多粘類芽孢桿菌SCHC33細菌菌株及其對抗果實、蔬菜或植物中的植物病原性真菌的用途的製作方法

2023-10-30 09:37:37

本發明公開了作為對抗植物病原性絲狀真菌，特別是對抗灰黴病灰葡萄孢菌(botrytiscinerea)的生物殺真菌劑的細菌菌株多粘類芽孢桿菌(paenibacilluspolymyxa)schc33。這種細菌菌株多粘類芽孢桿菌(p.polymyxa)schc33具有允許其與目前使用的商業生物殺真菌劑競爭的重要性質。其殺真菌活性非常有效並且不依賴於在其中培養細菌的培養基，其對人或植物無毒，其以monod動力學行為在簡單培養基中快速生長而無底物抑制，以使得其可以容易地以大規模和低成本生產。除了上述性質之外，其孢子形成的能力將允許獲得具備高穩定性和長使用壽命的商業製劑。本發明的應用領域包括在收穫前和收穫後條件下易受植物病原性真菌感染的所有果實、蔬菜和觀賞植物。技術實現要素：本發明提供了一種表徵為多粘類芽孢桿菌schc33的分離的野生型細菌菌株，及其作為生物殺真菌劑的用途。該細菌菌株根據用於專利目的的布達佩斯條約保藏於智利微生物遺傳資源中心(cchrgm)。由保藏機構於2014年7月23日授予的保藏號為rgm2141，所述保藏機構是智利微生物遺傳資源中心(cchrgm)的保藏機構。這種野生型智利天然細菌從智利的第七大區馬烏萊的的土壤中分離，並且具有殺死植物病原性真菌灰葡萄孢菌(b.cinerea)的不同的分離和野生型菌株的能力。真菌毒性分子的分泌賦予了所述細菌的殺真菌能力，所述真菌毒性分子與其所破壞的真菌相互作用並因此抑制分生孢子的萌發和真菌營養菌絲體的增殖。目前使用的許多生物殺真菌劑可能具有對人和植物的潛在致病性。相比之下，尚未報導多粘類芽孢桿菌schc33對植物或果實具有致病性或毒性，並且未報導對動物或人具有致病性。在實驗室中進行的實驗表明，將其接種在藤本植物的葉中，並在20℃下在僅含有1.5％瓊脂(w/v)以保持充分溼度水平的板中孵育7天後，未在這種宿主中產生可見變化。同樣地，當將大量菌株接種物(2×1010cfu(colony-formingunit，菌落形成單位))加入到完整或受傷的葡萄中時，在與上述相同的條件下培養7天後未見影響。本發明的生物製劑對應於從土壤中分離的野生型細菌，並且已經通過生物化學、微生物學、電子顯微鏡和16srdna測序技術個體化。多粘類芽孢桿菌schc33是智利的本土菌株，並且是一種對植物或動物非致病性的腐生生物，因此使用其活細胞作為抗灰葡萄孢菌的生物殺真菌劑是合適的。此外，本發明涉及包含所述細菌菌株的組合物或包含所述細菌菌株的提取物，或者涉及含有由其來源之化合物(例如由所述細菌菌株分泌的真菌毒性分子)的溶液或混合物，所有這些都能夠保護植物及其果實在收穫前和收穫後免於植物病原性微生物的攻擊。本發明還包括衍生自野生型菌株的具有基本上相同或更優良性質的任何突變體。此外，本發明涉及用於製備所述細菌菌株或其衍生物的方法，並且涉及其在保護植物，特別是果實中的應用。此外，本發明提供了使用純菌株多粘類芽孢桿菌schc33來防控真菌性植物病害的製劑。這種細菌的使用構成了合成化學殺真菌劑的天然替代物，確保了實現對由植物病原性真菌引起之病害的防控和消除的更安全的環境。最後，本發明提供了含有對於其生物活性適當的形式和量的所述菌株的組合物。混合物包含使得細菌附著於其接種之植物的無毒試劑、植物營養素和無害量的防腐劑，所述混合物是液體懸液或通過凍幹獲得的粉末形式。
背景技術：
