用於治療卵巢癌的鈣離子非依賴性磷脂酶A₂的抑制劑的製作方法

2023-10-10 13:03:09

專利名稱：用於治療卵巢癌的鈣離子非依賴性磷脂酶A2的抑制劑的製作方法
技術領域：
本發明涉及用於治療卵巢癌的鈣離子非依賴性磷脂酶A2的抑制劑。鈣離子非依賴性磷脂酶A2的抑制劑包括化學藥物和基因藥物，屬於醫藥領域，特別是抗癌症治療藥物。
背景技術：
磷脂酶A2 (PLA2)催化甘油磷脂SN-2位酯鍵的水解，生成溶血磷脂，如溶血磷脂酸 (lysophosphatidic acid, LPA)或溶血磷脂醯膽鹼(lysophosphatidylcholine, LPC)和自由脂肪酸，如花生四烯酸(arichidonic acid，AA)。這些產物直接或間接地調控細胞的生理活動、炎症應答和相關基因表達。花生四烯酸通過兩種代謝途徑生成包括前列腺素、 血栓烷和白三烯等類花生酸，這些具有生物活性的類脂介質通過信號傳導介導細胞炎症反應。LPA是由一個醯基、一個甘油骨架和一個磷酸基團組成的最簡單的甘油磷脂，是一種存在於生物體內的有生物活性的天然磷脂小分子，它既是合成細胞膜磷脂和三脂醯甘油的重要前體，又是細胞膜磷脂在磷脂酶作用下水解的產物。作為一種內源性生長因子，LPA具有多種生物學功能(Sherbet, G. V. and Patil, D. (2003)Genetic abnormalities of cell proliferation, invasion andmetastasis, with special reference to gynaecological cancers. Anticancer Res. 23，1357-1371)。LPA誘導細胞的生長、轉移和生存，它的生物學作用主要通過G蛋白偶聯受體信號轉導途徑而實現。LPA在生殖系統中起到重要的生理禾口病理作用(Fang, X.，Schummer, M.，Mao, M.，Yu, S.，Tabassam, F. H.，Swaby, R.， Hasegawa, Y. , Tanyi, J. L. , LaPushin, R. , Eder, A. et al. (2002) Lysophosphatidic acid is a bioactive mediator in ovarian cancer. Biochim. Biophys. Acta 1582,257-264 ； Conover, C. A. , Hartmann, L. C. , Bradley, S. , Stalboerger, P. , Klee, G. G. , Kalli, K. R. and Jenkins, R. B. (1998)Biological characterization of human epithelial ovarian carcinoma cells inprimary culture :the insulin-like growth factor system. Exp. Cell Res. 238，439-449)。LPA參與卵巢的排卵周期，影響卵母細胞的成熟；LPA影響精細胞受精時的頂體反應。迄今為止，在所有不同的病理過程中，LPA在卵巢癌中的作用被研究得最充分，LPA被證明是卵巢癌的關鍵生長因子(Hirte，H. W.，Kaiser, J. S. and Bacchetti, S. Establishment and characterization offour human epithelial ovarian carcinoma cell lines. Cancer,1994，74，900-906)。