一種胞內融合表達型前t載體及其製備與應用的製作方法

2023-10-20 04:00:42

專利名稱：：一種胞內融合表達型前t載體及其製備與應用的製作方法
技術領域：
：本發明涉及一種可用於快速構建目的基因胞內融合表達工程菌的胞內融合表達型前T載體及其製備與應用。(二)
背景技術：
：利用大腸桿菌製備具有藥用價值的生物活性肽是基因工程最常用的技術路線，但是目的基因表達產物在過表達時容易形成包含體，第一個胺基酸一般為曱硫氨酸，與天然生物活性肽的胺基酸序列不一致，作為藥用時容易產生免疫原性。需要探索純化工藝，難以表達分子量小的多肽。利用融合蛋白表達策略可以很好地解決上述問題目的基因融合表達以後，可以利用融合伴侶攜帶的純化標籤，用親和純化工藝純化目標蛋白，快速高效純化目標蛋白，融合蛋白用特異性蛋白酶酶切後可以得到胺基酸序列與天然生物活性肽完全一致的產物，可以表達分子量小的多肽。還可以利用融合伴侶增加表達產物的溶解性，從而有助於目標蛋白的純化和後續復性。大腸桿菌二硫鍵形成蛋白DsbA是一種周質蛋白，天然的DsbA基因上遊有編碼信號肽的基因序列，指導DsbA分泌於周質空間。DsbA具有很好的溶解性，具有分子伴侶的功能，幫助其他周質蛋白形成分子內二疏鍵。有文獻報導，利用分子生物學技術，去除DsbA信號肽基因，定點突變Cys殘基，使不含Cys殘基的DsbA在胞內表達，許多單獨表達容易形成包含體的生物活性肽與DsbA突變體融合後，表達產物以可溶性形式存在。將目的基因重組於無信號肽DsbA基因的下遊，在胞內可溶性表達目的基因，是新法製備各類生物活性肽的有效方法。但是常規的基因重組工序複雜，需要涉及基因拼接，DNA重組等。雖然現代分子生物學技術為這種重組提供了可行的多樣的方法，但是過程較為複雜，耗時、耗材，需要使用多種限制性內切酶、DNA純化等工序。T-載體是近年發M來的一種用於直接克隆PCR產物的新型載體。T-載體一般為線性，其分子末端各有一個3'dT(脫氧胸苷)突出。PCR技術是分子生物學和基因工程研究中的一項基本技術，它被廣泛用於體外擴增已知或未知的特異DNA片段。利用％《DNA聚合酶的末端轉移酶活性，在擴增DNA的3'末端非模板依賴地加上一個核苷酸，通常為脫氧腺苷酸(dA)。這個3'dA突出端被用於把PCR產物插入到插入位點有一個3'dT突出的T-載體上。這樣就將PCR產物以粘性末端連接的方式直接克隆到載體上。這種方式不僅克服了常規克隆方法的缺點，而且操作簡便、方法快捷、連"f妄效率高，因而其應用範圍非常廣泛。有多種方法製備T載體，利用限制性內切酶製備T-載體是最為先進的方式，其中ZcmI最適合於製備T-載體，該酶的特異性識別序列為5'CCANNNNN*NNNNTGG3',N可以是A、T、G、C的任意一種。酶法製備T載體首先要得到一個環狀的前T質粒載體，經Xc附I酶切兩個位點後，載體的大片段DNA線性化，而且兩個3，末端均帶dT,從而得到可用於PCR產物快速克隆的T栽體，如市場上供應pUCm-T。目前市場上供應的主要是克隆型T載體，主要滿足基因保存和測序的需要，如果構建一種表達型T載體，將PCR產物直接連接於表達型T載體上，使目的基因位於表達框架內，直接得到表達載體，即可一省略複雜的DNA重組步驟。不僅克隆目的DNA，而且還可以直接表達目的基因。另外，用酶法製備T載體有可能存在以下幾個方面的問題，一，如果酶切質粒DNA質量不高，外源基因不能插入載體中，而載體轉化感受態細胞後能夠在抗性平板上生長。pUCm-T載體設計了藍白斑篩選方案以篩選目的DNA片段是否插入載體，如果插入栽體，編碼半乳糖苷酶ot肽的基因LacZ被插入失活，細胞內沒有半乳糖苷酶活性，在含有生色底物X-gal的篩選平板中白色菌落為插入失活陽性克隆，而蘭色菌落為不含外源基因的陰性克隆。這種方法需要使用價格昂貴的X—gal,製備藍白斑篩選平板也比較麻煩。在特定融合表達載體中不適合應用，需要採用別的篩選方案。二，如果兩個Xc/wI酶切位點空間位置較近，將影響載體的酶切效率，即使載體DNA的純度很高，酶的質量也很好，也會出現酶切載體一"刀，，的情況，這種線性的載體不能和PCR產物連接，而是載體自連，從而導致陰性克隆的產生。
