RET6的同一性為32％(49％)。FS-HBP2與D.RET6有39％的同一性和56％的相似性。這些百分比用GCG軟體的最佳擬合命令(使用的間隙權為3，長度權為0.1)獲得。
所預期的四種蛋白質的二極結構相同，即在所述分子的氨基端一半以α-螺旋為主，而在羧基端一半β-摺疊和轉角相對較多。FS-HBP1(帶正電荷)與組胺的親和性較低提示在這些位置處的殘基可能組成結合位點的一部分。實施例3重組蛋白的表達1)克隆的構建FS-HBP1、FS-HBP2及MS-HBP1在草地貪夜蛾卵巢細胞(Sf21)中作為組氨酸標記蛋白(rFS-HBP1、rFS-HBP2及rMS-HBP1)表達。
為了加進His6標記，用聚合酶鏈式反應(PCR)首先對FS-HBP1的編碼區進行了擴增。該PCR包括20個循環，每個循環為於95℃30秒的解鏈步驟，於50℃30秒的引物-退火步驟，及於72℃30秒的延伸步驟。所用的正向引物為5』-GCAGGAGCTCGGCACGAG；反向引物為5』-TTTACTAGTGATGGTGATGATGATGGATCCCTTCTGGGAGGCAATCACTT。
設計所述引物使得在起始密碼子上遊加進一個SacⅠ位點，而將終止密碼子用一個BamHⅠ位點所取代，之後是6個組氨酸密碼子和含有TAG終止密碼子的一個SpeⅠ位點。用SacⅠ和SpeⅠ切割該PCR產物。後一種酶產生與XbaⅠ匹配的突出端，使該片段連接在pAcC129.1轉移載體(Livmgstone和Jones,1989)的SacⅠ位點和XbaⅠ位點之間，產生質粒pACC129.1-FS1.HIS。因此這個質粒含有加在FS-HBP1翻譯產物羧基端的序列Gly-Ile-(His)6。
質粒pACC129.1-FS1.HIS也被用於表達組氨酸標記的FS-HBP2和MS-HB3P1。用SacⅠ和BamHⅠ使FS-HBP1 cDNA缺失，從而使氨酸密碼子保持完整。將上遊SacⅠ位點及下遊BglⅡ位點(BglⅡ和BamHⅠ產生匹配突出端)通過PCR加到FS-HBP2和MS-HBP1的編碼區。該PCR包括20個循環，每個循環有於95℃30秒的解鏈步驟，於50℃30秒的引物-退火步驟及於72℃30秒的延伸步驟。對於FS-HBP2，正向引物為5』-AAGGAGCTCAGCATGAAGCTTCTCAT；反向引物為5』-TATAGATCTCTAGGCAAGCACTTGTG。
對於MS-HBP1，正向引物為5』-GCAGGAGCTCGGCACGAG，反向引物為5』-TATAGATCTGGTTCTGAGCTGGTGCTG。
PCR之後，將所得到的cDNA插入所述載體。然後將Gln-Ile-(His)6序列加到MS-HBP1翻譯產物的羧基端，並將Ile-(His)6加到FS-HBP2的翻譯產物上。
用杆狀病毒表達系統表達三種標記的多肽。用所述轉化載體和杆狀病毒(BacPak6；Clontech)轉染斜紋夜蛾(Sf21)細胞。按Kitts和Possee(1993)的方法擴增重組病毒。所述VABP顯然是分泌產物，因為它們主要發現於被轉染細胞的培養基及唾液腺中。
將(成熟)FS-HBP2的編碼區也克隆進pET-23a(+)表達載體中。將圖7中從位置(a)至(b)以及從位置(c)至(d)的序列在大腸菌所表達的截短形式的FS-HBP2中缺失。通過在含有FS-HBP2的pACC129.1-HIS質粒上進行PCR而獲得N-末端截短的蛋白質，PCR所用的正向引物為5』-TATGGATCCTTCACTTGCGTGGGTGTT，反向引物為5』-TATAGCGGCCGCCCGGGCTAGTGATGGTGATGATGAT。用BamHⅠ和NotⅠ酶切該PCR產物，並將其插入pET-23a(+)載體的BamHⅠ位點和NotⅠ位點之間。