磷脂酶A2 (PLA2)主要分為三類分泌型磷脂酶A2 (secreted PLA2, sPLA2)、胞漿型磷脂酶A2(calcium-d印endent cytosolic PLA2, cPLA2)和鈣離子非依賴性磷脂酶 A2(calcium-independent phospholipase A2, iPLA2)。CPLA2 禾口 SPLA2 主要參與激活的哺乳動物細胞的類脂代謝調節，IPLA2則主要調節基礎水平類脂代謝、參與磷脂重組和細胞膜結構的重組以及保持細胞磷脂水平的穩定。PLA2在多種腫瘤組織中有高表達，是潛在的治療惡性腫瘤的靶標。PLA2包括胞漿型磷脂酶A2 (CPLA2)、分泌型磷脂酶A2 (SPLA2)和鈣離子非依賴性磷脂酶A2 (iPLA2)。目前SPLA2已被作為潛在的治療結腸直腸癌的靶標(W02006/076414)，SPLA2的抗體還可用於治療炎症性疾病(W02004/050850)。而PLA2的複合抑制劑(包括cPLA2、iPLA2以及SPLA2)可用於治療神經損傷及其疾病(W02009009449A2)。iPLA2主要包括iPLA2 β和 IPLA2 y , IPLA2 β主要存在於胞漿中，而iPLA2Y主要存在於過氧化物酶體中。iPLA2 β在許多細胞和組織中表達，在細胞代謝中起重要作用。iPLA2i3的抑制劑可以作為治療糖尿病(KR200601285^A)、脂肪肝(KR20060124472A)的藥物，並且被發現可以抑制脂肪組織分化，但是還沒有專利報導其在治療癌症方面的應用。本發明人的研究發現iPLA2 β在卵巢癌細胞中高表達，抑制iPLA2i3的活性可以抑制卵巢癌細胞的生長、卵巢癌腫瘤的發生發展。 IPLA2^的抑制劑是治療卵巢癌的有效藥物。

發明內容
本發明的目的在於開發一種新型有效抑制生殖系統惡性腫瘤的專一性化學藥物和基因藥物。本發明的原理在於通過iPLA2 β的專一性化學抑制劑和shRNA來抑制iPLA2 β 的活性，從而抑制惡性腫瘤的生長及轉移。鈣離子非依賴性磷脂酶A2的抑制劑主要包括化學藥物溴烯醇內酯(bromoenol lactone, BEL)和基因藥物iPLA2 β基因的shRNA。其中的化學藥物溴烯醇內酯還包括溴烯醇內酯的手性異構體S-BEL。1.溴烯醇內酯(BEL)通過抑制iPLA2i3酶的活性來抑制癌細胞的生長大部分的卵巢癌細胞在無血清條件下能夠自主增殖，導致細胞數量持續增長。在缺乏外源性生長因子的條件下，卵巢癌細胞株大部分細胞處於G1期，S期、G2/分裂期的細胞所佔比例很少。這表明細胞數量的持續增加是由於緩慢但持續的細胞周期。為了探索卵巢細胞增殖失控的機制以及潛在的幹預治療的方法，我們研究了生長因子非依賴型的卵巢癌細胞的增殖是否與胞內PLA2的活動有關。磷脂酶A2潛在地參與了卵巢癌細胞的遷移以及脂類生長因子的分泌這些可能構成循環刺激以驅動卵巢癌細胞的增殖。BEL是iPLA2和鎂離子依賴性磷脂酸磷酸酶的不可逆抑制劑，可溶於乙醇、二甲基亞碸(DMSO)等溶劑。在美國西格瑪、開曼等多家公司都有銷售，我們採用的BEL購買於西格瑪-奧德裡奇公司。我們測定了在無血清條件下增殖的卵巢癌細胞中iPLA2i3及CPLA2的抑制劑的具體的藥理作用。與對照組(只加BEL載體(vehicle)相比，iPLA2的抑制劑BEL (S-BEL同樣具有很好的效果，在本說明書中均以BEL表示)能夠強烈阻止各種卵巢癌細胞株包括 0VCAR-3, SK0V-3和D0V-13的增長。BEL對卵巢癌細胞的抑制作用呈劑量依賴性。當藥量低至0. 5 μ M時仍然產生顯著效果。