：在任何類型的植物組織中由植物病原性真菌引起的感染都極具破壞性、傳播迅速並且幾乎發生在地球上的任何地方。目前用於控制這些病害的方法主要是基於使用化學殺真菌劑，儘管由於其大部分是頑拗性分子而使得其具有潛在毒性，但是其仍然被大規模應用，這是因為其允許相對有效地防控真菌病害，還因為仍然沒有有效並且環境安全的替代物。灰葡萄孢菌是植物病原性的多寄主性和死體營養型真菌，其感染具有重大經濟重要性的植物物種，包括果樹、觀賞植物和蔬菜。其產生被稱為灰腐病的病害，在草莓、覆盆子、桃、蘋果、梨、粟子、獼猴桃和葡萄等果實收穫前後造成嚴重的問題。在藤本植物中，這種真菌造成葡萄果穗的腐爛，這種病害目前被認為是智利出口果實生產中最嚴重的病害之一，因為其不僅在田地水平造成巨大損失，而且在其儲存和運輸期間也造成損失(williamsonb，tudzynskib，tudzynskip，vankanja2007.botrytiscinerea：thecauseofgraymoulddiseasemolplantpathol8：561-80；elad，y.，williamsonbtudzynski，p.和delen，n.編輯.2007.botrytis：biology，pathologyandcontrol.thenetherlands：kluweracademicpublishers)。目前，對這種重要的植物病原體的防控主要使用化學殺真菌劑進行，然而，近年來已經描述了一些對灰葡萄孢菌具有抗真菌活性的微生物。最有希望的實例之一是其活性成分是芽孢桿菌(bacillus)屬細菌，特別是枯草芽孢桿菌(bacillussubtilis)qst713，其由加利福尼亞州davis的agraquestinc.在蔬菜園的土壤樣品中發現。這種生物殺真菌劑在多個國家(包括智利)註冊，其具有低毒性，並在智利和美國於商業上用於防控病害，例如葡萄中的葡萄白粉病(uncinulanecator)和酸腐病。在專利kr20100024454中，公開了緩病類芽孢桿菌(paenibacilluslentimorbus)cmc3723(保藏號kacc91379)，除了防止植物病原體的生長之外，其還具有抑制植物中的病原體的能力，特別是梨樹黑星病(peartreescab)(梨黑星病(pearscab))、葡萄孢菌(botrytis)和白腐小核菌(sclerotinumcepivorum)。緩病類芽孢桿菌cmc3723從土壤中分離，並且具有抑制梨黑星菌(venturianashicola)、灰葡萄孢菌、白腐小核菌和尖孢炭疽菌(colletotrichumacutatum)的效果。用於在植物中預防由這些病原體引起之病害的試劑含有緩病類芽孢桿菌cmc3723的培養物。還公開了用於分離、培養、測定對抗植物病原性真菌和細菌的活性、鑑定緩病類芽孢桿菌cmc3723和製備含有其的培養基的方法。在這種情況下，細菌菌株緩病類芽孢桿菌cmc3723和多粘類芽孢桿菌schc33屬於同一屬，但屬於完全不同的物種。公開kr20090105149公開了具有抗菌活性的多粘類芽孢桿菌nb1和含有其的組合物，其可用於預防由植物病原體引起的病害。多粘類芽孢桿菌nb1作為針對植物病原體的拮抗劑，其保藏號為kfcc11413p。所描述的植物病原體是尖孢炭疽菌、終極腐黴(pythiumultimum)、辣椒疫黴(phytophthoracapsici)、立枯絲核菌(rhizoctoniasolani)ag4、灰葡萄孢菌和尖孢鐮刀菌(fusariumoxysporum)。專利kr20030075092教導了微生物類芽孢桿菌屬sd17，其產生用於植物病害的生物防控的抗真菌劑和用於植物病害的生物防控的組合物，其含有用於有效防控植物中病害的微生物。微生物類芽孢桿菌屬sd17(kctc10016bp)產生用於植物病害的生物防控的抗真菌劑，所述植物病害包括由腐黴屬(pythiumspp.)