一種肺炎支原體mp檢測試劑盒的製作方法

2023-10-10 06:02:39

專利名稱：一種肺炎支原體mp檢測試劑盒的製作方法
技術領域：
本發明提供一種肺炎支原體MP檢測試劑盒，具體是一種基於螢光PCR的MP-DNA檢測試劑盒。
背景技術：
肺炎支原體(mycoplasma pneumoniae, MP)是介於細菌和病毒之間的一種超過濾性病原微生物，主要通過呼吸道飛沫以氣溶膠微粒的形式傳播。1962年首先從人類原發性非典型肺炎(primary atypical pneumonia, PAP)患者的痰液中分離和培養而來。20世紀90年代以來，隨著肺炎病原學的變遷，MP已成為小兒肺炎的重要病原體，MP感染不僅引起肺部病變，且能侵犯心、腦、肝、腎等其他器官，引起多種肺外表現。MP還是社區獲得性肺炎(CAP)的重要病原，尤其是5歲以上小兒，MP在非流行年佔CAP病原1(Γ20%。因MP生長緩慢、潛伏期及帶菌時間長，形成間歇期發病緩慢、長時期傳播的流行特點，流行可達數月至數年。近些年來，流感人群比例逐年增加，不僅侵犯青少年和兒童，嬰幼兒發病率也呈增多趨勢，且由於MP感染常無特異性臨床表現，容易與一般的病毒性感冒相混淆，因此能夠及時確診何種病因致病，做到早發現早治療，減少兒童急性肺炎病情惡化，故早期診斷極為重要。目前MP感染常用的實驗室診斷方法有血清學檢查及基於PCR技術的檢測方法等。血清學檢查是重要的診斷MP感染的方法，血清學檢測技術有補體結合試驗(CFA)、間接免疫螢光技術(IFA)、顆粒凝集法(PA)以及酶聯免疫吸附法(ELISA)等。檢測兒童MP感染最常用的血清學方法是酶聯免疫吸附法；酶聯免疫吸附法因其具有高度的特異性和敏感性而被廣泛應用，但仍存在無法排除的幹擾因素，其定性結果仍需結合臨床表現、病史及其他診斷結果才能最後判 定支原體感染。近年來，聚核酶鏈式反應(PCR)法漸漸顯現了其在檢測上的優勢，螢光PCR技術是基於傳統PCR技術並結合光譜技術而發展起來的一種更靈敏，更特異，更精確的核酸檢測技術。檢測結果準確，重複性高，能動態反應患者治療前、後病原體動態變化及與臨床的關係，且整個過程中避免了傳統PCR需後處理的問題，減少了汙染。定量PCR的出現，打破PCR只能定性的局面，其中螢光定量PCR以其高靈敏度、高特異性、低汙染率、實時監測等特點，可為臨床提供更加準確、客觀的檢測結果，並及時地了解病情及預後。運用PCR技術進行檢測主要涉及到兩個方面，核酸的提取和核酸的擴增檢測。目前國內臨床上主要採用直接煮沸法對痰液及咽拭子樣本中的肺炎支原體核酸進行提取，具體是先將樣本濃縮，再加裂解液，煮沸，高速離心，上清為模板；該方法核酸提取過程較複雜，樣本處理耗時長，且在處理樣本時經過煮沸裂解、高速離心富集DNA等多個步驟，樣本中的DNA存在損耗，尤其對高濃度的樣本裂解不充分、富集不完全，會造成DNA的大量丟失導致樣本定量偏低，同時由於採用了水浴或金屬浴的高溫加熱步驟，容易造成氣溶膠汙染；濃縮這一步，不同廠家的濃縮效果不一樣，有的可以看到沉澱，有的無法看到，看得到沉澱的是因為將核酸與蛋白都濃縮了，這樣會導致後面加入裂解液時很難充分混勻；無法看到沉澱則使操作者無法確定吸棄上清時會不會吹打到核酸。