快速測定水和水產品中孔雀石綠和結晶紫的試劑盒及方法與流程
2023-10-30 16:07:13 3
本發明屬於食品安全檢測技術領域，涉及一種用於快速測定水和水產品中孔雀石綠和結晶紫的試劑盒；本發明還涉及一種用該試劑盒快速測定水和水產品中孔雀石綠和結晶紫的方法。
背景技術：
孔雀石綠、結晶紫是一種N-甲基三苯甲烷類染料，由於其抗菌效果好、價格便宜、容易獲得，曾被廣泛用於防治水產動物的真菌病、細菌病和寄生蟲病等。由於孔雀石綠在生物體內的代謝產物無色孔雀石綠，而研究發現孔雀石綠、結晶紫及其代謝產物無色孔雀石綠、結晶紫具有高毒素、高殘留、高致癌和高致畸、致突變等副作用，尤其隱色孔雀石綠、結晶紫不溶於水，難於排出體外，其殘留毒性比孔雀石綠更強。我國於2002年5月將孔雀石綠、結晶紫列入《食品動物禁用的獸藥及其化合物清單》中，禁止用於所有食品動物。目前，檢測孔雀石綠的方法有表面增強拉曼光譜法（SERS）、紫外光譜法、螢光光譜法、量子點螢光淬滅法、液相色譜-質譜聯用法（LC—Ms）、高效液相色譜法（HPLC）。液相色譜法和液相色譜-質譜串連法自動化程度高，儀器重複性好，被廣泛應用。但實際試驗過程中需要對樣品進行比較繁瑣的樣品前處理提取工作，實驗過程耗時長，穩定性不好，回收率不高。因此建立一種簡單，快捷，穩定，回收率高的樣品前處理提取方法是很有必要的。
技術實現要素：
本發明的目的是提供一種樣品處理時間短、檢測成本低、無需過固相萃取小柱淨化的快速測定水和水產品中孔雀石綠和結晶紫的試劑盒。
本發明的另一個目的是提供一種用上述試劑盒快速測定水和水產品中孔雀石綠和結晶紫含量的方法。
為實現上述目的，本發明所採用的技術方案是：一種快速測定水和水產品中孔雀石綠和結晶紫的試劑盒，由第一提取試劑、第二提取試劑和第三提取試劑組成，第一提取試劑為石英砂，第二提取試劑為硼氫化鉀；第三提取試劑這樣製得：分別稱取1-苄基-3-乙基苯並咪唑六氟磷酸鹽5.00g和1-丁基-3-甲基咪唑六氟磷酸鹽45.00g，加入100mL乙腈，溶解1-苄基-3-乙基苯並咪唑六氟磷酸鹽和1-丁基-3-甲基咪唑六氟磷酸鹽，70℃旋轉蒸發60min，去除乙腈，得第三提取試劑。
本發明所採用的另一個技術方案是：一種利用上述試劑盒快速測定水和水產品中孔雀石綠和結晶紫的方法，具體為：
步驟1：稱取0.54g第二提取試劑，溶於50mL超純水中，得第四提取試劑；
步驟2：稱取5.00g待檢測樣品於離心管中，加入20mL色譜純乙腈、1g第一提取試劑、10mL第四提取試劑和1.00mL第三提取試劑，渦旋1min，10000rpm離心3min，得上清液和沉澱物，用5mL乙腈洗滌該沉澱物，將洗滌後液與該上清液合併，溫度50℃旋轉蒸發5min，至出現明顯分層，於溫度4℃、轉速10000rpm離心3 min，取離心後下層液過濾；然後進行高效液相色譜測定，得第一色譜圖；
