產納他黴素的重組利迪鏈黴菌及其構建方法與應用的製作方法

2023-10-22 18:09:52 2

專利名稱：產納他黴素的重組利迪鏈黴菌及其構建方法與應用的製作方法
技術領域：
本發明涉及基因工程菌及其構建方法與應用，特別涉及產納他黴素的重組利迪鏈黴菌及其構建方法與應用。
背景技術：
隨著農作物種植結構的調整和栽培方式的變化，許多作物真菌性病害的發生和危害日趨嚴重，如甘藍枯萎病(Fusarium oxysporum f. sp. conglutinans)、小麥紋枯病菌(R. cereal is)、桃褐腐病菌(M. fructicola)、蘋果輪紋病菌(B. berengeriana)、百合根腐病菌(F. oxysporum)等病原菌的危害也十分嚴重(耿麗華等,2009)。一般的化學農藥都難以湊效，且頻繁使用增加了病原菌的抗藥性，汙染了生態環境，因此亟待開發新的、環境友好型的高效微生物農藥已成為近年病害生防領域的一大熱點。納他黴素(natamycin)是一種多烯大環內酯類抗生素，也稱匹馬菌素或遊黴素(Pimaricin)，分子式為C33H47O1315研究報導natamycin對幾乎所有的酵母菌、黴菌具有抗性，是一種極具有潛力的廣譜抗菌劑，能夠顯著抑制甘藍枯萎病菌(F. oxysporumf.s. conglutinans)、蘋果輪斑病菌(A. mali)、辣椒灰黴病菌(B. cinerea)、葡萄灰黴病菌(B. cinerea)、黃瓜枯萎病菌(F. f. sp. cucumerinum)、爺子早疫病菌(A. solani)、番爺灰黴病菌(B. cinerea)、桃褐腐病菌(M. fructicola)、李子褐腐病菌(M. fructicola)等病原菌的生長，並且不易產生抗藥性，在防治植物真菌病害方面顯示了良好的應用前景(teWelscher et al. , 2008; Du et al. , 2009;隋勤等，2007)。此外，natamycin 作為食品防腐劑是我國批准使用僅有的2種食品生物防腐劑之一(另一個是乳酸鏈球菌素，Nisin)，還被應用於臨床醫療，用於治療真菌引起的皮膚和黏膜感染等(Davidson andDoan, 1993;程良英，2010)。

發明內容
本發明所要解決的一個技術問題是提供納他黴素產量高的重組利迪鏈黴菌及其構建方法。本發明所提供的構建重組利迪鏈黴菌的方法，包括將納他黴素合成正調控基因導入作為宿主菌的利迪鏈黴菌中篩選得到納他黴素產量高於所述宿主菌的重組利迪鏈黴菌的步驟；所述納他黴素合成正調控基因編碼如下a)或b)的蛋白質a)胺基酸序列如SEQ ID No.1所示的蛋白質；b)將SEQ ID No.1中的一個或幾個胺基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且與納他黴素合成相關的由a)衍生的蛋白質。其中，SEQ ID No.1由192個胺基酸殘基組成。上述方法中，所述納他黴素合成正調控基因的編碼序列為SEQ ID No. 2的第433-1011位。所述納他黴素合成正調控 基因的序列具體可為SEQ ID No. 2的第14-1011位。其中，SEQ ID No. 2由1019個核苷酸組成，第1_13位為Nde I識別位點和保護鹼基，第14-432位為紅黴素抗性基因啟動子，第433-1011位為納他黴素合成正調控基因的編碼序列，第1012-1019為EcoRI識別位點和保護鹼基。上述方法中，所述將納他黴素合成正調控基因導入作為宿主菌的利迪鏈黴菌包括如下步驟將所述納他黴素合成正調控基因的表達載體導入大腸桿菌中得到重組大腸桿菌，再將所述重組大腸桿菌與所述作為宿主菌的利迪鏈黴菌進行雙親接合獲得所述重組利迪鏈黴菌；所述納他黴素合成正調控基因的表達載體中，啟動所述納他黴素合成正調控基因的啟動子是紅黴素抗性基因啟動子。在本發明的一個實施例中，所述紅黴素抗性基因啟動子的核苷酸序列是SEQIDNo. 3。其中，SEQ ID No. 3由199個核苷酸組成。在本發明的實施例中，所述納他黴素合成正調控基因的表達載體為將所述納他黴素合成正調控基因插入PIB139的所述紅黴素抗性基因啟動子下遊得到的重組表達載體，具體是將SEQ ID No. 2所示的DNA片段經NdeI和EcoRI酶切後插入pIB139的NdeI和EcoRI位點得到的重組表達載體pIB139-slnM。在本發明的實施例中，所述作為宿王囷的利迪鏈黴囷可為利迪鏈黴菌(Streptomyces lydicus) A02CGMCC No. 1654,所述大腸桿菌為去甲基化E. coliET12567(pUZ8002)。本發明所要解決的另一個技術問題是提供由上述任一種方法得到的重組利迪鏈黴菌。

