林蛙提取凍乾粉及其在製備治療痤瘡的藥物及化妝品中的應用的製作方法

2023-10-10 07:16:59

林蛙提取凍乾粉及其在製備治療痤瘡的藥物及化妝品中的應用的製作方法
【專利摘要】一種林蛙提取凍乾粉及其在製備治療痤瘡的藥物及化妝品中的用途，屬於生物製藥【技術領域】。是將林蛙幹除雜除塵後粉碎，再加入複合酶水解液，取離心後的上層上清液；將剩餘混合物研磨後剪切，噴霧乾燥成粉末狀，將該超微粉加入到醋酸中超聲後紗網過濾，離心後取上清液減壓濃縮；從而得到多糖、抗菌肽和鈣離子的混合物；將上述物質混合得到林蛙提取混合液，經預凍、升華、解吸、後處理得到林蛙提取凍乾粉。凍乾粉是純生物製劑，無任何副作用，所含短肽膠原蛋白在多糖的作用下可更好的進入正常細胞，給予細胞充足營養，並可修復受損細胞；抗菌肽可結合鈣離子，增強其對細菌細胞壁的破壞，並進入細菌細胞達到抑菌效果。
【專利說明】林蛙提取凍乾粉及其在製備治療痤瘡的藥物及化妝品中的 應用

【技術領域】
[0001] 本發明屬於生物製藥【技術領域】，具體涉及一種林蛙提取凍乾粉及其在製備治療痤 瘡的藥物及化妝品中的用途。

【背景技術】
[0002] 痤瘡是好發於毛囊皮脂腺的慢性炎症性疾病，好發於顏面、胸背，以粉刺、丘疹、膿 疤、結節、囊腫及疤痕為特徵，常伴皮脂溢出。多發於青年男女，又被稱為"青春痘"，古代稱 面瘡、酒刺、肺風等。但隨著生活壓力加大和綜合因素的影響，痤瘡的發病年齡有提高的趨 勢。病情纏綿難愈且留下癱痕，不僅影響美觀，還給患者帶來嚴重的精神負擔，影響工作和 社交活動。
[0003] 目前，國內對林蛙皮抗菌肽進行了研究，申報的專利也在增多，以林蛙為關鍵 詞，檢索國內外專利，沒有查到國外關於林蛙的專利，國內專利中CN1216768A "生物抗菌 肽及其製備方法"是涉及一種具有廣譜抗菌活性的林蛙蛙皮生物抗菌肽及其製備方法； CN1583166A "林蛙抗菌肽噴霧劑及其製備方法"、CN1583165A "林蛙抗菌肽凝膠劑及其製備 方法"是涉及保護林蛙皮膚抗菌肽以噴霧劑和凝膠劑兩種形式用於臨床皮膚感染、燒傷燙 傷感染領域；CN1679632A "林蛙鎮痛水提物及其製備方法及其製備方法"是關於保護從林蛙 皮中提取的一種具有鎮痛作用的林蛙鎮痛水提物及其製備技術。均是以林蛙皮為原料，提 取了林蛙皮抗菌肽。CN103073628A-種利用超聲波從林蛙體中提取抗菌肽的生產製備方法 是以林蛙體為原料採用超聲提取抗菌肽，提取的抗菌肽是分子量為4KDa最適pH值為3. 5， 等電點pi值為8. 0 - 10. 5的鹼性多肽。以上專利均以抗菌肽為保護內容，申請保護其在 抗菌方面的作用，所述抗菌是指抵抗細菌和真菌，包括大腸桿菌、綠膿桿菌等革蘭氏陰性菌 和金黃色葡萄球菌等革蘭氏陽性菌及臨床耐藥菌克雷伯桿菌、鮑曼不動桿菌、白色念珠菌、 酵母菌的一種或多種；並且抗菌治療途徑均為外用給藥。CN103432058A "林蛙膠原蛋白液 及其製備工藝"是以林蛙皮提取物、西洋參皂甙、五味子浸出液、蘆薈提取物和水配製而成； CN102492760A "一種利用複合酶生產活性東北林蛙膠原蛋白低聚肽的方法"是以幹東北林 蛙皮為原料；CN102229972A "製備林蛙皮膠原蛋白肽的方法"是以林蛙皮為原料，以上三個 專利均是以林蛙皮為原料或主要原料提取林蛙皮中所含的膠原蛋白。


【發明內容】

[0004] 本發明的目的之一是提供一種林蛙提取凍乾粉。
[0005] 本發明所述林蛙提取凍乾粉含有短肽膠原蛋白、多糖、抗菌肽、鈣離子，是按照下 述步驟製備得到的：
[0006] (1)將林蛙幹（林蛙幹為除脂除卵的林蛙幹體）除雜除塵後依次經20?100目 粉碎，使林蛙乾粉碎物的粒徑在500 μ m以下，按照lg : 1?10mL的比例加入複合酶水解液， 複合酶水解液中含木瓜蛋白酶1?5wt%、胰蛋白酶2?4wt%，風味蛋白酶1?3wt% ;在 50?55°C下酶解1?2h，酶解pH為7. 0?7. 5,而後在85?90°C、5?15min滅酶；再將 混合物在10?30°C離心，離心時間為1?5min，離心轉速為2000?4000rpm，取離心後混 合液體積20?40%的上層上清液，此時上層上清液中含有林蛙幹短肽膠原蛋白（由於離心 力的作用，短鏈膠原蛋白將集中在上層上清液中，長鏈蛋白分子將會集中在混合液的中下 層剩餘混合物中），其分子量為2?3KDa，等電點pi值為7. 5?7. 8,其中鹼性胺基酸（精 氨酸、賴氨酸、組氨酸）佔上層上清液的11. 04?12. 89% (質量比），酸性胺基酸（天冬氨 酸、穀氨酸）佔上層上清液的17. 99?19. 13% (質量比）。