在卵巢癌細胞株4天的培養過程中採用0. 2 μ M的BEL 處理(濃度較先前報導的降低了 5到10倍)強烈抑制了細胞的生長，該結果表明iPLA2i3 的活性在生長因子非依賴性的卵巢癌細胞生長中起決定性作用(圖1)，抑制iPLA2i3活性同樣抑制前列腺癌細胞如DU145、PC3的生長，說明iPLA2i3在生殖系統腫瘤細胞生長中都有類似作用。經比色染色法所得的分析結果表明，與BEL相比，吡咯烷(pyrrolidine，CPLA2的抑制劑)在藥理濃度(0.5 Ι.ΟμΜ)下對卵巢癌細胞的生長沒有抑制作用，說明CPLA2W 活性並不是卵巢癌細胞生長所必需的。與此一致的是，若以專一小幹擾RNA(SiRNA)阻止 CPLA2Q (CPLA2的一種主要同工酶)的表達並不會干擾卵巢癌細胞的生長因子非依賴性的增殖，與對照組(control siRNA，控制siRNA)相比，cPLA2 α siRNA組細胞生長沒有明顯區別(圖2)。2. IPLA2ShRNA抑制iPLA2 β的表達，從而抑制卵巢癌細胞生長對體外細胞進行iPLA2 β酶法檢測證實BEL確實能夠通過iPLA2 β產生影響，在所有的卵巢癌細胞株的細胞裂解液中添加BEL均能夠明顯抑制iPLA2 β的活性。儘管BEL不影響其他PLA2酶，但它已被證明能夠抑制磷脂酸磷酸水解酶。因此為了證明iPLA2i3參與細胞增殖，我們運用慢病毒介導的iPLA2i3 shRNA (主要指以iPLA2 β cDNA序列中40-60中的核苷酸的序列為序列1(GTCACCAACT TGTTCTCTAAC)和810-831中的核苷酸的序列為序列 2 (GATCATCAGCATGGACAGCAGC)或二者之一為靶的shRNA)來下調參與其他類型細胞的增殖調控的iPLA2亞型-iPLA2i3的表達，結果表明與未經病毒感染(uninfected)或者已感染的非靶序列感染的細胞(control shRNA)相比，敲減iPLA2i3 (iPLA2 β shRNA)的表達，強烈抑制0VCAR-3、SK0V-3及Dov_13細胞生長的的(圖3)。對Dov_13及0VCAR-3細胞進行shRNA 處理，比色染色，無血清條件下培養1天後檢測到細胞增長率明顯下降；而SK0V-3細胞在培養兩天後能觀察到細胞增長率下降。本發明所述iPLA2 β基因的shRNA包括針對iPLA2 β基因的所有有效抑制 iPLA2mRNA表達的shRNA核苷酸片段。3.抑制iPLA2i3活性能夠促進細胞凋亡IPLA2的活性受抑制，細胞存活率也同樣下降，兩者相關聯。我們通過測定BEL對 IPLA2^的抑制作用是否影響細胞凋亡來評估這種可能性。大部分卵巢癌細胞系都能抵制血清飢餓引起的細胞凋亡。在無血清條件下培養兩天之後，螢光共軛膜連蛋白質V(ArmeXin V)染色分析表明僅有一小部分的0VCAR-3、SK0V-3及Dove-13發生細胞凋亡。2 μ M的BEL 抑制細胞中的iPLA2i3活性，從而導各細胞系細胞凋亡百分率的平穩上升。通過shRNA抑制iPLA2i3的表達同樣增加了卵巢癌細胞在無血清條件下的細胞凋亡。4.抑制iPLA2 β的活性誘導細胞周期ρ53基因非依賴性的S期&/Μ期阻滯IPLA2活性受到細胞周期的調控，在增殖T細胞、CHO-Kl細胞中G2/M期和S期的後期能觀察到最高的iPLA2活性，這表明適度的iPLA2活性的調控對細胞周期進行是必要的。 我們檢測了抑制iPLA2i3活性而產生的卵巢癌細胞生長的抑制是否由於細胞周期阻滯而引起。將卵巢癌細胞在2 μ MBEL或者無血清的培養基中培養1 3天用流式細胞儀對每日所得細胞進行細胞周期分布(Phase distribution)分析。