鋅指蛋白－dna相互作用的遺傳篩選模型及其應用的製作方法

2023-10-31 04:19:22 1

專利名稱：鋅指蛋白－dna相互作用的遺傳篩選模型及其應用的製作方法
技術領域：
本發明涉及分子生物學領域的一種遺傳模型及其應用，特別是涉及研究鋅指蛋白-DNA相互作用的遺傳模型及其應用。
本發明所提供的鋅指蛋白-DNA相互作用的遺傳篩選模型，是含有報導質粒的大腸桿菌，所述報導質粒含有壯觀黴素抗性基因aadA，壯觀黴素抗性基因aadA的上遊含有aadA基因自身啟動子PaddA，壯觀黴素抗性基因aadA的下遊含有方向與啟動子PaddA相反，且強度高於PaddA的組成性啟動子；在所述組成性啟動子的操縱序列中插入鋅指蛋白小鼠轉錄因子Zif268的結合序列。
為了更利於操作，所述報導質粒是單拷貝的。
本發明巧妙地以經典型鋅指小鼠轉錄因子Zif268為材料，利用轉錄幹擾現象(Elledge SJ，et al.Position and density effects on repression by stationaryand mobile DNA-binding proteins.Genes Dev.1989，3(2)185-197；Elledge SJ，et al.Genetic selection for genes encoding sequence-specific DNA-bindingproteins.Proc Natl Acad Sci U S A.1989，86(10)3689-3693)，在大腸桿菌中建立了一種簡單、通用的研究鋅指蛋白-DNA相互作用的遺傳篩選模型，可以用來揭示鋅指蛋白的DNA識別規律，篩選、設計序列特異性的DNA結合蛋白，對特定基因如HIV等致病基因的表達進行人為幹預，實現特定疾病的有效預防與治療，具有重要的理論和實踐意義。
本發明的原理如

圖1所示報導質粒上含有壯觀黴素抗性基因aadA，在該基因的上、下遊各含有一個啟動子PaddA、PconII，其中上遊的啟動子PaddA是aadA基因自身的啟動子，下遊的啟動子PconII是一個合成的組成性啟動子，強度上要遠高於上遊的啟動子，方向與之相反，因此正常情況下，下遊的啟動子會組成性幹擾aadA基因的轉錄，使得含有報導質粒的宿主表現為壯觀黴素敏感Sps，此即所謂的轉錄幹擾。在組成性啟動子PconII相應於操縱序列Op的位置插入Zif268的結合序列，使PconII由組成性啟動子變成了可調節啟動子，用PconII-ZF表示，即構建了一個可被鋅指蛋白調節的報導質粒，含有該報導質粒的宿主表現為壯觀黴素敏感Sps，如果向宿主中再引進一個表達文庫，其中有一個克隆可以產生一個鋅指蛋白突變體，該突變體可以特異性的識別並結合0p位點，此時，PconII-ZF啟動的轉錄就會被阻斷，aadA基因就會在自身啟動子的作用下轉錄，宿主就轉變為壯觀黴素抗性Spr。根據壯觀黴素抗性的出現，就可以篩選得到識別特定位點的鋅指蛋白突變體。
本發明的報導質粒可以特異性地從約104-105的混合物中將表達質粒篩選出來，具有充分的靈敏性。本發明構建的體內遺傳篩選模型，無論是在可建立文庫大小、揭示胺基酸-鹼基作用規律還是在真實反映生理條件下鋅指蛋白-DNA作用特點等方面都比噬菌體顯示具有一定的優越性。
圖2為報導質粒pConII-ΔZB的序列測定電泳圖。
圖3為Zif268的DNA結合區的PCR擴增電泳圖。
圖4為表達質粒pGEX-D的雙酶切鑑定(EcoR I+BamH I)電泳圖譜。
圖5為表達質粒pGEX-D的序列測定圖譜。
圖6為融合蛋白GST-D純化後的電泳圖譜。