步驟3：以第三提取試劑為溶劑，配製六個不同質量體積濃度的孔雀石綠及結晶紫混合標準溶液，該六個標準溶液中孔雀石綠的質量體積濃度依次分別為：0.10ng/mL、1.00ng/mL、5.00ng/mL、50.00ng/mL、250.00ng/mL、1000.00ng/mL；該六個標準溶液中結晶紫的質量體積濃度依次分別為：0.10ng/mL、1.00ng/mL、5.00ng/mL、50.00ng/mL、250.00ng/mL、1000.00ng/mL；將孔雀石綠及結晶紫系列混合標準溶液於附帶螢光檢測器的高效液相色譜儀中測定，得第二色譜圖，由該第二色譜圖得到系列標準溶液中孔雀石綠及結晶紫在該色譜條件下的出生時間和不同濃度的峰面積。並以標準溶液質量體積濃度為橫坐標，色譜峰面積為縱坐標，繪製孔雀石綠及結晶紫標準溶液的工作曲線；
步驟4：根據步驟2測得的樣品製備液的峰面積值，從步驟3繪製的系列孔雀石綠及結晶紫標準溶液的工作曲線上找到峰面積值對應的孔雀石綠及結晶紫的含量，按下式計算待測水及水產品中孔雀石綠及結晶紫的含量X：
式中：X表示試樣中的孔雀石綠或結晶紫含量，單位ng/g；C1表示步驟2測得的樣品製備液的峰面積所對應的孔雀石綠或結晶紫的含量，單位ng/mL；C0表示試樣空白液中孔雀石綠或結晶紫的含量，單位ng/mL；m表示試樣質量，單位g；V表示步驟2中第三提取試劑的體積，單位mL。
本發明試劑盒製造成本低，對孔雀石綠及結晶紫的吸附性強，對油脂、蛋白質、澱粉等大分子雜質不產生吸附，可以有效的淨化樣品。實驗過程中所有試劑均為液體，與被測樣品接觸面積遠遠大於傳統固相萃取小柱，利於提高萃取富集效率，增大實驗結果的回收率。試劑盒中用於定量的提取試劑具有蒸汽壓低，穩定，不易揮發等特點，有利於萃取過程和檢測過程的穩定性及重複性。
附圖說明
圖1是採用本發明快速測定方法檢測水和水產品中孔雀石綠和結晶紫時，對待測樣品處理後用高效液相色譜儀測定得到的色譜圖。
圖2是採用本發明快速測定方法檢測水和水產品中孔雀石綠和結晶紫時，對系列標準混合溶液進行高效液相色譜測定得到的色譜圖。
具體實施方式
下面結合附圖和具體實施方式對本發明進行詳細說明。
本發明提供了一種用於快速測定水和水產品中孔雀石綠和結晶紫的試劑盒，由第一提取試劑、第二提取試劑和第三提取試劑組成，第一提取試劑為石英砂，第二提取試劑為硼氫化鉀；
第三提取試劑這樣製得：分別稱取1-苄基-3-乙基苯並咪唑六氟磷酸鹽5.00g和1-丁基-3-甲基咪唑六氟磷酸鹽45.00g，置於雞心瓶中，加入100mL乙腈，溶解1-苄基-3-乙基苯並咪唑六氟磷酸鹽和1-丁基-3-甲基咪唑六氟磷酸鹽，70℃旋轉蒸發60min，去除乙腈，得到無色透明粘稠的液體，該液體即為第三提取試劑。
第一提取試劑為石英砂。在提取過程中加入有機試劑乙腈，乙腈使蛋白質變性，容易使樣品聚沉在一起，提取不完全。將石英砂加入固體樣品中，在渦旋過程中石英砂可以將聚沉固體樣品磨碎，讓提取更充分。第二提取劑為硼氫化鉀。加入硼氫化鉀，將樣品中的孔雀石綠和結晶紫還原為有螢光性的物質便於檢測。第三提取試劑為苄基苯並咪唑疏水離子液體與咪唑疏水離子液體按照一定的比例混合得到的複合型離子液體。根據所提取目標物質孔雀石綠和結晶紫的結構，和相似相容原理，自主合成了與目標物結構相似的疏水性離子液體1-苄基-3-乙基苯並咪唑六氟磷酸鹽，該離子液體對孔雀石綠和結晶紫有良好的吸附作用。但是該離子液體常溫為固體，不能被應用到液-液分散萃取過程中，所以選用吸附性一般的疏水離子液體1-丁基-3-甲基咪唑六氟磷酸鹽作為1-苄基-3-乙基苯並咪唑六氟磷酸鹽的載體，兩種離子液體按照比例混合後呈現透明粘稠液體狀，可以被用在液-液分散萃取過程中。而且混合比例大於1︰9，得到的複合離子液體過去粘稠，不方便使用；混合比例小於1︰9，萃取回收率偏小，達不到試驗要求。