[0007] (2)將上述取上層上清液後的剩餘混合物（原體積的60?80% )放入膠體磨， 研磨2?15min，使混合物的平均粒徑在300 μ m以下；將混合物放入高剪切分散乳化機內， 剪切1?15min，使混合物平均粒徑在100?200 μ m之間；再將混合物進行噴霧乾燥成粉 末狀，此時得到林蛙幹提取短肽膠原蛋白後的剩餘纖維、骨質等物質的超微粉；將纖維、骨 質等物質的超微粉加入到質量濃度為2?10%醋酸中超聲，醋酸與超微粉的體積質量比為 10?40mL :lg，超聲時間為5?75min，超聲溫度為4?30°C ;經150μπι紗網過濾，紗網上 面未過濾物質再加入質量體積比為lg: 1?8mL、濃度為0. 01?0. 03mol/L的氫氧化鈉，進 行微波提取，微波功率為500?600W，微波提取時間為3?9min，再次經150 μ m紗網過濾； 合併兩次濾液，30?50°C攪拌10?30min，攪拌速度為100?200rpm ;將攪拌後的濾液離 心，離心溫度為4?30°C，離心時間為2?40min，離心轉速為2000?15000rpm ;取上清液 減壓濃縮，壓力為600?700託，溫度為65?70°C，濃縮體積比為8?40 :1 ;從而得到多糖、 抗菌肽和鈣離子的混合物；其中多糖的分子量為1?5KDa ;抗菌肽的分子量為1?3KDa，其 等電點pi值為7. 5?8.0,且其中鹼性胺基酸（精氨酸、賴氨酸、組氨酸）佔多糖、抗菌肽和 鈣離子的混合物的11. 28?13. 05% (質量比），酸性胺基酸（天冬氨酸、穀氨酸）佔多糖、 抗菌肽和鈣離子的混合物的10. 01?11. 47% (質量比）；
[0008] (3)將步驟（1)得到的短肽膠原蛋白和步驟（2)得到的多糖、抗菌肽、鈣離子混合， 得到林蛙提取混合液；將上述林蛙提取混合液經過預凍、升華、解吸、後處理得到林蛙提取 凍乾粉。
[0009] 預凍溫度為-42?-48°C，預凍時間為150?180min ;升華為多溫度段升華過程， 即在溫度-35?-40°C，壓力600?700託下維持150?240min ;在溫度-30'-35°C，壓力 600?700託下維持180?240min ;在溫度-25?-30°C，壓力500?600託下維持180? 240min ;在溫度-20?-25°C，壓力500?600託下維持150?180min ;在溫度-15?-20°C， 壓力450?500託下維持150?180min ;在溫度-10?-15 °C，壓力400?450託下維 持180?240min ;在溫度-5?-10°C，壓力300?400託下維持120?150min ;在溫度 0?-5°C，壓力300?400託下維持120?150min ;在溫度0?5°C，壓力400?500託下 維持150?180min ;解吸為多溫度段解吸過程，即在溫度5?10°C，壓力400?500託下維 持240?300min ;在溫度10?15°C，壓力500?600託下維持180?240min ;在溫度15? 20°C，壓力600?700託下維持180?240min，從而得到林蛙提取凍乾粉。
[0010] 所述的林蛙提取凍乾粉可以與藥學上可接受的載體或賦形劑形成藥物製劑，所述 製劑可以為噴霧劑、氣霧劑、霜劑、軟膏劑、凝膠劑或溼巾等外用劑型；或為口服液、顆粒劑、 混懸液、乳劑等口服劑型。
[0011] 所述林蛙提取凍乾粉可以與化妝品上可接受的載體或賦形劑形成相關化妝品，所 述化妝品可以為洗面奶、化妝水、潔膚水、平衡水、乳液、面霜、面膜、浴液等日化產品。
[0012] 本發明的目的之二是提供一種治療痤瘡的林蛙提取凝膠劑，按重量份計算，其原 料為：林蛙提取凍乾粉3?8份，丙二醇5?15份，卡波姆0. 2?1. 5份，聚氧乙烯氫化蓖 麻油5?15份，亞硫酸氫鈉0. 1?1份，乙二胺四乙酸二鈉0. 1?1份，尼泊金0. 1?1份， 氮酮0. 2?1. 5份，三乙醇胺0. 1?1份；且由如下步驟製備得到：無菌條件下將亞硫酸氫 鈉、乙二胺四乙酸二鈉溶解於超純水中，超純水與亞硫酸氫鈉、乙二胺四乙酸二鈉的體積質 量比為5?15mL :lg，30?50°C下攪拌10?30min，攪拌速度為100?200rpm，攪拌過程 中加入卡波姆，從而得到溶脹均勻的卡波姆溶脹液；取林蛙提取凍乾粉攪拌溶解於超純水 中，超純水與林蛙提取凍乾粉的體積質量比為5?10mL :lg，再加入丙二醇、聚氧乙烯氫化 菌麻油、氮酮、尼泊金攪拌，攪拌溫度30?60°C，攪拌時間15?40min，攪拌速度為100? 300rpm，然後將此混合溶液加入到卡波姆溶脹液中，20?50°C下攪拌10?40min，攪拌速度 為150?300rpm，攪拌過程中加入三乙醇胺；最後勻質4?7次，使粒徑在100 μ m以下，從 而得到無色透明的林蛙提取凝膠劑。用法用量：外用，每日早晚兩次患部塗敷，〇. 5?lmL/ 次，7天為1療程。