圖7為鋅指蛋白DNA結合區的凝膠滯留試驗電泳圖譜。
圖8為鋅指蛋白突變文庫的重疊式PCR擴增結果電泳圖。
表達鋅指蛋白的LB-Zif培養基其組成為在LB的基礎上添加100μM ZnCl2，100μg/ml L-酪氨酸，20mM的HEPES(用NaOH調pH 7.0)以及不同濃度的IPTG，氨苄青黴素100μg/ml。工具酶、常用生化試劑等為Biolab、Promega等公司及國產分析純產品。常規分子生物學技術參見《分子克隆實驗指南》(科學出版社，1992)
實施例1、報導質粒的構建選擇Zif268的核心識別序列5』-AGCGTGGGCGG-3』作為操縱序列，合成兩條互補的寡核苷酸片段P1、P2。合成片段混合退火，DNA聚合酶大片段聚合延伸。延伸片段經Not I、Hind III酶切消化、15％聚丙烯醯胺凝膠純化後，與用同樣限制性內切酶消化並經電泳純化的質粒pNN389大片段連接、轉化大腸桿菌。挑取單克隆，經酶切鑑定、序列測定，得到序列正確的報導質粒pConII-ΔZB(其鑑定圖譜如圖2所示)。在報導質粒中，Zif268的結合位點作為啟動子ConII的操縱序列，位於-4位。
P15』-GGTGGCAAGCTTGCATG-3』P25』-GGTAGCGGCCGCCTGTTGACAATTAATCATCGGCTCGTATAATGCAAGCGTGGGCGGCTGCAGGCATGCAAGCTTGCCACC-3』P2中自5』端第5-12位鹼基為Not I位點，自5』端第70-75位鹼基為HindIII位點，自5』端第47-57位鹼基為Zif268的結合位點ZB。
實施例2、報導質粒的壯觀黴素敏感性試驗將報導質粒pConII-ΔZB轉化JM109後，挑取單克隆培養過夜，取過夜培養物稀釋後進行鋪板試驗，結果如表1所示。
表1、不同報導質粒的壯觀黴素敏感性實驗 質粒 抗生素濃度(μg/ml)組別 Cm40 Sp50Sp80 Sp120 Sp150 Sp200 Sp3001pNN389 + ++ + + + +2pConII-ΔZB+ ++ - - - -3pConII-1 + +- - - - -+grow；- not grow pConII-1positive contra由表1可以看出由於pNN389含有氯黴素抗性基因，壯觀黴素抗性基因aadA正常表達，因此JM109(pNN389)在所有抗性平板上都穩定生長(實驗2)，與預期一致。報導質粒pConII-ΔZB與陽性對照pConII-1一樣(pConII-1的操縱序列為434抑制物的結合位點)，對壯觀黴素的敏感性(120μg/ml，80μg/ml)都低於原始質粒pNN389(300μg/ml)，說明在沒有轉錄抑制物即Zif268時，含有ZB作為操縱序列的啟動子能夠有效啟動，反向幹擾壯觀黴素抗性基因aadA的轉錄，使得報導質粒表現為不同程度的壯觀黴素敏感性，而且pConII-ΔZB具有較寬的篩選「窗口」(120-300μg/ml)。
作為一個報導質粒，還有一個需要考慮的問題就是由於與染色體整合、拷貝數增加、回復突變等導致的「背景噪聲」，而表2則進一步表明pConII-ΔZB在壯觀黴素為120μg/ml時的「回復」突變頻率極低，完全可以用作遺傳篩選的報導質粒，為下一步進行胞內的實驗打下了基礎。