所述重組利迪鏈黴菌具體可為利迪鏈黴菌AM02，其在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心的登記入冊編號為CGMCC No. 6815。本發明所要解決的再一個技術問題是提供所述重組利迪鏈黴菌的用途。本發明所提供的用途是下述I)或2)或3):I)所述重組利迪鏈黴菌在生產那他黴素中的應用；2)所述重組利迪鏈黴囷在製備植物病原真囷抑制劑中的應用；3)所述重組利迪鏈黴菌在抑制植物真菌病害中的應用。上述應用中，所述植物病原真菌為下述至少一種甘藍枯萎病菌(Fusariumoxysporum f. sp. conglutinans)和西瓜枯萎病菌(F. oxysporum f. sp. niveum)；所述植物真菌病害為下述至少一種由甘藍枯萎病菌(Fusarium oxysporum f. sp.conglutinans)引起的病害和由西瓜枯萎病菌(F. oxysporumf. sp. niveum)引起的病害。實驗證明，利迪鏈黴菌(Streptomyceslydicus) AM02 CGMCC No. 6815 納他黴素產量在YEME培養基上約是野生型菌株利迪鏈黴菌(Streptomyces lydicus)A02 CGMCCNo. 1654的3倍(圖3)，在發酵培養基上約是野生型菌株利迪鏈黴菌(Streptomyceslydicus) A02 CGMCC No. 1654 的 2 倍(圖 4)。利迪鏈黴菌(Streptomyceslydicus)AMO2CGMCC No. 6815對甘藍枯萎病菌(Fusarium oxysporum f. sp. conglutinans)的抑菌活性是利迪鏈黴菌(Streptomyces lydicus)A02 CGMCC No. 1654的1. 8倍,對西瓜枯萎病菌(F. oxysporum f. sp. niveum)的抑菌活性是利迪鏈黴菌(Streptomyces lydicus)A02CGMCC No. 1654的2. 2倍。本發明的重組利迪鏈黴菌，具有比野生型顯著提高的產納他黴素和抑菌能力，由於納他黴素可以作為食品保鮮劑及飼料添加劑，因此，本發明的重組利迪鏈黴菌可以應用於食品、生物能源及飼料添加等方面。生物材料信息分類命名利迪鏈黴菌(Streptomyceslydicus)菌株編號AM02保藏機構中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心保藏機構簡稱CGMCC地址北京市朝陽區北辰西路I號院3號保藏日期2012年11月12日保藏中心登記入冊編號CGMCC No. 6815下面結合具體實施例詳細描述本發明，這些實施例用於理解而不是限制本發明。


圖1 為 pIB139_slnM 的 NdeI 和 EcoRI 酶切結果。其中，泳道M為DNA分子`量標準，I為pIB139_slnM。圖2為阿泊拉黴素抗性PCR驗證轉化子的電泳圖譜。圖3為利迪鏈黴菌(Streptomyces lydicus) AM02和利迪鏈黴菌(Streptomyceslydicus) AO2在YEME培養基中的納他黴素產量比較。圖4為利迪鏈黴菌(Streptomyces lydicus) AM02和利迪鏈黴菌(Streptomyceslydicus) AO2在發酵培養基中的納他黴素產量比較。圖5為利迪鏈黴菌(Streptomyces lydicus) AM02和利迪鏈黴菌(Streptomyceslydicus) AO2 的抑菌活性比較。A中的病原菌為甘藍枯萎病菌,左側為利迪鏈黴菌(Streptomyces lydicus) A02對甘藍枯萎病菌的抑菌圈，右側為利迪鏈黴菌(Str印tomyces lydicus)AM02對甘藍枯萎病菌的抑菌圈。