[0013] 本發明的目的之三是提供一種治療痤瘡的林蛙提取乳液，按重量份計算，其原料 為林蛙提取凍乾粉3?8份，硬脂酸2?10份，十八醇2?10份，十六醇3?8份，白油 2?6份，Twenn-601?3份，羊毛脂1?3份，橄欖油1?5份，甘油5?15份，三乙醇胺 0. 1?2份，茉莉香精0. 1?2份，布羅波爾0. 01?1份，尼泊金丙酯0. 1?2份；且由如 下步驟製備得到：
[0014] (1)將硬脂酸，十八醇，十六醇，白油，Twenn-60,羊毛脂，橄欖油混合，20?50°C下 攪拌15?35min，攪拌速度為150-300rpm，形成油相；
[0015] (2)將林蛙提取凍乾粉與甘油，三乙醇胺，超純水充分混合，20?40°C下攪拌10? 25min，攪拌速度為300?500rpm，形成水相；
[0016] (3)將油相與水相在20?40°C下混合攪拌，攪拌時間5?20min，加入茉莉香精， 布羅波爾，尼泊金丙酯，再次攪拌，攪拌溫度20?40°C，攪拌時間10?30min，攪拌速度為 200?400rpm，經納米勻質機3?8次，得到林娃提取乳液。
[0017] 本發明的目的之四是提供一種治療痤瘡的林蛙提取面膜，按重量份計算，其原料 為林蛙提取凍乾粉3?8份，甘油4?8份，1，3- 丁二醇2?10份，透明質酸0. 05?1份， 熊果苷1?5份，卡波樹脂0. 1?1. 5份，泛醇0. 1?2份，維生素 C脂質體2?6份，三 乙醇胺〇. 1?2份，聚乙二醇-60氫化蓖麻油0. 1?1份，尼泊金丙酯0. 1?2份，茉莉香 精0. 1?1份；且由如下步驟製備得到：將林蛙提取凍乾粉，甘油，1，3-丁二醇，透明質酸， 熊果苷，卡波樹脂，泛醇，維生素 C脂質體，三乙醇胺，聚乙二醇-60氫化蓖麻油，尼泊金丙 酯，茉莉香精與超純水混合，攪拌，攪拌溫度20?60°C，攪拌時間10?40min，攪拌速度為 300?500rpm，110?120°C滅菌10?20min ;自然後冷卻至室溫後加入到放有無菌無紡布 (15cmX 15cm)獨立包裝袋內，密封即得。
[0018] 本發明的目的之五是提供一種治療痤瘡的林蛙提取凍乾粉口服劑，按重量份計 算，其原料為以20?65份林娃幹按照上面方法提取的林娃提取混合液，朽 1檬酸5?10份， 甜菊糖苷5?30份，安賽蜜5?25份，黃原膠5?10份，山梨酸鉀5?10份，醋酸鋅1? 5份，β -環糊精5?10份；且由如下步驟製備得到：
[0019] (1)減壓濃縮：將林蛙提取混合液在減壓條件下進行蒸餾，壓力在8X 103?3X 104 帕，溫度為50?85°C，濃縮比為1?5:1，得濃縮液；
[0020] (2)將研細的醋酸鋅緩慢加入濃縮液中，邊加邊攪拌；加完後用0· lmol/L的NaOH 調節pH為6. 2?6. 5,攪拌均勻後使其自然沉降，自然冷卻過夜；
[0021] (3)0. 45 μ m濾膜過濾，得澄清液體後，加入用檸檬酸、甜菊糖苷、安賽蜜，50? 65°C、100?200rpm下攪拌10?25min，過濾；然後向清液中加入黃原膠、山梨酸鉀、β -環 糊精，再經〇. 22 μ m濾膜精濾；
[0022] (4)冷凍乾燥得林蛙提取凍乾粉口服劑。
[0023] 用法用量：內服，每日早晚兩次口服，20mg/次，可溶解於飲用水、牛奶、豆漿等液 體食物中，7天為1療程。
[0024] 本發明的積極效果在於：林蛙提取凍乾粉是純生物製劑，無任何副作用，所含短肽 膠原蛋白在多糖的作用下可更好的進入正常細胞，給予細胞充足營養，並可修復受損細胞； 抗菌肽可結合鈣離子，增強其對細菌細胞壁的破壞，並進入細菌細胞達到抑菌效果。本發明 對皮膚黏膜無刺激、殺菌速度快、使用簡便、無色無味，適合不同年齡人群使用。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0025] 圖1 :林蛙提取混合液中上層上清液中所含短鏈膠原蛋白凝膠電泳圖。
[0026] 採用Tricine電泳法測短肽膠原蛋白分子量，以索萊寶公司的超低分子量蛋白質 marker作為標準，得出所含短肽膠原蛋白分子量約為2?3KDa。
[0027] 圖中左側為標準的marker，即標準分子量蛋白質的電泳圖，由左向右依次為實施 例一中林蛙提取混合液中上層上清液中所含短鏈膠原蛋白凝膠電泳圖；實施例二中林蛙提 取混合液中上層上清液中所含短鏈膠原蛋白凝膠電泳圖；實施例三中林蛙提取混合液中上 層上清液中所含短鏈膠原蛋白凝膠電泳圖；實施例四中林蛙提取混合液中上層上清液中所 含短鏈膠原蛋白凝膠電泳圖；實施例五中林蛙提取混合液中上層上清液中所含短鏈膠原蛋 白凝膠電泳圖。
[0028] 圖2 :多糖分子量標準曲線。