在羧基端截短的情況下，將完整的FS-HBP2編碼區插入pET 23a(+)載體中，所用的正向引物為5』-TATAGGATCCGGGAGCTCCAATCAGCCAGATTGGGC；反向引物為5』-TATAGCGGCCGCCCGGGCTAGTGATGGTGATGATGAT。用BamHⅠ和NotⅠ酶切該PCR方法，並將其插入pET-23a(+)載體的BamHⅠ位點和NotⅠ位點之間。然後將該質粒(以及插入片段)作為模板用反向引物進行PCR，所述反向引物為5』-TATATGGTACCCATCATCATCACCATCAC及5』-ATATATGGTACCGTTGTCGTAATCCGTAGTC。這就產生了減去待缺失區的完整的質粒擴增產物。用KpnⅠ(引物含有KpnⅠ位點)酶切之後進行重新連接。最初的未擴增質粒在轉化之前通過用DpnⅠ消化而將其破壞。所有的PCR均包括20個循環，每一循環有於95℃30秒的解鏈步驟，於50℃30秒的引物-退火步驟及於72℃30秒的延伸步驟。2)蛋白質純化及抗血清的產生Sf21細胞轉染60小時之後，收集培養基，離心除去細胞及細胞碎片(2,000g,10分鐘)，用(NH4)2SO4沉澱法分級分離上清液。rFS-HBP1和rFS-HBP2在50-80％(NH4)2SO4組分中沉澱，MS-HBP1-His在65-100％組分中沉澱。在重溶解於PBS的100％(NH4)2SO4中漂洗沉澱，並按Janknecht等(1991)的方法在Ni-瓊脂糖柱(Qiager)上純化。用咪唑洗脫帶組酸標記的蛋白質。用Centricon 10濃縮器(Amicon)濃縮洗脫液並用來更換緩衝液。將純化蛋白在PBS中貯存於-20℃。
為產生多克隆抗血清，將純化的重組蛋白(在150μlPBS中約2μg)與等體積的Montanide ISA 50佐劑(Seppic，法國)相混合，並皮下注射到Dunkin Hartley豚鼠體內。每隔10天重複該過程。第4次注射10天之後收集血清。3)電泳及蛋白質印跡法於飼養期從不同時間點切取蜱的唾液腺(及其它組織)，並在PBS中將其勻漿。於10,000g離心勻漿液5分鐘，並將上清液進行十二烷基磺酸鈉-聚丙烯醯胺凝膠電泳(SDS-PAGE；Laemmli,1970)。
圖7顯示rFS-HBP1、rFS-HBP2及rMS-HBP1電泳的12％SDS-PAGE凝膠。rFS-HBP1和rFS-HBP2在瓊脂糖上分別以～21kDa和～24kDa的表觀分子量泳動，而rMS-HBP2則以～22kDa泳動。
為進行蛋白質印跡，用AE-6675水平印跡裝置(Atto Corporation,日本)，通過半乾電印跡(Kyhse-Anderson,1984)將蛋白質轉至硝化纖維素(Gelman Sciences)上。將豚鼠中產生的抗血清(見上文)與綴合於鹼性磷酸酶(Sigma)的山羊抗豚鼠免疫球蛋白聯用，鑑別FS-HBP1、FS-HBP2及MS-HBP1。用氮藍四咪鹽及磷酸5-溴-4-氯-3-吲哚酯(Blake等，1984)顯現激酶活性。
通過遷移率變動分析研究最終天冬醯胺連接的蛋白質糖基化作用。在用水解所有普通類型的糖蛋白Asn-聚糖鏈的酶切糖苷酶(Maley等，1989)N-糖苷酶F(PNGase F,New England Biolabs)處理之前和之後，用唾液腺提取物和重組蛋白樣品進行SDS-PAGE及免疫印跡。用N-糖苷酶F處理時，在SDS-PAGE凝膠上只有MS-HBP1顯示出遷移率下降，表明它是一個糖蛋白。下降值相應於分子量2-3kDa的變動。