臨床上檢測MP-DNA的方法目前主要是基於實時螢光定量PCR的技術及其改進，實時螢光定量PCR技術是近年來發展迅速的一種核酸檢測技術，使用一種帶有螢光檢測裝置的PCR擴增儀，螢光檢測裝置能夠按照一定的程序周期性地發出特定波長的激發光，收集檢測螢光信號，通過檢測螢光信號的動態變化實時反映PCR的每個循環的擴增水平，試驗結束後可通過軟體自動分析獲得擴增曲線，根據擴增曲線與螢光閾值線的交點(即Ct值)以及擴增曲線的形狀，可以判斷陰陽性結果；如果同一反應中有已知濃度的定量參考品或標準品，則可以通過軟體自動分析獲得標準曲線，由此實現對未知樣本的定值(即定量檢測)。與傳統的PCR相對比，其在反應體系中增加了一條兩端分別標記螢光報告基團和淬滅基團的探針。探針結構完整時，螢光報告基團發出的螢光能量被淬滅基團吸收，呈現淬滅效應；如果擴增過程中有靶序列的存在，隨著目標片段的延伸，探針分子逐漸被Taq酶水解切斷，螢光報告基團與淬滅基團相互解離，阻斷了二者間螢光能量轉移效應，螢光報告基團發出的螢光信號被螢光檢測裝置收集。隨著擴增的進行，螢光信號隨著目的片段的擴增而呈現線性增強。試驗結束後，可以通過螢光PCR儀自帶的軟體自動分析數據，可以獲得陰陽性結果和樣本濃度的定值結果，因此，該技術在靶多核苷酸樣品的檢測和定量分析中，已逐漸取代傳統的PCR方法，得到十分廣泛的應用。目前國內外已有基於實時螢光定量PCR技術定量檢測MP-DNA的試劑盒應用於臨床檢測中，但這些試劑盒多半以煮沸法提取核酸，且其檢測靈敏度不高，約在50(Tl000copies/ml左右；另外,這些試劑盒大多缺乏完善的質控體系,還需要進一步完善和提高技術水平，使此類產品更加滿足臨床準確診斷的需要。

發明內容
本發明提供一種核 酸釋放劑在肺炎支原體MP檢測中的應用，所述核酸釋放劑包含莎梵婷(surfactin)O. θΓθ. 5mM/L，氯化鉀2(T300mM/L，十二烷基磺酸鈉O. 01 2%和乙醇
O.05 1%。在本發明所述核酸釋放劑中，其溶劑可以為本領域常用的，例如為無菌水或TE緩衝液。本發明首次披露在肺炎支原體MP檢測中使用含強蛋白變性劑的核酸釋放劑，在很大程度上簡化了該核酸檢測的步驟，而且檢測靈敏度有了很大的提高。本發明提供一種肺炎支原體MP檢測試劑盒，所述試劑盒中包括核酸釋放劑和PCR反應液，所述核酸釋放劑包含莎梵婷(surfactin) O. θΓθ. 5mM/L，氯化鉀2(T300mM/L，十二烷基磺酸鈉0. 0Γ2%和乙醇0. 05^1% ;所述PCR反應液中包含用於靶多核苷酸擴增的上遊引物、下遊弓I物和用於靶多核苷酸檢測的探針。使用本發明試劑盒中的核酸釋放劑釋放核酸的方法與煮沸法提取核酸的檢測結果沒有明顯差異，而本發明中提取核酸時採用強烈的蛋白變性劑，快速破壞病原體外殼蛋白結構，釋放出病原體核酸，無需加熱即可完成DNA的釋放和提取；本發明試劑盒檢測MP的靈敏度可達400copies/ml,定量線性範圍為400 4. 00E+09copies/ml。具體的，用於靶多核苷酸的上遊引物序列為5 』 -CCCACTCGCTGAACTGTTAGAT-3 』 ；下遊引物序列為5』 -GGGTAAACAAGCGGTTGAAGT-3』 ；用於靶多核苷酸的探針序列為5』 -CTGACACTGGTCCACAAAGCGTGAA-3』。本發明的試劑盒因採用用於檢測靶多核苷酸的上述引物和/或探針序列，具有很好的特異性。