、立枯絲核菌ag1-1、立枯絲核菌ag2-2、致病疫黴(phytophthorainfestans)或灰葡萄孢菌引起的病害。用於植物病害的生物防控的組合物，其含有：按重量計5至30％的類芽孢桿菌屬sd17(kctc-10016bp)的培養基；按重量計0.2至3.0％的對應於酵母提取物的活化孢子萌發的試劑；按重量計0.02至0.5％的水溶性顏料；按重量計1至5％的表面活性劑和添加劑或樹脂。公開ep1241247公開了用於保護植物抵抗植物病原性細菌和真菌的拮抗細菌。所分離的細菌是物種多粘類芽孢桿菌、綠針假單胞菌(pseudomonaschlororaphis)、惡臭假單胞菌(pseudomonasputida)、普城沙雷氏菌(serratiaplymuthica)和枯草芽孢桿菌。它們可以作為混合物或單獨施用，以防治例如以下的植物病害：葡萄中由根癌土壤桿菌(agrobacteriumtumefaciens)引起的冠癭病；番茄和捲心菜中由棒狀桿菌屬(corynebacteriumspp.)、丁香假單胞菌(pseudomonassyringae)和野油菜黃單胞菌(xanthomonascampestris)引起的病害；黃瓜和番茄中由灰葡萄孢菌引起的病害；黃瓜和蕃茄中由白粉菌(erysiphales)屬引起的白粉病；黃瓜、甜瓜和番茄中由尖孢鐮刀菌引起的立枯病；穀物中由麥根腐長蠕孢(helminthosporumsativum)引起的病害；棉花和豆類中由立枯絲核菌引起的根腐病；豆類中由齊整小核菌(sclerotiumrolfsii)引起的病害；蘑菇中的樹狀指孢黴(dactyliumdendroides)等。如果我們將在菌斑對抗生物測定法中獲得的來自公開ep1241247的多粘類芽孢桿菌抵抗灰葡萄孢菌的抗真菌活性與相同測定條件下的細菌菌株多粘類芽孢桿菌schc33的抗真菌活性進行比較，則菌株schc33產生更大直徑的抑制圈，因此其殺真菌活性更強。附圖說明圖1對應於多粘類芽孢桿菌schc33的掃描電子顯微照片。在(a)中清楚地觀察到由細菌分泌的物質，其對應於由15個胞外多糖形成的生物膜。在(b)中觀察到被從液體培養物中獲得的橢圓形孢子包圍的桿菌的集中。圖2是多粘類芽孢桿菌schc33的透射電子顯微照片。有分裂細胞及其相應的周生鞭毛。圖3示出了多粘類芽孢桿菌schc33的16srdna的部分核苷酸序列。圖4對應於多粘類芽孢桿菌schc33抵抗灰葡萄孢菌的對抗生物測定。在(a)中，示出了在無葡萄糖的基本培養基中進行的生物測定的結果。在(b)中，示出了在含有葡萄糖作為碳源的培養基中進行的生物測定的結果。在圖5中，示出了葡萄葉上灰葡萄孢菌分生孢子的萌發抑制生物測定的結果。(a)和(b)對應於陰性對照。(c)和(d)是陽性對照。在(e)和(g)中分別示出了對於1∶10和1∶100的分生孢子：細菌比例，對分生孢子萌發的生物防控效果。在(f)和(h)中分別觀察到對於1∶10和1∶100的分生孢子：細菌比例，類芽孢桿菌對分生孢子萌發的生物防控效果。圖6示出了對於初始葡萄糖濃度為2[g/l]的細菌生長曲線和葡萄糖消耗。在(a)中，示出了隨時間的生物質增加和葡萄糖消耗。(b)對應於生物質隨時間的半對數曲線。圖7示出了初始葡萄糖濃度對多粘類芽孢桿菌schc33的比生長速率的影響的曲線。圖8示出了實驗生長曲線和對所評估的動力學模型(monod、moser和tessier模型)的擬合。在圖9中示意性地示出了通過pcr擴增並且從中獲得其序列的16srdna的區域。紅色是用於pcr的引物。藍色是用於測序的引物。圖10示出了具有恆定通氣的2升生物反應器，其用於測定多粘類芽孢桿菌schc33的動力學生長參數。發明詳述菌株schc33對應於多粘菌(polymyxa)種和類芽孢桿菌(paenibacillus)屬。