表2、報導質粒pConII-ΔZB的「背景噪聲」克隆數目*質粒 Cm40 Sp120pConII-ΔZB1 (25±3.2)×10-6pNN389 1 1pConII-1 1 (13.1±4.2)×10-6*以Cm平板對應的克隆數為1 N＝3實施例3、Zif268的DNA結合區在大腸桿菌中的表達Zif268的DNA結合區域由三個串聯的鋅指蛋白組成，根據Zif268的序列，合成引物PDN、PDC，兩端分別添加EcoR I、BamH I酶切位點，PDC的末尾添加終止密碼TGA、TAA。其序列如下PDN5』-AAGGATCCGAACGCCCATATGCTTG-3』，對應於DNA結合區的氨基端PDC5』-ACGGAATTCTTATCAGTCCTTCTGTCTTAAATGG-3』，對應於DNA結合區的羧基端以PDN、PDC為引物，以含有zif268全長cDNA的質粒pBKS-Zif268為模板，53℃退火，72℃延伸得到含有三個鋅指的DNA結合區片段D(結果如圖3所示)。PCR擴增片段採用Promega公司WizardTMPCR Preps DNA純化系統進行純化，純化後的產物經BamH I、EcoR I酶切以後插入到pGEX-2T的相應位點，連接轉化大腸桿菌DH5αMCR，挑取單克隆，進行質粒大小、酶切鑑定及序列測定，得到序列完全正確的表達質粒pGEX-D，檢驗結果如圖4、圖5所示)。
挑選單克隆接種5ml LB-Zif培養基，培養過夜，按2％的比例取過夜培養物接種於搖瓶培養2-3小時至OD600＝0.3-0.5，用40μM的IPTG誘導，25-30℃誘導培養3-4hr，結果證實(如圖6所示)目的蛋白在大腸桿菌中獲得了表達。
實施例4、融合蛋白的純化離心收集培養菌體，菌體超聲破菌，添加Triton X-100至終濃度1％，溫和攪拌助溶。離心，保留含有目的蛋白的上清，與準備好的穀胱甘肽Sepharose 4B混合，使目的蛋白與之結合。一部份用含有穀胱甘肽的洗脫液洗脫，得到融合蛋白，另一部份用凝血酶切割，再行洗脫分離，分別得到穀胱甘肽轉移酶及鋅指DNA結合區，純化結果表明(如圖6所示)利用親和層析可以得到特異的融合蛋白GST-D，而且融合蛋白在凝血酶的作用下，可在融合位點處特異的被切割，得到游離的目的蛋白D。此外，在超聲破菌上清含有明顯的融合蛋白，這表明在特定的培養條件下，目的蛋白在胞內呈部份可溶性表達。
實施例5、Zif268 DNA結合區的DNA結合特性取純化得到的含有Zif268的DNA結合區的融合蛋白GST-D、或單獨DNA結合區蛋白，進行DNA結合凝膠遷移遲滯實驗，對其體外的結合特性進行分析。結果如圖7所示，圖中A部分是單獨的DNA結合區，B部分是融合蛋白，表明無論是融合蛋白，還是單獨的DNA結合區，都保持了與特定靶位點結合的特性，由於整個純化過程中，並沒有對目的蛋白進行復性等步驟，這表明Zif268 DNA結合區在大腸桿菌中得到了功能性表達，並且GST與DNA結合區的融合，沒有明顯影響鋅指蛋白的DNA結合特性。
實施例6、體內遺傳篩選模型的建立取pGEX-D(鋅指蛋DNA結合區的表達質粒)、pGEX-2T(穀胱苷肽轉移酶融合表達載體)分別轉化含有報導質粒pConII-ΔZB以及pConII-1、pNN389的大腸桿菌JM109，進行鋪板實驗，結果如表3所示。
表3、鋅指蛋白的體內遺傳篩選模型實驗 JM109所含不同質粒 轉化子數目％組別 AprCmrAprSprAprSpr/AprCmr1無質粒0 0-2pGEX-2T 0 0-3pGEX-D0 0-4pNN3890 0-5pConII-1 0 0-6pConII-ΔZB 0 0-7pNN389+pGEX-2T1/1 1/1 100/1008pNN389+pGEX-D 1/1 1/1 100/1009pConII-1+pGEX-2T 1/1 10-5/10-5010 pConII-1+pGEX-D 1/1 10-5/10-5011 pConII-ΔZB+pGEX-2T 1/1 10-5/10-5012 pConII-ΔZB+pGEX-D1/1 1/10-5100/0N/MIPTG誘導/IPTG不誘導下的克隆數目或百分比，以AprCmr上的轉化子數為1由實驗1-6發現單獨JM109或只含有一種質粒時，在雙抗平板AprSpr、AprCmr均不能生長，與預期一致，這表明所選擇的宿主、質粒不存在明顯的「背景噪聲」。
