重組藍藻抗病毒蛋白的製備方法及應用的製作方法

2023-10-20 15:06:37 2

專利名稱：：重組藍藻抗病毒蛋白的製備方法及應用的製作方法
技術領域：
：本發明涉及基因工程
技術領域：
,具體涉及一種重組藍藻抗病毒蛋白的製備方法，以及此方法中涉及的表達載體和寄主細胞，本發明還涉及所述表達載體和/或寄主細胞和/或所述方法得到的重組藍藻抗病毒蛋白在製備抗病毒藥物中的應用。
背景技術：
：藍藻抗病毒蛋白N(CVN)是一種從藍藻，又名藍細菌Cyanobacteria(Nost.ocettipsosporum)中分離得到的一種水溶性糖蛋白，其獨特的抗病毒活性最初是在一項抗人類免疫缺陷病毒(humani細翻defiiciencyvirus,:H]:V)天然藥物篩選計劃中發現的[BoydMR,GustafsonKR，McMahonJB，etal.Discoveryofcyanovirin_N，anovelhumani咖皿odefiiciencyvirus—inactivatingproteinthatbindsviralsurfaceenvelopeglycoproteingpl20-potentialapplicationstomicrobicidedevel鄰醒t[J].Antimicrob.AgentsChemother,1997,41(7):1521—1530.]。後來的研究表明其具有廣泛的抗病毒作用。天然CVN相對分子質量為llkD，一級結構含有101個胺基酸殘基，無翻譯後的修飾，帶有兩個內部二硫鍵。CVN能特異地、高親合性地結合在人免疫缺陷病毒HIV-1的衣殼蛋白gpl20上有效降低IIIV-l病毒對細胞的感染[BewleyCA,GustafsonKR，BoydMR,etal.Solutionstructureofcyanovirin—N，apotentHIV—inactivatingprotein[J].NatStructBiol，1998，5(7):571.]。此外CVN對流感病毒、伊波拉病毒、皰疹病毒.和黃-熱病病毒、副、克感病毒.、丙型月幹炎病毒.AntimicrobAgentsChemother,2003，47(8):2518.,BarrientosLG，0'KeefeBR,BrayM，etal.Cyanovirin_Nbindstotheviralsurfaceglycoproteingpl，2andinhibitsinfectivityoftheEbolavirus[J].AntiviralResearch,2002，58(1):47256.]等都有詰抗作用。早在CVN發現之初，CVN的重組表達研究就已經開始，目前已在大腸桿菌,酵母菌和植物細胞中表達成功,但這些重組表達方法存在表達產量低，易形成包涵體且復性困難，易形成無活性的二聚體形式，融合表達出現胺基酸缺失，純化方法複雜等缺點[MoriT，GustafsonKR，ParmellU(，etal.Recombinant,productionofcyanovirin—N,apotenthumanimmunodefiiciencyvirus—inactivatingproteinderivedfromaculturedcyanobacterium[J].Protein:ExprPurif，1998，12(2):151.，MoriT，BarrientosLG，HanZ，etal.Functionalhomologsofcyanovirin_Namenabletomassproductioninprokaryoticandeukaryotichosts[J].ProteinExprPurif,2002,26(1):42.，ColleluoriDM，TienD，KangF,etal.Expression,purifiication，andcharacterizationofrecombinantcyanovi—rin—Nforvaginalanti-HIVmicrobicidedevelopment[J].ProteinExprPurif，2005,39(2):229.，SextonA,DrakePM，MahmoodN,etal.TransgenicplantproductionofCyanovirin—N，anHIVmicrobicide[J].FASEBJ，2006,20(2):356.]。3小分子泛素樣修飾蛋白(Smallubiquitin-likemodifiier，SUMO)，和泛素具有類似生物學功能，廣泛存在於真核細胞中。