氯毒素變體、綴合物及其使用方法

2023-10-18 11:41:04 2

專利名稱：氯毒素變體、綴合物及其使用方法
技術領域：
本發明一般性涉及氯毒素，更具體地說，本發明涉及氯毒素變體、氯毒素變體綴合物、包含氯毒素變體或綴合物的組合物，以及使用氯毒素變體、綴合物和組合物的方法。
背景技術：
神經外科醫師長期尋找闡明腦癌細胞以鑑定癌症病灶並且在腫瘤切除操作過程中實時將癌症與正常組織區分的方法。由氯毒素(CTX)即從Leiurus quinquestriatus全蠍中發現的肽組成的生物綴合物和近紅外螢光(NIRF)分子例如Cy5.5，(〃腫瘤塗料〃)以高靈敏度清楚地鑑定了腫瘤病灶(M.Veiseh等人，"Tumor PaintiAChlorotoxin:Cy5.5Bioconjugate for Intra-Operative Visualization of CancerFoci, "Cancer Research 67 (14): 6882-88，2007)。最初選擇 CTX 用於這些研究，因為與正常腦組織相比它優先結合神經膠質瘤細胞(L.Soroceanu等人，"Use of Chlorotoxin forTargeting of Primary Brain Tumors, "Cancer Research 58:4871-4879, 1998)。因為 CTX靶標顯示出為多種其他癌症類型共有，所以CTX:Cy5.5有效地指示出了前列腺、結腸、肉瘤、髓母細胞瘤和其他類型的實體瘤(M.Veiseh 2007)。CTX是36個胺基酸的肽，它具有4個二硫鍵，這些二硫鍵賦予多肽高度三維結構。CTX在15、23和27位具有3個賴氨酸殘基，它們用於綴合NHS-酯修飾的Cy5.5和其他螢光分子。得到的生物綴合物是典型地75-85%在27位單-標記的肽和少量與Lys 15和Lys 23綴合的二-和三-標記的肽的混合物。儘管能夠具有Food and DrugAdministration (FDA)和另外類似管理部門批准的混合物，但是商業化可能受到阻礙，因為它昂貴且在未來難以匹配單_、二-和三-標記批量的比例。對具有氯毒素優良特性並且具有用於綴合診斷劑或治療劑的單一賴氨酸殘基以提供單一均勻的新分子本體 的多肽存在需求。本發明尋求滿足這一需求並且還提供相關的優勢。

發明內容
本發明提供了氯毒素變體、由氯毒素變體構成的綴合物、包含氯毒素變體或綴合物的組合物，以及使用氯毒素變體、綴合物和組合物的方法。在一個方面中，本發明提供了具有單一賴氨酸殘基(Lys 27)的修飾的氯毒素肽。在一個實施方案中，修飾的氯毒素肽具有被非賴氨酸的胺基酸取代的Lys 15和Lys 23的天然氯毒素。在一個實施方案中，修飾的氯毒素肽具有SEQ ID N0:2中給出的胺基酸序列。在一個實施方案中，修飾的氯毒素肽具有SEQ ID N0:3中給出的胺基酸序列。在一個實施方案中，修飾的氯毒素肽具有SEQ ID N0:4中給出的胺基酸序列。在一個實施方案中，修飾的氯毒素肽具有SEQ ID N0:5中給出的胺基酸序列。在一個實施方案中，修飾的氯毒素肽具有SEQID NO:6中給出的胺基酸序列。還提供了包含本發明修飾的氯毒素肽的組合物。在一個實施方案中，該組合物包含藥學可接受的載體。在另一個方面中，本發明提供了可通過給予氯毒素治療的疾病或病症的治療方法，包括對有此需要的受試者給予有效量的本發明修飾的氯毒素肽。 在本發明的另一個方面中，提供了包含本發明修飾的氯毒素肽的氯毒素綴合物。在一個實施方案中，所述氯毒素綴合物包含與一種或多種治療劑、診斷劑、成像劑或靶向劑或增加修飾的氯毒素肽的循環半衰期的基團共價偶合的修飾的氯毒素肽。在一個實施方案中，所述治療劑、診斷劑、成像劑或靶向劑或增加修飾的氯毒素肽的循環半衰期的基團通過賴氨酸殘基與修飾的氯毒素共價偶合。適合的診斷劑或成像劑包括螢光標記(例如量子點或聚合物點)、放射性標記和磁共振成像標記(例如硼納米顆粒、硼和碳納米顆粒、碳化硼納米顆粒、含硼聚合物、含硼和碳的聚合物、碳化硼聚合物和還包含釓的任意的這些納米顆粒或聚合物)。適合的靶向劑包括抗體、多肽、多糖和核酸。適合的治療劑包括化療劑(例如甲氨蝶呤、多西他賽、順鉬和依託泊苷)和生物治療劑(例如cDNA、siRNA、shRNA，和RNAi)。適合的增加修飾的氯毒素肽的循環半衰期的基團包括聚乙二醇基團、糖基基團和糖基聚乙二醇基團。在其他方面中， 提供了使用氯毒素綴合物的方法。在一個實施方案中，本發明提供了使可通過氯毒素成像的組織成像的方法，包括使可通過氯毒素成像的組織接觸本發明的氯毒素綴合物，以使可通過氯毒素成像的組織成像。在一個實施方案中，本發明提供了檢測可通過氯毒素檢測的癌症的方法，包括使可通過修飾的氯毒素成像的組織接觸本發明的修飾的氯毒素綴合物，以檢測可通過氯毒素檢測的癌症。在一個實施方案中，本發明提供了檢測和摘除可通過氯毒素檢測的癌症的方法，包括使組織接觸本發明的修飾的氯毒素綴合物，以檢測癌組織，並且摘除通過修飾的氯毒素綴合物檢測的癌組織。在一個實施方案中，本發明提供了治療修飾的氯毒素綴合物靶向的癌症的方法，包括使結合修飾的氯毒素的組織接觸本發明的修飾的氯毒素綴合物以治療癌症。