其通過微生物學和生物化學測試的表徵示於表1中。其在馬鈴薯葡萄糖瓊脂(agar-papa-dextrosa，pda)和mlg培養基(麥芽提取物10g/l，葡萄糖2g/l，瓊脂15g/l)中產生無色素沉著的無色/白色菌落。表1.多粘類芽孢桿菌schc33的形態學和生理學特徵形狀桿菌革蘭氏染色陽性運動性(+)色素產生(-)胞外多糖產生(eps)(+)4℃下的生長(+)通過掃描電子顯微術和透射電子顯微術對多粘類芽孢桿菌schc33的超結構表徵在光學顯微術水平下，培養物由革蘭氏陽性可運動桿菌構成，而在掃描電子顯微術(microscopíaelectrónicadebarrido，sem)水平下，清楚地觀察到桿菌形態，細胞大小長度為3至5μm，直徑為0.5至0.8μm(見圖1)。此外，細胞簇由對應於胞外多糖(exopolisacáridos，eps)的粘附特性的物質結合，其允許形成生物膜(參見圖1a)，這對於細菌粘附到植物表面以保護其免於植物病原性生物體(細菌或真菌)的攻擊是非常重要的。通過sem沒有觀察到細菌附屬物，然而，使用負染色技術，可以在透射電子顯微術(microscopioelectrónicodetransmisión，tem)下檢測到長度約3至5μm的周生鞭毛的存在(參見圖2)，其完全符合對於這種類型的細菌所描述的背景(lals.和tabacchionis.2009.ecologyandbiotechnologicalpotentialofpaenibacilluspolymyxa：aminireview，indianj.microbiol49：2-10)。多粘類芽孢桿菌schc33的分子表徵除了細菌的微生物學和生物化學表徵之外，通過獲得16srdna的一部分核苷酸序列及其隨後的生物信息學分析來進行分子表徵。在圖3中示出了多粘類芽孢桿菌schc33的16srdna的部分核苷酸序列(1,255個核苷酸)。使用blastn將該序列與資料庫中的現有序列進行比較，產生表2所示的結果。表2.多粘類芽孢桿菌schc33的16srdna根據blastn的比對結果。指示了由電腦程式計算的參數的值。因此，微生物學測試、電子顯微術、16srdna測序和生物信息學分析證實這是一種新的多粘類芽孢桿菌菌株，其從智利的第七大區馬烏萊的的土壤中分離並命名為schc33。確定多粘類芽孢桿菌schc33對抗植物病原性真菌灰葡萄孢菌的抗真菌活性進行菌斑對抗生物測定，其中將真菌菌絲體盤置於培養皿的中心，並在其邊緣接種細菌(參見圖4)。在無葡萄糖的培養基(參見圖4a)和含有這種單糖的培養基(參見圖4b)中都清楚地觀察到真菌的生長抑制圈。此外，如果使用不同的培養基，例如馬鈴薯-葡萄糖瓊脂(pda)；含有0.5％酵母提取物、1％胰蛋白腖和0.5％nacl的luriabertani培養基；含有1.5％麥芽提取物和0.7％酵母提取物的ml培養基等，則殺真菌活性保持完整。如果除了上述培養基外還加入葡萄糖，則對灰葡萄孢菌的殺真菌活性沒有改變。該結果是非常相關的，因為在其他革蘭氏(-)細菌如普城沙雷氏菌中觀察到，在含有葡萄糖的培養基中真菌毒性分子的分泌受到了抑制。因此，對於以工業規模生產細菌生物質，可以使用任何培養基。確定多粘類芽孢桿菌schc33抵抗植物組織上灰葡萄孢菌攻擊的保護能力使用細菌的兩種已知量107和108cfu/ml，以評價與枯草芽孢桿菌qst713(商業生物殺真菌劑的活性成分)相比的生物防控功效。7天的結果是令人滿意的，用多粘類芽孢桿菌schc33細菌獲得了對植物組織的稍高水平的保護。陰性對照表現出小面積壞死，這是由為了促進感染所造成的傷口所引起，而其中僅接種真菌分生孢子的陽性對照遭受了幾乎覆蓋100％葉面積的灰葡萄孢菌感染。