發明內容本發明則是為了提供一種胞內融合表達型前T載體及其製備方法，可利用這種前T載體得到的T載體，簡單地、快速地構建表達於胞內的DsbA融合蛋白基因工程菌。除使用XcwI夕卜，無需其他限制性內切酶即可快速構建胞內融合表達型基因工程菌。為達到發明目的本發明採用的技術方案是一種胞內融合表達型前T載體，由如下方法製備得到(l)構建編碼^spTI-GSGSG畫HHHHHH國義c附I-Ampr-Xc附I誦州"din的DNA片段——DNA1;(2)定點突變pET39質粒中Lacl基因內部的三個義cml位點，在編碼胺基酸序列不變的情況下，改變DNA序列，使XcwI識別位點喪失，得到定點突變消除位點的pET39-l;(3)利用fo;TI和///"dill將DNA1定向重組於pET39-l中，得到pET39-2，(4)去除pET39-2中的DsbA信號肽基因，得到所述胞內融合表達型前T載體。所述胞內融合表達型前T載體質粒圖鐠如圖l所示。本發明還涉及所述的胞內融合表達型前T載體的製備方法，所述方法如下(1)構建編碼JR^TI-GSGSG-HHHHHH-XcmI-Ampr-ZcmI-///"dIII的DNA片段——DNA1;2)定點突變pET39質粒中Lacl基因內部的三個XcmI位點，在編碼胺基酸序列不變的情況下，改變DNA序列，使ZcwI識別位點喪失，得到定點突變消除XcwI位點的pET39-l;(3)利用說:/TI和歷'"dIII將DNA1定向重組於pET39-l中，得到pET39-2，(4)去除pET39-2中的DsbA信號肽基因，得到所述胞內融合表達型前T載體。所構建的5^TI-GSGSG-HHHHHH-ZcwI-Ampr-Xc附I-歷"din目的結構如下imageseeoriginaldocumentpage8所構建的5s/7TI-GSGSG-HHHHHH-^"cmI-Ampr^rcwI-//z"din目的基因序列，其序列可以有變化，前部分它只要編碼這些胺基酸(GSGSG-HHHHHH)就可以，不過編碼第五個組氨酸的密碼子必須設計為CAC,使該密碼子的第三個鹼基與第六個組氨酸的密碼子的前兩個鹼基組成義cwl識別序列(CCANNNNN*NNNNTGG的前半部分關4建識別序列CCA,其下遊第五個鹼基N、殳計為T);因此，所述DNA1在滿足編碼所述胺基酸序列的前提下，還應滿足如下條件含有片段CCANNNNTNNNNTGG,N選自A、T、C、G中的一種，才艮據其編碼的胺基酸進行設計。其中，下劃線標記的為關,列，中間的T是製備T載體所必須的鹼基，可作為絲氨酸密碼子第一個鹼基，在本發明中第六個組氨酸密碼子下遊設計為胺基酸密碼子，不可以設計為TAA、TAG或TGA等終止密碼子，否則不能表達為融合蛋白。優選設計甘氨酸密碼子。優選的，所述DNA1序列如下5，-ATAC77^4GCGAGAAAAAAGGTTCTGGTTCTGGTCATCATCATCATCACCATGGATCTAATGGATAGGTTAATGTC國3，。翻譯情況如下5，-TACJGCGAGAAAAAAGGTTCTGGTTyrLeuSerGluLysLysGlySerGlyTCTGGTCATCATCATCATCACCA*GGASerGlyHisHisHisHisHisHisGlyTCTAATGfeATAGGTTAATGTC-3，Ser恭附I所述DNA1中含有卡那黴素除外的普通大腸桿菌敏感的抗生素抗性基因，如氨千青黴素抗性基因、四環素抗性基因或氯黴素抗性基因等。前T載體有雙抗性，如果外源DNA成功地插入於兩個Jc/z/I位點之間，前T載體中位於兩個Jc邁I位點之間的抗生素抗性消失，只留下卡那黴素抗性，有利於用影印法快速篩選陽性克隆。所述DNA1構建方法如下(1)引物A、B互為模板進行PCRl反應A:5，-ATACTTAAGCGAGAAAAAAGGTTCTGGTTCTGGTCAT-3';B:5,-GACATTAACCTATCCATTAGATCCATGGTGATGATGATGATGACCAGAACCAGAACC-3，；PCR反應條件94。