本發明的上述方面和許多附加優點易於理解，在參照如下詳細描述並且結合附圖考慮時其會得到更好的理解。圖1比較了天然氯毒素(線性CTX)與本發明有代表性的修飾的氯毒素肽(K15A_K23A CTX;K15R_K23R CTX)的序列。天然和具有4個二硫鍵的取代的CTX如黃線所示。圖2是本發明有代表性的修飾的氯毒素肽和天然氯毒素的二級α H化學位移的比較。通過從實驗α H位移中扣除隨機螺旋位移計算二級α H位移(D.S.Wishart等人，1H, 13C和 15N Chemical ShiftReferencing in Biomolecular NMR, "Journal of BiomolecularNMR 6，135-140, 1995)。天然 CTX(深藍色)、線性 CTX(藍色)、K15A_K23ACTX(紅色)和K15R_K23R CTX(橙色)的棒形圖。兩個鏈如藍色箭頭所示，α -螺旋如紅色所示。取代的殘基和殘基D18如綠色星號所示。圖3Α和3Β示例本發明有代表性的修飾的CTX:Cy5.5生物綴合物的功能圖像(圖 3A, K15A_K23A CTX:Cy5.5 ;和圖 3B, K15R_K23RCTX: Cy5.5)。通過尾靜脈給具有 WT 或ND2: SmoAl腫瘤的小鼠注射50 μ I 40 μ M修飾的生物綴合物。在注射後3天使用Xenogen光譜取生物光子圖像。然後將腦冷凍在OCT中，切成12 μ m切片，用Η&Ε染色以確定腫瘤負荷。發明詳述本發明提供了氯毒素變體、由氯毒素變體構成的綴合物、包含氯毒素變體或綴合物的組合物、以及使用氯毒素變體、綴合物和組合物的方法。在一個方面中，本發明提供了氯毒素變體。本文所用的術語"氯毒素變體"與術語"修飾的氯毒素肽"可互換使用且指具有至少一些有用的天然氯毒素活性的非天然多肽。氯毒素是天然存在的包含36個胺基酸並且具有SEQ ID NO:1中給出的胺基酸序列的多肽。術語"修飾的氯毒素肽"是指具有胺基酸序列的多肽，其中天然氯毒素的一個或多個胺基酸殘基被在該位置上非天然氯毒素的胺基酸殘基取代(即替代)。例如，天然氯毒素的殘基15和23是賴氨酸殘基；在本發明的一些實施方案中，提供了在15和23位上具有丙氨酸或精氨酸殘基的修飾的氯毒素肽。在一個實施方案中，本發明提供了具有單一賴氨酸殘基(Lys 27)的修飾的氯毒素肽。在該實施方案中，修飾的氯毒素肽具有被非賴氨酸的胺基酸取代的Lys 15和Lys 23天然胺基酸，得到了具有單一賴氨酸殘基(Lys 27)的修飾的氯毒素。在該實施方案中，修飾的氯毒素肽具有SEQ ID NO:2中給出的胺基酸序列，其中Lys 15和Lys 23被獨立地選自天然存在和非天然胺基酸、胺基酸類似物和胺基酸模擬物的胺基酸取代。天然存在的胺基酸是通常在天然存在的蛋白質中發現的20種L-胺基酸(Ala或A、Cys 或 C、Asp 或 D, Glu 或 E、Phe 或 F，Gly 或 G、His 或 H、Ile 或 1、Lys 或 K、Leu 或 L、Met或 M、Asn 或 N、Pro 或 P、Gln 或 Q、Arg 或 R、Ser 或 S、Thr 或 T, Val 或 V、Trp 或 W、Tyr 或Y)。非天然胺基酸包括D-胺基酸。胺基酸類似物和胺基酸模擬物以與天然存在的胺基酸類似的方式起作用。胺基酸類似物是指具有與天然存在的胺基酸相同的基本化學結構的化合物，僅作為實例，α-碳與氫、羧基、氨基和R基團鍵合。這種類似物可以具有修飾的R基團(作為實例正亮氨酸)或可以具有修飾的肽骨架，而仍然保留與天然存在的胺基酸相同的基本化學結構。胺基酸類似物的非限制性實例包括高絲氨酸、正亮氨酸、甲硫氨酸亞碸、甲硫氨酸甲基鋶。在一個實施方案中，Lys 15和/或Lys 23獨立地被鹼性胺基酸(即His、Arg)、非天然胺基酸、胺基酸類似物或胺基酸模擬物替代。在一個實施方案中，Lys 15和/或Lys 23獨立地被非極性(疏水性)胺基酸(即Ala、Phe、lie、Leu、Met、Pro、Val、Trp)、相關的非天然胺基酸、胺基酸類似物或胺基酸模擬物替代。在一個實施方案中，Lys 15和/或Lys 23獨立地被極性(不帶電荷的)胺基酸(即Cys、Gly、Asn、Gln、Ser、Thr、Ty;r)、非天然胺基酸、胺基酸類似物或胺基酸模擬物替代。
在一個實施方案中，Lys 15和/或Lys 23獨立地被酸性胺基酸(即Glu、Asp)、非天然胺基酸、胺基酸類似物或胺基酸模擬物替代。在一個實施方案中，修飾的氯毒素肽具有被丙氨酸取代的Lys 15和Lys23(K15A_K23A CTX)。在該實施方案中，修飾的氯毒素肽具有SEQ ID N0:3中給出的胺基酸序列。在一個實施方案中，修飾的氯毒素肽具有被精氨酸取代的Lys 15和Lys23(K15R_K23R CTX)。在該實施方案中，修飾的氯毒素肽具有SEQ ID N0:4中給出的胺基酸序列。在一個實施方案中，修飾的氯毒素肽具有被丙氨酸取代的Lys 15和被精氨酸取代的Lys 23(K15A_K23R CTX)。在該實施方案中，修飾的氯毒素肽具有SEQ ID N0:5中給出的胺基酸序列。在另一個實施方案中，修飾的氯毒素肽具有被精氨酸取代的Lysl5和被丙氨酸取代的Lys 23(K15R_K23A CTX)。在該實施方案中，修飾的氯毒素肽具有SEQ ID N0:6中給出的胺基酸序列。