突變單加氧酶細胞色素P450cam的製作方法
2023-10-31 01:55:12 1
專利名稱：突變單加氧酶細胞色素P450cam的製作方法
技術領域：
本發明涉及單加氧酶細胞色素P450cam的突變體。
單加氧酶用氧催化激活的和未激活的碳-氫鍵發生選擇性氧化作用1，因此在有機合成中有很大用途。但是，由於很難分離足夠量的單加氧酶和/或相關的電子轉移蛋白而使該領域的發展受到阻礙。儘管得到了150多種不同細胞色素P-450單加氧酶的胺基酸序列，但是迄今為止只知其中3種的結構2,3,4，而且在細菌系統中尚未很成功地過度表達5。
一種細胞色素P-450單加氧酶是可溶性的，而且可以足夠的量表達出來，它是來自P.putida的高度特異性的P-450cam，可催化樟腦的區域選擇性和立體選擇性羥基化反應而生成5-外型羥基樟腦6。已確定了P-450cam的高分辨晶體結構2，由於認為該細菌酶的作用機制與其哺乳動物對應物的相似，因此，用其作為哺乳動物酶的結構模型的框架。
已經描述了P-450cam的核苷酸序列和相應的胺基酸序列5,7。該酶活性位點的位置是已知的，而且已研究了結構-功能之間的關係8,9。已描述了在101和185、247以及2959,10,11和87位12的P-450cam突變體。還描述了酪氨酸96(Y96)變成苯丙氨酸96的突變體(Y96F)11,13,14,15。但在所有情況下，文獻只報導了突變對分子氧化反應的影響，所述分子是已確定的野生型酶的底物。而沒有說明如何利用該突變作用來提供用於不同新底物氧化作用的生物催化劑。
為了開發新的生物催化劑，我們開始了目的在於再設計P-450cam的項目，以便該酶可更有效地特異性氧化有機分子，而不論所述分子是否是野生型蛋白質的底物。
如
圖1所示，P-450cam的三維結構表明活性位點提供與樟腦的疏水基團以緊密範德華力接觸。特別重要的是樟腦與亮氨酸244、纈氨酸247和纈氨酸295側鏈之間的接觸。三個芳香族殘基(Y96、F87和F98)歸類在一起，排列成底物結合穴，同時酪氨酸96與樟腦羰基氧之間的氫鍵使底物保持正確的方向，以確保反應的區域特異性和立體特異性。
Lipscomb和同事16在1978年證明野生型P-450cam有二聚的傾向，但他們也報導了單體和二聚體對樟腦氧化作用的催化活性沒什麼差別。由於二聚反應可由硫還原劑逆轉，因此他們得出結論有分子間半胱氨酸二硫鍵(S-S)形成所致。他們不能確定二聚作用中是否每個P-450cam分子涉及1個以上的半胱氨酸。由於那時既不知道P-450cam的胺基酸序列，也不清楚其晶體結構，因此他們無法確定與該反應有關的關鍵半胱氨酸殘基(一個或多個)。
我們利用分子模型設計來研究對活性位點穴中3個芳香族殘基(Y96、F87、F98)點突變的可能影響。我們注意到用較小的、疏水非芳香族側鏈殘基取代這些芳香族殘基中的任何殘基，均可產生可用於結合更多疏水底物的「芳香族穴」。用程序GRID17計算芳香族探針與細菌色素P-450cam可能的突變體之間的作用能，在所述突變體中，將這些殘基變成了丙氨酸(F87A、Y96A和F98A)。然後用分子模型程序包Quanta18圖解檢測結果。
在接近芳香族探針的活性位點穴內，突變體F98A的結合相互作用似乎最強，而Y96A稍弱，且F87A相當小。在第一種情況下，將酪氨酸96突變為丙氨酸，因為它更接近結合穴的中心，而苯丙氨酸98在穴的一側。另外，由於失去了結合底物的氫，因此酪氨酸96的除去會降低該酶對樟腦的特異性。
本發明的一個方面是提供單加氧酶細胞色素P-450cam的突變體，其中除去了334位的半胱氨酸殘基。
優選所述除去是用除半胱氨酸以外的另一種胺基酸取代半胱氨酸殘基。
另外，所述除去是從該酶中刪除整個半胱氨酸334殘基。
將突變體96位的酪氨酸殘基適宜地用除酪氨酸以外的任何胺基酸殘基取代。
所述胺基酸通常選自下列任何一種丙氨酸、精氨酸、天冬醯胺、天冬氨酸、半胱氨酸、穀氨酸、谷胺醯胺、甘氨酸、組氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、賴氨酸、甲硫氨酸、脯氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、色氨酸、酪氨酸和纈氨酸，其中例外情況是在334位是半胱氨酸時，所述胺基酸不得是半胱氨酸，而在96位是酪氨酸的情況下，所述胺基酸不得是酪氨酸。