用上述快速測定試劑盒能快速提取水及水產品中孔雀石綠及結晶紫，通過液相色譜螢光檢測器，檢測其含量。具體測定步驟為：
步驟1：稱取0.54g第二提取試劑，溶於50mL超純水中，得到第四提取試劑，現用現配；
步驟2：稱取5.00g待檢測樣品於離心管中，加入20mL色譜純乙腈、1g第一提取試劑、10mL第四提取試劑和1.00mL第三提取試劑，渦旋1min，10000rpm離心3min，得上清液和沉澱物，將該上清液轉入雞心瓶中，用5mL乙腈洗滌該沉澱物，將洗滌後液合併到盛放上清液的雞心瓶中，50℃旋轉蒸發5min，至出現明顯分層，將雞心瓶中液體於溫度4℃、轉速10000rpm離心3 min，取離心後下層液過濾孔直徑為0.45μm的濾膜；然後進行高效液相色譜儀測定。色譜條件：色譜柱：C18 4.6×250 mm分析柱；流動相：pH=3.5乙酸銨緩衝液（v）+乙腈（v）=20+80；流速：1 mL/min；柱溫：35 ℃；進樣量：20 μL；激發波長：265 nm，發射波長：360nm；得圖1所示的第一色譜圖；
步驟3：以第三提取試劑為溶劑，配製六個不同質量體積濃度的孔雀石綠及結晶紫混合標準溶液，該六個標準溶液中孔雀石綠的質量體積濃度分別為：0.10ng/mL、1.00ng/mL、5.00ng/mL、50.00ng/mL、250.00ng/mL、1000.00ng/mL；該六個標準溶液中結晶紫的質量體積濃度分別為：0.10ng/mL、1.00ng/mL、5.00ng/mL、50.00ng/mL、250.00ng/mL、1000.00ng/mL；將孔雀石綠及結晶紫系列混合標準溶液於附帶螢光檢測器的高效液相色譜儀中測定。色譜柱：C18 4.6×250 mm分析柱；流動相：pH=3.5乙酸銨緩衝液（v）+乙腈（v）=20+80；流速：1 mL/min；柱溫：35 ℃；進樣量：20 μL；激發波長：265 nm，發射波長：360nm。得圖2所示的第二色譜圖，由該第二色譜圖得到系列標準溶液中孔雀石綠及結晶紫在該色譜條件下的出生時間和不同濃度的峰面積。並以標準溶液質量體積濃度為橫坐標，色譜峰面積為縱坐標，繪製孔雀石綠及結晶紫標準溶液的工作曲線；該標準曲線的線性範圍、回歸方程、相關係數、檢出限（3倍信噪比）、RSD%（n=10）值見表1：
表1標準曲線的線性範圍、回歸方程、相關係數、檢出限、RSD%
步驟4：根據步驟2測得的樣品製備液的峰面積值，從步驟3繪製的系列孔雀石綠及結晶紫標準溶液的工作曲線上找到峰面積值對應的孔雀石綠及結晶紫的含量，按下式計算待測水及水產品中孔雀石綠及結晶紫的含量X：