在本發明的另一個方面中，提供了包含修飾的氯毒素肽的組合物。該組合物可以包含用於遞送修飾的氯毒素肽的藥學可接受的載體或稀釋劑。適合的藥學可接受的載體或稀釋劑包括注射用鹽水或葡萄糖。治療方法.在另一個方面中，本發明提供了治療可通過給予氯毒素治療的疾病或病症的方法。在一個實施方案中，該方法包括對有此需要的受試者給予有效量的本發明修飾的氯毒素肽。本文所用的術語〃有效量〃是指將所治療的疾病或病症的一種或多種症狀緩解至一定程度所給予的活性劑或 化合物的足量。結果可以是疾病徵兆、症狀或原因減少和/或緩解，或生物系統的任意其他期望的改變。可以給予包含這種活性劑或化合物的組合物用於預防、增強和/或治療。可以使用例如劑量遞增研究這樣的技術測定任何個體情況中的適合的〃有效〃量。在一個實施方案中，本發明提供了治療患者中表達氯毒素結合位點的癌症的方法，包括對有此需要的患者給予有效量的本發明氯毒素變體。在一個實施方案中，本發明提供了治療表達氯毒素結合位點的癌症的方法，包括對有此需要的患者給予有效量的藥物組合物，該藥物組合物包含本發明的氯毒素變體和藥學可接受的載體。在一個實施方案中，本發明提供了治療表達氯毒素結合位點的腫瘤的方法，包括對有此需要的患者給予有效量的本發明的氯毒素變體。在一個實施方案中，本發明提供了用於抑制表達氯毒素結合位點的細胞侵害活性的方法，包括將有效量的氯毒素變體施用於表達氯毒素結合位點的細胞。本發明的治療方法可施用於有這種治療需要的人和動物受試者。實際上可以用本發明的氯毒素變體和綴合物治療表達氯毒素結合位點的每種類型的惡性癌症。這些惡性癌症可以包括神經膠質瘤、星形細胞瘤、髓母細胞瘤、脈絡叢癌、室管膜瘤、腦膜瘤、膠質母細胞瘤、神經節瘤、嗜鉻細胞瘤和轉移腦瘤、其他腦瘤、神經母細胞瘤、頭頸癌、小細胞肺癌、乳腺癌、腸癌、胰腺癌、結腸癌、肝癌、腎癌、皮膚癌、肉瘤(30個類型以上)、骨肉瘤、橫紋肌肉瘤、尤因肉瘤、癌、黑素瘤、卵巢癌、宮頸癌、淋巴瘤、甲狀腺癌、直腸癌症、結直腸癌、子宮內膜癌症、生殖細胞腫瘤、喉癌、多發性骨髓瘤、前列腺癌、視網膜母細胞瘤、胃癌、睪丸癌和維爾姆斯瘤。氯毒素綴合物.在另一個方面中，本發明提供了本發明修飾的氯毒素肽的綴合物。在一個實施方案中，該綴合物包含本發明修飾的氯毒素肽，其與增加修飾的氯毒素肽的循環半衰期的基團共價偶合。在另一個實施方案中，該綴合物包含與治療劑、診斷劑、成像劑或靶向劑共價偶合的本發明修飾的氯毒素肽。在一些實施方案中，所述治療劑、診斷劑、成像劑或靶向劑或增加修飾的氯毒素肽的循環半衰期的基團通過肽的賴氨酸殘基共價偶合。增加修飾的氯毒素肽的循環半衰期的適合的基團包括本領域公知用於增加多肽的循環半衰期的那些基團(例如聚乙二醇化、糖基化、聚乙二醇糖基化)。用於聚乙二醇化的有代表性的基團包括聚亞烷基氧化物(聚環氧化物，polyalkylene oxides)(聚氧化乙烯、聚氧化丙烯以及聚氧化乙烯和聚氧化丙烯的共聚物)。用於糖基化的有代表性的基團包括寡糖類(例如碳水化合物，包括多唾液酸)。在一個實施方案中，所述綴合物是聚乙二醇化氯毒素且包含與一種或多種聚亞烷基氧化物(例如聚氧化乙烯)共價偶合的修飾的氯毒素肽。在一個實施方案中，所述綴合物是糖基化氯毒素且包含與一種或多種寡糖類共價偶合的修飾的氯毒素肽。在一個實施方案中，所述綴合物是聚乙二醇糖基化(glycopegylated)氯毒素且包含與一種或多種糖基化聚亞烷基氧化物(例如糖環氧乙烷)共價偶合的修飾的氯毒素肽。適合的治療劑包括細胞毒性劑。有代表性的治療劑包括化療劑，例如甲氨蝶呤、多西他賽、順鉬和依託泊苷等；生物治療劑，例如核酸分子(例如DNA，例如cDNA JPRNA，例如siRNA, shRNA, RNAi)，包括轉錄和遷移抑制劑和信號轉導調節劑。適合的診斷劑包括提供通過螢光法和非螢光成像的方法檢測的試劑。其他適合的診斷劑包括放射性標記(例如放射性同位素標記的化合物)，例如125I、14C和31P等和磁共振成像劑。適合的靶向劑包括抗體、多肽、多糖和核酸。在本發明的另一個方面中，提供了包含修飾的氯毒素肽綴合物的組合物。該組合物可以包括用於遞送修飾的氯毒素肽綴合物的藥學可接受的載體或稀釋劑。適合的藥學可接受的載體或稀釋劑包括注射用鹽水或葡萄糖。成像方法.在本發明的另一個方面中，提供了使用修飾的氯毒素肽綴合物的方法。在一個實施方案中，本發明提供了使可用氯毒素成像的組織成像的方法。在該方法中，使可用氯毒素成像的組織接觸氯毒素綴合物。在一個實施方案中，成像方法是螢光成像法。用於製備和使用螢光氯毒素綴合物的有代表性的方法描述在美國專利申請公開號US20080279780A1中，發明名稱為螢光氯毒素綴合物和用於癌症手術中顯影的方法，特別將該文獻完整地引入本文參考。本發明提供了可通過螢光成像檢測的氯毒素綴合物，它能夠使癌組織手術中顯影；包含氯毒素綴合物的組合物；和使用氯毒素綴合物的方法。在一個方面中，本發明提供了可通過螢光成像檢測的氯毒素綴合物，它能夠使癌組織手術中顯影。