在組別7-11中，JM109同時含有表達、報導兩種質粒時，在AprCmr上穩定生長，說明兩種質粒的抗性標記良好，且是相容性質粒，可在JM109中穩定共存，而且無論有無IPTG誘導，在兩種雙抗平板上生長無明顯差別，說明GST及其融合蛋白的表達，不會非特異地影響質粒pNN389、pConII-1、pConII-ΔZB的複製、抗性基因的表達等功能。
在實驗7-8中，JM109在AprSpr、AprCmr兩種雙抗平板上生長無差異，而實驗9-11中，AprSpr平板上幾乎無菌落出現。這是由於pNN389中無反向啟動子，壯觀黴素抗性基因會組成性表達，因此表現為壯觀黴素抗性，而質粒pConII-1、pConII-ΔZB由於含有反向啟動子，壯觀黴素基因的表達得到抑制，因此在AprSpr平板上只有極少量菌落出現(10-5)，這也同時表明報導質粒pConII-1、pConII-ΔZB的「背景噪聲」極低，與實施例2結果相符。
在實驗12中，JM109中含有鋅指蛋白特異的表達質粒和報導質粒，當沒有IPTG誘導時，在AprSpr平板上也只有少量菌落生長，屬於pConII-ΔZB的「背景噪聲」，但是當有IPTG誘導時，所有AprCmr克隆都會呈現為AprSpr抗性(AprSpr/AprCmr＝100％)。實驗1-12共同表明質粒pGEX-D介導的鋅指蛋白DNA結合區的表達特異性地與報導質粒pConII-ΔZB上的鋅指結合位點結合，阻止反向啟動子PconII-ΔZB的組成性啟動，使得抗性基因aadA得以在自身啟動子的啟動下表達，表現為壯觀黴素抗性，這也說明至此已經建立了鋅指蛋白的體內遺傳篩選模型。
實施例7、體內遺傳篩選模型的篩選效率評估由於最終目的是利用上述實驗，進行突變體的篩選，因此需要確定整個試驗的特異性、敏感性。為了考察利用上述試驗從巨大文庫中篩選稀有克隆的潛力，將質粒pGEX-D用不同量的pGEX-2T稀釋，然後進行鋪板，探討能否特異性地將表達鋅指蛋白的質粒從一個混合物中篩選出來，結果發現報導質粒可以特異性地從約104-105的混合物中將表達質粒篩選出來，具有充分的靈敏性，已經足夠突變文庫的篩選之用。對於那些稀有克隆(1/108)，經過多輪篩選(3-4輪)，即可以從一個文庫中被篩選出來。
實施例8、鋅指1關鍵位置完全隨機化突變文庫的建立為較為徹底地探討識別螺旋中胺基酸—鹼基之間的相互作用，同時考慮到可操作文庫的大小，在維持識別螺旋中保守性His+7不變的情況下，使+4位的胺基酸為leu或Arg，+9位的胺基酸為Arg或Lys，將-1-+8位其它位置隨機化。據此設計引物PMS、PMR，用於鋅指1的突變，其序列如下PMS3』 CGC CTA -5』PMR5』- CT/CTKNN (KNN)2AA/CG(KNN)4AGAAAAGCGGCGCTAGCAGGA-3』採用重疊式PCR技術，通過三次PCR反應，對鋅指1(ZF1)的關鍵位置的核苷酸進行突變，其PCR結果如圖8所示。由圖中可以發現在重疊式PCR中，第二次擴增產物約為240bp，與預期一致，以第一、二次產物為模板的第三次擴增產物D*雖然大小上約280bp，但不是呈現緊密單一條帶，推測是因為PCR產物本身具有較大的分子多樣性，達到1011，而不同分子之間的電荷性質具有微小的差別，因此在泳動性上表現不均一。