B中的病原菌為西瓜枯萎病菌,左側為利迪鏈黴菌(Streptomyces lydicus) A02對西瓜枯萎病菌的抑菌圈，右側為利迪鏈黴菌(Streptomyces lydicus)AM02對西瓜枯萎病菌的抑菌圈。圖6A為利迪鏈黴菌活性產物的HPLC第一次分離譜圖。圖6B為利迪鏈黴菌活性產物的HPLC第三次分離譜圖。圖7為納他黴素樣品的紫外掃描圖譜。圖8為納他黴素樣品的紅外吸收光譜。圖9A為納他黴素樣品的高分辨質譜圖(負離子)。圖9B為納他黴素樣品的高分辨質譜圖(正離子)。圖10A為納他黴素樣品的核磁共振碳譜(500MHz)。圖10B為納他黴素樣品的核磁共振氫譜(500MHz)。
具體實施方式
以下的實施例便於更好地理解本發明，但並不限定本發明。下述實施例中的實驗方法，如無特殊說明，均為常規方法。下述實施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業途徑得到。下述實施例中的鏈黴菌表達載體pIB139 (Christopher J. Wilkinson, etal.1ncreasingthe Efficiency of Heterologous Promoters in Actinomycetes. J. Mol.Microbiol. Biotechnol. (2002)4(4) :417426.)公眾可從北京市農林科學院獲得，以重複本申請實驗。下述實施例中的去甲基化E. coliET12567(pUZ8002) (Sun-UkChoi,Chang-KwonLee,Yong-1l Hwang, Hiroshi Kinoshita, and Takuya Nihira (2004)Cloning and FunctionalAnalysis by Gene Disruption of a Gene Encodinga y -Butyrolactone Autoregulator Receptorfrom Kitasatospora setae.JOURNAL OFBACTERIOLOGY, 186:34233430.)公眾可從北京市農林科學院獲得，以重複本申請實驗。下述實施例中的病原菌甘藍枯萎病菌(Fusarium oxysporum f. sp.conglutinans)和西瓜枯萎病菌(F. oxysporumf. sp. niveum)(隋勤，劉偉成，裘季燕，劉霆，潘爭豔，劉學敏.利迪鏈黴菌A02的抑菌譜及其抑菌活性的穩定性.植物保護，2007, 33(5)67-71 ;盧彩鴿，劉偉成，劉霆，董丹，張濤濤，劉德文.利迪鏈黴菌AOl活性代謝產物對甘藍枯萎病菌的抑制作用及其機理.中國農業科學2012，45(18) :3764-3772)公眾可從北京市農林科學院獲得，以重複本申請實驗。實施例1、構建高產納他黴素的重組利迪鏈黴菌一、纖維素酶基因表達載體pIB139_slnM的構建本實施例構建的納他黴素合成正調控基因的表達載體名稱為pIB139_slnM，該載體中含有納他黴素合成正調控 基因slnM。納他黴素合成正調控基因slnM的序列如SEQIDNo. 2所示。SEQ ID No. 2由1019個核苷酸組成，第1_13位為Nde I識別位點和保護鹼基，第14-432位為紅黴素抗性基因啟動子，第433-1011位為納他黴素合成正調控基因的編碼序列，第1012-1019為EcoRI識別位點和保護鹼基。pIB139-slnM中啟動該納他黴素合成正調控基因轉錄的啟動子是紅黴素抗性基因啟動子(SEQ ID No. 3)。pIB139_slnM的具體構建方法如下^fSEQ ID No.1所示的兩端帶有NdeI和EcoRI酶切位點的slnM片段經NdeI和EcoRI酶切後與經過相同酶切的鏈黴菌表達載體pIB139(攜帶SEQ ID No. 3的紅黴素抗性基因啟動子PermE)連接，得到將pIB139的NdeI和EcoRI之間的片段替換為帶有自身啟動子納他黴素合成正調控基因slnM序列的重組表達載體pIB139_slnM。