在本發明中，優選的是，所述試劑盒中還包括用於將未知樣本濃縮的MP濃縮液，所述MP濃縮液包括l(Tl00mM/L的聚乙二醇6000和5(T500mM/L的氯化鈉溶液。在血清樣本加入MP濃縮液進行濃縮後，能更好地進行隨後的MP-DNA核酸釋放和檢測。本發明中，優選所述試劑盒中還包括內標，所述內標的序列為5』 -CCTCTAGCGCTGCGAATAGAACTTCCTCTGTTCAAGCCTTCCCTTTATACGCTCAAGCTGGTTCTTCTTCAAGGTTCAAGCAATAGAAACGGAGATCTAC-3 』。本發明中所述內標為插入pUC18T載體的一段長為100鹼基對的人工合成DNA序列的重組體，即質粒，它作為PCR擴增體系中的陽性內對照，預防由於樣本中可能存在的PCR幹擾物質導致的假陰性。在所述試劑盒中包含內標的情況下，所述PCR反應液中還包括用於內標檢測的上遊引物、下遊引物和探針；內標上遊引物序列為5 』 -CCTCTAGCGCTGCGAATAGAA-3 』，內標下遊引物序列為5』-GTAGATCTCCGTTTCTATTGCTTGA-3』，內標探針序列為 5 』-TCAAGCCTTCCCTTTATACGCTCAAGC-3，。優選本發明所述試劑盒中還包括酶混合液，所述酶混合液中包含耐熱DNA聚合酶(Taq酶)和O. 5^2U/ μ I的尿嘧啶DNA糖基化酶(UNG酶)，同時在所述PCR反應液中還包含dUTP。其中UNG酶的功能是降解含有dU的PCR產物，利用UNG酶和PCR反應液中的dUTP可以起到預防PCR產物汙染的作用，從而防止樣本檢測假陽性。在一個具體實施方式
中，所述試劑盒中還包括MP定量參考品、MP陽性對照和MP陰性對照。本發明還提供一種MP檢測試劑盒，所述試劑盒中包括PCR反應液，所述PCR反應液中包含用於靶多核苷酸擴增的上遊引物、下遊引物和用於靶多核苷酸檢測的探針，且用於靶多核苷酸的上遊引物序列為5』 -CCCACTCGCTGAACTGTTAGAT-3』;用於靶多核苷酸的下遊引物序列為 5』 -GGGTAAACAAG CGGTTGAAGT-3』。本發明又提供一種MP檢測試劑盒，所述試劑盒中包括PCR反應液，所述PCR反應液中包含用於靶多核苷酸擴增的上遊引物、下遊引物和用於靶多核苷酸檢測的探針，且用於靶多核苷酸的探針序列為5』 -CTGACACTGGTCCACAAAGCGTGAA-3』。本發明還具體提供一種MP檢測試劑盒，所述試劑盒中包括MP濃縮液、核酸釋放劑、PCR反應液、內標、酶混合液、MP定量參考品、MP陽性對照和MP陰性對照；且所述核酸釋放劑中包含莎梵婷(surfactin) O. θΓθ. 5mM/L,氯化鉀2(T300mM/L，十二烷基磺酸鈉O. 0Γ2%,乙醇O. 05^1%和溶劑TE緩衝液；所述PCR反應液中包含用於靶多核苷酸擴增和檢測的上遊引物、下遊引物和探針，用於內標擴增和檢測的上遊引物、下遊引物和探針，10XPCR反應緩衝液，脫氧核糖核苷三磷酸和/或核糖核苷三磷酸dNTP ;所述內標為插入PUC18T載體的一段長為100鹼基對的人工合成DNA序列的重組體；所述酶混合液中包含DNA聚合酶和尿嘧啶DNA糖基化酶。本發明提供的MP螢光定量PCR檢測試劑盒操作快速、方法簡便、檢測靈敏度高、檢測範圍寬，應用該試劑盒可以對痰液、咽拭子等未知樣本中的MP-DNA進行快速準確的檢測，為診斷肺炎支原體感染提供可靠的實驗依據。