[0029] 以標準葡聚糖T1 (分子量1000)、T3 (分子量3000)、T5 (分子量5000)、T10 (分子量 10000)，藍葡聚糖（分子量2000000)為標準品，經S印hadex G-25凝膠柱（100cmX1.5cm) 以超純水洗脫，流速為1. 2mL/min，254nm檢測多糖分子量分布，計算出每種標準葡聚糖糖 峰洗脫體積。以分子量為200萬的藍葡聚糖和葡萄糖作為標準糖來確定層析柱的外水體積 Vo和總體積Vt，Ve為總體積減去外水體積。以Ve/Vt為橫坐標，lg(Mw)為縱坐標作標準曲 線，計算多糖分子量的公式為：
[0030] Lg(Mw) = - K2)Ve/Vt
[0031] Mw :多糖分子量
[0032] Ve :待測樣品的糖峰洗脫體積；
[0033] Vo :分子篩排阻層析柱的外水體積；
[0034] Vt :分子篩排阻層析柱的總體積；
[0035] 1^、1(2為常數。
[0036] 以藍葡聚糖和不同分子量葡萄糖標準製作得出多糖分子量標準曲線；
[0037] 圖3 :林蛙提取混合液所含多糖經S印hadex G-25凝膠柱層析得到的洗脫曲線。
[0038] 採用凝膠層析製備方法檢測，用S印hadex G-25凝膠柱層析254nm下紫外檢測 儀測定林蛙提取混合液洗脫曲線，得出洗脫體積Ve。將洗脫體積Ve帶入公式lg(Mw)= (I -K2)Ve/Vt，根據標準葡聚糖曲線（圖2所示曲線），算出林蛙提取混合液所含多糖分子 量Mw約為1?5Kda。
[0039] 圖4 :混合多糖標準RP-HPLC分析圖譜。
[0040] 採用高效液相色譜法測定繪製單糖標準曲線，稱取多糖標準樣品，加入lmL無水 鹽酸-甲醇，充N2封管後，100°C水解16h後吹乾液體。甲醇解後的多糖標準樣品經乾燥後， 加入2mol/L三氟乙酸2mL，120°C充N2封管水解3h，水解產物倒入蒸發皿中，加入適量無水 乙醇45°C水浴蒸除三氟乙酸。PMP柱前衍生化及其處理，取0. 5mL PMP試劑和0. 5mL0. 3mol/ L的NaOH溶液於蒸發皿中，將乾燥物溶解後取其中的0. 1 mL於小離心管中，7 0 °C水浴 30min。進行高效液相檢測。
[0041] 高效液相色譜分析條件
[0042] 儀器：Shimadzu LC-14ATvp液相色譜儀，附SPD-10AVD紫外檢測器
[0043] 色譜柱：DIKMA Inertsil 0DS-3ym(150X4. 6mm)
[0044] 檢測溫度：35 °C
[0045] 檢測波長：245nm
[0046] 洗脫液：82% PBS (0· 1M，ρΗ7· 0)，18% Acetonitrile (v/v)
[0047] 流速：1. OmL/min
[0048] 圖5 :林蛙提取液所含多糖組分的RP-HPLC分析圖譜。
[0049] 採用高效液相法分析其單糖組成情況，利用混合多糖的標樣確定組分中單糖的比 例。林蛙提取混合液中含有的單糖有甘露糖、鼠李糖、葡萄糖、半乳糖、木糖、阿拉伯糖、巖 藻糖、葡萄糖醛酸以及半乳糖醛酸，其中鼠李糖：甘露糖：半乳糖：葡萄糖：木糖：阿拉伯糖： 巖藻糖的比例約為1 :4 :6 :12 :7 :5 :3(體積比），糖醛酸含量中葡萄糖醛酸：半乳糖醛酸= 1 :1(體積比）；
[0050] 圖6 :林蛙提取混合液中所含抗菌肽分子凝膠電泳圖。
[0051] 採用Tricine電泳法測抗菌肽分子量，以索萊寶公司的超低分子量蛋白質marker 作為標準，得出所含抗菌肽分子量約為1?3Kda。
[0052] 圖中左側為標準的marker，即標準分子量蛋白質的電泳圖，由左向右依次為實施 例一中林蛙提取混合液中所含抗菌肽分子凝膠電泳圖；實施例二中林蛙提取混合液中所含 抗菌肽分子凝膠電泳圖；實施例三中林蛙提取混合液中上所含抗菌肽分子凝膠電泳圖；實 施例四中林蛙提取混合液中所含抗菌肽分子凝膠電泳圖；實施例五中林蛙提取混合液中所 含抗菌肽分子凝膠電泳圖。

【具體實施方式】
[0053] 下面結合實施例對本發明作進一步描述。本發明所用林蛙乾產自是我國東北地區 長白山麓。中國林娃（Rana temporaria chensinensis)俗稱田雞、哈士蟆、雪哈等，在動物 分類上屬兩棲綱、無尾目、蛙科、蛙屬，是我國東北地區長白山麓的特有品種，屬於藥、食兩 用的珍貴蛙種，並且資源豐富。
[0054] 實施例一林蛙提取凍乾粉的製備
[0055] 將林蛙幹35g(林蛙幹為除脂除卵的林蛙幹體）除雜除塵後分別經20、40目、80 目、100目粉碎，使林蛙乾粉碎物的粒徑在500 μ m以下，按照lg :7mL的比例加入複合酶水 解液，複合酶水解液中含木瓜蛋白酶2wt %、胰蛋白酶3wt %，風味蛋白酶2wt %，酶解溫度 為52°C，酶解時間為1. 5h，酶解pH為7. 3,而後85°C、12min滅酶，將混合物在溫度25°C時 離心，離心時間為311^11，離心轉速為3000印111，取離心後混合液體積30 (%的上層上清液，此 時提取了林蛙幹中含有的短肽膠原蛋白；