pIB139_slnM轉化大腸桿菌DH5 α ,以阿泊拉黴素(apramycin)抗性篩選從而獲得攜帶正調控基因及其自身啟動子序列的轉化子，該轉化子以pKGGAATTCCATATGCGGTCGGAGGTGCGGGCATGAC)和 p2 (GGAATTCTCACTTCACGAAGTCGTCCAC)為引物進行 PCR 擴增得到約IlOlbp的片段，用NdeI和EcoRI酶切pIB139_slnM得至Ij 5. 9kb的pIB139質粒片段及約998bp的帶有自身啟動子納他黴素合成正調控基因slnM序列(圖1)，從而確定該正調控基因雙啟動子表達載體構建成功。二、利用pIB139_slnM將帶有自身啟動子納他黴素合成正調控基因slnM導入利迪鏈黴菌(Streptomyces lydicus) A02CGMCC No. 1654得到納他黴素高產菌株-利迪鏈黴菌(Streptomyces lydicus) AM02CGMCC No. 6815將pIB139-slnM載體轉化去甲基化Ε· coliET12567 (pUZ8002)，通過兩親接合的方法，轉化利迪鏈黴菌A02，通過阿伯拉黴素抗性篩選得到陽性轉化子，PCR驗證得到正確的轉化子。具體轉化方法如下I)將 pIB139-slnM 載體轉化去甲基化 E. coliET12567 (pUZ8002)通過熱激法將pIB139-slnM 載體導入 E. coliET12567 (pUZ8002)並經過 60 μ g/ml阿泊拉黴素抗性篩選得到轉入pIB139-slnM載體的重組菌E. coliET12567 (pUZ8002) /pIB139_slnM。2)兩親接合構建那他黴素高產的重組利迪鏈黴菌參考文獻(Bierman M et al. 1992)進行兩親接合，具體方法如下將重組菌E. coliET12567(pUZ8002)/pIB139-slnM接種到含有氯黴素、卡那黴素和阿泊拉黴素抗性的LB液體培養基，370C，200rpm,培養過夜，次日早晨按1%的接種量接到新鮮LB培養基中培養至OD6qq=O. 4-0. 6，收集菌液，40C，4000rpm,離心2min，棄上清，用20mL冰冷的純的LB培養液重懸沉澱，4°C,4000rpm,離心2min,棄上清，目的是洗去抗生素。用2mL冰冷的純的LB培養液重懸沉澱。(2)將PDA斜面生長2周的利迪鏈黴菌(Sti^ptomyceslydicus)A02CGMCC No. 1654 (CN100467588C)孢子用無菌雙蒸水洗脫下來，並用加樣器吹打均勻，製備得到孢子懸浮液。(3)250 μ L鏈黴孢子懸液加入500 μ L2XYT培養液，輕輕混勻。50°C熱擊 lOmin，活化孢子。500 μ L 重組菌 E. coliET12567 (pUZ8002)/pIB139_slnM 菌液與500 μ L活化好的利迪鏈黴菌(Streptomyces lydicus)A02CGMCC No. 1654孢子懸液,輕輕混勻。4000rpm，室溫離心3min，去上清，混勻沉澱塗布於MS培養基+10mM/L MgCl2, 28°C倒置培養至次日早晨(18h)，之後塗抗生素溶液(將O. 5mg萘啶酮酸和60 μ g阿泊拉黴素溶於ImLddH2O中得到的液體)。2-3天後挑取單菌落到新的加入上述抗生素溶液的MS平板上。挑取在該 MS 平板上的菌落用上述 p3(AGCTCATCGGTCAGCTTCTC)和 p4(GGCATCGCATTCTTCGCATC)進行PCR擴增阿泊拉黴素抗性基因，將其中一株可以得到731bp的擴增產物的重組菌命名為利迪鏈黴菌(Streptomyces lydicus) AM02。利迪鏈黴菌(Streptomyces lydicus) AM02已於2012年11月12日保藏於中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏中心登記入冊編號CGMCC No. 6815。利迪鏈黴菌(Streptomyceslydicus) AM02CGMCC No. 6815 菌體的形態特徵如下革蘭氏染色陽性；在GYM瓊脂培養基上生長7天後，基內菌絲髮育良好，無橫隔，不斷裂；氣生菌絲生長良好，多分枝；孢子絲柔曲或彎曲，孢子橢圓形。三、利迪鏈黴菌(Streptomyceslydicus) AM02CGMCC No. 6815 的合成納他黴素能力所用的培養基如下高氏一號斜面培養基=K2HPO4O.5g，NaClO. 