圖1中①為實施例中MP-DNA檢測結果為陽性的待測樣本的擴增曲線，圖1中②為實施例中MP-DNA檢測結果為陰性的待測樣本的擴增曲線。
具體實施例方式以下僅為本發明的優選實施方式，本發明的保護範圍並不局限於此，任何本領域的技術人員在本發明公開的技術範圍內，可很容易進行的改變或變化都涵蓋在本發明的保護範圍之內。因此，本發明的保護範圍應以權利要求書的保護範圍為準。實施例1本實施例提供一種具體的肺炎支原體檢測試劑盒，它包括如下組分①MP濃縮液包含50mM/L的聚乙二醇6000 (PEG-6000)和100mM/L的氯化鈉。②核酸釋放劑包含莎梵婦(surfactin) O.1mM/L,氯化鉀100mM/L,十二燒基磺酸鈉(SDS) O. 1%, O. 1%的乙醇和溶劑TE緩衝液。③內標(陽性內對照)為插入PUC18T載體的一段長為100鹼基對的人工合成DNA序列的重組體，即質粒，濃度為2. 00E+04copies/ml, 100鹼基對的序列為5』 -CCTCTAGCGCTGCGAATAGAACTTCCTCTGTTCAAGCCTTCCCTTTATACGCTCAAGCTGGTTCTTCTTCAAGGTTCAAGCAATAGAAACGGAGATCTAC-3』。④PCR反應液包括10XPCR反應緩衝液5 μ 1，0. 2mmol/L的dNTP，用於靶多核苷酸擴增的上、下遊引物均為0.3μπιΟ1/1，用於靶多核苷酸檢測的探針為0.3μπιΟ1/1，用於內標片段擴增的上下遊引物均為0.3 μ mol/L，用於檢測內標的探針為O.1 μ mol/L。其中，所述10XPCR反應緩衝液為包括pH7. 5的200mmol/L三羥甲基氨基甲烷鹽酸鹽溶液、30mmol/L氯化鎂溶液、500mmol/L氯化鉀 溶液、0. 2%的曲拉通溶液和10%的甲醯胺溶液；所述dNTP包括dATP、dCTP、dUTP和dGTP ;所述用於靶多核苷酸擴增的上下遊引物及用於靶多核苷酸檢測的探針是源於肺炎支原體核酸的保守區域的引物和探針，其鹼基對序列分別為上遊引物5』 -CCCACTCGCTGAACTGTTAGAT-3』，下遊引物5』 -GGGTAAACAAGCGGTTGAAGT-3』，探針5』 -CTGACACTGGTCCACAAAGCGTGAA-3』 ；所述的用於檢測內標的引物探針序列分別為，上遊引物5』 -CCTCTAGCGCTGCGAATAGAA-3』，下遊引物5』 -GTAGATCTCCGTTTCTATTGCTTGA-3』，探針5』 -TCAAGCCTTCCCTTTATACGCTCAAGC-3』。⑤酶混合液包含5U/ μ I的耐熱DNA聚合酶(Taq酶)和IU/ μ I的尿嘧啶DNA糖基化酶(UNG酶)。⑥MP定量參考品來源於使用MP企業定量線性參考品LfL5定值後的MP強陽性質粒，該MP定量參考品包括A、B、C、D四個濃度組成的梯度參考品，其濃度分別為 4. 00E+07copies/ml (Α)、4· 00Ε+06copies/ml (Β)、4·00E+05copies/ml (C)、4.00E+04copies/ml (D)0⑦MP陽性對照為臨床醫院收集的已滅活的MP強陽性咽拭子樣本，經濃縮離心後，加入滅菌生理鹽水溶解沉澱，並經合格的MP試劑盒檢測並定值後，用滅菌生理鹽水稀釋至濃度為 4. 00E+05copies/ml。⑧MP陰性對照臨床醫院收集的已滅活的MP陰性咽拭子樣本，用滅菌生理鹽水稀釋100倍後，經合格的MP試劑盒檢測為陰性。實施例2