[0056] 短肽膠原蛋白中（紫外光譜分析法分析胺基酸類別，胺基酸自動分析儀收集測定 胺基酸質量分數）精氨酸、賴氨酸、組氨酸的含量（佔上層上清液質量的百分數）分別為 3.12%、7.43%、0.73 (%，天冬氨酸、穀氨酸的含量（佔上層上清液質量的百分數）分別為 7. 86%、11· 19%。
[0057] 取上清後剩餘混合物（原體積的70% )，放入膠體磨，研磨5min，使混合物的平均 粒徑在300 μ m以下；將混合物再放入高剪切分散乳化機內，剪切4min，使混合物平均粒徑 在100?200 μ m之間，將混合物進行噴霧乾燥成粉末狀，此時得到林蛙幹提取短肽膠原蛋 白後剩餘纖維、骨質等物質的超微粉；
[0058] 將纖維、骨質等物質的超微粉加入到質量濃度為8%醋酸中，醋酸與超微粉的體積 質量比（mL :g)為18:1。超聲，超聲時間為：45min，超聲溫度為20°C;過濾，經150μπι紗網 過濾；150 μ m紗網上面未過濾物質加入質量體積比為1:6的0.025mol/L氫氧化鈉，進行微 波提取，微波功率為520W，微波時間6min，再次經150 μ m紗網過濾；合併兩次濾液，20°C，攪 拌15min，攪拌速度為120rpm ;攪拌後的濾液離心，離心溫度為20°C，離心時間為16min，離 心轉速為6000rpm;取上清，減壓濃縮，壓力為650託，溫度為65°C，濃縮體積比為12:1 ;此 時得到多糖、抗菌肽、鈣離子的混合物（鈣離子的檢測採用EDTA滴定法檢測）；
[0059] 混合物中多糖（Sephadex G - 25凝膠柱分離收集單糖，高效液相色譜法測定單糖 組成）主要由甘露糖、鼠李糖、葡萄糖、半乳糖、木糖、阿拉伯糖、巖藻糖、葡萄糖醛酸以及半 乳糖醛酸組成，其中含單糖鼠李糖：甘露糖：半乳糖：葡萄糖：木糖：阿拉伯糖：巖藻糖約為 1 :4:6 :12 :1 :0.5 :1(體積比），糖醛酸中葡萄糖醛酸：半乳糖醛酸=1 :1(體積比）；
[0060] 抗菌肽中（紫外光譜分析法分析胺基酸類別，胺基酸自動分析儀收集測定胺基酸 質量分數）精氨酸、賴氨酸、組氨酸的含量（佔混合物的百分數）分別為2. 73%、8. 16%、 0.69%，天冬氨酸、穀氨酸的含量（佔混合物的百分數）分別為4. 47% :5. 98%。
[0061] 將短肽膠原蛋白、多糖、抗菌肽、鈣離子混合，得到林蛙提取混合液130mL，其中鈣 離子為 104mg(80mg/100ml)。
[0062] 將林蛙提取混合液經過預凍溫度為_35°C，預凍時間為150min;升華當溫 度-38°C，壓力650託，維持時間180min，當溫度-33°C，壓力680託，維持時間180min，當溫 度-25°C，壓力500託，維持時間240min，當溫度-20°C，壓力500託，維持時間150min，當溫 度-15°C，壓力450託，維持時間150min，當溫度-10°C，壓力400託，維持時間240min，當溫 度-5°C，壓力300託，維持時間120min，當溫度-2°C，壓力300託，維持時間120min，當溫度 2°C，壓力400託，維持時間180min ;解吸當溫度5°C，壓力450託，維持時間240min，當溫度 l〇°C，壓力500託，維持時間180min，當溫度15°C，壓力600託，維持時間240min，得到林蛙 提取凍乾粉，質量是3. 8g。
[0063] 實施例二林蛙提取凝膠劑的製備
[0064] 處方組成（按重量份計算）：按照實施例一的方法由林蛙幹35g製備的林蛙提取 凍乾粉3. 8g，丙二醇5g，卡波姆0. 2g，聚氧乙烯氫化蓖麻油5g，亞硫酸氫鈉0. lg，乙二胺四 乙酸二鈉〇. lg，尼泊金〇. lg，氮酮〇. 2g，三乙醇胺0. lg。
[0065] 製備方法：
[0066] (1)林蛙提取凍乾粉的製備
[0067] 稱取林娃幹35g(中國林娃長白山亞種，購自吉林大藥房），按照實施例一的方法 製備成林蛙提取凍乾粉3. 8g ;
[0068] (2)林蛙提取凝膠劑的製備
[0069] 無菌條件下將亞硫酸氫鈉、乙二胺四乙酸二鈉溶解於7:1 (mL:g)超純水中，40°C， 攪拌15min，攪拌速度為150rpm，攪拌過程中加入卡波姆，使其溶脹均勻；取林娃提取凍幹 粉攪拌溶解於5:1 (mL:g)超純水中，加入丙二醇、聚氧乙烯氫化蓖麻油、氮酮、尼泊金攪拌， 攪拌溫度40°C，攪拌時間20min，攪拌速度為200rpm，將此溶液加入到卡波姆溶脹物中， 30°C，攪拌時間20min，攪拌速度為200rpm，攪拌過程中加入三乙醇胺，使其均勻，經納米勻 質機6次，使林蛙提取凝膠原液的粒徑在100 μ m以下。分裝，得無色透明林蛙提取凝膠劑， 質量是34. 6g。