PCR產物回收後，經E.coR I、BamH I酶切，與經同樣限制性內切酶處理過的表達載體pGEX-2T連接，連接產物經用0.5×TE重新溶解降低電導以後，選擇2.4KV、4kΩ條件電擊、轉化MC1061。同時電擊轉化10次，獲得了約108-109的轉化子，此即初級文庫。
回收所有轉化子，在含有100μg/ml的1L LB培養基中大量培養過夜，擴增初級文庫。收集過夜培養物，進行質粒的大量製備與純化，得到表達質粒文庫pGEX-D*，分成不同等份，-20℃保存備用。
實施例9、識別保守亞位點GCG同功突變體的篩選取含有報導質粒的大腸桿菌JM109(pConII-ΔZB)，製備電轉化感受態，然後用製備好的表達質粒文庫DNA進行電轉化、篩選。
由於報導質粒偶爾會由於拷貝數增加、整合以及點突變等導致表型由壯觀黴素敏感改變為壯觀黴素抗性即假陽性的出現，使「背景噪聲」提高，為排除這一幹擾，我們在每一輪篩選以後，都將表現為壯觀黴素抗性的克隆重新製備質粒，轉化到含有報導質粒的菌株中，進行下一輪的篩選。另外，由於抗性轉化子中同時含有表達質粒和報導質粒，在製備DNA重新轉化時，有可能會同時將含有的報導質粒轉化進同一個大腸桿菌宿主，為克服這一影響，選擇報導質粒上特有的限制性內切酶Hind III進行消化，使之變成線形，然後再轉化。
經過以上處理以後，如表5所示，隨著篩選的進行，抗性克隆所佔的比例(AprSpr/Apr比值)明顯增高。四輪以後，富集倍數達到104，AprSpr/Apr比值已經接近1，挑取單克隆，進行質粒製備，Hind III消化，轉化JM109，再進行質粒製備，序列測定，得到20個克隆，其序列及相關特性如表6、7所示。
表5、突變體的篩選篩選輪數 富集效率(Aprspr/AprCmr)1 10-62 2×10-43 0.024 0.85表6、突變體的序列及特性 fGCG體內結合特異性常數，用不同突變體重新轉化含有報導質粒的JM109時陽性克隆所佔比例即AprSpr/ApfCmr表7、鋅指1中不同位置上胺基酸的偏性位置 胺基酸PePfδ32(Pf-Pe)/δ32-1 R(Arg) 3/32 12/20 0.052 9.73K(Lys) 1/32 6/20 0.031 8.68D(Asp) 1/32 1/20 0.031 0.61Q(Gln) 1/32 1/20 0.031 0.61+2 D(Asp) 1/32 9/20 0.031 13.5C(Cys) 1/32 3/20 0.031 3.84Q(Gln) 1/32 1/20 0.031 0.61+3 D(Asp) 1/32 6/20 0.031 8.68E(Glu) 1/32 5/20 0.031 7.06V(Val) 2/32 6/20 0.043 5.52+4 L(Leu) 3/32 17/20 0.052 14.5R(Arg) 3/32 3/20 0.052 1.08+6 R(Arg) 3/32 15/20 0.052 12.6T(Thr) 2/32 2/20 0.043 1.23K(Lys) 1/32 1/20 0.031 0.61+9 R(Arg) 3/32 14/20 0.052 11.7K(Lys) 1/32 6/20 0.031 8.68Pe在完全隨機文庫中，預期出現頻率；Pf在所有20個克隆中實際出現頻率，δ標準方差，[Pe(1-Pe)/n]1/2，n＝32即NNK所代表的32種密碼子。
實施例10、識別保守亞位點GCG同功突變體的序列分析由表6、表7中的統計結果可以發現，對於識別GCG亞位點的同功鋅指突變體，+4、+9位相對固定，此外，-1、+2、+3、+6四個位置顯示出對特定胺基酸的偏愛，具有較大的保守性，由於保守性意味著功能性，說明上述四個位置在DNA識別中具重要作用。