本實施例提供上述實施例1所述試劑盒用於檢測痰液及咽拭子等未知樣本中MP-DNA的操作步驟一、試劑準備根據待測樣本、MP陰性對照、MP陽性對照以及MP定量參考品A D的數量，按比例取相應量的PCR反應液(38μ I/人份)、酶混合液(2μ I/人份)及內標O. 4μ I/人份，充分混勻成PCR-mix，例如待測樣本為3人份時，一共需配製9人份(上述四者的人份數分別為3、1、I和4)的PCR-mix ;瞬時離心後備用。二、核酸提取1.痰液用槍頭挑取適量痰液置於1. 5ml滅菌離心管中，加入Iml生理鹽水，充分震蕩混勻後靜置一個小時使痰液液化，液化後的痰液樣本混勻後吸取100 μ I至1. 5ml離心管中，加入MP濃縮液100 μ 1，12，OOOrpm離心5min，棄上清(建議有20 μ I殘留)，沉澱中力口入50μ I核酸釋放劑，震蕩或移液槍吸打混勻，作為待測樣本備用。2.咽拭子往樣本收集管中加入Iml無菌生理鹽水，充分振蕩混勻，然後把全部液體(樣本洗脫液)倒入1. 5ml滅菌離心管中(棉拭子靠離心管壁擠幹後丟棄)，混勻後吸取100 μ I至另一1. 5ml離心管中加入MP濃縮液100 μ 1,12, OOOrpm離心5min,棄上清(建議有20μ I殘留)，沉澱中加入50μ I核酸釋放劑，震蕩或移液槍吸打混勻，作為待測樣本備用。
3. MP陰性對照、MP陽性對照、MP定量參考品ΜΡ陰性對照、MP陽性對照、MP定量參考品Al分別取10 μ I與10 μ I核酸釋放劑混勻待用。三、向PCR反應管中加樣每個PCR反應管中加入上述第二步驟中處理後的待測樣本、MP陰性對照、MP陽性對照以及MP定量參考品A D各10 μ I ;靜置10分鐘後，每管加入步驟一中的PCR-miX40l·! 1，吸打混勻2-3次，去除氣 泡後蓋上管蓋，2000rpm離心30秒。四、螢光PCR反應與結果分析(在螢光定量PCR擴增儀上進行)I)將PCR反應管放入擴增儀樣品槽，按對應順序設置待測樣本名稱及定量參考品濃度。2)突光檢測通道選擇選擇FAM通道(Reporter: FAM, Quencher: None )檢測MP ;選擇 HEX 或 VIC 通道(Reporter: VIC, Quencher:None)檢測內標；參比突光(PassiveReference)設置為 none。3)螢光定量PCR反應條件見表1:表I
權利要求
1.一種核酸釋放劑在肺炎支原體MP檢測中的應用，所述核酸釋放劑包含莎梵婷(surfactin)O. θΓθ. 5mM/L，氯化鉀 2(T300mM/L，十二烷基磺酸鈉 O. 01 2%和乙醇 O. 05 1%。
2.一種肺炎支原體MP檢測試劑盒，所述試劑盒中包括核酸釋放劑和PCR反應液，所述核酸釋放劑包含莎梵婷(surfactin) O. θΓθ. 5mM/L,氯化鉀2(T300mM/L，十二烷基磺酸鈉0.Of 2%和乙醇0. 05^1% ;所述PCR反應液中包含用於靶多核苷酸擴增的上遊引物、下遊引物和用於靶多核苷酸檢測的探針。
3.根據權利要求2所述的檢測試劑盒，其特徵在於，用於靶多核苷酸的上遊引物序列為5 』 -CCCACTCGCTGAACTGTTAGAT-3 』；用於靶多核苷酸的下遊引物序列為5， -GGGTAAACAAGCGGTTGAAGT-3，。
