一種基於csf-fmd二聯基因工程疫苗的製備方法

2023-10-22 19:07:02 1

一種基於csf-fmd二聯基因工程疫苗的製備方法
【專利摘要】本發明涉及一種基於CSF-FMD二聯基因工程疫苗的製備方法，公開了基於豬瘟病毒和豬O型口蹄疫病毒二聯核酸疫苗的研究及應用。基於豬瘟病毒和豬O型口蹄疫病毒二聯核酸疫苗主要原料為：pcDNA3.1-CSFV-E2-FMDV-O-VP1真核質粒。本發明本發明針對CSFVE2基因和FMDV-OVP1進行核酸疫苗研究，可刺激動物機體產生相應高水平的抗體，體現出很強的特異性。針對CSFV和FMDV-O引發豬的感染和傳播，通過E2基因和VP1基因對兩種病毒起到防控效果，可達到安全和有效的效果。
【專利說明】—種基於CSF-FMD 二聯基因工程疫苗的製備方法
【技術領域】
[0001]本發明涉及一種基於CSF-FMD 二聯基因工程疫苗的研究及應用。
【背景技術】
[0002]豬瘟(Swine Fever, SF)又名豬霍亂(Hog Cholera, HC)，歐洲也稱之為古典豬瘟(Classical Swine Fever, CSF),是由豬痕病毒(Classical Swine Fever Virus, CSFV)引起的一種高度接觸性、急性傳染病。其特徵是發病急、高熱稽留，微循環血管壁變性及其導致的全身泛發性小點出血，內臟器官中的多發性出血、壞死和梗死，具有很強的傳染性和很高的致死率。被世界動物衛生組織(World organization of animal health,0IE)列為法定報告的動物疫病之一，我國將其列為一類動物傳染病。豬瘟病毒基因組為單股正鏈RNA，全長大約為12.3kb。其放閱讀框(Open Reading Frame,0RF)編碼的多聚蛋白經加工切割成12種蛋白質，其中C、E0、EU E2等4種蛋白是成熟病毒粒子的組成成分，被稱為結構蛋白；其餘8種蛋白的為非結構蛋白。而E2蛋白是豬瘟病毒最主要的保護性抗原蛋白，在感染細胞中以同源二聚體或與El形成異源二聚體形式存在於病毒粒子及感染的細胞表面。研究表明，E2蛋白的糖基化位點與病毒的毒力有著直接的關係。在四種結構蛋白中，E2蛋白保守性最低，最易發生變異。許多學者認為CSFV的E2抗原變異有可能是導致該病毒逃脫或抵禦免疫保護的主要原因。
[0003]口蹄疫(Foot-and-Mouth Disease, FMD)是由口蹄疫病毒(Foot-and-MouthDisease Virus,FMDV)引起的一種急性、熱性、高度接觸性人畜共患傳染病。該病傳播快，傳播途徑廣，發病率高，對家畜養殖業危害極大，該病主要侵害牛、豬、羊和駱駝等家畜及多種野生偶蹄動物。被OIE列為法定上報疫病，而我國將其列為一類動物疫病的首位。口蹄疫病毒具有多型易變的特點，目前有7個血清主型，分別為O、A、C、SAT 1、SAT2、SA T3和亞洲I型(Asia I )。我國口蹄疫的病毒型為O、A型和亞洲I型。口蹄疫病毒為單股正鏈RNA病毒，基因組全長約8500個核苷酸(nt)。其放閱讀框(Open Reading Frame, 0RF)共同編碼一多聚蛋白。多聚蛋白經3次裂解後，形成3~4種病毒結構蛋白(VP0或VP4、VP2.VP3.VP1)和8、種非結構蛋白。FMDV抗原變異是由衣殼蛋白VP1-VP4的胺基酸殘基決定的。其中VPl最容易發生變異，它暴露於病毒表面，是決定病毒抗原性的主要成分，能誘導機體產生保護性的中和抗體；而￥?4幾乎不發生變異。FMDV抗原變異主要發生在FMDV衣殼蛋白VPl的G-H環上，是由抗原表位的胺基酸缺失、添加或替換造成的。FMDV的這種變異有可能使病毒突變株逃避抗體的中和或調理作用，獲得持續感染的機會。
[0004]近年來，豬瘟的流行和發病特點發生了很大變化，出現了以繁殖障礙和仔豬先天性感染為特徵的非典型豬瘟，表現為症狀溫和，隱形帶毒，有些地區經常發生疫苗免疫失敗或免疫無效的現象。而口蹄疫大面積爆發和流行一波未平一波又起，我國應用弱毒疫苗和滅活疫苗，取得了一定的防制效果。但無論是弱毒疫苗還是滅活疫苗都是由完整病毒粒子製成的疫苗，都無法逃避安全性問題。