優選在位置87、98、101、185、193、244、247、295、297、395和396的一個或多個胺基酸殘基由另一胺基酸殘基取代。
我們用模型設計程序Quanta從公開的結晶原子配位資料分析了得到的P-450cam的結構。我們確定有5個靠近P-450cam表面的半胱氨酸(半胱氨酸58、85、136、148、334)可能參與了導致蛋白質二聚作用的分子間二硫鍵的形成。我們進行定點誘變以便將這些半胱氨酸均以丙氨酸取代，由此得到5個Cys-Ala表面突變體。
研究野生型P-450cam以及5個Cya-Ala表面突變體中蛋白質二聚的程度。可通過在Resource Q柱(Pharmacia)上的陰離子交換快速蛋白質液相色譜和在Superose 12柱(Pharmacia)上的凝集過濾大小排斥色譜檢測野生型P-450cam和C58A、C85A、C136A和C148A突變體中的二聚體。另一方面，對於334A突變體來說，甚至在高濃度(0.1mM左右)也沒有檢測到二聚體(參見圖2中的數據)。我們得出結論，野生型P-450cam通過兩個蛋白質分子間表面的半胱氨酸334的分子間形成S-S二硫鍵進行二聚作用。
C334A突變明顯有利於除去不想要的蛋白質二聚作用，由此確保在任何時候溶液中均只存在單一物種。另外，我們還發現了該突變有完全意想不到的好處。象所有蛋白質一樣，野生型P-450cam在放置後有聚集現象。蛋白質聚集的原因尚不清楚，但P-450cam聚集物是不可溶的，而且沒有催化活性。在4℃，甚至在-20℃50％甘油溶液中貯存後，野生型和C58A、C85A、C136A和C148A突變體均有二聚作用和聚集現象。在轉換過程中，特別是在任何有經濟前途的工業應用，如合成有機分子所需的較高P-450cam濃度不會發生聚集作用。而C334A突變體甚至在室溫下以mM濃度，3天內也沒有聚集的跡象。因此，C334A突變在蛋白質加工、貯存以及提高催化劑半衰期方面有積極的效果。
我們相信在96位的突變是關鍵，這使得該突變酶能夠催化相當寬範圍內有機底物的氧化作用。也可突變鄰近所述酶活性位點的其它胺基酸，以便改變活性位點的形狀和特異性。這些其它胺基酸包括在位置87、98、101、185、193、244、247、295、297、395和396的胺基酸。設想這些位置的一個或多個胺基酸可進行下列置換用小的疏水胺基酸以便擴大活性位點；或用大的疏水胺基酸以便縮小活性位點的大小；或用帶芳香環的胺基酸，所述芳香環會與底物的相應芳香環相互作用。
就氧化反應而言，反應條件在所附參考文獻中有所介紹。所述酶系統除突變體酶外，通常還包括假單胞氧還蛋白和假單胞氧還蛋白還原酶，以及作為輔助因子的NADH。在下列試驗部分描述了環己基苯的氧化作用。下面研究並描述了各種類型的有機化合物。我們注意到野生型P-450cam對以下部分中的許多分子的氧化作用均有活性。但是在所有情況下，突變體P-450cam蛋白質均有高得多的轉換活性。ⅰ)有機化合物是芳香化合物，是在不使酶失活或變性的條件下使用的烴或化合物。由於所述突變作用是以在酶的活性位點產生結合芳香族的穴為目的，因此突變體酶能夠催化各種各樣芳香族化合物的氧化。在下文試驗部分舉例證明了芳香族和多芳香族化合物的氧化作用，而且很令人意想不到的是，已指出野生型酶只能催化樟腦家族成員的氧化，而對其它一些分子如苯乙烯19、乙苯9,10、四氫萘酮衍生物20和菸鹼21的活性低。ⅱ)有機化合物是例如脂族或脂環族的、帶有功能基團的烴(見反應方案1)。在氧化反應前，將芳香族保護基與功能基團相連，在氧化反應後，將其從功能基團上除去。適宜的芳香族基團是苄基。保護基有兩個目的第一，它可以使底物更疏水，從而提高與疏水酶穴的結合；第二，它有助於使底物固定在活性位點。因此，通過使用正確的芳香族保護基，可同時實現底物的區域選擇性和立體選擇性羥基化反應。單功能基化烴的實例是環己基、環戊基和烷基衍生物(反應方案1)。這些化合物的氧化產物是很有價值的有機合成原料，特別是用於同手型化合物生產。可使用許多芳香族保護基，如苄基或萘基醚和苯甲醯醚和醯胺(反應方案1)。用苯並噁唑基作為羧基保護基，用N-苄基噁唑烷基作為醛保護基也在研究之列。在酶促氧化作用後，很容易裂解這兩種基團，而且以前在有關醛和酸的微生物氧化的文獻22中已有描述。ⅲ)有機化合物是C4至C22的脂族或脂環族烴。在下文試驗部分說明了環己烷和直鏈以及支鏈烴的氧化。我們發現野生型P-450cam也能夠氧化這些分子，但活性低，而在所有情況下，突變體的活性都更高。ⅳ)有機化合物是滷代的脂族或脂環族烴。下文還描述了高丙體六六六(六氯環己烷)的氧化。
