組分特性增強的處理的ecm材料的製作方法

2023-10-20 19:53:52

專利名稱：組分特性增強的處理的ecm材料的製作方法
組分特性增強的處理的ECM材料 相關申請參考
本申請要求2006年10月23日提交的標題為"組分特性增強的處理 的ECM材料"的美國臨時專利申請序號60/853,584的權益。該臨時專利 申請因此通過引用而整體結合到本文中。
背景
本發明一般涉及醫學移植材料，尤其是涉及得自組織材料的醫學 移植材料。
已經提出用於醫學移植、細胞培養和其它相關應用的各種處理的 細胞外基質(ECM)材料。例如，已經提出包含得自小腸、胃或膀胱組 織的黏膜下層的醫學移植物和細胞培養材料。見，例如美國專利號 4,902,508、 4,956,178、 5,281,422、 5,554,389、 6,099,567和6,206,931。 A匕夕卜，Cook Biotech Incorporated, West Lafayette, Indiana目前製備基於 小腸黏膜下層的各種醫學產品，其商標為SURGISIS⑧、STRATASIS 和OAS鵬。
例如在美國專利號6,379，710中，也已經提出得自肝基底膜的醫學 材料。以及已經提出用於醫學和/或細胞培養應用的得自羊膜的ECM 材料(見例如美國專利號4,361，552和6，576,618)和得自腎被膜的ECM材 料(見2003年1月9日公布的國際PCT專利申請號WO 03/002165)。
已經嘗試提供保留除膠原外的醫學重要性物質的處理的ECM材 料。然而，為了製備其中不希望有的組分已被除去的處理的ECM，材 料典型地經過一組操作，該操作可以對包含在材料中的期望的組分具 有不期望的後果。例如，已經顯示除膠原之外，黏膜下層和其它ECM 材料包括可以有助於材料生物活性及其在醫學移植和其它用途中價說明書第2/31頁
值的各種期望的組分。例如，ECM材料可以包括當保留在處理的ECM
中時可有益的生長因子、細胞粘連蛋白和蛋白聚糖。然而，難以在制 備醫學上可接受的移植物中有選擇地保留這些組分，同時除去高水平 的不希望有的組分。
生物材料需要保留不僅具有必需的物理性質和高水平的生物相 容性和無菌性，而且具有期望的水平的有益組分。也需要用於製備和 使用這些材料的方法，以及從這些材料形成的醫療裝置。本發明解決 了這些需要。
概述
在一個方面，本發明提供包括處理的細胞外基質(ECM)材料的醫 學移植材料。ECM材料保留膠原和非膠原組分，並期望顯示血管源性 特徵。同時，ECM材料具有低水平的不希望有的組分例如天然脂質、 核酸(例如DNA)和/或免疫球蛋白A (IgA)組分。在優選的實施方案中， ECM材料包括黏膜下層。
在一個實施方案中，本發明提供包括無菌、去細胞化細胞外基質 (ECM)材料的醫學移植材料。ECM材料包括不大於20 pg/g水平的天然 成纖維細胞生長因子-2 (FGF-2)和天然免疫球蛋白A (IgA)。在一些形 式中，材料可以具有不大於約4%的脂質含量。在優選的實施方案中， 分離的ECM材料包括黏膜下層並具有不大於5 pg/g水平的天然IgA和
不大於約3%的天然脂質含量。
在還另一方面，本發明提供包括無菌、去細胞化細胞外基質(ECM) 材料的醫學移植材料。ECM材料具有至少約IO ng/g的天然FGF-2含量 和至少一種且各自為一定形式的以下物質(i)不大於約20 i!g/g水平的 天然IgA; (ii)不大於約4。/。重量水平的天然脂質；(iii)至少約50 1ig/g水 平的天然透明質酸；和(iv)至少約500嗎/g水平的天然硫酸酯化糖胺聚 糖。在某些優選的實施方案中，ECM材料包括黏膜下層。在另外的形 式中，ECM材料具有不大於約5 i!g/g水平的天然IgA和不大於約3。/o重
7量的天然脂質含量。
本發明還提供治療患者的方法。該方法包括將本發明的醫學移植 材料移植至患者。
本發明還提供用於製備醫學移植材料的方法。該方法包括提供起
始細胞外基質(ECM)材料。該起始ECM材料被處理以減少材料的脂 質、核酸和/或IgA和/或其它免疫球蛋白含量，同時材料保留顯著水平 的生長因子、蛋白聚糖和/或糖胺聚糖。在某些實施方案中，該方法包 括用稀釋的離子清潔劑溶液處理起始ECM材料，以破裂細胞和核膜， 並用鹼性溶液處理起始ECM材料，以溶解和除去DNA和其它核酸物 質。該方法可以另外包括用有機溶劑處理ECM材料，以從材料中除去 脂質，和/或用氧化性消毒劑溶液，例如含過氧化物的消毒劑溶液處理 ECM材料，以將材料消毒。優選衝洗ECM材料，以除去這些溶液留下 的殘留物。
本發明的醫學移植材料可以以各種形式提供。例如，醫學移植材 料可以一種或多種片、糊、海綿、非膠凝水溶液、粉末或凝膠提供。 也考慮這些形式的組合。
各種形式的醫學移植材料可以用於各種醫學(包括獸醫)應用。實 例包括組織，例如以下組織的^^復或重建神經組織、皮膚組織(例如 在傷口護理中)、心血管組織(包括血管組織和心臟組織)、心包組織、 肌肉組織、膀胱組織、目艮組織、牙周組織、骨、結締組織例如腱或初 帶及其它。
根據本文的描述，本發明的其他實施方案以及特徵和優點將是顯 而易見的。
附圖簡述