氯毒素是使所述綴合物定向於所關注的組織的靶向劑。在一個實施方案中，本發明的氯毒素綴合物包括與氯毒素共價偶合的一種或多種螢光基團(例如紅外或近紅外發射螢光基團)。本文所用的術語〃紅外或近紅外發射螢光基團〃是指具有大於約600nm的螢光發射最大值的螢光基團。具有較短波長(例如約500 —約600nm)發射螢光基團的螢光氯毒素綴合物用於組織化學成像。這些綴合物可能會較少用於人和動物體內成像，其中優選較長波長(例如大於約600nm)發射螢光基團。在氯毒素綴合物的一些實施方案中，螢光基團衍生自特徵在於發射波長最大值大於約600nm以避免自體突光的突光化合物，自體突光是通過幾毫米一 I釐米組織/血液/流體傳播的發射、不被人或動物組織中的血紅蛋白、其他血液成分或蛋白質吸收的發射。所述螢光基團與氯毒素共價偶合，從而能夠通過螢光成像使所述綴合物顯影。所述螢光基團衍生自螢光·化合物。適合的螢光化合物是那些可以與氯毒素共價偶合、而基本上對氯毒素綴合物的靶向和結合功能沒有不良影響的化合物。類似地，適合的螢光化合物在與氯毒素綴合後保留其螢光特性。在一個實施方案中，所述的螢光基團是酞菁基團。酞菁化合物的特徵在於其相對高的消光係數和有利的螢光量子產量。酞菁化合物的螢光發射波長最大值作為酞菁結構的函數改變。根據具體酞菁化合物的不同，螢光發射波長最大值可以從綠色(約490nm)改變至近紅(約740nm)。在本發明方法的實施過程中，優選具有遠紅外(約650nm)至近紅外(約750nm)的螢光發射最大值的酞菁化合物。在這些發射波長下，來自局部環境的背景螢光是最小的且所關注的組織相對透明。由於在這些波長下所關注的組織的相對透明性，所以與使用在較短波長(小於600nm)具有發射的螢光化合物的其他綴合物相比，可以觀察到本發明綴合物激發和螢光發射顯影最大化且其靶向的組織的量相對更大。適合的酞菁包括商購自GE Healthcare的CYDYE突光素，命名為Cy2 (506nm)、Cy2 (506nm)、Cy3 (570nm)、Cy3B (572nm)、Cy3.5 (596nm)、Cy5 (670nm)、Cy5.5 (675nm)和Cy7 (694nm)(括號內是發射最大值)。在一個實施方案中，酞菁化合物是Cy5.5。在一個實施方案中，所述的螢光基團是磺化咕噸基團。適用於實施本發明的磺化咕噸化合物描述在美國專利US6，130，101中，特別將該文獻完整地引入本文參考，且該化合物商購自 Molecular Probes, Inc.，Eugene, 0R，命名為 ALEXA FLUOR。ALEXA FLUOR 是螢光團家族的名稱，其特徵在於其相對高的消光係數和有利的螢光量子產量。磺化咕噸化合物的螢光發射波長最大值作為該化合物的結構的函數改變。根據具體磺化咕噸化合物的不同，螢光發射波長最大值可以從綠色(約450nm)改變至近紅(約780nm)。在本發明方法的實施過程中，優選具有遠紅外(約650nm)至近紅外(約750nm)的螢光發射最大值的ALEXAFLUOR化合物。 適合的磺化咕噸化合物包括ALEXA FLUORS,例如ALEXAFLU0R 350 (442nm)、ALEXA FLUOR 405 (42lnm)、ALEXAFLU0R 488 (539nm)、ALEXA FLUOR 500 (525nm)、ALEXAFLU0R 514 (540nm)、ALEXA FLUOR 532 (554nm)、ALEXAFLU0R 546 (575nm)，ALEXAFLUOR 555 (565nm)、ALEXAFLU0R 568 (603nm)、ALEXA FLUOR 594 (617nm)、ALEXAFLU0R610 (628nm)、ALEXA FLUOR 633 (647nm)，ALEXAFLU0R 635 (645nm)、ALEXA FLUOR647(668nm)、ALEXAFLU0R 660(690nm)、ALEXA FLUOR 680(702nm)、ALEXAFLU0R 700(719nm)和ALEXA FLUOR 750 (779nm)(括號內是發射最大值)。在一個實施方案中，磺化咕噸是ALEXA FLUOR 680。可以按照與 The Handbook-A Guide to Fluorescent Probes andLabelingTechnologies, Richard P.Haugland(Molecular Probes,Inc., asubsidiary ofInvitrogen Corp.)中所述類似的方式製備有代表性的磺化咕噸-氯毒素綴合物。用於本發明的其他適合的NIR螢光團包括DyLight-680、DyLight_750、VivoTag-750, DyLight-800, IRDye-800、VivoTag-680 和吲哚菁綠。本發明修飾的氯毒素肽還可以與量子點和聚合物點偶合。適合的螢光化合物包括賦予該化合物對於氯毒素的化學反應性的官能團。適合的官能團包括與胺基共價偶合的N-羥基琥珀醯亞胺(NHS)基團、與巰基共價偶合的馬來醯亞胺基團和與醛基共價偶合的醯肼基團。優選用於製備本發明綴合物的螢光化合物包括單一反應性官能團(例如一-NHS酯)。可以理解，其他綴合化學品適合於製備本發明的氯毒素綴合物。 本發明適合的綴合物包括約I 一約3個螢光基團/氯毒素。在一個實施方案中，所述的綴合物包括約I個螢光基團。在本發明的另一個方面中，提供了包含氯毒素綴合物的組合物。該組合物適合於對人和動物受試者給藥並且包含藥學可接受的載體。該組合物包含藥理學有效量的修飾的氯毒素綴合物。通常可以通過建立的方法確定有效量。