5g，KNO31. Og,FeSO4 · 7Η200· 01g, MgSO4 · 7Η200· 5g，可溶性澱粉 20g，瓊脂 20g，水 1000ml ；pH7. 2-7. 4。種子培養基15g黃豆粒( 加蒸懼水煮沸0. 5-lh,取濾液),5g蛋白腖,2. 5g硫酸銨，20g葡萄糖，IOg澱粉，0. 25g硫酸鎂，0. 2g磷酸二氫鉀，5g氯化鈉，配成水溶液，調pH7_8後，加Ig碳酸韓，加水定容至1000ml。發酵培養基15g黃豆粒(加蒸懼水煮沸0. 5-lh,取濾液),5g蛋白腖,2. 5g硫酸銨，IOg蔗糖，IOg澱粉，O. 25g硫酸鎂，O. 2g磷酸二氫鉀，5g氯化鈉，配成水溶液，調pH7_8後，力口Ig碳酸I丐，加水定容至1000ml。不加蔗糖的YEME培養基3g酵母提取物，5g蛋白腖，3g麥芽提取物，IOg葡萄糖，加水定容至1000ml,滅菌後加2ml2. 5M MgCl2。A、在發酵培養基中生產納他黴素將利迪鏈黴菌(Streptomyceslydicus) AO2CGMCC No. 1654 和利迪鏈黴菌(Streptomyces lydicus) AM02CGMCC No. 6815分別接種到高氏一號斜面培養基上，28°C培養7-10天，待其產生足量的孢子，用無菌鉬環刮取其孢子2 - 3環接種於250ml三角瓶內的50ml種子培養基內，置可控溫搖床上,在28°C條件下，200rpm (旋轉半徑13mm)恆溫振蕩培養24h-30h ;然後在無菌條件下將其分接於60個500ml三角瓶內的發酵培養基內(每瓶裝液量為100ml),利迪鏈黴菌(Streptomyces lydicus) A02CGMCC No. 1654和利迪鏈黴菌(Streptomyceslydicus) AM02CGMCC No. 6815 的接種量相同，每瓶接種後 OD6tltl 值均為 O.1 ；接種後的搖瓶在31°C條件下，以240rpm (旋轉半徑13mm)的轉速振蕩培養0、24、48、72、96、120h，取發酵液測定納他黴素的產量。實驗重複三次。B、在不加蔗糖的YEME培養基中生產納他黴素將利迪鏈黴菌(Streptomyceslydicus) A02CGMCC No. 1654 和利迪鏈黴菌(Streptomyces lydicus) AM02CGMCC No. 6815 分別接種到高氏一號斜面培養基上，28°C培養7-10天，待其產生足量的孢子，用無菌鉬環刮取其孢子2 - 3環接種於250ml三角瓶內的50ml種子培養基內，置可控溫搖床上，在28°C條件下，200rpm (旋轉半徑13mm)恆溫振蕩培養24h-30h ;然後 在無菌條件下將其分接於70個500ml三角瓶內的不加蔗糖的YEME培養基內(每瓶裝液量為100ml)，利迪鏈黴菌(Str印tomyceslydicus) A02CGMCCNo. 1654 和利迪鏈黴菌(Streptomyces lydicus) AM02CGMCC No. 6815 的接種量相同，每瓶接種後0D600值均為0.1 ;接種後的搖瓶在31°C條件下，以240rpm (旋轉半徑13mm)的轉速振蕩培養0、24、48、72、96、12011，取發酵液測定納他黴素的產量。實驗重複三次。C、納他黴素產量分析將以上步驟獲得的ImL發酵液加入9mL甲醇，充分振蕩後，進行30min超聲波提取，5000rpm/min離心10 — 15min沉降菌絲體及固形物，上清液稀釋10倍後用0. 45 μ m的無菌微孔濾膜過濾，收集濾液，所得樣品用於HPLC檢測。色譜柱C18柱(5 μ m, 4. 6mm X 200mm);檢測波長303nm;流速1. OOmT ,/mi η ;進樣量10μ ;檢測柱溫30°C ;實驗流動相為V(甲醇)V(水)=65 35。以納他黴素(sigma_P9703)為標準品採用外標法(標準曲線法)對納他黴素進行定量。實驗結果表明，利迪鏈黴菌(Streptomyceslydicus) AM02CGMCC No. 6815 搖瓶發酵在不加蔗糖的YEME培養基上發酵72小時產量為1. 148g/L培養基，在發酵培養基上發酵96 小時產量為 5. 