構建突變體，其中活性位點取代與334位半胱氨酸表面突變為丙氨酸相結合，並包括代替96位酪氨酸(Y96)的丙氨酸、亮氨酸、纈氨酸或苯丙氨酸。最後將數個活性位點突變與表面突變結合起來以構建帶有多個突變的突變體酶。用聚合酶鏈反應(PCR)，從P.Putida的總細胞DNA擴增編碼細胞色素P-450cam及其天然電子轉移配對物假單胞氧還蛋白和假單胞氧還蛋白還原酶的基因。所用的表達載體/大腸桿菌宿主組合是用於P-450cam的菌株JM109中的pRH109123，用於假單胞氧還蛋白的菌株JM109中的pUC118，以及用於假單胞氧還蛋白還原酶的菌株DH5中的pGLW11。用Zoller和Smith的方法24，用M13 mp19亞克隆進行寡核酸指導的點特異性誘變，用Kunkel的方法25完成突變體的篩選。
用分光光譜法研究可能的底物結合。在沒有底物的情況下，野生型酶是6-配位的低自旋形式，弱結合水佔據了第六個配位位點，在418nm有特徵性的索瑞(Soret)最大峰。與樟腦以及底物類似物金剛烷酮、金剛烷和降冰片烷的結合將血紅素完全轉變為5配位的高自旋形式，該形式在392nm有特徵性的索瑞譜帶。血紅素的這種自旋狀態的改變伴有血紅素還原電位的增加，從而使生理電子轉移配對物假單胞氧還蛋白能夠還原P-450cam並引發催化羥基化循環26。因此，血紅素自旋狀態的改變，可以定性的表示表1和2所示分子被野生型和突變型體P450cam酶氧化的可能性。
在30℃，將通常為3ml的含10μM假單胞氧還蛋白、2μM假單胞氧還蛋白還原酶、1μM細胞色素P-450cam單加氧酶(野生型或突變體)、200mM KCl、50μg/ml牛肝過氧化氫酶(Sigma)以及1mM靶有機化合物，如環己基苯(作為0.1M乙醇儲備液加入)的緩衝液(50mM Tris.HCl,pH7.4)預保溫5分鐘。通過加入NADH達到2mM的總濃度，來啟動酶促反應。再將4等份NADH(每次將NADH的濃度提高1mM)以10分鐘間隔，於30分鐘內加入到保溫液中，同時加入一等份底物(提高濃度1mM)。在60分鐘後，通過加入0.5ml氯仿並旋轉混合物來驟熄反應。4℃離心(4000g)進行相分離。用氣相色譜分析氯仿層。
對於許多底物化合物，如環己基苯，由於並不是所有的P-450cam介導的氧化產物都是可以購買到的，因此在氮氣流下，將氯仿提取物蒸發至幹，用己烷提取殘留物，用高效液相色譜分離這些氧化產物，用己烷/異丙醇梯度洗脫。然後用質譜，特別是核磁共振光譜鑑定純化的產物。
對於在含水緩衝液中有不同溶解度的不同底物來說，加入到保溫混合物中的底物的最終濃度可以為0.2mM至0.4mM。可在340nm監測NADH濃度，而且在所有情況下，均是在保溫過程中加入更多底物和NADH。
用上述試驗技術，本發明人研究了相當多的可作為野生型P-450cam和突變體Y96A之底物的有機化合物。研究工作還包括命名為Y96V、Y96L、Y96F、C334A的突變體；組合突變體F87A-Y96G-F193A,和組合活性位點與表面突變體的Y96A-C334A；Y96V-C334A；Y96L-C334A；Y96F-C334A；F87A-Y96G-F193A-C334A。C334A和C334A-Y96A的結果列於表1和表2，在表中將結構上相關的分子歸類在一起。
表1詳細說明了突變體Y96A-C334A在氧化小的直鏈、支鏈和環狀烴時，NADH的消耗。表2(a)至2(h)詳細描述了到目前為止已闡明的突變體和底物組合所得產物分布。
可用任何熟知的、可自由得到的標準限制性技術使位置334上的半胱氨酸缺失，因此本文不再作詳述。反應方案1
表1K2pp(μM)aWTY96A