[0070] 實施例三林蛙提取乳液的製備
[0071] 處方組成（按重量份計算）：按照實施例一的方法由林蛙幹35g製備的林蛙提取 凍乾粉3. 8g，硬脂酸4. 5g,十八醇2. 51g,十六醇2. 5g,白油3. lg, Twenn-600. 5g,羊毛脂 1. 2g，橄欖油0. 5g，甘油6. 5g，三乙醇胺0. 31g，茉莉香精0. lg，布羅波爾0. 05g，尼泊金丙 酯 〇. 2g。
[0072] 製備方法：
[0073] (1)林蛙提取凍乾粉的製備
[0074] 稱取林娃幹35g(中國林娃長白山亞種，購自吉林大藥房），按照實施例一的方法 製備成林蛙提取凍乾粉3. 8g ;
[0075] (2)林蛙提取乳液的製備
[0076] 將硬脂酸，十八醇，十六醇，白油，Twenn-60,羊毛脂，橄欖油混合，攪拌，攪拌溫度 40°C，攪拌時間20min，攪拌速度為200rpm，形成油相；
[0077] 將林蛙提取凍乾粉與甘油，三乙醇胺，超純水充分混合，攪拌，攪拌溫度20°C，攪拌 時間lOmin，攪拌速度為300rpm，形成水相；
[0078] 將油相與水相在30°C下混合攪拌，加入香精，布羅波爾，尼泊金丙酯，再次攪拌，攪 拌溫度25°C，攪拌時間15min，攪拌速度為200rpm，經納米勻質機4次，既得林蛙提取乳液， 質量是120g。
[0079] 實施例四林蛙提取面膜的製備
[0080] 處方組成（按重量份計算）：按照實施例一的方法由林蛙幹35g製備的林蛙提取 凍乾粉3. 8g，甘油5. Og，1，3- 丁二醇4. Og，透明質酸0. lg，熊果苷2. Og，卡波樹脂0. 5g，泛 醇0. 5g，維生素 C脂質體3. 0g，三乙醇胺0. 4g，聚乙二醇-60氫化蓖麻油0. 3g，尼泊金丙酯 0.2g，茉莉香精0. lg。
[0081] 製備方法：
[0082] (1)林蛙提取凍乾粉的製備
[0083] 稱取林娃幹35g(中國林娃長白山亞種，購自吉林大藥房），按照實施例一的方法 製備成林蛙提取凍乾粉3. 8g ;
[0084] (2)林蛙提取面膜的製備
[0085] 將林蛙提取凍乾粉，甘油，1，3- 丁二醇，透明質酸，熊果苷，卡波樹脂，泛醇，維生素 C脂質體，三乙醇胺，聚乙二醇-60氫化蓖麻油，尼泊金丙酯，茉莉香精與超純水混合，超純 水加至100. 〇%，115°C滅菌lOmin。自然冷卻至室溫，加入到放有無菌無紡布（15cmX 15cm) 獨立包裝袋內，密封即得。
[0086] 實施例五林蛙提取凍乾粉口服劑的製備
[0087] 處方組成（按重量份）：按照實施例一的方法由林蛙幹35g製備的林蛙提取混合 液130mL，檸檬酸6g，甜菊糖苷5g，安賽蜜5g，黃原膠5g，山梨酸鉀5g，醋酸鋅lg，β -環糊 精5g。
[0088] 製備方法：
[0089] (1)林蛙提取混合液的製備：
[0090] 稱取林娃幹35g(中國林娃長白山亞種，購自吉林大藥房），按照實施例一的方法 製備成林娃提取混合液130mL ;
[0091] (2)減壓濃縮：將提取混合液在減壓條件下進行蒸餾，壓力在9. 3X 103帕，溫度為 65°C，濃縮比為4:1，得濃縮液；
[0092] (3)將研細的醋酸鋅緩慢加入濃縮液中，邊加邊攪拌；加完後用0· lmol/L NaOH調 節pH為6. 4,攪勻後使其自然沉降，自然冷卻過夜；
[0093] (4)0. 45 μ m濾膜過濾，得澄清液體後，加入用檸檬酸酸化的甜菊糖苷、安賽蜜，溫 度在58°C時，160rpm攪拌，攪拌時間為18min，過濾，再向清液中加入適量黃原膠和溶解好 的山梨酸鉀、β -環糊精，經0. 22 μ m濾膜精濾；
[0094] (5)冷凍乾燥得成品--林蛙提取凍乾粉口服劑型。
[0095] 以下試驗例表明本發明在治療痤瘡藥物中的用途
[0096] 試驗例1
[0097] 採用完全隨機的方法，將420例病患受試對象分配到治療組（240例，共4組）和 對照組（180例，3組）。治療組分別採用實施例二、實施例三、實施例四、實施例五製成的林 蛙提取凍乾粉製劑，對照組採用迪維霜（重慶華邦製藥股份有限公司）、林蛙皮抗菌肽（採 用CN1216768A方法製備）、林蛙體抗菌肽（採用CN103073628A方法製備）。根據療效標準 判斷療效，結果見表1。