發揮著調節蛋白質之間的相互的作用(SUMO化和去SUMO化)，調節蛋白在核質間的運輸，幫助蛋白質在細胞內正確的定位，調節蛋白質的轉錄活性以及抗泛素化等作用[Zhou,F.F.Xue,Y.andLu，H.Letal.Agenome-wideanalysisofsumoylation—relatedbiologicalprocessesandfunctionsinhumannucleus[J]FEBSLett,2005，579:3369.，，Johnson,E.S.ProteinmodifiicationbySUMO[J]A畫.Rev.Biochem,2004，73:355.]。SUMO蛋白融合表達系統是一種有效地表達小分子量蛋白的表達方法，具有抗蛋白酶解，增加重組蛋白表達量，促進蛋白正確摺疊，能準確無誤地切除融合標籤，純化工藝簡單等優點。
發明內容為克服上述現有技術中存在的問題及不足，本發明的目的首先在於提供一種高效表達活性重組藍藻抗病毒蛋白N(CVN)的表達載體。本發明的另一目的是提供攜帶或整合了上述表達載體的寄主細胞。本發明的再一目的是提供一種利用上述寄主細胞高效表達重組CVN的方法。本發明的再一目的是提供一種具有抗病毒活性的重組CVN。本發明的最後目的是將上述表達載體和/或寄主細胞和Z或上述重組CVN用於製備抗病毒的藥物。為實現上述目的，本發明的技術方案如下本發明首先基於S[M蛋白融合表達系統,構建了包含編碼藍藻抗病毒蛋白N的核苷酸序列的表達載體，所述核苷酸序列編碼的蛋白包含SEQIDNO:l和SEQIDNO:2的胺基酸序列。本發明進一步提供了包含該表達載體的寄主細胞，同過培養該細胞，並結合現有的分子生物學技術對目標蛋白進行了分離純化，得到了高純度的重組CVN。本發明進-步用實驗證明了純化後的重組CVN的抗病毒活性，充分證明上述表達載體和/或寄主細胞和/或得到的重組蛋白能夠應用於製備抗病毒的藥物。作為優選方案，我們的表達載體選擇包含SEQIDN0:3的核苷酸序列，選擇的載體骨架是P:ET3c並優選大腸桿菌作為表達載體的宿主。具體步驟是根據大腸桿菌密碼子偏好性對CVN原始核苷酸序列進行優化，通過多次PCR合成SUM0-CVN的全長序列，構建pET3c-SUM0-CVN重組表達質粒，轉入大腸桿菌BL21(DE3)菌株中表達SUM0-CVN融合蛋白，然後用特異性的SUMO蛋白酶對融合蛋白進行酶切，並再次通過Ni柱純化除去含6XHis標籤的SUM，SUMO融合蛋白和SUMO蛋白酶，得到純化的重組CVN蛋白。本發明的有益效果如下(1)提高了CVN在宿主菌中的表達水平。將CVN與分子伴侶蛋白SUMO融合，促進CVN在大腸桿菌中的表達,最終獲得表達量40%的工程寄主菌株；(2)改變了CVN高表達的表達形式，不再形成包涵體；(3)通過His標籤的巧妙應用，簡化了下遊純化路線，並且不需要His標籤特異性蛋白酶就可最終製備不帶標籤的CVN，得到的純化後的重組CVN在最大程度上保留了天然CVN的結構特徵,表現為重組CVN蛋白的肽質量指紋譜與理論肽質量指紋譜完全一致。圖1是PCR合成SUMO-CVN全長序列方案。其中，M:DL2000DNAmarker,1:F卜CVN、R卜CVNPCR產物；2:F2-CVN、R2-CVNPCR產物；3:F3-CVN、R3-CVNPCR產物4:F4-CVN、R4-CVNPCR產物5:F4-CVN、R5-CVNPCR產物；6:F-SUMO、R-SUMOPCR產物;7:SUMO-CVN全長序列。圖3是PET3c-SUMO-CVN質粒的圖譜。圖4是重組質粒pET3c-SUM0-CVN的雙酶切鑑定結果。其中M:DL2000DNAmarker;1:雙酶切鑑定；2:PCR鑑定。圖5是SUMO-CVN融合蛋白表達條件的優化。其中M:lowmolecularproteinmarker;1，2，3分別是0.5慮]:PTG在37。C、3(TC、20。C誘導4h;4是O.5mMIPTG20。C誘導24h;5，6，7分別是lmMIPTG在37°C、30°C、20。C誘導4h;8:lmMIPTG2(TC誘導24h。圖6是重組CVN蛋白純化結果的SDS-PAGE鑑定圖譜。其中:M是lowmolecularproteinmarker;1:上清;2:穿透峰;3:4mM咪唑洗脫峰;4:200mM咪唑洗脫峰;5:酶切;6:酶切後200fflM咪唑洗脫峰;7:CVN。圖7是重組CV-N蛋白的肽質量指紋譜(PMF)，"I"表示於理論肽譜相符的肽質量。圖8是MALDI-TOF測定重組CV-N蛋白分子量。其中(A)包含Tl和T7肽段;(B)包含T2,T3，T4，T5,T7和T8月太段。圖9是MTT法測定CVN，SUMO—CVN蛋白抗HSV-I活性。圖10是MTT法測定CVN，SUMO—CVN蛋白對Vero細胞毒性。圖11是CVN對HIV-1/11IB致細胞病變效應的抑制活性。