在用多粘類芽孢桿菌schc33保護的葉和用枯草芽孢桿菌qst713保護的葉兩者中，由真菌引起的損傷程度顯著降低。在多粘類芽孢桿菌schc33的情況下，使用1∶10的分生孢子∶細菌的比率，則由真菌產生的損傷僅覆蓋20.5％的葉表面，當比率為1∶100時降低至11.7％。在用枯草芽孢桿菌qst713的試驗中，分別為：對於1∶10的比率，由真菌產生的植物組織壞死覆蓋36.9％的葉表面，並且當分生孢子∶細菌比率為1∶100時降低至15.4％。這些結果示於表3和圖5中，表明細菌通過直接接種在容易被灰葡萄孢菌感染的蔬菜田中具有用作生物殺真菌劑的巨大潛力。表3.葡萄葉中損傷表面的結果在5個葡萄果穗上確定多粘類芽孢桿菌schc33抵抗灰葡萄孢菌攻擊的保護能力使用細菌的2種已知量107和108cfu/ml，在湯姆森無籽品種的葡萄果穗上進行抵抗灰葡萄孢菌的保護生物測定，以評價其作為生物防控劑的效力。30天的結果表現出與在葡萄葉中所示的相當的保護作用，因為對於所使用的兩種細菌的量，通過噴霧接種細菌的果穗均沒有表現出灰葡萄孢菌之菌絲體的明顯生長。不論是在僅用細菌(108cfu/ml)接種的果穗中還是在用單獨無菌水接種的那些中，陰性對照均沒有顯示出灰葡萄孢菌的存在。此外，這些結果是細菌對於實驗中所使用的果實無害的清楚證據，因為沒有觀察到形態學改變，也沒有觀察到所用葡萄的著色和感官特徵的變化。陽性對照(通過僅用真菌分生孢子噴灑接種的葡萄果穗)顯示明顯的灰葡萄孢菌的感染，明顯地觀察到經接種果穗的漿果中真菌菌絲體的營養生長。確定多粘類芽孢桿菌schc33生長的動力學參數並將結果調整到預建立的模型之一使用2升容量的生物反應器，獲得具有不同葡萄糖濃度的5個細菌生長曲線。在表4中示出了獲得的實驗數據，並且在圖6中示出了具有2g/l葡萄糖的培養基中培養物的相應生長曲線，其中首先獲得與生物質隨時間的形成相關的曲線，然後將半對數曲線用於鑑定細菌生長的階段。因此，可以看出，沒有潛伏期並且指數生長期在生長開始時立即起動，這種行為在所進行的所有實驗運行中得到了重複。在整個指數生長期期間葡萄糖消耗以恆定速率發生，實驗中這利用在生長減緩期間保持高葡萄糖濃度(≥1g/l)來實現。在細菌生長中通過底物或產物均沒有觀察到抑制，因此對動力學模型的調整限於不出現這種情況的那些模型中，在這種情況下為monod、moser和tessier(shulerm.，kargif2002.stoichiometryofmicrobialgrowthandproductformationinbioprocessengineering：basicconcepts，shulerm.，kargif.harlow編：pearson，207-218)。表4.對於初始葡萄糖濃度為2[g/l]的細菌生長曲線，從生物質增加和葡萄糖消耗獲得的實驗數據。獲得圖7所示將比生長速率與培養基中葡萄糖的初始濃度相關聯的曲線，使得獲得以葡萄糖作為主要底物生長的該細菌的內在動力學參數。然而，這些參數的驗證首先需要對圖8所示的前述3種模型之一的動力學調整的統計驗證。在這種情況下，獲得的曲線表現出了根據文獻的預期行為，當增加底物濃度時，特定細菌生長速率持續增加，直到達到最大點，之後速率恆定(acevedof.，gentinaj.2004.cinéticadefermentación.infundamentosdeingenieríabioquímica.f.acevedo，j.gentina，a.illanes編.valparaíso：edicionesuniversitariasdevalparaíso，151-168)。