圖8顯示蛋白質印跡，包含在飼養期的不同時間點從雌性蜱(A和B)及雄性蜱(C)獲取的唾液腺提取物，並在12％SDS-PAGE凝膠上分離。抗FS-HBP1(A)和抗FS-HBP2(B)血清從附著後(p.a.)第1天至第3天起顯示陽性反應。從附著後第一天一直到飼養期結束，抗-MS-HBP1血清(C)可檢測到MS-HBP1。4)N-端測序在牛津大學生物化學系的MRC免疫化學裝置上測定純化的rFS-HBP1、rFS-HBP2和rMS-HBP1的氨基端序列。按Schger和VonJagow(1987)的方法在SDS-PAGE凝膠上電泳樣品，並電印跡至Pro-Blott膜上(Applied Biosystems,Warrington，英國)。用考馬斯亮藍染色所述膜，並將目的條帶切下，按Matsudaira(1987)法進行測序。用Applied Biosystems的「小型印跡」軟片(cartridge)(所述膜片已插至其上)，在Applied Biosystems的494A型「Procise」蛋白測序儀(Perkin-Elmer,Applied Biosystems Division,Warrington，英國)上電泳電印跡的樣品。採用廠商推薦的膜結合樣品程序進行測序。實施例4蛋白的特徵記述1)組胺結合分析將純化的重組蛋白按Warlow和Bernard(1987)提出的方法進行組胺結合試驗。這種方法通過加入聚乙二醇(Mw 8000)和離心法，運用蛋白質沉澱從結合配體分離游離配體(放射標記的組胺)。在所有實驗中，在溫育4個小時確保無組胺代謝發生後，在醋酸銨溶劑系統中進行薄層層析。
用全部3種rVABP獲得3H-組胺的飽和結合(圖9Aⅰ、9Bⅰ和9Cⅰ)。Scatchard圖(圖9Aⅱ、9Bⅱ和9Cⅱ)顯示rMS-HBP(Kd=1.2×10-9M；SD=0.4；3次測量)及rFS-HBP2(Kd=1.7×10-8M；SD=0.9)的高親和性，但rFS-HBP1的親和性較低(Kd=7.8×10-8M；SD=1.5)，提示結合組胺可能不是該蛋白的首要功能。
對於rMS-HBP1，存在協同結合的證據。當含有3H-組胺(～0.3pmol；11,200cpm)和過量rMS-HBP1(～100pmol)的樣品補充有少量組胺(0.5pmol)時，檢測到結合放射性配體明顯增加(7,560±110cpm，比之於6,840±150cpm；5次測定)，表明結合容量有所增強。協同結合與MS-HBP1的二聚體或多聚體的性質相一致。事實上，MS-HBP1似乎形成分子間二硫橋；當在SDS凝膠的上樣緩衝液中不包括還原劑時，它在SDS凝膠上的遷移率較低。看來FS-HBPS只具有分子內二硫鍵，正如缺少還原劑時較高遷移率所提示的。
在競爭試驗中(一式三份進行)，將一系列組胺樣化合物[組胺、咪唑、5-羥色胺、多巴胺、H1受體激動劑β-組氨酸、H1拮抗物氯苯那根及新胺替根、H2激動劑dimaprit及H2拮抗物糠硝烯二胺和西咪替丁]以1000倍的量加到每種rVABPS中，在1000倍量下冷組胺可以從結合位點置換95％以上的3H-組胺。組胺樣化合物幾乎不引起或不置換放射性配體，表明VABP特異性地並以不同於H1受體和H2受體的方式結合組胺。
將FS-HBP2在AD494(DE3)pLysS細菌(Novagen)中的pET-23a(+)載體上表達。細菌表達的FS-HBP2與在杆狀系統中所表達的FS-HBP2相比，與組胺結合的親和性略低(Kd=0.6-0.9×10-8M)。缺乏45個N-端胺基酸或28個C-端胺基酸的截短形式的蛋白質(見上文)根本不與組胺結合。這提示FS-HBP2的完整結構對於結合組胺是重要的，並且結合位點更可能由分散的殘基所決定，而不是由α-螺旋或β-摺疊上某處的一段連續胺基酸序列所決定。2)收縮-抑制在懸於含有充氧Krebs溶液的10ml室中的豚鼠迴腸上進行收縮-抑制試驗(圖10)。通過向該室中加入1.25nmol組胺(H)來誘導收縮(記錄為峰形)。達峰值後再用Krebs溶液洗去組胺(W)，使迴腸鬆弛。通過加入～2nmol rFS-HBP2(F2)和組胺實際上減少收縮。～2nmol rFS-HBP1未產生明顯效應(數據未示)。甚至在加入超量組胺(XH)之後，～4nmol(單體量)rMS-HBP1(M)與組胺一起加入後完全抑制了收縮。