C變性10min,48。C退火300s,72。C延伸10min;(2)以pETllb為模板，利用引物Ampl、Amp2進行PCR2反應Ampl:5'扁CACCATGGATCTAATGGATAGGTTAATGTCATGATAATA國3';Amp2:5'-CTTAAGCTTCCAAGGGTATAATGGAAATGAAGTTTTAAATCAATC-3';Amp2引物的5，末端含有//z'wdlll和JTcmI識別序列(CCANNNNN*NNNNTGG,其中N承設計為T,N選自A、T、C、G中的一種)。(3)將PCR1和PCR2所得片段用引物A和引物Amp2進行基因拼接，得到所述編碼^^TI-GSGSG-HHHHHH國Xcml-Ampr陽Xcml-歷"din的DNA片段——DNA1;拼接反應條件94。C預變性3min,94。C變性30s，60。C退火30s,72。C延伸120s,30個循環，72。C延伸10min。所述的定點突變三個ZcwI位點，採用常規SOE技術，在編碼胺基酸序列不變的情況下，改變改變Lacl的基因DNA序列，使Xcml識別位點喪失，得到定點突變消除Xc附I位點的pET39-l所述的DsbA信號肽基因的去除(1)以pET39為模板，以DsbA-l:5，國AAGCATATGGCGCAGTATGAAGAT-3，、DsbA畫2:5,-TCGCTTAAGTATTTCACTGT-3，為引物進行PCR3反應，PCR條件94。C3min;94。C30s、40°C30s、72°Clmin，3個循環；94°C30s、48°C30s、72°Clmin,27個循環；72°C10min;4°C10min;(2)以7V"&I和BwTI酶切PCR3產物和pET39-2,使不含信號肽基因的DNA片段置換pET39-2中原有的DsbA基因，得到胞內融合表達型前T載體。所述的胞內融合表達型前T載體主要用於製備胞內融合表達型T載體。具體的，所述應用如下將胞內融合表達型前T載體用限制性內切酶Xcml在37。C下酶切2h，再進行1%瓊脂糖凝膠電泳，得到兩條明顯的亮帶，切取大片段，用3SDNAGelPurificationKit純化回收，得到線性化的胞內融合表達型T載體。本發明的有益效果主要體現在利用本發明得到的T載體可簡單地、快速地構建表達於胞內的DsbA融合蛋白基因工程菌。除使用Xcml外，無需其他限制性內切酶即可快速構建胞內融合表達型基因工程菌。(四)圖1為本發明所述胞內融合表達型前T載體質粒圖譜。(五)具體實施例方式下面結合具體實施例對本發明進行進一步描述,但本發明的保護範圍並不僅限於此(實施例中所有試劑、質粒、酶、引物等，均購自上海生工生物工程技術服務有限公司)實施例l:Lacl基因定點突變消除義cml位點採用SOE法，以pET39為PCR模板，六條引物分別設計為Lac-1:5，誦ttaggatccgcgacccatttgct-3,(含醜o附HI.位點)Lac-2:5，陽agagatatccgcaccaacgcgca-3，(含五coRV位點)Lac國3:5'國ctgattggcgttgctacctccagtctggccctgca-3，(用於哭變4立,存、1)Lac-4:5'-gccagactggaggtagcaacgccaatcagcaacga-3，(用於哭變位點l)Lac國5:5'-tcccactgcgatgttagttgctaacgatcagatggcgct國3，(用於突變4立點2、3)Lac國6:5，誦catctgatcgttagcaactaacatcgcagtgggaacgatgc3，(用於哭變位點2、3)表2:位點突變前後序列對比tableseeoriginaldocumentpage12以Lac-1和Lac-2為引物，pET-39質粒為才莫板，PCR擴增Lacl序列。反應參數如下94。C預變性3min，進入PCR循環94。C變性0.5min,50。C退火0.5min,72。C延伸2min，30個循環，72。C延伸10min,產物標記為"Lacl/2"。(1)定點突變979bp處的Xcml位點以Lac-l和Lac-4為引物、Lacl/2為模板進行PCR反應，參數為94。