有效量是足以佔據癌細胞中的氯毒素結合位點、但不足以將與非腫瘤組織的非特異性結合降至最低的用量。有效量優化了手術中成像的信噪比。本發明提供了使用氯毒素綴合物檢測組織的方法，本發明的氯毒素綴合物靶向氯毒素結合位點並且與之結合。可以理解，氯毒素結合位點可以採取兩種形式:結合氯毒素的位點和結合本發明氯毒素綴合物的位點。可以理解氯毒素結合位點可以不同於氯毒素綴合物結合位點。在一個實施方案中，提供了區分表達氯毒素結合位點的癌病灶的方法。該方法包括下列步驟:(a)使所關注的組織接觸對表達氯毒素結合位點的細胞具有親和力和特異性的氯毒素綴合物，其中氯毒素綴合物包含一種或多種與氯毒素共價偶合的紅外或近紅外發射螢光基團；和(b)測定氯毒素綴合物的結合水平，其中相對於正常組織，結合水平升高指示該組織是腫瘤。在一個實 施方案中，提供了檢測表達氯毒素結合位點的癌症的方法。該方法包括下列步驟:(a)使所關注的組織接觸對表達氯毒素結合位點的細胞具有親和力和特異性的氯毒素綴合物，其中氯毒素綴合物包含一種或多種與氯毒素共價偶合的紅外或近紅外發射螢光基團；和(b)測定氯毒素綴合物的結合水平，其中相對於正常組織，結合水平升高指示該組織是腫瘤。在一個實施方案中，提供了測定表達手術中患者氯毒素結合位點的癌細胞位置的方法。該方法包括下列步驟:
(a)對患者給予藥物組合物，其中該藥物組合物包含藥學可接受的載體和足以使表達體內氯毒素結合位點的癌細胞成像的用量的氯毒素綴合物，其中氯毒素綴合物包含一種或多種與氯毒素共價偶合的紅外或近紅外發射螢光基團；(b)通過螢光成像測定氯毒素綴合物的結合水平以確定表達氯毒素結合位點的癌細胞的位置，其中相對於正常組織，結合水平升高指示存在表達氯毒素結合位點的癌細胞；和(C)從患者中手術取出至少一些表達通過螢光成像定位的氯毒素結合位點的細胞。本發明用於檢測癌症病灶的成像方法適用於小鼠和其他癌症動物模型和獸醫實踐。本發明的螢光氯毒素綴合物可以包括其他有用的試劑。其他有用的試劑包括診斷劑和治療劑。在另一個實施方案中，成像方法是磁共振成像方法。磁共振成像中製備和使用氯毒素綴合物的有代表性的方法描述在美國專利申請公開號US 200701254965A1中，發明名稱為氯毒素-標記的納米顆粒組合物和靶向原發性腦腫瘤的方法，特別將該文獻完整地引入本文參考。本發明提供了能夠靶向原發性腦腫瘤的氯毒素-標記的納米顆粒、包括納米顆粒的組合物、使用所述納米顆粒使組織成像的方法和使用所述納米顆粒處理表達氯毒素結合位點的細胞的方法。在一個方面中，本發明提供了氯毒素-標記的顆粒，其包含:(a)具有表面的 芯，該芯包含具有磁共振成像活性的材料；(b)修飾的氯毒素肽；和(C)使修飾的氯毒素肽與表面共價偶合的連接基。所述的芯包括具有磁共振成像活性的材料。具有磁共振成像活性的適合的材料包括金屬氧化物，例如氧化亞鐵、氧化鐵、氧化矽、多晶矽氧化物、氧化鋁、氧化鍺、硒化鋅、二氧化錫、二氧化鈦、氧化銦錫和氧化釓。可以使用一種或多種金屬氧化物的混合物。除磁性材料外，所述的芯還可以包括無磁性材料，例如氮化矽、不鏽鋼、鈦、硼、碳化硼、硼和碳混合物和鎳鈦。還可以使用一種或多種無磁性材料的混合物。本發明的顆粒包括約I 一約100個修飾的氯毒素/顆粒。在一個實施方案中，所述的顆粒包括約10 —約50個修飾的氯毒素/顆粒。在一個實施方案中，所述的顆粒包括約10個修飾的氯毒素/顆粒。在一個實施方案中，所述的顆粒包括約50-約100個修飾的氯毒素/顆粒。如上所述，本發明的磁性納米顆粒包括用作靶向基團的氯毒素，所述的靶向基團有效地使所述納米顆粒定向於表達氯毒素結合位點的細胞，在那裡結合所述納米顆粒。原發性腦瘤細胞(例如來源於神經外胚層的腫瘤細胞和神經膠質瘤細胞)包括氯毒素結合位點。氯毒素-標記的納米顆粒還可以包括其他有用的試劑。其他有用的試劑包括診斷劑。適合的診斷劑包括通過非磁共振成像的方法檢測納米顆粒的試劑。適合的診斷劑包括發射光的化合物(例如螢光團、磷光體和發光體)。適合的螢光團包括如上所述的那些。在一個實施方案中，氯毒素-標記的顆粒還包含螢光基團。本發明的顆粒包括約
I一約10個螢光基團/顆粒。在一個實施方案中，所述顆粒包括約I 一約2個螢光基團/顆粒。在一個實施方案中，突光基團選自紅外和近紅外發射突光基團(即具有大於約600nm的發射最大值的螢光基團)。在一個實施方案中，螢光基團是酞菁基團。在一個實施方案中，螢光基團是Cy5.5基團。其他適合的診斷劑包括放射性標記(例如放射性同位素標記的化合物),例如
1251、14C 和 31P 等。在本發明的另一個方面中，提供了包括本發明顆粒的組合物。在一個實施方案中，該組合物包含適合於對人或動物受試者給藥的納米顆粒。該組合物可以包含可接受的載體。在一個實施方案中，該組合物是藥學可接受的組合物並且包含藥學可接受的載體。本文所用的術語〃載體〃是指有利於遞送顆粒的稀釋劑(例如鹽水)。在其他方面中，本發明提供了使用納米顆粒的方法。在一個實施方案中，本發明提供了使來源於神經外胚層的腫瘤細胞與無腫瘤腦組織相區分的方法。在該方法中，區分來源於神經外胚層的腫瘤細胞與無腫瘤腦組織的步驟在於:(a)使所關注的組 織接觸對來源於神經外胚層的腫瘤細胞具有親和力和特異性的氯毒素-標記的納米顆粒；和(b)測定氯毒素-標記的納米顆粒的結合水平，其中相對於正常組織，結合水平升高指示該組織是腫瘤。