a使用Sligar法(S.G.Sligar,Biochemistry,1976,15,5399-5406)，兩次獨立測定的平均值。Kapp值與緩衝液中K+濃度完全無關。當〔K+〕＞150mM時，就野生型和Y96A而言，對樟腦的Kapp均為0.6μM。該表數據於磷酸鹽緩衝液中(pH7.4)，在〔K+〕=70mM時測定，以避免較高離子濃度下底物產生鹽析。b未達飽和。
表2(a)
表2(b)
表2(c)
表2(d)
表2(e)
表2(f)
表2(g)
表2(h)
表3由P450cam突變體催化的小烷烴的轉變下列所有突變體均含有C334A突變。用NADH消耗率(nmol NADH/nmol P450cam/s)表示轉變率。<
>用P450cam活性位點突變體氧化底物後的產物結構和分布。
「本底」一般本底NADH氧化率是0.07nmol NADH(nmol P450cam)-1秒-1。
表4(a)用P450cam活性位點突變體氧化底物後的產物結構和分布。下列所有突變體均含有C334A突變。
表4(b)
表4(c)
表4(d)
表4(e)
表4(f)
表4(g)
表4(h)<
參考文獻1.「細胞色素P-450結構、機理、和生物化學」ed.P R ortizde Montellano,Plenum Press,New York,1986。
2．T L Poulos,B C Finzel和A J Howard,分子生物學雜誌(J.mol.Biol.),t987,195,687-700。
3．C A Hasemann,K G Ravichandran,J APeterson,和J Deisenhofer,分子生物學雜誌(J.mol.Biol.),1994,2-16,1169-1185。
4．K G Ravichandran,S S Boddupalli,C AHasemann,J A Peterson,和J Deisenhofer,科學雜誌(Science),1993,261,731-736。
5．B P Unger,I C Gunsalus,和S G Sliger,生物化學雜誌(J.Biol.Chem.),1986,261,1158-1163；J S Miles,A W Munro,B N Rospendowski,W E Smith,JMcknight,和A J Thomson,生物雜誌(Biochem.J.),1992,288,503-509；T H Richardson,M J Hsu,T Kronbach,H J Bames,G chan,M R Waterman,B Kemper,和EF Johnson,Arch.Biochem.Biophys.,1993,300,510-516；S S Boddupalli,T Oster,R W Estabrook,和J APeterson,生物化學雜誌(J.Biol.Chem.),1992,267,10375-10380；H Li K Darish和T L Poulos.生物化學雜誌(J.Biol.Chem.),1991,266,11909-11914。
6．1 C Gunsalus和G C Wagner,酶學方法(MethodsEnzymol.),1978,52,166-188。
7．M Haniu,L G Armes,K T Yasunobu,B AShastry,和I C Gunsalus.生物化學(Biol.Chem.),1982,257,12664-12671。
8．S G Sligar,D Filipovic,和P S Stayton,酶學方法(Methods Enzymol.),1991,206,31-49。
9．P J.Loida和S G Sligar,生物化學(Biochemistry),1993,32,11530-11538。
10．P J.Loida和S G Sligar,蛋白工程(ProteinEng.),1993,6,207-212。
11．W M.Atkins和S G Sligar,美國化學會志(J.Am.Chem.Soc),1989,111,2715-2717。
12．S F Tuck,S Graham-Lorence,J A Peterson,和P R Ortiz de Montellano,生物化學雜誌(J.Bi ol.Chem.),1993,268,269-275。