C預變性3min,進入PCR循環94°C變性0.5min,50。C退火0.5min，72。C延伸1min，30個循環，最後72。C延伸10min。其產物標記為"Lacl/4"。以Lac-2和Lac-3為引物、Lacl/2為模板進行的PCR反應，其參數為94。C預變性3min，進入PCR循環94。C變性0.5min,48。C退火0.5min，72。C延伸1min,30個循環，72。C延伸10min。產物標記為"Lac2/3",置-20。C保存。(2)Lac-l和Lac-2為引物對Lacl/4和Lac2/3進行SOE拼接SOE參數94。C預變性3min，進入PCR循環94°C變性0.5min,56。C退火0.5min,72。C延伸2min,30個循環，72。C延伸10min。產物標記為"Lac979"。(3)定點突變1495bp和1513bp兩處的Xcml位點以Lac-l和Lac-6為引物、Lac979為模板進行PCR反應，其參數為94。C預變性3min,進入PCR循環94。C變性0.5min，50。C退火0.5min,72。C延伸2min,30個循環,72。C延伸10min。產物標記為"Lacl/6"。以Lac-2和Lac-5為引物、Lac979為模板進行PCR反應，其參數為94。C預變性3min，進入PCR循環94。C變性0.5min,47。C退火0.5min,72。C延伸0.5min,4個循環；再94。C變性0.5min，50。C退火0.5min，72。C延伸0.5min，26個循環；72。C延伸10min。產物標記為"Lac2/6"。(4)以Lac-l和Lac-2為引物對Lacl/6和Lac2/5進行SOE拼接SOE參數94。C預變性3min，進入PCR循環94。C變性0.5min，56。C退火0.5min,72。C延伸2min,30個循環，最後72。C延伸10min。產物標記為"LacI'"。拼接產物Lacl'利用fiamHI和五coRV定向重組於pET39中(具體方法為以5awHI和￡coRV分別雙酶切Lacl'PCR產物和pET39,切膠回收pET39質粒的大片段DNA,與Lacl'PCR產物的酶切回收產物連接，轉化大腸桿菌克隆宿主DH5a),得到LacI基因的三個ZcmI位點定點突變的pET39-l質粒。實施例2:Icwl酶切盒的製備及前T載體的構建引物A、B互為模板進行PCR1反應A:5'國ATACTTAAGCGAGAAAAAAGGTTCTGGTTCTGGTCAT-3'B:5'-GACATTAACCTATCCATTAGATCCATGGTGATGATGATGATGACCAGAACCAGAACC誦3'反應參數如下94。C變性10min，48。C退火300s,72。C延伸10min。以pETl1b為模板，利用下列兩條引物進行PCR2反應Ampl:5'-CACCATGGATCTAATGGATAGGTTAATGTCATGATAATA-3'Amp2:5'-CTTAAGCTTCCAAGGGTATAATGGAAATGAAGTTTTAAATCAATC-3'反應參數如下94。C預變性3min,94。C變性30s,55。C退火30s,72°C延伸120s,30個循環，72。C延伸10min。上述兩PCR1和PCR2產物片^殳用引物A和Amp2進行基因拼接反應，反應參數如下94。C預變性3min,94。C變性30s,60。C退火30s，72°C延伸120s,30個循環，72。C延伸10min。得到編碼5^TI-GSGSG-HHHHHH-Zc附I-Ampr-義cwI-歷"dni的DNA片段，利用fe/TI和///mini定向重組於實施例1已定點突變消除XcwI位點的pET39-l中，得到pET39-2。實施例3:DsbA信號肽基因的去除(保留ATG作為起始密碼子)設計引物DsbA-l:5，-AAGCATATGGCGCAGTATGAAGAT-3',(劃線部分為識別序列)DsbA-2:5，-TCGCTTAAGTATTTCACTGT-3，，(劃線部分為^y;TI識別序列)PCR模板pET39質粒(或大腸桿菌基因組DNA也可，推薦pET39質粒作為模板)PCR參數94。