在一個實施方案中，本發明提供了檢測來源於神經外胚層的腫瘤細胞的方法。在該方法中，通過下列步驟檢測來源於神經外胚層的腫瘤細胞:(a)使所關注的組織接觸對來源於神經外胚層的腫瘤細胞具有親和力和特異性的氯毒素-標記的納米顆粒；和(b)測定氯毒素-標記的納米顆粒的結合水平，其中相對於正常組織，結合水平升高指示該組織是腫瘤。上述方法用於區分和檢測神經膠質瘤細胞。在上述方法中，測定氯毒素-標記的納米顆粒的結合水平包括磁共振成像。在上述方法的一些實施方案中，氯毒素-標記的納米顆粒還包含螢光基團。在這些實施方案中，測定氯毒素-標記的納米顆粒的結合水平可以包括螢光成像。在一個實施方案中，本發明提供了在術前、手術中和術後測定患者神經膠質瘤細胞位置的方法。該方法包括下列步驟:(a)對患者給予藥物組合物，其中該藥物組合物包含藥學可接受的載體和足以使體內神經膠質瘤細胞成像的用量的螢光團/氯毒素-標記的納米顆粒；(b)通過術前磁共振成像測定螢光團/氯毒素-標記的納米顆粒的結合水平，以確定神經膠質瘤細胞的位置，其中相對於正常組織，結合水平升高指示存在神經膠質瘤細胞；
(c)從患者中手術取出至少一些通過磁共振成像定位的神經膠質瘤細胞；(d)通過手術中螢光成像測定螢光團/氯毒素-標記的納米顆粒的結合水平，以確定殘留的神經膠質瘤細胞的位置，其中相對於正常組織，結合水平升高指示存在殘留的神經膠質瘤細胞；(e)從患者中手術取出至少一些通過螢光成像定位的殘留神經膠質瘤細胞；和(f)通過術後磁共振成像測定螢光團/氯毒素-標記的納米顆粒的結合水平，以確定神經膠質瘤細胞的位置，其中相對於正常組織，結合水平升高指示存在神經膠質瘤細胞。在該方法中，足以使體內神經膠質瘤細胞成像的螢光團/氯毒素-標記的納米顆粒的用量約為l_20mg Fe/kg體重("Fe"是指存在於顆粒芯中的鐵)。在上述方法中，可以重複步驟(d)和(e)。上述方法包括術前、手術中和術後成像。可以理解，上述方法的變化形式屬於本發明的範圍。該方法的其他變化形式包括，例如(I)僅術前成像；(2)僅手術中成像；(3)僅術後成像；(4)僅術前和手術中成像；(5)僅術前和術後成像；和(6)僅手術中和術後成像。本發明提供了使用納米顆粒處理組織的方法。在一個實施方案中，本發明提供了治療患者中的神經膠質瘤的方法，包括對有此需要的患者給予有效量的藥 物組合物，該藥物組合物包含氯毒素-標記的納米顆粒和藥學可接受的載體。在一個實施方案中，本發明提供了治療神經外胚葉瘤的方法，包括對有此需要的患者給予有效量的藥物組合物，該藥物組合物包含氯毒素-標記的納米顆粒和藥學可接受的載體。在一個實施方案中，本發明提供了抑制腫瘤細胞的侵害活性的方法，包括對腫瘤細胞給予有效量的藥物組合物，該藥物組合物包含氯毒素-標記的納米顆粒和藥學可接受的載體。下文描述了本發明有代表性的修飾的氯毒素肽及其特性、肽的綴合物及其特性和所述綴合物在成像中的應用。修飾的氯毒素肽的製備.本發明的兩種有代表性的修飾的氯毒素(CTX)肽(丙氨酸取代的氯毒素，K15A_K23A-CTX ;精氨酸取代的氯毒素，K15R_K23R_CTX)序列如圖1中所不。使用Boc (叔-丁氧擬基)/HBTU[2-(1H-苯並二唑-1-基)-1, I, 3, 3-四甲基服六氟憐酸鹽]進行原位中和化學反應合成肽。具有pH 7.8的0.1M Tris-HCl、0.2MNaCl、5mM還原型穀胱甘肽/0.5mM氧化穀胱甘肽的緩衝溶液用於在室溫氧化取代的肽以及環化和氧化CTX過夜。RP-HPLC用於純化肽且通過分析型RP-HPLC和ES-MS證實兩種CTX類似物K15A_K23A-CTX和K15R_K23R-CTX的純度和分子量。NMR棑布.將所沭狀溶於90% 0和10%隊0並目在600MHz在298° K記錄一維和二維TOCSY和NOESY光譜。使用充分建立的技術指定NMR光譜(K.Wuthrich, 〃NMR of Proteinsand NucleicAcids〃, Wiley-1nterscience, New York, 1986) 酸胺區中的化學位移充分分散，證實所述肽正確摺疊，且每種肽的NOESY光譜中的指紋區顯示α H - NH依次連接性的完整循環，除兩個脯氨酸殘基(Pro4和Pro31)以外。然而，正如預計的，從脯氨酸殘基及其在先殘基的S質子中觀察到NOEs。天然CTX和合成類似物的二級α H化學位移比較如圖2中所示。
取代的CTX生物綴合物的表徵.使天然和修飾的肽與Cy5.5綴合併且如下文實施例中所述純化。通過HPLC和質譜分析得到的生物綴合物。正如預計的，Ala和Arg取代僅產生單-標記的CTX:Cy5.5生物綴合物。取代的CTX:Cy5.5的功能評價.取代的潛在有益性取決於肽的功能靶向活性是否與天然CTX生物綴合物可比擬。通過生物光子成像測定每種肽使Cy5.5信號優先於正常腦而靶向至髓母細胞瘤細胞的能力。在每種情況中，將50 μ L 40 μ M生物綴合物注入顯示與晚期腦瘤具有一致性臨床徵兆的小鼠的尾靜脈。3天後，處死小鼠，使用Caliper/Xenogen光譜生物光子成像系統使其腦成像。與正常腦相比，所有修飾的肽綴合物優先使髓母細胞瘤癌組織發光(圖3A和3B)。在所有情況中將腫瘤中的信號與不具有髓母細胞瘤的注射的對照組動物的小腦中的信號比較。與正常信號比較的腫瘤中的信號為:天然CTX:Cy5.5，