對這3個動力學模型的評價基於如表5所示的相關統計參數，表明使用葡萄糖作為主要底物的多粘類芽孢桿菌schc33的生長擬合為monod型動力學模型，因為它是具有更接近1的相關係數的模型，同時也是具有更低的卡方參數的模型，其相對於所分析的其他2個模型具有一個數量級的差異。然後通過分析monod獲得多粘類芽孢桿菌schc33的內在動力學參數，因此這種細菌使用葡萄糖作為主要底物的最大比生長速率為μ最大＝0.218小時-1，其葡萄糖親和常數為ks＝0.087g/l，從葡萄糖產生生物質的產率為yx/s＝0.159[g生物質/g葡萄糖]。表5.獲得的實驗數據的統計分析和獲得所評價的3個模型的動力學參數實驗部分獲取土壤樣品從第七大區馬烏萊的的農業土壤原位進行取樣，將約10個隨機樣品送到智利聖地牙哥大學(universityofsantiagodechile)的真菌病毒學實驗室，在所述實驗室中將其儲存在室溫下，直到後面使用。獲得細菌分離株將土壤樣品在67℃下進行熱處理48小時，然後將1克每個樣品懸浮於1ml無菌蒸餾水中。最後，將1ml每個樣品的該懸浮液一式三份接種在具有mlg+c培養基(10g/l麥芽提取物，2g/l葡萄糖，15g/l瓊脂，放線菌酮50μg/ml)的培養皿上，獲得不同的菌群，從其中分離菌落並備份以用於以後的分析。抗真菌活性的測定單獨備份所獲得的多種菌落，並在具有mlg培養基的培養皿上進行針對灰葡萄孢菌ccg149的菌斑對抗生物測定，後者是來自真菌病毒學實驗室的高毒力脫病毒株，並在馬鈴薯-葡萄糖瓊脂培養基(pda)上生長直到完成測試。還在不同組成(主要是有和沒有葡萄糖)的培養基中評估抗真菌活性的變化。進行了兩種類型的生物對抗。第一種由以下步驟組成：在培養皿的中心植入5mm直徑的菌絲體盤，並在四個等距點處接種相同量的不同細菌分離株，並在20℃下觀察生長7天。第二種方法由以下步驟組成：在距離培養皿中心等距點處植入8個直徑為5mm的菌絲體，在所述菌絲體處接種細菌分離株。在20℃再次觀察生長7天。作為對照，通過用無菌水代替細菌分離株進行相同的測試。選擇對真菌表現出一定程度的抗真菌活性(可觀察到在培養皿中的抑制圈)的所有那些細菌分離株。隨後，使用均勻分布在培養皿中的分生孢子懸浮液進行相似的測定，所述培養皿在20℃下孵育24小時，以確保樣品在培養基中的正確吸附。然後，將10μl細菌培養物接種在板的中心，其在液體培養基中600nm處的光密度為0.9，並且在20℃下孵育7天，以觀察對於灰葡萄孢菌分生孢子的萌發抑制圈。獲得純細菌克隆，dna分離，通過pcr擴增16srdna和測序從具有增加的抗真菌活性(培養皿中抑制圈≥1cm)的那些細菌分離株中進行連續稀釋以獲得認為是純細菌菌株的同基因克隆。使用基因組dna商業試劑盒提取獲得的菌株的基因組dna，隨後使用稱為8f/1392r的真菌通用引物(參見圖9)對這些樣品進行pcr擴增，目的是獲得約1400個鹼基對的特異性16srdna片段。對於pcr，使用總體積為50μl的10ng基因組dna、0.5μm每種引物、200μmdntp、2.5udna聚合酶、1x反應緩衝液和1.5mmmgcl2。循環由以下步驟組成：在95℃下4.5分鐘的初始變性步驟和95℃下1分鐘、60℃下1分鐘和72℃下2分鐘的40個循環，以在72℃下5分鐘的步驟結束。將pcr產物在1％瓊脂糖(w/v)凝膠電泳中分離。對於測序，使用引物對27f/800r(參見圖9)，並且通過blastn分析所獲得的序列。通過電子顯微術進行超結構分析為了獲得允許確定細菌的形態和結構方面的圖像，製備多粘類芽孢桿菌schc33的樣品以用於通過掃描和透射電子顯微術來可視化並分析。對於掃描電子顯微鏡(jeoljsm-25-sii)，使用液體細菌培養物的樣品，其以使用金的金屬遮蔽技術製備。