圖12是CVN對宿主細胞生長的抑制活性(毒性)。圖13是CVN抗HIV-1ZIIIB活性測定過程中的宿主細胞形態。具體實施例方式本發明實施例涉及的主要材料如下宿主菌BL21(DE3)、質粒pET3c由本室保存；質粒pET3c-SUM0和SUMO蛋白酶由暨南大學醫藥生物技術研究開發中心黃亞東博士惠贈，Taq酶、T4連接酶限制性內切酶NdeI、Bamhl購自大連寶生物公司，IPTG、小相對分子質量標準蛋白、引物購自上海生工生物公司；NiS印haroseTM6FastFlow購自Amersham公司，四甲基偶氮唑(MTT)，美國SIGMA公司；單純皰疹病毒1型(HSV-l)F，武漢大學病毒研究所；Vero細胞，美國ATCC公司。其它試劑均為分析純試劑。NTA-lObuffer(20mmolZLTris-HCl，pH8.O，O.5mol/LNaCl，10咖ol/L咪唑)，NTA_40buffer(20咖ol/LTris-HCl，pH8.0，0.5mol/LNaCl，40咖ol/L咪唑)，NTA-200buffer(20mmol/LTris-HCl，pH8.0,0.5mol/LNaC:[,20ramo:[/:[.,咪唑)，酶切緩衝液(2mniol/LTris-HCl，p:H8.0,2%]:g印a:[,1.5rao1/LNaCl，IO翻IZLDTT)。實施例1達質粒pET3c-SUM0-CVN的構建及序列分析1、引物序列的設計5根據大腸桿菌密碼子偏好性，對CVN原始序列進行優化，合成十一條引物,通過多次PCR合成SUMO-CVN的全序列，合成策略如圖1所示。所設計的引物由上海生工生物工程技術服務有限公司合成，序列見表l。表1用於合成SUMO-CVN全長序列的弓I物引物名稱序列F4-CVNCAGAGAACAGATTGGTGGTCTTGGTAAATTCTCCCAGACF3-CVNCTGGGTAAATTCTCCCAGACCTGCTACAACTCCGCTATCCAGGGTTCTGF2-CVNCTCCGCTATCCAGGGTTCTGTTCTGACCTCTACCTGCGAACGTACCAACGGTGGFl-CVNCGAACGTACCAACGGTGGTTACAACACCTCCTCTATCGACCTGAACTCCGTTATCGRl-CVNGAAGTTAGACGGCTGCCATTTCAGAGAACCGTCAACGTTTTCGATAACGGAGTTCAGGTR2-CVNCAGAGGAACCAGCCAGCTGGGTGTTACGGCAGGTTTCGATGAAGTTAGACGGCTGCCR3-CVNCGAACTGCTGAGCACGGGTTTTGCATTCAGCAGCCAGTTCAGAGGAACCAGCCAGCTR4-CVNGTTAGCGATGTGGTCGTCCAGGTTGATTTTGGTAGAAACGAACTGCTGAGCACGGGTR5-CVNAGAGGATCCTCATCATTCGTATTTCAGGGTACCGTCGATGTTAGCGATGTGGTCGTCF-SUMOCAGCATATGCATCATCATCATCR-SUMOCTGGGAGAATTTACCAAGACCACCAATCTGTTCTCTG2、PCR合成SUMO-CVN全序列合成分兩步進行，首先通過多次PCR合成CVN基因，第一次PCR引物是Fl-CVN、R卜CVN。反應體系為引物各1ii1，8y1無菌ddH20，10y1TaqPCRMast.erMix,反應混合物9化變性lmin，退火至55°C，保持lmin，72t:延伸lmin，進行29個循環。反應產物進行1%瓊脂糖凝膠電泳，並做膠回收，作為下一輪PCR的模板，經過5次PCR反應合成全長的CVN序列。SUMO全長序列通過PCR方法從PET3c-SUMO中合成。利用SUMO序列末端與CVN序列前端的20bp重疊互補序列進行PCR:以SUMO序列和CVN序列為延伸模板，F卜SUMO,R5-CVN為上下遊引物，在常規的PCR條件下進行反應，反應產物進行1%瓊脂糖凝膠電泳(圖2)，6並做膠回收，得到SUM0-CVN全長序列。3、表達質粒構建及序列分析如圖3所示，將質粒pET3c和SUM0-CVN全長序列分別用NdeI與BamIII進行雙酶切，酶切產物進行1%瓊脂糖凝膠電泳，回收酶切產物，用T4DNA連接酶把這兩個酶切產物連接起來，構建成重組質粒pET3c-SUM0-CVN。重組質粒轉化大腸桿菌JM109感受態細胞，塗布於含氨苄青黴素的LB平板上，37t:培養過夜，提取質粒進行PCR及NdeI與BamHI雙酶切鑑定(圖4),並送往英駿公司測序。