[0098] 用法：實施例二組、實施例三組、實施例四組、迪維霜組、林娃皮抗菌肽組、林娃體 抗菌肽組為外用劑型，每日早晚兩次清洗患處後使用藥物，實施例二組每次用藥量為2g，用 藥方式為塗抹患處，2次/d ;實施例三組每次用量為2mL，使用方式為塗抹患處，2次/d ;實 施例四組使用前清洗患處，每次使用時間為15min，1次/d ;迪維霜組每次用藥量為2g，用藥 方式為塗抹患處，2次/d ;林蛙皮抗菌肽組每次用藥量為2mL，用藥方式為塗抹患處，2次/ d ;林蛙體抗菌肽組每次用藥量為2mL，用藥方式為塗抹患處，2次/d ;實施例五組為內服組， 早晚每次口服20mg。
[0099] 各組同時停用其他相關手段和治療藥物，均以7天為1療程。
[0100] 統計學方法：計量資料用t檢驗，記數資料用X2及Rdiit檢驗，P〈0. 05為差異有 統計學意義。
[0101] 療效評定標準：
[0102] 參照《中藥新藥治療痤瘡的臨床研究指導原則》中關於疾病療效判定標準。痊癒： 症狀，體徵消失或基本消失，積分值減少1>95% ;顯效：症狀，體徵明顯改善，積分值減少 > 70% ;有效：症狀，體徵有好轉，積分值減少> 30% ;無效：症狀，體徵未見好轉，積分值減 少〈30%。
[0103] 表1本發明治療痤瘡的情況（例）
[0104]

【權利要求】
1. 一種林蛙提取凍乾粉，其特徵在於：含有短肽膠原蛋白、多糖、抗菌肽和鈣離子，且 按照下述步驟製備得到： (1) 將林蛙幹除雜除塵後依次經20?100目粉碎，使林蛙乾粉碎物的粒徑在500 μ m以 下，按照lg :1?10mL的比例加入複合酶水解液，複合酶水解液中含木瓜蛋白酶1?5wt%、 胰蛋白酶2?4wt %，風味蛋白酶1?3wt %;在50?55°C下酶解1?2h，酶解pH為7. 0? 7. 5,而後在85?90°C、5?15min滅酶；再將混合物在10?30°C離心，離心時間為1? 5min，離心轉速為2000?4000rpm，取離心後混合液體積20?40 %的上層上清液，此時上 層上清液中含有林蛙幹短肽膠原蛋白； (2) 將上述取上層上清液後的剩餘混合物放入膠體磨，研磨2?15min，使混合物的平 均粒徑在300 μ m以下；將研磨後的混合物放入高剪切分散乳化機內，剪切1?15min，使混 合物平均粒徑在100?200 μ m之間；再將剪切後的混合物噴霧乾燥成粉末狀，得到超微粉； 將該超微粉加入到質量濃度為2?10%醋酸中超聲，醋酸與超微粉的體積質量比為10? 40mL :lg，超聲時間為5?75min，超聲溫度為4?30°C;再經150μ m紗網過濾，紗網上面未 過濾物質再加入質量體積比為lg: 1?8mL、濃度為0. 01?0. 03mol/L的氫氧化鈉，進行微 波提取，微波功率為500?600W，微波提取時間為3?9min，再次經150 μ m紗網過濾；合併 兩次濾液，30?50°C攪拌10?30min，攪拌速度為100?200rpm ;將攪拌後的濾液離心，離 心溫度為4?30°C，離心時間為2?40min，離心轉速為2000?15000rpm ;取上清液減壓 濃縮，壓力為600?700託，溫度為65?70°C，濃縮體積比為8?40 :1 ;從而得到多糖、抗 菌肽和鈣離子的混合物； (3) 將步驟（1)得到的短肽膠原蛋白和步驟（2)得到的多糖、抗菌肽、鈣離子混合，得到 林娃提取混合液； (4) 將上述林蛙提取混合液經過預凍、升華、解吸處理後得到林蛙提取凍乾粉。
2. 如權利要求1所述的林蛙提取凍乾粉，其特徵在於：預凍溫度為-42?-48°C，預凍 時間為150?180min ;升華為多溫度段升華過程，即在溫度-35?-40°C，壓力600?700 託下維持150?240min ;在溫度-30'-35°C，壓力600?700託下維持180?240min ;在 溫度-25?-30°C，壓力500?600託下維持180?240min ;在溫度-20?-25°C，壓力 500?600託下維持150?180min ;在溫度-15?-20°C，壓力450?500託下維持150? 180min ;在溫度-10?-15°C，壓力400?450託下維持180?240min ;在溫度-5?-10°C， 壓力300?400託下維持120?150min ;在溫度0?-5 °C，壓力300?400託下維持120? 150min ;在溫度0?5°C，壓力400?500託下維持150?180min ;解吸為多溫度段解吸過 程，即在溫度5?10°C，壓力400?500託下維持240?300min ;在溫度10?15°C，壓力 500?600託下維持180?240min ;在溫度15?20°C，壓力600?700託下維持180? 240min，從而得到林蛙提取凍乾粉。
3. 權利要求1或2所述的林蛙提取凍乾粉在製備治療痤瘡的藥物及化妝品中的應用。