338g/L 培養基；利迪鏈黴菌(Sti^ptomyces lydicus) A02CGMCC No. 1654搖瓶發酵在不加蔗糖的YEME培養基上發酵72小時產量為0. 375g/L培養基，在發酵培養基上發酵96小時產量為2.546g/L培養基。說明利迪鏈黴菌(Sti^ptomyces lydicus)AM02CGMCC No. 6815納他黴素產量在不加蔗糖的YEME培養基上約是野生型菌株利迪鏈黴菌(Sti^ptomyces lydicus)A02CGMCC No. 1654的3倍(圖3)，在發酵培養基上約是野生型菌株利迪鏈黴菌(Streptomyces lydicus) A02CGMCC No. 1654 的 2 倍(圖 4)。
其中，利迪鏈黴菌發酵液中納他黴素的粗提和鑑定方法如下一)發酵液中納他黴素的粗提將上述利迪鏈黴菌的發酵液分別用3倍體積的無水乙醇預處理，4°C靜置2h，以沉澱菌體、固形顆粒、可溶性粘膠狀物、核酸和雜蛋白質以及中間代謝產物等，上清液用2層濾紙以布氏漏鬥真空抽濾，濾液經旋轉蒸發儀在45°C下減壓濃縮，濃縮液即為納他黴素粗提物，4°C保存備用。二 )、納他黴素粗提物的分離純化通過大孔樹脂柱層析、矽膠柱層析和高效液相色譜儀HPLC進行逐步分離純化。1、大孔樹脂吸附柱層析選用40cmX2. 6cm玻璃層析柱，X_5大孔樹脂(天津南開大學化工廠)。大孔樹脂按廠家說明預處理後用適量去離子水調勻，緩慢加入裝有1/3體積去離子水的層析柱中，同時從柱底部以勻速緩慢放出蒸餾水，使柱中液面始終保持在樹脂層上面。裝至約3/4柱高度，自然沉降6 10h，使平衡後的裝柱體積為150ml。取納他黴素粗提物與樹脂按1:1的體積比進行動態吸附。洗脫過程為2倍柱體積的無離子水洗脫除去部分色素和大量水溶性雜質；2倍柱體積的30% (體積百分含量)甲醇洗脫去色素；最後用2倍柱體積的70% (體積百分含量)乙醇洗脫活性成分。分管收集洗脫液，每管15ml，濾紙片法進行活性測定。結果表明活性洗脫液集中在第48 56管(即自4. 8倍柱體積至5. 6倍柱體積之間的洗脫液)。將活性洗脫液，45°C下減壓濃縮後供下一步分離。2、矽膠吸附柱層析 選用40cmX2. 6cm玻璃層析柱，100目 200目矽膠，以體積比為8 I I的乙醇、氨水和水的混合液為洗脫液；取約150g矽膠用去離子水浸泡3h，傾去細小顆粒，布氏漏鬥真空抽濾除去水分；再用6mol/LHCl浸泡12h，然後用去離子水洗至中性，真空抽乾；用無水乙醇浸泡過夜，真空抽乾；臨用前在120° C下活化2h，乾燥至恆重；層析柱中裝入1/3柱體積的洗脫液，然後緩慢加入用洗脫液混合均勻的矽膠，約至3/4柱高時停止加入，靜置6 10h，使矽膠緩慢沉降。然後用2 3倍體積的洗脫液以lmL/min的流速衝洗柱體，使之平衡。平衡後的柱體積為150ml。取步驟I的大孔樹脂活性洗脫濃縮液IOml上柱進行動態吸附，用2 3倍柱體積的洗脫液按O. 5ml/min的流速進行洗脫，用自動部分收集器分管收集洗脫液，每管5ml。以釀酒酵母菌ACCC20036為指示菌，利用濾紙片瓊脂擴散法檢測每管洗脫液活性。結果表明其洗脫液中的活性組分集中在第7 36管(即自O. 23倍柱體積至1. 2倍柱體積之間的洗脫液)。將活性洗脫液，45°C下減壓濃縮後供下一步分離。3、製備型HPLC分離純化採用LC-9101 型循環製備 HPLC，JAIGEL-ODS-AP 型 SP-120-15 製備柱。取步驟2的矽膠柱層析後的活性洗脫濃縮液，用O. 45 μ m微孔濾器過濾，自動進樣器進樣，每次進樣量6ml ;以甲醇水(體積比為7 3)為流動相進行分離，利用UV檢測器在波長305nm處檢測並自動形成分離圖譜；利用餾分收集器分別收集圖譜中各曲線峰所對應的洗脫液；以釀酒酵母菌ACCC20036為指示菌，利用濾紙片瓊脂擴散法檢測每管洗脫液活性。以2ml/min的泵流速進行第一次分離後，再以3ml/min的泵流速相繼分離2次。實驗結果表明，第一次HPLC分離共檢測到30個峰，其中保留時間為57. 866min的強吸收峰為活性峰(圖6A)，其相對峰面積為35. 121% ;對其進行的第二次分離檢測到6個峰，其中保留時間為41. 699min的峰為活性峰，其相對峰面積為97. 020% ;第三次分離檢測到保留時間為39. 766min的峰為活性峰(圖6B)，通過峰面積計算其純度為99. 845%。將第三次分離得到的活性峰樣品進行真空濃縮，乾燥後呈白色或奶油色粉末，該樣品即為納他黴素樣品。利用島津分析型HPLC採用下述方法對其進行純度驗證取少量樣品溶於70%甲醇水溶液，以甲醇(A)和水(B)為流動相進行梯度洗脫。色譜條件為C18反相柱，柱溫30°C，UV檢測器，檢測波長305nm，SIL-1OADVP自動進樣器進樣10 μ 1，以Iml/min的流速洗脫60min。梯度洗脫步驟如下