1、表達菌株的篩選及誘導表達挑取經測序正確的單克隆，抽提質粒轉化到表達宿主BL21(DE3)中，用含氨苄青黴素的平板篩選出陽性轉化子，挑取單克隆到3ml含氨苄的LB培養基中，37°C,180rpm培養至D6。。=0.61.0。取lml作未誘導對照，其餘加:I:PTG至終濃度lramo:l/L，在37。C下誘導4h，離心收集菌體，菌體沉澱重懸於100u1ddH20中，並加入1u1溶菌酶，室溫孵育30min。4。C，20000Xg離心15min，分別取....匕清和沉澱，進行12%的SDS-PAGE分析。選擇有表達產物的單克隆進行菌種保存。2、SUMO-CVN融合蛋白表達條件分析將保存的菌種按1%接種於3mlLB培養基，37°C、180，振蕩培養過夜，1%的接種量接種到50ml含氨苄青黴素(100mg/L)的LB培養基中，至0D6。。到0.6時，把培養基分成4瓶，3瓶分別在37°C、30°C、20°C0.5mMIPTG誘導表達4h;另外1瓶在20°C、0.5mMIPTG誘導表達24h。用同樣的方法，在1.OmM]:PTG條件下誘導表達。4°C、6000Xg、lmin離心收集菌體。菌體沉澱溶解在5mlNTA-10buffer(20咖olZLTris-HCl，pH8.0，0.5mol/LNaCl，10咖ol/L咪唑)中，凍融3次，超聲破碎3次。破碎產物4°C、25000Xg、30min離心，收集上清和沉澱，進行SDS-PAGE電泳分析，並進行灰度掃描，確定各表達條件下可溶性目的蛋白表達量，確定最佳表達條件。結果如下:SDS-PAGE電泳分析(圖5)可見重組菌體會表達大小約為29kDa的融合蛋白，且融合蛋白多數位於上清中，為可溶性表達(圖5，l匿l)。可溶性融合蛋白表達情況如(表2)所示。由表2可知最佳表達條件是IPTG終濃度為0.5mmol/L,2(TC，誘導表達24h。表2不同表達條件下可溶性蛋白含量tableseeoriginaldocumentpage73、SUM0-CVN融合蛋白搖瓶發酵及純化選取高表達菌株接種到1L含氨苄青黴素(100mg/L)的LB培養基中，按前述最佳表達條件進行搖瓶發酵並誘導。4。C、6000Xg、10min離心收集菌體,凍融一次，然後將菌體沉澱以1:10比例重新懸浮於NTA-lbuffer，超聲破碎(工作時間5s、間歇時間5s，99次，重複3遍)，4°C、25000Xg、30min離心收集上清。上清液上樣至柱床體積為20ml的Ni-NTA親和層析柱中，流速0.6ml/min，NTA-10buffer洗回基線，流速為Iml/min,NTA-40buffer洗雜蛋白，NTA-200buffer，洗脫目的蛋白。純化後的目的蛋白經S印hadexG-25分子篩脫咪唑後進行SUMO蛋白酶酶切，除去SUMO融合蛋白。結果如下1L的發酵培養基搖床發酵後收集得到6±0.5g菌體，菌體破碎產物用Ni-NTA親和層析柱進行純化，不含6xllis標籤的雜蛋白40翻1/L咪唑的NTA-40緩衝液洗脫，StMO-CVN目的蛋白用含2mraol/L咪唑的NTA-200緩衝液洗脫。1L發酵產物約可以純化得到44.6±lmg融合蛋白，佔菌體總蛋白的20.2%。純化產物經SDS-PAGE電泳後進行灰度掃描，結果顯示純度達90%(圖6)。4、SUMO-CVN融合蛋白酶切、CVN蛋白純化及鑑定純化後的目的蛋白調整濃度至l呢/ml，加入1USUMO蛋白酶/mg融合蛋白，在酶切緩衝液中，30t:酶切lh。因SUMO、SUM0蛋白酶均含有6XHis標籤，酶切後的樣品按前述的純化方法除去SUMO、未酶切的SUMO-CVN和SUMO蛋白酶後得到目的蛋白CVN。純化後的CVN蛋白用基質輔助雷射解吸/電離飛行時間質譜(MALDI-TOF-MS)進行肽質量指紋譜(peptidemassfiingerprinting,PMF)鑑定並須lj定分子量。結果如下純化後的目的蛋白經S印hadexG_25分子篩脫咪唑後進行SUMO蛋白酶酶切，除去SUMO融合蛋白。酶切產物的SDS-PAGE電泳分析(圖6)表明，30°C，lh條件卜一80%的融合蛋白可以被酶切開。酶產物再次用Ni-NTA親和層析柱進行純化得到目的蛋白CVN，SDS-PAGE電泳分析(圖6)表明純化的CVN蛋白純度可達95%。l丄的發酵產物最終可純化得到11±0.3mg的CVN蛋白。CVN蛋白一級結構的完整對其發揮抗病毒活性是至關重要的，研究發現N端和C端缺失能夠造成CVN活性的下降，下降比例隨著缺失殘基的增加而提高.AntimicrobAgentsChemother,2003，47(8):2518.]。為鑑定重組蛋白是否是CVN蛋白、有無胺基酸缺失，純化後的重組蛋白脫鹽後用基質輔助雷射解吸./電離飛行時間質譜(MALDI-TOF-MS)進行肽質量指紋譜(p印tidemassfiingerprinting，:PMF)鑑定並測定分子量，結果如圖7、圖8所示。