我們發現BEL處理後0VCAR-3、 SK0V-3及Dove-13等p53缺失型(p53 negative)細胞株在Gl期的細胞數量的一致減少， 而S期和(VM期有明顯的細胞積聚。而不加BEL的對照組(vehicle) 0VCAR-3和SK0V-3細胞經3天(Day3)培養之後大部分細胞處於G1期(70% 75% )，小部分處於S期(15% 20% )約10%處於MAi2期(圖4、5)。這證明了 iPLA2i3的活性對於非生長因子依賴性的細胞周期由S期向&/M期過渡是必需的。INS-I胰島腺瘤細胞中，由iPLA2受抑制而產生的G1細胞周期阻滯是依賴於P53腫瘤抑制基因的。而0VCAR-3和SK0V-3是P53基因缺陷型(p53 negative)的細胞株，這也許是BEL處理不導致G1期細胞阻滯的原因。因此，我們檢驗其他具有正常P53基因(p53wt) 卵巢癌細胞系(如0VCA-420、0VCA-433)對BEL的反應。對這兩個P53陽性的細胞系細胞進行BEL處理，細胞周期分析表明仍有S期及G2/M期細胞阻滯的現象，但沒有G1期細胞阻滯，證實了在卵巢癌細胞中iPLA2對細胞周期通過S期和&/M期的作用是不依賴於一個P53 的(圖5)。經BEL處理的細胞明顯的積累於S期和&/M期，與此一致的是，免疫印跡分析表明在S期及&/M期細胞中相關的細胞周期調節因子如周期蛋白B、周期蛋白E表達水平上調。 SK0V-3和0VCAR-3細胞中表現出的周期蛋白D1低水平表達與BEL無關。在BEL處理的細胞中能觀察到c-Myc (基因)表達水平下調。在G1期c-Myc表達達到峰值從而推動細胞從 G1期向S期過渡，這一表達水平的下降反映了 iPLA2受抑制引起的G1期細胞部分減少。5. shRNA敲減 Ρ1Α2β表達抑制了裸鼠體內卵巢癌細胞的腫瘤發生、發展為了進一步探索1 1^2調節體內卵巢癌細胞增殖的生物學意義，本發明人研究了 IPLA2下調對卵巢癌SK0V-3和0VCAR-3細胞腫瘤生長的影響。Dov_13不能在裸鼠體內生長，因而不能用於體內研究。實驗證明慢病毒介導的shRNA使iPLA2 β的表達水平穩定下降。將未感染(uninfected)的SK0V-3和感染了攜帶一個非目標序列的受控病毒(control virus)的SK0V-3皮下注射對於裸鼠具有高致瘤性。但是感染了攜帶iPLA2 β shRNA的病毒之後致瘤性減少，這表現為腫瘤體積(tumor volume)減少和生長速度的減慢(圖6)。 IPLA2^基因敲減同樣顯著減少了 0VCAR-3的在裸鼠體內致瘤性。免疫印跡及螢光顯微鏡表明共同表達的綠色螢光蛋白質存在於病毒感染的腫瘤細胞中，證實了 shRNA在體內長時期穩定的表達。這個結果表明了抑制iPLA2i3活性能提供一個新型的控制腫瘤生長及惡化的策略。本發明的積極效果本發明涉及溴烯醇內酯及iPLA2 β shRNA用於治療卵巢癌。卵巢癌是女性腫瘤中死亡率最高的腫瘤，對女性健康造成嚴重威脅。本發明提供了一種治療生殖系統惡性腫瘤， 特別是卵巢癌的有效方法，iPLA2i3的基因藥物或化學抑制劑對卵巢癌細胞的生長和腫瘤的形成發展都有非常明顯的抑制作用，可以有效控制卵巢癌的發展，為卵巢癌患者帶來延長生命和康復的機會。


圖1，iPLA2的抑制劑BEL抑制卵巢癌細胞的生長圖2，CPLA2化學抑制劑或siRNA對卵巢癌細胞的生長沒有抑制作用圖3，慢病毒介導的shRNA抑制卵巢癌細胞的生長圖4、BEL對0VCAR3細胞周期的影響圖 5、BEl 對 0VCA-420、0VCA-433 生長周期的影響圖6、shRNA抑制iPLA2活性，從而抑制卵巢癌細胞在裸鼠體內生長，腫瘤發生、發