【發明內容】

[0005]本發明要解決的技術問題在於:提供一種安全的基於CSF-FMD 二聯基因工程疫苗的製備方法。
[0006]本發明的技術方案:一種基於CSF-FMD 二聯基因工程疫苗的製備方法，其特徵在於:包含以下步驟:
(1)豬瘟病毒病料CSFV-E2的RT-PCR擴增；豬O型口蹄疫病毒病料FMDV-OVPl的RT-PCR 擴增；
(2)回收RT-PCR產物，與pMD19-T載體連接；將連接產物轉化入大腸埃希氏菌DH5α感受態細胞培養，挑取上述轉化平皿中的白色菌落，接種到含有氨苄青黴素的2ΧΥΤ液體培養基中，振蕩培養至混濁，提取質粒並進行酶切鑑定，篩選出陽性並進行測序；
(3)將所構建重組質粒pMD19-CSFV-E2與pcDNA3.1 ( + )載體分別進行BamH I和EcoRI雙酶切，回收純化目的片段，將二者用T4 DNA連接酶連接，連接產物轉化至DH5 α感受態細胞，獲得陽性重組質粒pcDNA3.1-CSFV-E2，利用試劑盒提取質粒，進行BamH I和EcoR I雙酶切及PCR鑑定，並送測序驗證；
(4)將所構建重組質粒pMD19-FMDV-0-VPl與pcDNA3.1-CSFV-E2分別進行BamH I和Hind III雙酶切，回收純化目的片段，將二者用T4 DNA連接酶連接，連接產物轉化至DH5a感受態細胞，獲得陽性重組質粒pcDNA3.1-CSFV-E2-FMDV-0-VP1，利用試劑盒提取質粒，進行BamH I和Hind III雙酶切及PCR鑑定，並送公司測序驗證。
[0007]本發明有益效果:本發明將預防並控制CSFV和FMDV-O對豬的感染；本發明所製備核算疫苗適用於對豬的免疫，為豬瘟病毒和豬O型口蹄疫病毒的防治提供安全有效的免疫產品，並減少對養豬業帶來的經濟損失。本發明與現有技術相比，具有以下的技術優勢和積極效果:
(I)安全性好:本發明是針對豬瘟病毒和豬O型口蹄疫病毒其中一個重要的閱讀框展開研發，通過對豬制定合理的免疫程序，從而達到對豬瘟病毒和豬O型口蹄疫病毒的預防與控制，可達到很好的免疫效果，而不產生致病性。
[0008](2)特異性好:本發明針對CSFV E2基因和FMDV-O VPl基因進行核酸疫苗研究，可刺激動物機體產生相應高水平的抗體，體現出很強的特異性。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0009]圖1為本發明豬瘟病毒和豬O型口蹄疫病毒二聯核酸疫苗的研究及應用流程圖。
【具體實施方式】
[0010]本發明的實施例:
基於豬瘟病毒和豬O型口蹄疫病毒二聯核酸疫苗的研究及應用的主要原料:
真核表達質粒PCDNA3.1-CSFV-E2-FMDV-0-VP1、胰蛋白腖、酵母提取物、氯化鈉、無內毒素質粒抽提相關試劑等。
[0011]所述的基於豬瘟病毒和豬O型口蹄疫病毒二聯核酸疫苗的研究及應用製備步驟包括:
第一，引物的設計及合成登錄 GeneBank (www.ncb1.nlm.nih.gov)獲取 CSFV-GZ-2009 株(登錄號:HQ380231.1)、C-ZJ-2008 株(登錄號:HM175885.1)、JLl (06)株(登錄號:EU497410.1)和Shimen/HVRI株(登錄號:AY775178.1)序列，以Bioedit軟體比對選取序列後經PrimerPremier 5軟體設計豬瘟病毒E2基因特異性引物。
[0012]登錄GeneBank (www.ncb1.nlm.nih.gov)獲取 EGY 10/2011 株(登錄號:KC440883.1)、0/S15K0R/2002 株(登錄號:KF694745.1)、AFG_016/2003 株(登錄號:HQ268526.1)和MAY/3/2000株(登錄號:HQ632768.1)序列，以Bioedit軟體比對選取序列後經Primer Premier 5軟體設計豬O型口蹄疫病毒VPl基因特異性引物；
第二，最佳反應體系的確定 豬瘟RT-PCR擴增體系:
RT 反應體系:5XBuffer 4.0 μ L、CSFV Ε2-Ρ1 (10 μ mol/L) 1.0 μ L、CSFV E2-P2(10 μ mol/L) 1.0 μ L、dNTP (lOmmol/L) 1.0 μ L、RNA 模板 11.0 μ L、MLV 1.0 μ L、RNA抑制酶1.0 μ L，總體積20.0 μ L0
[0013]PCR反應體系:10 XPCR Buffer 5.0 μ L、dNTP (IOmmo 1/L) 1.0 μ L、DNA模板 1.0μ L, CSFV E2-Pl(10ymol/L) 1.0 μ L、CSFV Ε2-Ρ2 (10 μ mol/L) 1.0 μ L, Taq DNA 聚合酶(2.5 U/--L) 1.0 μ L、ddH20 40.0yL,總體積 50.0 μ L。
[0014]RT的反應參數:45°C反轉錄60min,95°C滅活5min ；PCR反應參數為:94°C預變性5min。94°C變性 lmin，51°C退火 lmin，72°C延伸 90s 共 30 個循環，最後 72°C延伸 IOmin0
[0015]口蹄疫RT-PCR擴增體系:
RT 反應體系:5XBuffer 4.0 μ L, FMDV-OVP1-P I (10 μ mol/L) 1.0 μ L、FMDV-OVP1-P2 (10 μ mol/L) 1.0 μ L、dNTP (IOmmo 1/L) 1.0 μ L、RNA 模板 11.0 μ L、MLV
1.0 μ L、RNA 抑制酶 1.0 μ L，總體積 20.0 μ L。
[0016]PCR 反應體系:10 X PCR Buffer 5.0 μ L, FMDV-OVP1-P I (10 μ mol/L) 1.0 μ L、FMDV-OVP1-Ρ2 (10 μ mol/L) 1.0 μ L、dNTP (IOmmoI/L) 1.0 μ L、DNA 模板 1.0 μ L、TaqDNA 聚合酶(2.5 U/--L) 1.0 μ L、ddH20 40.0 μ L，總體積 50.0 μ L。
[0017]RT的反應參數:45°C反轉錄60min,95°C滅活5min ；PCR反應參數為:94°C預變性5min。94°C變性 lmin，53°C退火 lmin，72°C延伸 90s 共 30 個循環，最後 72°C延伸 IOmin0
[0018]第三，CSFV E2基因和FMDV-0 VPl基因的克隆
RT-PCR產物於1%瓊脂糖凝膠中電泳，切下含目的條帶的凝膠，參照膠回收試劑盒說明書回收RT-PCR產物，用常規方法與pMD19-T載體連接；將連接產物轉化入大腸埃希氏菌DH5a感受態細胞，37°C培養12 h，挑取上述轉化平皿中的白色菌落，接種到含有氨苄青黴素的2 X YT液體培養基中，37°C振蕩培養過夜至混濁，提取質粒並進行酶切鑑定，篩選出陽性並進行測序。
[0019]第四，真核質粒pcDNA3.1-CSFV-E2-FMDV-0-VP1 的構建
將所構建重組質粒PMD19-CSFV-E2與pcDNA3.1( + )載體分別進行BamH I和EcoR I雙酶切，回收純化目的片段，將二者用T4 DNA連接酶於16°C連接過夜，連接產物轉化至DH5 α感受態細胞，獲得陽性重組質粒pcDNA3.1-CSFV-E2。利用試劑盒提取質粒，進行BamH I和EcoR I雙酶切及PCR鑑定。所述真核構建體系為:目的DNA片段6 μ L、pcDNA3.1( + ) I μ L、Τ4 DNA ligase I μ LUOXΤ4 DNA ligase buffer 2.5 μ L、滅菌 ddH20 14.5 yL，總體積25.0 μ L0
[0020]將所構建重組質粒 pMD19-FMDV-0-VPl 與 pcDNA3.1-CSFV-E2 分別進行 BamH I 和Hind ΠΙ雙酶切，回收純化目的片段，將二者用T4 DNA連接酶於16°C連接過夜，連接產物轉化至DH5a感受態細胞，獲得陽性重組質粒pcDNA3.1-CSFV-E2-FMDV-0-VP1。利用試劑盒提取質粒，進行BamH I和Hind ΠΙ雙酶切及PCR鑑定，並送公司測序驗證。所述真核構建體系為:目的 DNA 片段 2.5 μ L、pcDNA3.1-CSFV-E2 I μ L、T4 DNA ligase I μ L、10XT4 DNAligase buffer 2.5 μ L、滅菌 ddH20 18 μ L,總體積 25.0 μ L。
[0021 ]第五，真核質粒 pcDNA3.1-CSFV-E2-FMDV-0-VP1 體外培養
所述體外表達，培養並收穫處於指數生長期的Vero細胞，用胰蛋白酶消化後用6 mL營養液懸浮細胞。然後取6孔細胞培養板，加I mL上述細胞懸液和I mL生長液，放入37°C5% C02恆溫培養箱培養24 h，使細胞達70%~80%融合時進行轉染。參照LipofecttamineΤΜ2000試劑說明書進行重組質粒pcDNA3.1-CSFV-E2-FMDV-0-VP1轉染試驗。在培養箱中培養48h，檢測轉染水平，同時設置轉染空質粒pcDNA3.1 ( + )和不轉染質粒的細胞作為對照。
[0022]第六，基於豬瘟病毒和豬O型口蹄疫病毒二聯核酸疫苗的研究及應用，動物性實驗如下:
Cl)經擴增培養pcDNA3.1-CSFV-E2-FMDV-0-VP1後，製備大量無內毒素的pcDNA3.1-CSFV-E2-FMDV-0-VP1質粒，免疫小白鼠，監測小白鼠血清中CSFV和FMDV特異性抗體水平。(2)免疫小白鼠，5飛周齡小白鼠(購自貴陽醫學院)隨機分成5組，分別為生理鹽水空白組，pcDNA3.1-CSFV-E2-FMDV-0-VP1真核質粒試驗組，pcDNA3.1(+)空質粒試驗組，豬瘟疫苗組和口蹄疫疫苗組。(3)免疫程序為:相同部位肌肉注射，在首免前2d注射
0.25%普魯卡因100 μ I/只，每組質粒免疫劑量為100 μ g/只，於首免後間隔14d加免一次。(4)分別於首免後O、7、14、21、28、35d小鼠血清，用間接ELISA法測定血清中CSFV和FMDV-O的抗體水平。(5)CSFV抗體陽性判定值為1.971，FMDV-O抗體陽性判定值為1.879。pcDNA3.1-CSFV-E2-FMDV-0-VP1真核質粒刺激小鼠機體產生抗體水平出現很高的陽性水平。
[0023]第七，臨床應用
pcDNA3.1-CSFV-E2-FMDV-0-VP1質粒接種免疫豬，監測其刺激豬產生的抗體水平，以驗證方法的臨床應用性。
[0024]通過第一至第七步驟的比較及驗證，證實基豬瘟病毒和豬O型口蹄疫病毒二聯核酸疫苗的研究及應用確實能使小鼠機體產生抗豬瘟病毒和豬O型口蹄疫病毒的高抗體水平。
【權利要求】
1.一種基於CSF-FMD 二聯基因工程疫苗的製備方法，其特徵在於:包含以下步驟: (1)豬瘟病毒病料CSFV-E2的RT-PCR擴增；豬O型口蹄疫病毒病料FMDV-OVPl的RT-PCR 擴增； (2)回收RT-PCR產物，與pMD19-T載體連接；將連接產物轉化入大腸埃希氏菌DH5α感受態細胞培養，挑取上述轉化平皿中的白色菌落，接種到含有氨苄青黴素的2 X YT液體培養基中，振蕩培養至混濁，提取質粒並進行酶切鑑定，篩選出陽性並進行測序； (3)將所構建重組質粒pMD19-CSFV-E2與pcDNA3.1 ( + )載體分別進行BamH I和EcoRI雙酶切，回收純化目的片段，將二者用T4 DNA連接酶連接，連接產物轉化至DH5 α感受態細胞，獲得陽性重組質粒pcDNA3.1-CSFV-E2，利用試劑盒提取質粒，進行BamH I和EcoR I雙酶切及PCR鑑定，並送測序驗證； (4)將所構建重組質粒pMD19-FMDV-0-VPl與pcDNA3.1-CSFV-E2分別進行BamH I和Hindm雙酶切，回收純化目的片段，將二者用T4 DNA連接酶連接，連接產物轉化至DH5a感受態細胞，獲得陽性重組質粒pcDNA3.1-CSFV-E2-FMDV-0-VP1，利用試劑盒提取質粒，進行BamH I和Hind II雙酶 切及PCR鑑定，並送公司測序驗證。
【文檔編號】A61K48/00GK103933581SQ201410182816
【公開日】2014年7月23日 申請日期:2014年5月4日 優先權日:2014年5月4日
【發明者】王開功, 尹鑫, 周碧君, 文明, 程振濤, 王慧 申請人:貴州大學