其中從圖7(A)上可以找到Tl和T7肽段，從圖7(B)上可以找到T2，T3，T4，T5，T7,T8肽段，測定結果與胰蛋白酶酶切後理論肽譜相符(表3)。重組蛋白分子量測定結果為11019.87Da(圖8)，與天然CVN蛋白理論分子量11013.16Da相差0.005KD,在誤差範圍內，說明所獲得的重組蛋白為完整的CVN蛋白，無末端胺基酸缺失。表3:胰蛋白酶切後理論肽譜tableseeoriginaldocumentpage9購自JRHBioscience(LotNo.:6D0974)2、方法WST-1法(1)抑制率測定在P3生物安全櫃中，重組CVN用含10%FBS的RPMI1640培養液稀釋至50ug/mL(4.53ymol/L)、10ug/mL(0.91iimol/L)、2yg/mL(180翻1/L)禾口0.4iig,ZmL(36翻1/L)，共4個濃度梯度；收集培養至對數生長期的MT_4細胞，計數細胞總數和活細胞數，用含10%FBS的RPMI1640培養液調整細胞濃度至1X105cell/mL;取100iiL細胞懸液至96孔板中，加入1TCI:D50的HIV-l/IIIB病毒(50uL/孔)，再加入預先稀釋好的不同濃度CVN樣品(50yL/孔)，每個樣品平行設置4個復孔，同時設空白對照、細胞對照、病毒對照和陽性對照(AZT，63nmol/L)各4個復孔;37°C，5%C02培養箱中培養96h後，加入10yL/孔WST-1(5mmol/L)溶液，37"C孵育4h，450nm測定吸光值。(2)毒性測定與抑制率測定方法相同，但各培養板孔中只加細胞和待測樣品，不加病毒。(3)計算公式抑制率(IR)=(As-Av)/(Ac-Av)As:樣品吸光值均值；[,]Av:病毒對照組吸光值均值；Ac:細胞對照組吸光值均值；3、結果如圖11-13所示，CVN具有明顯的抑制IIIV-1/IIIB活性，在濃度為10iig/'mL(.91iiraol/L)時，抑制率為73%,細胞密度為無病毒細胞對照組的95%,與陽性藥物AZT的抑制率和毒性相當(74%，101%)，為高效低毒抗病毒物質。綜上所述，本發明構建了pET3c-SUM0-CVN重組表達質粒，在大腸桿菌BL21(DE3)中表達成功。SUMO-CVN融合蛋白經Ni-NTA親和層析柱純化後，用S印hadexG-25分子篩脫去咪唑，以特異性的SUMO蛋白酶酶切即可除去融合標籤。因SUMO-CVN融合蛋白N端，SIM)蛋白酶N端均含有6xHis標籤，因此可以用Ni-NTA親和層析柱方便地除去酶切後混合物中的雜蛋白，得到純度達95%的重組CV-N蛋白，純化後的重組蛋白脫鹽後經肽質量指紋譜(PMF)鑑定和分子量測定表明其與野生型蛋白完全相同。抗病毒活性測定的結果表明重組蛋白CVN具有良好的抗HSV-I:型病毒活性，未酶切過的StM-CVN融合蛋白同樣具有較好的抗HSV-I型病毒活性；重組蛋白CVN也具有明顯的抑制HIV-1/IIIB活性，為高效低毒抗病毒物質。實驗結果表明SUMO融合表達適合表達全長序列的，無融合標籤的重組CVN蛋白。該表達方法克服了其它表達方法產量低，易形成包涵體,純化困難等缺點。上述實施例為本發明較佳的實施方式，但本發明的實施方式並不受上述實施例的限制，其他的任何未背離本發明的精神實質與原理下所作的改變、修飾、替代、組合、簡化，均應為等效的置換方式，都包含在本發明的保護範圍之內。序列表〈110>暨南大學〈120〉重組藍藻抗病毒蛋白的製備方法及應用〈130>5〈160>21〈170>PatentInversion3.3〈210〉1〈211>15〈212>PRT〈213〉人工序列〈400〉1HisHisHisHisHisHisGlyMetSerAspSerGluValAsnGinGlu151015AlaLysProGluValLysProGluValLysProGluThrHislieAsn202530LeuLysValSerAspGlySerSerGluliePhePheLyslieLysLys354045ThrThrProLeuArgArgLeuMetGluAlaPheAlaLysArgGinGly505560LysGluMetAspSerLeuArgPheLeuTyrAspGlylieArglieGin65707580AlaAspGinThrProGluAspLeuAspMetGluAspAsnAsplielie859095GluAlaHisArgGluGinlieGlyGly100105〈210>2〈211>101〈212>:PRT〈213>Homosapiens〈400>2LeuGlyLysPheSerGinThrCysTyrAsnSerAlalieGinGlySer151015ValLeuThrSerThrCysGluArgThrAsnGlyGlyTyrAsnThrSer202530SerlieAspLeuAsnSerVallieGluAsnValAspGlySerLeuLys354045TrpGinProSerAsnPhelieGluThrCysArgAsnThrGinLeuAla505560GlySerSerGluLeuAlaAlaGluCysLysThrArgAlaGinGinPhe65707580ValSerThrLyslieAsnLeuAspAspHislieAlaAsnlieAspGly859095SThrLeuLysTyrGlu100〈210>3〈211)624〈212>DNA〈213〉人工序列〈220〉〈221>CDS〈222〉(1)(624)〈223〉根據大腸桿菌密碼子偏好性，對CVN原始序列進行優化，通過多次PCR合成UMO-CVN的全序列〈400>3atgcatcatcatcatcatcacggcatgtcggac.teagaagtcaat.caaMetHisHisHisHisHisHisGlyMetSerAspSerGluValAsnGin15101548gaagetaagccagaggtcaagccagaagtcaagcctgagactcacateGluAlaLysProGluValLysProGluValLysProGluThrHislie20253096aatt.taaaggtgtecgatggatctteagagatettcttcasgateaaa144AsnL.euLysValSerAspGlySerSerGluliePhePheLyslieLys354045aagaccactcctttaagaaggctgatggaagcgttcgetaaaagacag192LysThrThrProLeuArgArgLeuMetGluAlaPheAlaLysArgGin505560ggtaaggaaatggactecttaagattcttgtacgacggtatt卿att240GlyLysGluMetAspSerLeuArgPheLeuTyrAspGlylieArglie65707580GingetAlagatcagAspGin3CCThr85CCtg33g3tProGluAspttgiLeugacAsp90EltgMetgagGluAspsacAsngatAsp95atelie288attgaggetcacagagaacagattggtggtcttggtaaatt.cteccag336lieGluAlaHisArgGluGinlieGlyGlyLeuGlyLysPheSerGin100105110acctgctacaactecgetatecagggttctgt:tctgacctctacc.tgc384ThrCysTyrAsnSerAlalieGinGlySerValLeuThrSerThrCys115120125gaacgtaccaacggtggttacaacacctectctategacctgaactec432GluArgThrAsnGlyGlyTyrAsnThrSerSerlieAspLeuAsnSer130135140gttategaaaacgttgacggttctctgaaatggcagccgtctaacttc480VallieGluAsnVaiAspGlySerLeuLysTrpGinProSerAsnPhe145150155160ategaaacctgccgtascacccagctggetgg.t.tectctgaactgget528lieG丄uThrCysArgAsnThrGinLeuAlaGlySerSerGluLeuAla165170175getgaatgcaaaacccgtgetcagcagttcgtttctaccaaaateaac576AlaGluCysLysThrArgAlaGinGinPheValSerThrLyslieAsn180185190ctggacgaccacategetaacategacggtaccctgaaatacgaatga624LeuAspAspHislieAlaAsnlieAspGlyThrL.euLysTyrGlu195200205〈210M〈211>207〈212>PRT〈213>人工序列〈400>4MetHisHisHisHisHisHisGlyMetSerAspSerGluValAsnGin151015GluAlaLysProGluValLysProGluValLysProGluThrHislie202530AsnLeuLysValSerAspGlySerSerGluliePhePheLyslieLys354045LysThrThrProLeuArgArgLeuMetGluA丄aPheAlaLysArgG丄n505560GlyLysGluMetAspSerLeuArgPheLeuTyrAspGlylieArglie65707580GinAlaAspGinThrProGluAspLeuAspMetGluAspAsnAsplie859095lieGluAlaHisArgGluGinlieGlyGlyLeuGlyLysPheSerGin100105110ThrCysTyrAsnSerAlalieGinGlySerValLeuThrSerThrCys115120125GluArgThrAsnGlyGlyTyrAsnThrSerSerlieAspLeuAsnSer130135140VallieGluAsnValAspGlySerLeuLysTrpGinProSerAsnPhe145150155160lieGluThrCysArgAsnThrGinLeuAlaGlySerSerGluLeuAla165170175AlaGluCysLysThrArgAlaGinGinPheValSerThrLyslieAsn180185190LeuAspAspHislieAlaAsnlieAspGlyThrLeuLysTyrGlu195200205〈210>5〈211>39〈212>麗〈213>人工序列〈220〉〈22〗)misc—feature〈222〉(1).(39)〈223〉多次PCR合成SUM0-CVN的全序列的....匕遊引物之一F4-CVN〈400>5cagagaacagatt.ggtggtcttggtaaattctxccagac39〈210>6〈211)49〈212>DNA〈213〉人工序列〈220〉〈221>misc—feature〈222>(1)..(49)〈223>多次PCR合成SUMO-CVN的全序列的上遊引物之一F3-CVN〈400>6ctgggtaaattctcccagacctgctacaactccgctatccagggttctg49〈210>7〈211)54〈212>麗〈213>人工序列〈220〉〈221〉misc_feature〈222〉(1).(54)〈223〉多次PCR合成SUM0-CVN的全序列的....匕遊引物之一F2-CVN〈400>7ctccgctatccagggttctgttctgacctctacctgcgaacgtaccaacggtgg54〈210>8〈211>56〈212>DNA〈213>人工序列〈220〉〈22l>misc—feature〈222>(1)..(59)〈223〉多次PCR合成SUM0-CVN的全序列的上遊引物之一Fi-CVN15〈400>8cgaacgtaccaacggtggttacaacacctcctctatcgacctgaactccgttatcg56〈210>9〈211>22〈212〉DNA〈213>人工序列〈220〉〈221>misc_feat.ure〈222〉(1)(22)〈223>多次PC:R合成SUM0-CVN的全序列的上遊引物之一F-SUMO〈400>9cagcatatgcatcatcat.catc22〈210>10〈211>59〈212>I)NA〈213>人工序列〈220〉〈221>misc_feat.ure〈222〉(1)(59)〈223>多次PC:R合成SUMO-CVN的全序列的下遊引物之一Rl-CVN〈400>10gaagttagacggctgccatttcagagaaccgtc朋cgtutcgataacggagUcaggt.59〈210>11〈211>57〈212〉DNA〈213>人工序列〈220〉〈221>misc_feat.ure〈222〉(1)(57)〈223>多次PC:R合成SUMO-CVN的全序列的下遊引物之一R2-CVN〈400>11cag恥gaaccagccagctgggtgttacggcaggUtcg;U.gaagttagacggctgcc57〈210>12〈211>57〈212〉DNA16〈22l〉misc—feature〈222>(1)..(57)〈223〉多次PCR合成SUMO-CVN的全序列的下遊引物之一R3-CVN〈400〉12cgaactgctgagcacgggttttgcattcagcagccagttcagaggaaccagccagct57〈210>13〈211>57〈212>I)NA〈213〉人工序列〈220〉〈221〉misc—feature〈222>(1)..