在透射電子顯微術的情況下，對來自液體細菌培養物的樣品用ph7.0的1％(w/v)磷鎢酸鉀進行負染色，並在在80kv下在phillipstecnai12biotwin顯微鏡上觀察。獲得動力學參數為了獲得使用葡萄糖作為主要底物的生長動力學參數，在lg培養基(酵母提取物5g/l，葡萄糖)中以初始葡萄糖濃度0.1g/l、0.2g/l、0.5g/l、1g/l、2g/l和5g/l進行細菌不連續生長的實驗運行。如圖10所示，構建2升容量的生物反應器，空氣進料來自20l/分鐘容量壓縮機並且用2μm過濾器滅菌，取樣器與無菌注射器相連，利用所述無菌注射器獲得細菌培養物樣品。在所有實驗運行中，，將通氣(1vvm)、溫度(30℃)、ph(5)和攪拌(200rpm)保持恆定於參考文獻推薦的最優值處。對於每個實驗運行，將200ml處於生長指數期的細菌培養物接種在含有2升培養基的生物反應器中，將生物反應器開始樣品攪拌和通氣的時刻認為是0時刻。每30分鐘根據600nm波長下細菌培養物的光密度記錄生物質的增加，並使用商業試劑盒測量培養基中所溶解的葡萄糖的減少。當使用葡萄糖作為主要底物時，利用這些數據構建細菌生長和葡萄糖攝取隨時間的圖，將半對數曲線圖用於計算多粘類芽孢桿菌schc33的比生長速率(μ)。另外，由所述實驗數據獲得底物親和力常數(ks)的值和每份底物的生物質產量(yx/s)。調整至細菌生長的動力學模型為了將多粘類芽孢桿菌schc33的生長調整至一種細菌生長動力學模型，使用在每個實驗運行中獲得的比生長速率值並且構建將葡萄糖的初始濃度與由測量獲得的比生長速率相關聯的圖。評估了三種細菌生長動力學，其中將不同的數學模型向實驗數據調整並根據模型改變一個或更多個常數，通過牛頓法，推算這些常數將實驗值與使用microsoftoffice插件excelsolver所計算的那些值之間的殘差平方和(rss)最小化。為了評估哪個模型是對實驗數據呈現更好擬合的模型，使用以下統計參數：相關係數其中：vc：基於模型的計算值ve：實驗值n：數據數卡方其中：rss：殘差平方和n：數據數n：常數植物組織中的生物測定使用剛剛收穫的葡萄葉，觀察對植物組織上分生孢子萌發的抑制。將葉子用次氯酸鈉溶液0.5％(v/v)洗滌，然後用無菌蒸餾水洗滌。隨後，將其在具有1.5％(w/v)瓊脂的培養皿中孵育，以在測定的7天期間保持水分。使葉子損傷以促進感染，然後分別用在液體培養基中的細菌培養物和分生孢子懸浮液以1∶10和1∶100的比例接種。作為對照，除了由僅用無菌水接種的葉組成的對照和使用名為的商業生物殺真菌劑的有效成分枯草芽孢桿菌qst713的對照以外，製備僅用分生孢子接種的葉和僅用細菌接種的葉(表6)。表6.進行的實驗處理將結果定量為在20℃下孵育7天時損傷的葉面積相對於總表面的百分比。為此，使用imagej軟體(http：//rsb.info.nih.gov/ij/index.html)獲得各自的面積，所有值在20℃下孵育7天後測定。確定多粘類芽孢桿菌schc33抵抗葡萄果穗上灰葡萄孢菌攻擊的保護能力使用湯姆森無籽葡萄果穗觀察對果實上分生孢子萌發的抑制。將果穗用含有0.5％(v/v)次氯酸鈉的溶液洗滌，然後用無菌蒸餾水洗滌，然後在測定期間的30天在消毒的封閉容器中孵育。用分生孢子和細菌的懸浮液以1∶10和1∶100(分生孢子í細菌)的比例接種果穗。作為對照，僅用分生孢子接種果穗，另一些則僅用細菌接種，而一組對照由僅用無菌蒸餾水接種的果穗組成(表7)。表7.進行的實驗處理處理分生孢子懸浮液類芽孢桿菌培養物蒸餾h2o1++-2++-3+--4-+-5--+對結果進行定性分析，確定果穗表面上是否存在灰葡萄孢菌菌絲體的生長。在20℃下孵育的30天期間進行觀察。當前第1頁12