rMS-HBP1蛋白和rFS-HBP2蛋白是強結合物，足以與組胺競爭豚鼠迴腸的H1受體(見圖10)。與它們相對較低的親和性一致的是，用rFS-HBP1幾乎沒有或沒有觀察到對迴腸收縮的抑制。
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權利要求
1．血管活性胺結合蛋白(VABP)，它以小於10-7M的解離常數與血管活性胺類特異性地結合，並且與MS-HBP1、FS-HBP1、FS-HBP2和D.RET6屬於同一蛋白家族。
2．根據權利要求1中的VABP，它來源於吸血性外寄生蟲、蜘蛛、蠍、蛇或有毒動物。
3．根據權利要求1中的VABP，它來源於蜱類。
4．根據權利要求1中的VABP，它來源於蜱類具尾扇頭蜱或網紋革蜱(Dermacenter reticularis)。
5．根據前述權利要求中任一項的VABP，它與組胺特異性地結合。
6．FS-HBP1、FS-HBP2、MS-HBP1及D.RET6中的任何一種VABP。
7．權利要求1-6中任一項的任一種VABP的功能相當的衍生物或片段。
8．根據任一前述權利要求的VABP、衍生物或片段(VABM)，它以重組形式表達。
9．根據權利要求7或權利要求8的VABM，其中已將VABP以基因工程方式或化學方式與一個或多個肽或多肽相融合。
10．根據權利要求1-9中任一項的VABM，它結合到如樹脂的支持物上。
11．核酸分子，它編碼根據權利要求1-9中任一項的VABM，或與這種VABM編碼分子相雜交。
12．權利要求11的核酸，它包括DNA、cDNA或RNA。
13．權利要求11或權利要求12的核酸，它包括DNA。
14．包含根據權利要求11-13中任一項的核酸分子的克隆載體或表達載體。
15．權利要求14的載體，它基於病毒。
16．權利要求15的載體，它基於杆狀病毒。
17．用權利要求14-16中任一項的載體轉化或轉染的宿主細胞。
18．已經用根據權利要求11-13中任一項的核酸分子轉化的轉基因動物。
19．製備根據權利要求1-9中任一項的蛋白方法，包括在宿主細胞中表達根據權利要求14至16中任一項的載體，並在表達所述蛋白的條件下培養所述宿主細胞及回收如此產生的所述蛋白。
20．適用於在人類或動物體液中檢測組胺水平的試劑盒，包含根據權利要求1至10中任一項的VABM及檢測工具。
21．根據權利要求1至10中任一項的用於治療的VABM。
22．根據權利要求1至10中任一項的VABM，用於在人類或動物中結合血管活性胺類。
23．根據權利要求1至10中任一項的VABM，用於在人類或動物中結合組胺。
24．根據權利要求1至10中任一項的VABM的用途，用於在人類或動物中探測血管活性胺類。
25．根據權利要求1至10中任一項的VABM的用途，用於在人類或動物中探測組胺。
26．根據權利要求1至10中任一項的VABM在疫苗的用途。
27．根據權利要求1至10中任一項的VABM，用作抗組胺劑。
28．根據權利要求1至10中任一項的VABM，用作抗炎藥。
29．根據權利要求1至10中任一項的VABM的用途，與藥學上可接受載體結合用於治療人類或動物炎症的藥物的生產中。
全文摘要
按照本發明,提供以低於10
文檔編號C12N15/12GK1225683SQ9719631
公開日1999年8月11日 申請日期1997年5月19日 優先權日1996年5月18日
發明者G·C·佩森, P·A·納託爾 申請人:牛津瓦克斯有限公司