-1位，主要是Arg、Lys兩個帶正電荷的胺基酸，二者幾乎以同樣頻率出現，但是也出現了帶負電荷的Asp以及中性的Gln。在Zif268與保守DNA結合位點形成複合物的晶體結構中[8]，-1位的胺基酸是與5』-GCG-3』中3』的G作用，由於在G∶C鹼基配對中，電荷分布不均勻，G呈負電性，因此帶正電荷的Arg、Lys與G之間會通過氫健HB相互作用。但是早期的噬菌體顯示實驗中，-1位的胺基酸或者多為Arg、或者多為Lys(Jamieson AC，et al.In vitro selection of zinc fingers with alteredDNA-binding specificity.Biochemistry.1994 May 17；33(19)5689-5695)，理論上，二者都可以很好地與G作用，出現上述差異的原因可能是噬菌體顯示實驗中樣本數較小，也可能是文庫構建方法不同。
與-1位相反，+2位主要是帶負電荷的Asp，其次是Cys。正負電荷之間正可以形成鹽橋，而且Asp還可以對Arg-1、Lys-1的長的側鏈起到支撐作用，穩定整個DNA-蛋白複合物的結構，這與晶體結構中的結果相一致。但是在MT15中，情況剛好相反，是Gln-1His+2，+2位的His帶正電荷，很可能在咪唑基與醯胺基之間也可以形成HB。
+3位，主要是Asp、Glu、Val，三者出現頻率幾乎一致，此外也出現了Leu、Thr、Gin等其它胺基酸，與Barbas CF 3 rd、Klug A(Choo Y，et al. Selection of DNAbinding sites for zinc fingers using rationally randomized DNA reveals codedinteractions.Proc Natl Acad Sci U S A.1994 Nov 8；91(23)11168-11172，WuH，et al.Building zinc fingers by selectiontoward a therapeutic application.Proc Natl Acad Sci U S A.1995 Jan 17；92(2)344-348)等人的結果一致。在晶體結構中，+3位的胺基酸與DNA雙螺旋結構最接近，因此該位置上胺基酸可能會受到空間位阻效應的影響，由於在GCG中，中間的C較小，所以既可以接納較大的胺基酸如Leu、Gln、Glu，也可以接納較小的胺基酸如Val、Thr、Asp，但是由於C帶有正電極性，帶負電荷的Asp、Glu在該位置的高頻出現，說明+3位的胺基酸在與鹼基作用中，可能同時受到化學互補、立體化學互補的雙重因素的限制，這是以前的實驗所未揭示的。此外，Jamieson AW等利用噬菌體顯示實驗發現該位置主要是Asp，但是其在文庫構建中只是將-1、+2、+3、+6位突變，其它位置固定不變(Jamieson AC，et al.In vitroselection of zinc fingers with altered DNA-binding specificity.Biochemistry.1994May 17；33(19)5689-5695)，而本發明則是將更多位置突變，得到了更為多樣的胺基酸分布，滿足構建更大文庫之必要，而且也表明在鋅指蛋白中，的確存在識別螺旋內的胺基酸間的相互作用，這種作用又會間接地影響鋅指蛋白的DNA識別。