展
具體實施例實施例1 在裸鼠皮下注射卵巢癌細胞SK0V3 —周后，每天注射一次BEL(劑量0. 5 Img/ kg)，對照組注射BEL載體(DMS0)，然後觀察腫瘤生長情況，一個月可以觀察到，BEL藥物組與對照組相比，具有明顯的抑制腫瘤生長作用，藥物處理組和對照組的腫瘤大小分別為0. 09cm3 和 0. 35cm3，腫瘤減小了 74%。實施例2 在裸鼠皮下注射感染iPLA2shRNA慢病毒的卵巢癌細胞SK0V3，對照組注射shRNA 空載體，然後觀察腫瘤生長情況，一個月後可以觀察到，iPLA2shRNA組與對照組相比，具有明顯的抑制腫瘤生長作用，腫瘤大小分別為0. 07cm3和0. 32cm3，腫瘤減小了 78%。實施例3 在裸鼠皮下注射iPLA2shRNA慢病毒感染的卵巢癌細胞0VCAR-3，對照組注射 shRNA空載體，然後觀察腫瘤生長情況，在兩個月後可以觀察到，iPLA2shRNA組與對照組相比，具有明顯的抑制腫瘤生長作用，腫瘤大小分別為0. 05cm3和0. 25cm3，腫瘤減小了 80%。序列表江南大學用於治療卵巢癌的鈣離子非依賴性磷脂酶A2的抑制劑2Patentin version 3. 1121DNA人工序列iPLA2 β cDNA序列中40-60位的核苷酸序列1GTCACCAACT TGTTCTCTAA C 21222DNA<213X213〉人工序列iPLA2 β cDNA序列中810-831位的核苷酸序列2GATCATCAGC ATGGACAGCA GC 2權利要求
1.用於治療卵巢癌的鈣離子非依賴性磷脂酶A2的抑制劑，其特徵在於鈣離子非依賴性磷脂酶A2的抑制劑主要包括化學藥物溴烯醇內酯和基因藥物iPLA2i3基因的shRNA。
2.如權利要求1所述用於治療卵巢癌的鈣離子非依賴性磷脂酶A2的抑制劑，其特徵在於其中的化學藥物溴烯醇內酯還包括溴烯醇內酯的手性異構體S-BEL。
3.如權利要求1所述用於治療卵巢癌的鈣離子非依賴性磷脂酶A2的抑制劑，其特徵在於其中的基因藥物iPLA2i3基因的shRNA包括針對iPLA2i3基因的所有有效抑制iPLA2mRNA 表達的shRNA核苷酸片段。
4.權利要求1、3所述的用於治療卵巢癌的鈣離子非依賴性磷脂酶A2的抑制劑，其特徵在於其中的siRNA主要指以iPLA2 β cDNA序列中40-60中的核苷酸的序列為序列1和 810-831中的核苷酸的序列為序列2或二者之一為靶的shRNA。
全文摘要
本發明涉及鈣離子非依賴性磷脂酶A2(iPLA2β)的化學抑制劑溴烯醇內酯及短髮卡RNA(short hairpin RNA，shRNA)用於治療生殖系統惡性腫瘤。磷脂酶A2參與細胞膜磷脂的重組及溶血磷脂生長因子的生成，因而在細胞的生長代謝過程中起關鍵作用。作為磷脂酶家族的一員，鈣離子非依賴性磷脂酶A2(iPLA2β)在多種腫瘤如卵巢癌、前列腺癌中高表達。iPLA2β的化學抑制劑溴烯醇內酯(bromoenol lactone，BEL)或它的手性異構體S-BEL、iPLA2β基因的shRNA抑制iPLA2β的活性，從而抑制生殖系統腫瘤，如卵巢癌細胞的生長和腫瘤的形成。iPLA2β的化學抑制劑BEL、S-BEL和iPLA2β基因的shRNA是治療生殖系統腫瘤(卵巢癌)的有效藥物。
文檔編號A61P35/00GK102166364SQ201110093299
公開日2011年8月31日 申請日期2011年4月14日 優先權日2011年4月14日
發明者宋元達, 張灝, 趙建新, 陳衛 申請人:江南大學