1.96+/-0.47(n=10) ;Ala 取代的，3.3+/-1.8 (n=8);和 Arg 取代的，2.6+/-0.85 (n=5)。在統計學上，所有修飾的肽生物綴合物都與天然CTX:Cy5.5之間無顯著差異，顯示賴氨酸取代不會干擾CTX結合其靶標。

本發明的優點.當開發針對人臨床試驗的新治療劑時，不僅要考慮到效力、藥代動力學、藥效學和毒理學，而且要考慮到實際問題，即可能損害管理許可或增加生產成本。腫瘤漆(Tumor Paint)，即安全和有效地使小鼠模型中的實體瘤發光的生物綴合物，提出了與如下事實相關的生產挑戰:所述生物綴合物實際上是單_、二-和三-標記的CTX的混合物。本發明提供了三種新的有代表性的化學體，它們在功能上與使NIRF分子靶向至癌症的CTX等效，而僅與單一 NIRF分子綴合。使用精氨酸酶裂解偶合蛋白質組分析對CTX:Cy5.5中的CTX綴合位點作圖，並且顯示典型地>80%的產物在Lys 27上單標記，且少量還在Lys 15或Lys 23綴合。在與4種其他NIRF染料綴合的CTX的分析中，觀察到具有少量二 -和三標記的肽的單-標記的肽佔優勢的類似模式，除Dylight 750以外，即僅生成單-標記的種類的NIRF染料。Dylight750以單體方式結合未修飾的CTX的事實啟示其他兩個賴氨酸的利用是有限的。顯然CTX中的賴氨酸殘基無一涉及CTX與癌細胞上其靶標的主動結合。這一結論基於如下觀察結果:儘管Lys 15或Lys 23被Ala或Arg取代，但是靶向結合得到保護，大量Cy5.5或其他NIRF染料添加到Lys 27上不會妨礙與活性位點結合。實驗方法固相肽合成.採用手動固相肽合成(SPPS)合成具有標準保護基(例如Asn (Xan)、Asp (OcHex)、Arg (TOS)、Cys (MeBzl)、Lys (ClZ)、Ser (Bzl)、Thr (Bzl)和 Tyr (BrZ))的肽。將Ala和Arg取代的線性CTX組裝在不具有硫酯連接基的PAM-Arg樹脂上。在_5 — 0° C通過使用氟化氫(HF)與對-甲酚和對-硫代甲酚作為清除劑(9:0.8:0.2(vol/vol)HF:對-甲酚:對-硫代甲酚)將肽從樹脂上裂解，進行1.5h。使用C18柱反相-高效液相色譜法(RP-HPLC)、通過在215nm監測吸收度、使用0-80%溶液B (溶液Α:Η20/0.05%三氟乙酸；溶液B:90%CH3CN/10%H20/0.045%三氟乙酸)梯度純化肽。電噴霧質譜(ES-MS)證實合成肽的純度和分子量。摺疊.在室溫用具有pH 7.8的0.1M Tris-HCl、(λ 2M NaCl、5mM還原型穀胱甘肽/0.5mM氧化穀胱甘肽組成的緩衝水溶液將Ala和Arg取代的類似物氧化過夜。RP-HPLC用於純化肽，並且通過分析型RP-HPLC和ES-MS證實純度和分子量。
NMR光譜法.600MHz 1H NMR光譜法用於監測肽類似物的三維結構。將肽樣品溶於90%H20 和 10%D20(v/v) ο D2O (99.99%)獲自 Cambridge Isotope Laboratories, Woburn, MA0二維NMR實驗包括全相關光譜法(TOCSY)，並且在298° K記錄核歐豪斯效應分光光度(NOESY)光譜。血清穩定性測定.使用20 μ M最終肽濃度，在100%人男性血清(Sigma)中進行血清穩定性測定。以HOOOg將血清離心IOmin以除去脂質成分，並且將上清液在37° C溫育15min，然後測定。在37° C在血清中溫育每種肽，並且在O、1、3、6、10、16和24h取出40 μ L一式三份等分試樣。用40 μ L 6Μ脲使每一血清等分試樣猝滅，並且在4° C溫育lOmin。然後用40 μ L 20%三氟乙酸使每一血清等分試樣猝滅，並且在4° C再溫育lOmin，以沉澱血清蛋白。以14000g將樣品離心IOmin並且用RP-HPLC、使用溶液B線性梯度(0.3mL/min流速)分析100 μ L上清液。對照樣品在進行相同處理過程的磷酸緩衝鹽水中包含等量的肽。通過在215nm積分檢測肽的回收百分比。動物模型.嚴格根據用於試驗室動物護理和應用的NationalInstitutes ofHealth Guide操作所有動物。全部動物研究根據FredHutchinson Cancer ResearchCenter’s Institute of Animal Care andUse Committee 批准的方案進行。使用 C57bl/6作為背景的髓母細胞瘤ND2:SmoAl自體小鼠模型(A.R.Hallahan等人，〃The SmoAlMouseModel Reveals That Notch Signaling is Critical for the Growthand Survival ofSonic Hedgehog-1nduced Medulloblastomas, "CancerResearch 64:7794-7800, 2004.B.A.Hatton 等人 〃The Smo/SmoModel:Hedgehog-1nduced Medulloblastoma With 90%Incidence andLeptomeningeal Spread, "Cancer Research 68:1768-1776，2008)用於評價環化 CTX:Cy5.5、K15A_K23A CTX:Cy5.5 和 K15R_K23RCTX:Cy5.5 的特異性。