4.根據權利要求2所述的檢測試劑盒，其特徵在於，用於靶多核苷酸的探針序列為5』-CTGACACTGGTCCACAAAGCGTGAA-3』。
5.根據權利要求2 4中任意一項所述的檢測試劑盒，其特徵在於，所述試劑盒中還包括用於將未知樣本濃縮的MP濃縮液，所述MP濃縮液包括l(Tl00mM/L的聚乙二醇6000和5(T500mM/L的氯化鈉溶液。
6.根據權利要求2 4中任意一項所述的檢測試劑盒，其特徵在於，所述試劑盒中還包括內標，所述內標的序列為 5 』 -CCTCTAGCGCTGCGAATAGAACTTCCTCTGTTCAAGCCTTCCCTTTATACGCTCAAGCTGGTTCTTCTTCAAGGTTCAAGCAATAGAAACGGAGATCTAC-3，。
7.根據權利要求6所述的檢測試劑盒，其特徵在於，所述PCR反應液中還包括用於內標檢測的上遊引物、下遊引物和探針；內標上遊引物序列為5』 -CCTCTAGCGCTGCGAATAGAA-3』，內標下遊引物序列為5』 -GTAGATCTCCGTTTCTATTGCTTGA-3』，內標探針序列為5』 -TCAAGCCTTCCCTTTATACGCTCAAGC-3』。
8.根據權利要求2 4中任意一項所述的檢測試劑盒，其特徵在於，所述試劑盒中還包括酶混合液，所述酶混合液中包含耐熱DNA聚合酶(Taq酶)和0. 5^2U/ μ I的尿嘧啶DNA糖基化酶(UNG酶)，同時在所述PCR反應液中還包含dUTP。
9.一種MP檢測試劑盒，所述試劑盒中包括PCR反應液，所述PCR反應液中包含用於靶多核苷酸擴增的上遊引物、下遊引物和用於靶多核苷酸檢測的探針，且用於靶多核苷酸的上遊引物序列為5』 -CCCACTCGCTGAACTGTTAGAT-3』 ；用於靶多核苷酸的下遊引物序列為5， -GGGTAAACAAGCGGTTGAAGT-3，。
10.一種MP檢測試劑盒，所述試劑盒中包括PCR反應液，所述PCR反應液中包含用於靶多核苷酸擴增的上遊引物、下遊引物和用於靶多核苷酸檢測的探針，且用於靶多核苷酸的探針序列為 5』 -CTGACACTGGTCCACAAAGCGTGAA-3』。
全文摘要
本發明提供一種肺炎支原體MP檢測試劑盒，所述試劑盒中包括核酸釋放劑和PCR反應液，所述核酸釋放劑包含莎梵婷(surfactin)0.01~0.5mM/L，氯化鉀20~300mM/L，十二烷基磺酸鈉0.01~2%和乙醇0.05~1%；所述PCR反應液中包含用於靶多核苷酸擴增的上遊引物、下遊引物和用於靶多核苷酸檢測的探針。使用本發明核酸釋放方法與煮沸法提取核酸的檢測結果無明顯差異，而本發明中提取核酸時採用強烈的蛋白變性劑，快速破壞病原體外殼蛋白結構，釋放出病原體核酸，無需加熱即可完成DNA的釋放和提取；本發明試劑盒檢測MP的靈敏度可達400copies/ml，定量線性範圍為400~4.00E+09copies/ml；應用該試劑盒可以對痰液、咽拭子等未知樣本中的MP-DNA進行快速準確的檢測，為診斷肺炎支原體感染提供可靠的實驗依據。
文檔編號G01N21/64GK103060451SQ20131000901
公開日2013年4月24日 申請日期2013年1月10日 優先權日2013年1月10日
發明者戴立忠, 鄧中平, 艾穎娟 申請人:湖南聖湘生物科技有限公司