C3min94°C30s40°C30s72°Clmin3個循環94°C30s48°C30s72°Clmin27個循環72。ClOmin4°ClOmin以iV&I和^;TI酶切PCR產物和pET39-2,-使不含信號肽基因的DNA片段置換pET39-2中原有的DsbA基因，獲得不含DsbA信號肽基因的重組質粒，即胞內融合表達型前T栽體，為實現DsbA融合蛋白胞內表達創造條件。實施例4:目的基因與融合表達型T載體的重組TnaAl:5,-CTGATGACGATGACAAAATGGAAAACTTTAAACATCTC畫3，38bpTnaA2:5，-AAGCTTTTAAACTTCTTTAA-3,21bp以K-12為模板，TnaA1和TnaA2為引物，用plusDNA聚合酶PCR擴增色氨酸酶基因，反應參數如下94。C預變性3min，94。C變性30s，42。C退火30s,72。C延伸90s,30個循環，72。C延伸10min。將實施例2的表達型前T載體用限制性內切酶在37。C下酶切2h,再進行1%瓊脂糖凝膠電泳分析。結果可見兩條明顯的亮帶，切取大即得到線性化表達型T載體。將PCR產物直接與線性化T載體用T4DNAligase在4。C冰箱中連接16h,連接產物用CaCl2法轉化五.cc^DH5a。實施例5:正向連接重組子的篩選以及胞內融合表達基因工程菌的構建表達型重組轉化子的篩選引物check:5'-ATACTTAAGCGAGAAAAAAGGTT國3'首先，將連接產物的轉化液在含100ng/mL卡那黴素的LB固體平板均勻鋪開，35。C恆溫箱培養1620h。正向篩選能正常生長的菌落。然後將在卡那黴素抗性LB固體平板上正常生長的菌落影印到含100pg/mL氨爺黴素LB固體平板上。3(TC恆溫箱培養1620h。在卡那黴素抗性平板上挑選相應的不能在氨千黴素抗性平板上生長的克隆。這一步可以將未酶切和只有一個位點酶切的重組質粒篩掉，稱為反向篩選。最後，將篩選到的克隆，用單菌落PCR法，以鑑定引物check和目的基因的下遊引物和用PCR進行鑑定，這一步可以消除平板上殘餘的未轉入宿主細胞的重組質粒的影響並能確定目的基因的插入方向，稱為正向篩選。其體系和參數分別為10xBuffer(wkhMg2+)5|iL10mmol/LeachdNTPs210mmolTnaA12|jL10mmol/Lcheck2|jL相應陽性單克隆無菌牙籤蘸取TaqDNA聚合酶0.5MuL無菌雙蒸水補足至50MuL94。C預變性3min,進入PCR循環94'C變性0.5min,42。C退火0.5min,72。C延伸1.5min，30個循環，最後72。C延伸10min。取部分PCR產物進行瓊脂糖凝膠電泳檢測並攝片，有分子量約1500bp條帶出現的為陽性克隆。經check引物鑑定為陽性的克隆送英俊生物技術有限公司測序證實，正向測序引物為T7promoterprimer#69348-3,反向測序引物為T7terminatorprimer#69337-3。權利要求1.一種胞內融合表達型前T載體，由如下方法製備得到:(1)構建編碼BspTI-GSGSG-HHHHHH-XcmI-Ampr-XcmI-HindIII的DNA片段——DNA1；(2)定點突變pET39質粒中LacI基因內部的三個XcmI位點，在編碼胺基酸序列不變的情況下，改變DNA序列，使XcmI識別位點喪失，得到定點突變消除XcmI位點的pET39-1；(3)利用BspTI和HindIII將DNA1定向重組於pET39-1中，得到pET39-2，(4)去除pET39-2中的DsbA信號肽基因，得到所述胞內融合表達型前T載體。2.如權利要求1所述的胞內融合表達型前T載體，其特徵在於所述胞內融合表達型前T載體質粒圖i普如圖1所示。3.