時f"j (分)Λ(%)Β(%)
O 103565
11 205050
21 306535
3卜 408020
41 50955
SI 60100O`
結果顯示洗脫曲線為單一的峰，說明其為單一組分，純度達到化學結構測定的要求。四、純化樣品化學結構的解析鑑定1、紫外吸收光譜(UV)將上述步驟三純化的納他黴素樣品極微量溶於超純水中，用日立UV — VIS3010紫外可見分光光度計在190nm 400nm波長範圍內以超純水為空白對照進行全波長掃描，自動形成紫外吸收圖譜。由紫外掃描圖譜可見，納他黴素樣品表現出典型的四烯類抗生素譜型，即在波長281nm、291nm、305nm和319nm附近均有典型的共軛四烯發色基團的吸收峰,其中波長305nm處吸收值最大，281nm處吸收值最小(圖7)，說明該物質屬於多烯類中的四烯抗生素。2、紅外吸收光譜(IR)採用KBr壓片法，用德國BRUKER公司TENS0R27傅立葉紅外光譜儀進行400cm 1^OOOcm 1區域內掃描。納他黴素樣品的紅外光譜如圖8所示，其中v_3416. 78CHT1為-OH的特徵吸收峰；vmax3288. 23cm-1為N-H的伸縮振動特徵吸收峰；vmax2940. 44和2980. 27cm-1是-CH3的特徵吸收峰；vmax3017. 23CHT1是-CH2的特徵吸收峰；vmax1715. 38^1表現典型的羰基強吸收峰；vmax1571. 44cm—1表現-C=C-的強吸收峰；vmax1634. 40cm—1表現-C=C-的弱吸收峰。3、高分辨質譜採用德國BRUKER公司超高解析度9. 4T混合型四級杆傅立葉串聯質譜儀(9. 4TQ-FT-MS);條件capillary4000,Dry Gas :4. 01/s,源溫180° C, scan range :300 2000, syringe pump :1. 5ml/min,數據分析軟體為 Bruker DaltonicsDataAnalysis3. 4。結果表明，納他黴素樣品進行分析的圖譜中，採用正離子檢測方式檢測到加合離子[Μ+Na]+為m/z688. 2937 (圖9B);採用負離子檢測方式檢測到準分子離子[M_H]+為m/z664. 2975的化合物(圖9A);採用正、負離子檢測方式對納他黴素樣品進行檢測分析，確定664. 2975為分子離子峰。綜上所述，納他黴素樣品的主要活性組分的分子式均為C33H47NO13，分子量為665 ；由公式不飽和度(n) =1+Nc+ (Nn-Nh) /2 (Ne :碳原子數；Nn :氮原子數；Nh :氫原子數)計算其分子式的不飽和度為11，表明其分子結構中含有多個不飽和鍵與環等。4、核磁共振譜(NMR)以氘代-二甲基甲 醯胺(d-DMF)為溶劑，以四甲基矽烷(TMS)為內標，室溫下測定。採用Bruker AVANCE DRX-500核磁共振譜儀(德國Bruker光譜儀器公司)，以氘代-二甲基甲醯胺(d-DMF)為溶劑，四甲基矽烷(TMS)為內標，進行氫譜(1HNMR)和碳譜(13CNMR)的測定；前者共振頻率為500. 1325156MHZ，採樣次數32768次；後者共振頻率125. 7577612MHZ，採樣次數為 65536 次。實驗結果表明，納他黴素樣品的核磁共振13C圖譜(圖10A)中可以看出，分子中有一個羧基碳原子的化學位移(δ 165. 217)；一個羰基碳原子的化學位移(δ 178. 603)；一組共軛四烯碳原子的化學位移(δ 125. 089 145. 447);一組與羥基相連的碳原子的化學位移(δ 66. 102 70. 326);糖環上五個碳原子共振峰(δ 71. 194 97. 894);甲基碳原子共振峰(δ 18.062，δ 20. 360)。500兆赫的核磁共振1H圖譜(圖10Β)中可以看出，多烯環上和四個雙鍵相連的質子氫(-CH=CH-)的化學位移(δ 5. 686 6. 625ppm);五個羥基中的質子氫的化學位移值(δ 4. 187 4. 741ppm);五個亞甲基和兩個甲基中的質子氫的化學位移(δ1. 274 2. 439ppm)。綜合分析上述實驗數據，納他黴素樣品的主要活性組分為納他黴素，其化學結構式為