4. 一種治療痤瘡的林蛙提取凝膠劑，其特徵在於：按重量份計算，其原料為林蛙提取 凍乾粉3?8份，丙二醇5?15份，卡波姆0. 2?1. 5份，聚氧乙烯氫化菌麻油5?15份， 亞硫酸氫鈉0. 1?1份，乙二胺四乙酸二鈉0. 1?1份，尼泊金0. 1?1份，氮酮0. 2?1. 5 份，三乙醇胺0. 1?1份；且由如下步驟製備得到： (1)無菌條件下將亞硫酸氫鈉、乙二胺四乙酸二鈉溶解於超純水中，超純水與亞硫酸氫 鈉、乙二胺四乙酸二鈉的體積質量比為5?15mL :lg，30?50°C下攪拌10?30min，攪拌速 度為100?200rpm，攪拌過程中加入卡波姆，從而得到溶脹均勻的卡波姆溶脹液； (2) 取林蛙提取凍乾粉攪拌溶解於超純水中，超純水與林蛙提取凍乾粉的體積質量比 為5?10mL :lg，再加入丙二醇、聚氧乙烯氫化蓖麻油、氮酮、尼泊金攪拌，攪拌溫度30? 60°C，攬拌時間15?40min，攬拌速度為100?300rpm ; (3) 將步驟（2)的混合溶液加入到步驟（1)的卡波姆溶脹液中，20?50°C下攪拌10? 40min，攪拌速度為150?300rpm，攪拌過程中加入三乙醇胺； (4) 勻質4?7次，使上述反應產物粒徑在100 μ m以下，從而得到無色透明的用於治療 痤瘡的林蛙提取凝膠劑。
5. -種治療痤瘡的林蛙提取乳液，其特徵在於：按重量份計算，其原料為林蛙提取 凍乾粉3?8份，硬脂酸2?10份，十八醇2?10份，十六醇3?8份，白油2?6份， Twenn-601?3份，羊毛脂1?3份，橄欖油1?5份，甘油5?15份，三乙醇胺0. 1?2 份，茉莉香精〇. 1?2份，布羅波爾0. 01?1份，尼泊金丙酯0. 1?2份；且由如下步驟制 備得到： (1) 將硬脂酸，十八醇，十六醇，白油，Twenn-60,羊毛脂，橄欖油混合，20?50°C下攪拌 15?35min，攪拌速度為150_300rpm，形成油相； (2) 將林蛙提取凍乾粉與甘油，三乙醇胺，超純水充分混合，20?40°C下攪拌10? 25min，攪拌速度為300?500rpm，形成水相； (3) 將油相與水相在20?40°C下混合攪拌，攪拌時間5?20min，加入茉莉香精，布羅 波爾，尼泊金丙酯，再次攪拌，攪拌溫度20?40°C，攪拌時間10?30min，攪拌速度為200? 400rpm，經納米勻質機勻質3?8次，得到用於治療痤瘡的林蛙提取乳液。
6. -種治療痤瘡的林蛙提取面膜，其特徵在於：按重量份計算，其原料為林蛙提取凍 乾粉3?8份，甘油4?8份，1，3- 丁二醇2?10份，透明質酸0. 05?1份，熊果苷1?5 份，卡波樹脂〇. 1?1. 5份，泛醇0. 1?2份，維生素 C脂質體2?6份，三乙醇胺0. 1?2 份，聚乙二醇-60氫化蓖麻油0. 1?1份，尼泊金丙酯0. 1?2份，茉莉香精0. 1?1份；且 由如下步驟製備得到： (1) 將林蛙提取凍乾粉，甘油，1，3- 丁二醇，透明質酸，熊果苷，卡波樹脂，泛醇，維生素 C脂質體，三乙醇胺，聚乙二醇-60氫化蓖麻油，尼泊金丙酯，茉莉香精與超純水混合，攪拌， 攪拌溫度20?60°C，攪拌時間10?40min，攪拌速度為300?500rpm，110?120°C滅菌 10 ?20min ; (2) 將上述反應物冷卻後加入到放有無菌無紡布獨立包裝袋內，密封后得到用於治療 痤瘡的林蛙提取面膜。
7. -種治療痤瘡的林蛙提取凍乾粉口服劑，其特徵在於：按重量份計算，其原料為 20?65份林蛙幹按照權利要求1所述步驟得到的林蛙提取混合液，5?10份檸檬酸，甜菊 糖苷5?30份，5?25份安賽蜜，5?10份黃原膠，5?10份山梨酸鉀，1?5份醋酸鋅， 5?10份β -環糊精；且由如下步驟製備得到： (1) 減壓濃縮：將林蛙提取混合液在減壓條件下進行蒸餾，壓力為8Χ 103?3Χ 104帕， 溫度為50?85°C，濃縮比為1?5:1，得濃縮液； (2) 將研細的醋酸鋅緩慢加入濃縮液中，邊加邊攪拌；加完後用0. lmol/L的NaOH調節 pH為6. 2?6. 5,攪拌均勻後使其自然沉降，冷卻過夜； (3) 0. 45 μ m濾膜過濾，得澄清液體後，加入檸檬酸、甜菊糖苷、安賽蜜，50?65 °C、 100?200rpm下攪拌10?25min，過濾；然後向清液中加入黃原膠、山梨酸鉀、β -環糊精， 再經0. 22 μ m濾膜精濾； (4) 冷凍乾燥，即得到用於治療痤瘡的林蛙提取凍乾粉口服劑。
【文檔編號】A61K9/06GK104147050SQ201410360694
【公開日】2014年11月19日 申請日期:2014年7月25日 優先權日:2014年7月25日
【發明者】孟慶繁, 王迪, 付珧, 滕樂生, 劉豔, 逯家輝, 李喆, 張 傑, 劉瑜, 滕利榮, 孟威, 孟研 申請人:吉林大學