製備如權利要求1或2所述的胞內融合表達型前T載體的方法，所述方法如下(1)構建編碼5s/TI-GSGSG-HHHHHH-ZcmI-Ampr-Xc附I國歷"dIII的DNA片段——DNA1;(2)定點突變pET39質粒中Lacl基因內部的三個Xcml位點，在編碼胺基酸序列不變的情況下，改變DNA序列，使Xc附I識別位點喪失，得到定點突變消除位點的pET39-l;(3)利用^spTI和///"dill將DNA1定向重組於pET39-l中，得到pET39-2，(4)去除pET39-2中的DsbA信號肽基因，得到所述胞內融合表達型前T載體。4.如權利要求3所述的方法，其特徵在於所述DNA1序列含有如下片段CCANNNNTNNNNTGG。5.如權利要求4所述的方法，其特徵在於所述DNA1序列如下5'-ATACr編GCGAGAAAAAAGGTTCTGGTTCTGGTCATCATCATCATCA￡￡4TGGAICTAAI^￡ATAGGTTAATGTC-3'6.如權利要求3所述的方法，其特徵在於所述DNA1中含有卡那黴素除外的普通大腸桿菌敏感的抗生素抗性基因。7.如權利要求3所述的方法，其特徵在於所述DNA1構建方法如下(1)引物A、B互為模板進行PCR1反應A:5，誦ATACTTAAGCGAGAAAAAAGGTTCTGGTTCTGGTCAT-3，；B:5，畫GACATTAACCTATCCATTAGATCCATGGTGATGATGATGATGACCAGAACCAGAACC-3,;PCR反應條件94。C變性10min,48。C退火300s，72。C延伸10min;(2)以pETllb為模板，利用引物Ampl、Amp2進行PCR2反應Ampl:5'-CACCATGGATCTAATGGATAGGTTAATGTCATGATAATA-3';Amp2:5'國CTTAAGCTTCCAAGGGTATAATGGAAATGAAGTTTTAAATCAATC-3';所述編碼5^TI-GSGSG-HHHHHH-XcwI-AmpLXcmI-///"dIII的DNA片段——DNA1;拼接反應條件94。C預變性3min,94。C變性30s,60°C退火30s，72。C延伸120s,30個循環,72。C延伸10min。8.如權利要求3所述的方法，其特徵在於所述的去除信號肽基因的方法如下(1)以pET39為模板，以DsbA誦l:5,國AAGCATATGGCGCAGTATGAAGAT-3，、DsbA-2:5，-TCGCTTAAGTATTTCACTGT-3，為引物進行PCR3反應,PCR條件:94。C3min;94°C30s、40°C30s、72。Clmin,3個循環；94°C30s、48°C30s、72°Clmin，27個循環；72°C10min;4°C10min;(2)以MM和5s/TI酶切PCR3產物和pET39-2，使不含信號肽基因的DNA片段置換pET39-2中原有的DsbA基因，得到胞內融合表達型前T載體。39.如權利要求1或2所述的胞內融合表達型前T載體在製備胞內融合表達型T載體中的應用。10.如權利要求9所述的應用，其特徵在於所述應用如下將胞內融合表達型前T載體用限制性內切酶Xcml在37。C下酶切2h,再進行1%瓊脂糖凝膠電泳，得到兩條明顯的亮帶，切取大片段，用DNA純化試劑盒回收DNA,得到胞內融合表達型T載體。全文摘要本發明提供了一種胞內融合表達型前T載體，由如下方法製備得到(1)構建編碼BspTI-GSGSG-HHHHHH-XcmI-Ampr-XcmI-HindIII的DNA1片段；(2)定點突變pET39質粒中LacI基因內部的三個XcmI位點，在編碼胺基酸序列不變的情況下，改變DNA序列，使XcmI識別位點喪失，得到定點突變消除XcmI位點的pET39-1；(3)利用BspTI和HindIII將DNA1定向重組於pET39-2中；(4)去除pET39-2中DsbA信號肽基因，得到所述胞內融合表達型前T載體。本發明除了使用XcmI製備線形T載體外，不需要用其它限制性內切酶，可一步法構建融合表達基因工程菌，為大量製備活性肽工程菌庫提供了可行的技術方法。文檔編號C12N15/63GK101381738SQ20071007121公開日2009年3月11日申請日期2007年9月6日優先權日2007年9月6日發明者於真真,任慧穎,楊丹燕,林陳水,明許申請人:浙江工業大學