權利要求
1.構建重組利迪鏈黴菌的方法，包括將納他黴素合成正調控基因導入作為宿主菌的利迪鏈黴菌中篩選得到納他黴素產量高於所述宿主菌的重組利迪鏈黴菌的步驟； 所述納他黴素合成正調控基因編碼如下a)或b)的蛋白質 a)胺基酸序列如SEQID No.1所示的蛋白質； b)將SEQID No.1中的一個或幾個胺基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且與納他黴素合成相關的由a)衍生的蛋白質。
2.根據權利要求1所述的方法，其特徵在於所述納他黴素合成正調控基因的編碼序列為 SEQ ID No. 2 的第 433-1011 位。
3.根據權利要求1或2所述的方法，其特徵在於所述納他黴素合成正調控基因的序列為 SEQ ID No. 2 的第 14-1011 位。
4.根據權利要求1-3中任一所述的方法，其特徵在於所述將納他黴素合成正調控基因導入作為宿主菌的利迪鏈黴菌包括如下步驟將所述納他黴素合成正調控基因的表達載體導入大腸桿菌中得到重組大腸桿菌，再將所述重組大腸桿菌與所述作為宿主菌的利迪鏈黴菌進行雙親接合獲得所述重組利迪鏈黴菌；所述納他黴素合成正調控基因的表達載體中，啟動所述納他黴素合成正調控基因的啟動子是紅黴素抗性基因啟動子。
5.根據權利要求1至4中任一所述的方法，其特徵在於所述作為宿主菌的利迪鏈黴菌為利迪鏈黴菌(Streptomyces lydicus) A02CGMCC No. 1654。
6.由權利要求1至5中任一所述方法得到的重組利迪鏈黴菌。
7.根據權利要求6所述的重組利迪鏈黴菌，其特徵在於所述重組利迪鏈黴菌的菌株號為AM02，其在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心的登記入冊編號為CGMCCNo.6815。
8.權利要求6或7所述的重組利迪鏈黴菌在生產那他黴素中的應用。
9.權利要求6或7所述的重組利迪鏈黴菌在製備植物病原真菌抑制劑中的應用；或在抑制植物真菌病害中的應用。
10.根據權利要求9所述的應用，其特徵在於所述植物病原真菌為下述至少一種甘藍枯萎病菌(Fusarium oxysporum f. sp. conglutinans)和西瓜枯萎病菌(F. oxysporumf. sp. niveum)； 所述植物真菌病害為下述至少一種由甘藍枯萎病菌(Fusarium oxysporum f. sp.conglutinans)引起的病害和由西瓜枯萎病菌(F. oxysporum f. sp. niveum)引起的病害。
全文摘要
本發明公開了產納他黴素的重組利迪鏈黴菌及其構建方法與應用。本發明的構建產納他黴素的重組利迪鏈黴菌的方法，包括將納他黴素合成正調控基因導入作為宿主菌的利迪鏈黴菌中篩選得到納他黴素產量高於所述宿主菌的重組利迪鏈黴菌的步驟；所述納他黴素合成正調控基因編碼如下a)或b)的蛋白質a)胺基酸序列如SEQ IDNo.1所示的蛋白質；b)將SEQ ID No.1中的一個或幾個胺基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且與納他黴素合成相關的由a)衍生的蛋白質。本發明的重組利迪鏈黴菌，具有比野生型顯著提高的產納他黴素和抑菌能力，可以應用於食品、生物能源及飼料添加等方面。
文檔編號C12N15/76GK103060364SQ20121057981
公開日2013年4月24日 申請日期2012年12月27日 優先權日2012年12月27日
發明者吳慧玲, 劉偉成, 燕繼曄, 董丹, 劉霆, 盧彩鴿, 張殿朋, 張濤濤, 田兆豐, 盧向陽 申請人:北京市農林科學院