13．C Di Prime,G Hui Bin Hoa,P.Douzou,和SSligar,生物化學雜誌(J.Biol.Chem.),1990,265,5361-5363。
14．W M.Atkins和S G Sligar,生物化學雜誌(J.Biol.Chem.),1988,263,18842-18849。
15．W M.Atkins和S G Sligar,生物化學(Biochemistry),1990,29,1271-1275。
16．J D Lipscomb,J E Harrison,K M Dus,和I CGunsalus,生物化學、生物物理研究交流(Biochem.Biophys.Res.Conunun.),1978,83,771-778。
17．P J Goodford,醫藥化學雜誌(J.Med.Chem.),1985,28,849-857。
18．Quanta 4.0,Molecular Simulations Inc.,16 NewEngland Executive Park,Burlington,MA 01803-5297。
19．J A Fruetet,J R Collins,D L Camper,G HLoew,和P R Ortiz de Montallano,美國化學會志(J.Am.Chem.Soc.),1992,114,6987-6993。
20．Y Watanabe和Y Ishimura,美國化學會志(J.Am.Chem.Soc.),1989,111,410-411。
21．J P Jones,W F Trager,和T J Carlson,美國化學會志(J.Am.Chem.Soc.),1993,115,381-387。
22．「製備有機化學中的生物轉化」H G Davis,R HGreen,D R Kelly,和S M Roberts,Academic Press,London,1989,Page 169 ff。
23．J E Baldwin J M Blackburn,R J Heath,和JD Sutherland,生物醫藥化學通訊(Bioorg.Med.Chem.Letts.)1992,2,663-668。
24．M J Zoller和M Smith,核酸研究(Nucleic AcidsRes.),1982,10,6487-6500。
25．T A Kunkel,美國國家科學院動態(Proc.Natl.Acad.Sci.,USA)1985,82,488-492。
26．S G Sligar和I C Gunsalus,美國國家科學院動態(Proc.Natl.Acad.Sci.,USA)1976,73,1078-1082。
權利要求
1．單加氧酶細胞色素P-450cam的突變體，其中除去了位置334上的半胱氨酸殘基。
2．根據權利要求1的突變體，其中所述除去是用除半胱氨酸以外的另一種胺基酸取代半胱氨酸殘基。
3．根據權利要求1的突變體，其中所述除去是所述酶中使整個的半胱氨酸334殘基缺失。
4．根據前述任一權利要求的突變體，其中用除酪氨酸以外的任何其它胺基酸取代突變體中96位上的酪氨酸殘基。
5．根據權利要求1、2或4的突變體，其中所述胺基酸選自下列任一胺基酸丙氨酸、精氨酸、天冬醯胺、天冬氨酸、穀氨酸、谷胺醯胺、甘氨酸、組氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、賴氨酸、甲硫氨酸、脯氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、色氨酸、酪氨酸和纈氨酸。
6．根據前述任一權利要求的突變體，其中用另一胺基酸殘基取代位置87、98、101、185、193、244、247、295、297、395和396上任一或多個胺基酸殘基。
7．實質上如本文前面附圖和/或實施例所述的單加氧酶細胞色素P-450cam突變體。
全文摘要
單加氧酶細胞色素P450cam的突變體,其中除去了334位的半胱氨酸殘基。
文檔編號C12N9/02GK1212015SQ9619923
公開日1999年3月24日 申請日期1996年11月1日 優先權日1995年11月1日
發明者L·L·王, S·L·弗利施, D·P·尼克爾森, A·J·哈特 申請人:Bg公開有限公司