選擇具有症狀性髓母細胞瘤的半合子或純合(稱作ND2:SmoAl)小鼠用於在這些研究中登記。使用開放場地籠評價檢測症狀。症狀包括頭傾斜、弓狀姿勢、共濟失調、頭蓋骨突出和體重減輕。離體成像.通過尾靜脈給顯示髓母細胞瘤症狀的ND2:SmoAl動物注射50μ L40 μ M K15A_K23A CTX:Cy5.5 或 K15R_K23RCTX: Cy5.5。注射後 3 天使用 CO2 吸入對小鼠實施安樂死，並且使用Xenog en光譜成像系統(Caliper)得到其腦的離體生物光子圖像。然後將腦冷凍在Tissue-Tek最適切割溫度(OCT)化合物(Sakura)中，切成12 μ m切片，並且根據標準方案進行蘇木精和伊紅(H&E)染色。儘管示例和描述了本發明的優選實施方案，但是可以理解，可以在不脫離本發明精神和範圍的情況下進行各種改變。
權利要求
1.飾的氯毒素肽，具有單一賴氨酸殘基。
2.飾的氯毒素肽，具有被非賴氨酸的胺基酸取代的天然氯毒素的Lys15和Lys 23，得到具有單一賴氨酸殘基的修飾的氯毒素。
3.飾的氯毒素肽，具有SEQID N0:2中給出的胺基酸序列。
4.權利要求1一 3任一項的修飾的氯毒素肽，其中Lys 15和Lys23被獨立地選自天然和非天然胺基酸的胺基酸取代。
5.權利要求1一 4任一項的修飾的氯毒素肽，其中Lys 15和Lys23被丙氨酸取代。
6.權利要求1一 4任一項的修飾的氯毒素肽，其中Lys 15和Lys23被精氨酸取代。
7.權利要求1一 4任一項的修飾的氯毒素肽，其中Lys 15被丙氨酸取代且Lys 23被精氨酸取代。
8.權利要求1一 4任一項的修飾的氯毒素肽，其中Lys 15被精氨酸取代且Lys 23被丙氨酸取代。
9.飾的氯毒素肽，具有SEQID N0:3中給出的胺基酸序列。
10.飾的氯毒素肽，具有SEQID N0:4中給出的胺基酸序列。
11.飾的氯毒素肽，具有SEQID NO:5中給出的胺基酸序列。
12.飾的氯毒素肽，具有SEQID NO:6中給出的胺基酸序列。
13.合物，包含權利要求1一 12任一項的修飾的氯毒素肽。
14.權利要求13的組合物，還包含藥學可接受的載體。
15.療可通過給予氯毒素治療的疾病或病症的方法，包括對有此需要的受試者給予有效量的權利要求1 一 12任一項的修飾的氯毒素肽。
16.毒素綴合物，包含權利要求1一 12任一項的修飾的氯毒素肽。
17.毒素綴合物，包含權利要求1一 12任一項的修飾的氯毒素肽，其與下列物質中的一種或多種共價偶合:治療劑、診斷劑、成像劑或靶向劑或者增加修飾的氯毒素肽的循環半衰期的基團。
18.權利要求17的氯毒素綴合物，其中所述的治療劑、診斷劑、成像劑或靶向劑或者增加修飾的氯毒素肽的循環半衰期的基團通過賴氨酸殘基與修飾的氯毒素肽共價偶合。
19.權利要求17或18的氯毒素綴合物，其中所述的診斷劑或成像劑選自螢光標記、放射性標記和磁共振成像標記。
20.權利要求17或18的氯毒素綴合物，其中所述的診斷劑或成像劑選自量子點或聚合物點。
21.權利要求17或18的氯毒素綴合物，其中所述的診斷劑或成像劑選自硼納米顆粒、硼和碳納米顆粒、碳化硼納米顆粒、含硼聚合物、含硼和碳的聚合物、碳化硼聚合物以及還包含釓的任意的這些納米顆粒或聚合物。
22.權利要求17或18的氯毒素綴合物，其中所述的靶向劑選自抗體、多肽、多糖和核酸。
23.權利要求17或18的氯毒素綴合物，其中所述的治療劑選自化療劑和生物治療劑。
24.權利要求17或18的氯毒素綴合物，其中所述的治療劑選自甲氨蝶呤、多西他賽、順鉬和依託泊苷。
25.權利要求17或18的氯毒素綴合物，其中所述的治療劑選自cDNA、siRNA、shRNA和RNAi。
26.權利要求17或18的氯毒素綴合物，其中所述增加修飾的氯毒素肽的循環半衰期的基團選自聚乙二醇基團、糖基基團和糖基化聚乙二醇基團。
27.可通過氯毒素成像的組織成像的方法，包括使可通過氯毒素成像的組織接觸權利要求17-21任一項的氯毒素綴合物，以使可通過氯毒素成像的組織成像。
28.測可通過氯毒素檢測的癌症的方法，包括使可通過修飾的氯毒素成像的組織接觸權利要求17-21任一項的修飾的氯毒素綴合物，以檢測可通過氯毒素檢測的癌症。
29.測和摘除可通過氯毒素檢測的癌症的方法，包括: (a)使組織接觸權利要求17-21任一項的修飾的氯毒素綴合物，以檢測癌組織；和 (b)摘除通過修飾的氯毒素綴合物檢測的癌組織。
30.療修飾的氯毒素綴合物靶向的癌症的方法，包括使結合修飾的氯毒素的組織接觸權利要求17、18和23-2 5任一項的修飾的氯毒素綴合物。
全文摘要
氯毒素變體、氯毒素變體綴合物、包含氯毒素變體或綴合物的組合物和使用氯毒素變體、綴合物和組合物的方法。
文檔編號A61K38/17GK103097403SQ201180031651
公開日2013年5月8日 申請日期2011年2月4日 優先權日2010年5月11日
發明者J·M·奧爾森 申請人:弗雷德哈欽森癌症研究中心