式中：X表示試樣中的孔雀石綠或結晶紫含量，單位ng/g；C1表示步驟2測得的樣品製備液的峰面積所對應的孔雀石綠或結晶紫的含量，單位ng/mL；C0表示試樣空白液中孔雀石綠或結晶紫的含量，單位ng/mL；m表示試樣質量，單位g；V表示步驟2中第三提取試劑的體積，單位mL。
由於第四提取試劑是硼氫化鉀水溶液，其目的是為了將目標物還原為有螢光性的物質，加入的體積是非定量的，而第三提取試劑需要準確加入1.00mL；而且，在旋轉蒸發後溶液會分層，下層為疏水性的複合離子液體，其體積為1.00mL，故上述公式中使用了步驟2中第三提取試劑的體積。
下面通過本發明快速測定方法與GB/T20361-2006和現有的文獻1～3公開的測定方法進行比較，突出該快速提取試劑盒在孔雀石綠和結晶紫的檢測中的優越性：
1）實驗耗時對比：
國標GB/T20361-2006規定的方法和現有的文獻公開的方法中對孔雀石綠和結晶紫的樣品前處理的提取過程都需要加入鹽酸羥胺，以防止目標物變質，加入對甲苯磺酸增加溶劑對目標物的提取效率，並且要控制溶液的pH值，反覆萃取，最後經過固相萃取小柱淨化等一系列的操作。操作耗時60～120min。而用本發明快速提取試劑盒對樣品進行前處理，耗時14min。而且因為操作步驟少，不會出現現有的文獻公開的方法中，二氯甲烷萃取層忽上忽下的現象。
2）穩定性實驗對比：
按國標GB/T20361-2006規定的方法和現有的文獻1～3公開的方法的RSD%均大於5%。而本發明快速測定方法的RSD%為3%左右。說明本發明快速測定方法具有很好的重現性和穩定性。這是因為現有提取方法基本為固相萃取方法，固相萃取本身的缺點是操作繁瑣，而且兩根固相萃取小柱的填料和柱效也不是完全相同的，所以導致實驗結果重現性不好。而本發明的萃取劑為性質均勻的液體，切操作簡單，步驟少，所以穩定性重現性好。
3）回收率對比：
文獻[1]提供的方法的孔雀石綠和結晶紫的回收率為82.5%～105%，文獻 [2] 提供的方法的孔雀石綠和結晶紫的回收率為78.3～100．9%，文獻[3]提供的方法的孔雀石綠和結晶紫的回收率85.7～89.7%，國標方法的孔雀石綠和結晶紫的回收率為75～85%，可見，用現有方法測定水和水產品中孔雀石綠及結晶紫時，孔雀石綠和結晶紫的回收率不夠穩定，這也是固相萃取柱的弊端。應用本發明快速測定方法時，孔雀石綠回收率為90.9～93.6%，結晶紫回收率為91.5～93.8%，可見本發明快速測定方法的回收率高，而且穩定。這是因為現有的固相萃取方法，萃取調料為C18，C18的結構與孔雀石綠及結晶紫的結構並不相似，所以萃取效果並不良好。而1-苄基-3-乙基苯並咪唑六氟磷酸鹽的結構與孔雀石綠及結晶紫的結構非常相似，都有共軛大π鍵，可以使萃取效果更完全，所以本快速測定方法完全利用高效的萃取技術，更穩定，更快捷。
實施例