+4位，顯示對Leu的強烈偏愛，+9位，Arg、Lys同等頻率出現。+6位主要是Arg，可以與G相互作用，與晶體結構一致。+1、+5位則具有較大的隨意性，在DNA識別中可能不具直接作用。
比較而言，在-1、+2、+3、+6四個位置中，-1、+6位的保守性明顯強於+2、+3位，而且+6為最嚴格，在所用15個突變體中，絕大多數為Arg，與WT的一致。結構上，由於-1、+6位分別與GCG的5』、3』端的鹼基作用，因此在穩定單一鋅指-三聯體亞位點識別中起錨定作用，有更重要的地位。早期的噬菌體顯示實驗指出對於識別任何一個三聯體亞位點的單一鋅指，實際上只有-1、+3、+6位中的兩個位置比較保守(Rebar EJ，et al.Zinc finger phageaffinity selection of fingers with new DNA-bindingspecificities.Science.1994 Feb 4；263(5147)671-673)，而我們的結果卻證實上述三個位置都比較固定，且+2位起輔助性作用。我們的結果還說明，在鋅指蛋白與DNA作用過程中，有些鹼基可同不止一個胺基酸接觸如G可以與Arg、His、Gln、Ser、Lys等作用，在胺基酸---鹼基之間並不存在一個簡單的一一對應關係，也反映出鋅指蛋白DNA識別作用中的複雜性。
此外，在電荷性質上，本發明得到的克隆其整個識別螺旋帶有強的正電荷，而Jamieson AW等認為主要是電中性的(Jamieson AC，et al.In vitro selection of zincfingers with altered DNA-binding specificity.Biochemistry.1994 May 17；33(19)5689-5695)。由於在DNA大槽中，GC配對中的電極性分布，GCG亞位點總體上帶有負電性質，因此帶正電荷的識別螺旋深入到大槽中，與帶負電的GCG作用，識別作用會更加穩定，也更合理。這又一次說明對更多位置進行突變，是完全必要的。
而且，所有噬菌體顯示實驗，都未能篩選到野生型的序列，而本發明的實驗卻兩次得到，表明體內篩選模型的確比噬菌體顯示更真實地反映了生理條件下的作用過程。利用噬菌體顯示進行親和篩選時，根據的是一種群體作用，最終的結果完全有可能是低特異性、低親和力卻具有高表達優勢的個體，相反那些高特異、高親和力、表達劣勢的個體卻有可能被淘汰。
權利要求
1.鋅指蛋白-DNA相互作用的遺傳篩選模型，是含有報導質粒的大腸桿菌，所述報導質粒含有壯觀黴素抗性基因aadA，壯觀黴素抗性基因aadA的上遊含有aadA基因自身啟動子PaddA，壯觀黴素抗性基因aadA的下遊含有方向與啟動子PaddA相反，且強度高於PaddA的組成性啟動子；在所述組成性啟動子的操縱序列中插入鋅指蛋白小鼠轉錄因子Zif268的結合序列。
2.根據權利要求1所述的遺傳篩選模型，其特徵在於所述報導質粒是單拷貝的。
3.權利要求1所述遺傳篩選模型在篩選鋅指蛋白突變體中的應用。
全文摘要
本發明公開了鋅指蛋白－DNA相互作用的遺傳篩選模型及其應用，目的是提供一種建立在大腸桿菌中的，簡單、通用的研究鋅指蛋白－DNA相互作用的遺傳篩選模型。本發明所提供的鋅指蛋白－DNA相互作用的遺傳篩選模型，是含有報導質粒的大腸桿菌，所述報導質粒含有壯觀黴素抗性基因aadA，壯觀黴素抗性基因aadA的上遊含有aadA基因自身啟動子P
文檔編號C12N1/21GK1438323SQ0310017
公開日2003年8月27日 申請日期2003年1月8日 優先權日2003年1月8日
發明者趙志虎, 馬清鈞 申請人:中國人民解放軍軍事醫學科學院生物工程研究所