(57)〈223〉多次PCR合成SUMO-CVN的全序列的下遊引物之一R4-CVN〈400〉13gttagcgatgtggtcgtccaggt.tgaUUggtagaaacgaactgctgfigc;icgggt.57〈210>14〈211>57〈212>I)NA〈213>人工序列〈220〉〈22l〉misc—feature〈222>(1)..(57)〈223〉多次PCR合成SUMO-CVN的全序列的下遊引物之一R5-CVN〈400〉14agaggatcctcatcattcgtatttcagggtaccgtcgatgttagcgatgtggtcgtc57〈210〉15〈211>37〈212>DNA〈213〉人工序列〈220〉〈221)misc—feature〈222>(1)..(37)〈223〉多次PCR合成SUMO-CVN的全序列的R遊引物之一R-SUMO〈400〉15ctgggagaatttaccaagaccaccaat.ctgttctctg37〈210>16〈211〉21〈212>P:RT〈213>Homosapiens〈220〉〈221〉PEPTIDE〈222〉(1)(21)〈223〉肽指紋圖譜T2肽段〈400〉16PheSerGinThrCysTyrAsnSerAlalieGinGlySerValLeuThr151015SerThrCysGluArg20〈210〉17〈211>24〈212>PRT〈213>Homosapiens〈220〉〈221):PEPT]:DE〈222>(1)..(24)〈223〉肽指紋圖譜T3肽段〈400〉17ThrAsnGlyGlyTyrAsnThrSerSerlieAspLeuAsnSerVallie151015GluAsnValAspGlySerLeuLys20〈210〉18〈211>11〈212>PRT〈213>Homosapiens〈220〉〈221):PEPT]:DE〈222>(1)..(11)〈223〉肽指紋圖譜T4肽段〈400〉18TrpGinProSerAsnPhelieGluThrCysArg1510〈210>19〈211>15〈212>PRT〈213>:Horaosapiens〈220〉〈221〉PEPTIDE〈222〉(1)..(15)〈223〉肽指紋圖譜T5肽段〈400>19AsnThrGinLeuAlaGlySerSerGluLeuAlaAlaGluCysLys151015〈21>2〈211>8〈212>PRT〈213>Homosapiens〈220〉〈221〉PE:PTI:DE〈222〉(1)(8)〈223〉肽指紋圖譜T7肽段〈400>20AlaGinGinPheValSerThrLys15〈210>21〈211〉15〈212>P:RT〈213>Homosapiens〈220〉〈221〉PEPTIDE〈222〉(1)(15)〈223〉肽指紋圖譜T8肽段〈400>21lieAsnLeuAspAspHislieAlaAsnlieAspGlyThrLeuLys15101519權利要求1.一種表達載體，其特徵在於所述表達載體包含編碼藍藻抗病毒蛋白N的核苷酸序列，所述核苷酸序列編碼的蛋白包含SEQIDNO:l和SEQIDNO:2的胺基酸序列。2.根據權利要求l所述的表達載體，其特徵在於所述核苷酸序列為SEQIDNO:3。3.根據權利要求2所述的表達載體，其特徵在於所述表達載體為pET3cSUM0-CVN。4.一種包含權利要求1-3中任一項所述表達載體的寄主細胞。5.根據權利要求4所述的寄主細胞，其特徵在於所述細胞為原核細胞。6.根據權利要求5所述的寄主細胞，其特徵在於所述細胞為大腸桿菌。7.—種重組藍藻抗病毒蛋白的製備方法，其特徵在於培養權利要求4-6任一項所述寄主細胞，分離並純化所需的重組藍藻抗病毒蛋白。8.權利要求7所述方法製備得到的重組藍藻抗病毒蛋白。9.權利要求1-3任一項所述表達載體和/或權利要求4-6任一項所述寄主細胞和/或權利要求8所述重組藍藻抗病毒蛋白在製備抗病毒藥物中的應用。全文摘要本發明提供了包含重組藍藻抗病毒蛋白N核苷酸序列的表達載體和包含該表達載體的寄主細胞，並在此基礎上提供了一種製備重組藍藻抗病毒蛋白的方法，獲得了重組藍藻抗病毒蛋白，並進一步證明了所述表達載體和/或所述寄主細胞和/或所述重組藍藻抗病毒蛋白能夠應用於製備抗病毒藥物。本發明的方法克服了現有技術產量低，易形成包涵體，純化困難等缺點。利用本發明製備的重組CVN蛋白的肽質量指紋譜與理論肽質量指紋譜完全一致，並通過抗病毒實驗證明了所得重組蛋白具有良好的抗病毒活性。文檔編號A61K38/16GK101705241SQ20081019892公開日2010年5月12日申請日期2008年9月28日優先權日2008年9月28日發明者熊盛,王一飛,高相雷申請人:暨南大學