分別稱取1-苄基-3-乙基苯並咪唑六氟磷酸鹽5.00g和1-丁基-3-甲基咪唑六氟磷酸鹽45.00g，置於雞心瓶中，加入100mL乙腈，溶解1-苄基-3-乙基苯並咪唑六氟磷酸鹽和1-丁基-3-甲基咪唑六氟磷酸鹽，70℃旋轉蒸發60min，去除乙腈，得到無色透明粘稠的液體，該液體即為第三提取試劑。用石英砂（第一提取試劑）、硼氫化鉀（第二提取試劑）和該第三提取試劑組成用於快速測定水和水產品中孔雀石綠和結晶紫的試劑盒。使用該試劑盒時：稱取0.54g硼氫化鉀，溶於50mL超純水中，得到第四提取試劑。稱取5.00g待檢測樣品於離心管中，加入20mL色譜純乙腈、1g石英砂、10mL第四提取試劑和1.00mL第三提取試劑，渦旋1min，10000rpm離心3min，得上清液和沉澱物，將該上清液轉入雞心瓶中，用5mL乙腈洗滌該沉澱物，將洗滌後液合併到盛放上清液的雞心瓶中，50℃旋轉蒸發5min，至出現明顯分層，將雞心瓶中液體於溫度4℃、轉速10000rpm離心3 min，取離心後下層液過濾孔直徑為0.45μm的濾膜；然後進行高效液相色譜儀測定。色譜條件：色譜柱：C18 4.6×250 mm分析柱；流動相：pH=3.5乙酸銨緩衝液（v）+乙腈（v）=20+80；流速：1 mL/min；柱溫：35 ℃；進樣量：20 μL；激發波長：265 nm，發射波長：360nm；得第一色譜圖。以第三提取試劑為溶劑，配製六個不同質量體積濃度的孔雀石綠及結晶紫混合標準溶液，該六個標準溶液中孔雀石綠的質量體積濃度分別為：0.10ng/mL、1.00ng/mL、5.00ng/mL、50.00ng/mL、250.00ng/mL、1000.00ng/mL；該六個標準溶液中結晶紫的質量體積濃度分別為：0.10ng/mL、1.00ng/mL、5.00ng/mL、50.00ng/mL、250.00ng/mL、1000.00ng/mL；將孔雀石綠及結晶紫系列混合標準溶液於附帶螢光檢測器的高效液相色譜儀中測定。色譜柱：C18 4.6×250 mm分析柱；流動相：pH=3.5乙酸銨緩衝液（v）+乙腈（v）=20+80；流速：1 mL/min；柱溫：35 ℃；進樣量：20 μL；激發波長：265 nm，發射波長：360nm。得圖2所示的第二色譜圖，由該第二色譜圖得到系列標準溶液中孔雀石綠及結晶紫在該色譜條件下的出生時間和不同濃度的峰面積。並以標準溶液質量體積濃度為橫坐標，色譜峰面積為縱坐標，繪製孔雀石綠及結晶紫標準溶液的工作曲線；根據測得的樣品製備液的峰面積值，從繪製的系列孔雀石綠及結晶紫標準溶液的工作曲線上找到峰面積值對應的孔雀石綠及結晶紫的含量，按下式計算待測水及水產品中孔雀石綠及結晶紫的含量X：
式中：X表示試樣中的孔雀石綠或結晶紫含量，單位ng/g；C1表示測得的樣品製備液的峰面積所對應的孔雀石綠或結晶紫的含量，單位ng/mL；C0表示試樣空白液中孔雀石綠或結晶紫的含量，單位ng/mL；m表示試樣質量，單位g；V表示所用第三提取試劑的體積，單位mL。
參考文獻：
文獻[1] 張健玲、張勇清、鬍子謙、閆劍勇，水產品中孔雀石綠和隱色孔雀石綠殘留量測定的液相色譜法[J] 中國衛生檢駐雜誌2006 年2月 第16卷 第2期 。
文獻[2] 羅瑞峰、羅小玲、馬小寧，水產品中孔雀石綠、結晶紫及其代謝產物檢測方法的探討[J] 化學分析計量 2011年，第20卷，第3期。
文獻[3] 李永夫、高華鵬、姚芳、殷居易，高效液相色譜法檢測鰻魚中孔雀石綠及其代謝物殘留[J] 安徽農業科學. 2009.37（1）：31-33。。