圖1描繪由單層的細胞外基質(ECM)材料形成的本發明的醫學移 植材料，該細胞外基質(ECM)材料從溫血脊推動物的組織分離。
圖2描繪由兩層的ECM材料形成的本發明的醫學移植材料，該ECM材料從溫血脊推動物的組織分離。
圖3提供本發明的一種人工瓣膜裝置的側視圖，該裝置包括附接 至框架的ECM材料。
圖4提供在圖3中描繪的人工瓣膜裝置的左側視圖。 圖5提供在圖3中描繪的人工瓣膜裝置的右側視圖。
詳述
為了促進理解本發明的原理的目的，現在將參考其某些實施方案 並將使用具體的語言描述它們。然而應理解，並不因此而限制本發明 的範圍，如本發明所涉及領域的技術人員正常發生的那樣，考慮在所 述實施方案中的此類變化和進一步修改，和本文所述的本發明原理的 此類進一步應用。
如上所述，在本發明的一個方面提供具有獨特組分特性的細胞外 基質移植材料，該組分特性為不希望有的組分低，同時保留顯著水平 的期望的組分。這些獨特的材料可以通過處理方法來製備，該處理方 法包括處理相對不純的ECM起始材料，以減少不希望有的組分，例如 核酸、脂質和/或免疫球蛋白例如IgA的含量，同時保留顯著水平的期 望的組分例如生長因子、蛋白聚糖和/或糖胺聚糖(GAGs)。通常，ECM 起始材料將用溫和的清潔劑溶液，例如離子型或非離子型清潔劑溶液 處理。低濃度的清潔劑確保保留顯著水平的期望的組分，例如如上所 述的那些組分。在某些操作方式中，ECM材料將用十二烷基硫酸鈉 (SDS)的水溶液或另 一種離子型或非離子型清潔劑溶液，在清潔劑濃 度約0.05%-約1%,更優選約0.05%-約0.3%下處理。該處理可以持續一 段時間，典型的約0.1小時-約10小時，更典型的約0.5小時-約2小時， 以有效破壞細胞和核膜，並減少ECM材料的免疫球蛋白(例如IgA)含 量。優選以該方式處理分離的ECM材料，破壞細胞和核膜並導致顯著 降低其IgA含量的材料，因此降低材料的免疫原性。例如，本發明處 理的ECM材料可以具有不大於約20 pg/g的天然IgA含量。在優選的實
9施方案中，本發明的ECM材料可以具有不大於15 pg/g，不大於IO (ig/g， 或甚至不大於5昭/g的天然IgA含量。在某些實施方案中，處理的ECM 材料基本上不包括天然的IgA。"基本上不包括IgA"指分離的ECM材料 包括低於可檢測水平的IgA。用於檢觀'JIgA的方法在本領域中熟知，並 包括例如酶聯免疫吸附測定法(ELISA)。在這方面應理解，得自不同 來源的ECM材料可能具有不同的在組織中佔優勢的免疫球蛋白。期望 本文公開的處理技術將有效降低ECM材料中其它免疫球蛋白，包括在 源組織中佔優勢的那些免疫球蛋白的含量。因此，本發明的其它方面 涉及ECM材料的分離，該ECM材料具有顯著降低水平(例如低於約20 嗎/g)的(i)在源組織中佔優勢的免疫球蛋白，或(ii)總免疫球蛋白含量 (在組織中所有免疫球蛋白的和)。 /.,
除了'用清潔劑茶廣處理ECM材料之外，ECM材料可以與參與達 到期望的ECM組分特性的其它試劑接觸。例如，可以用DNA可溶於其 中的含水介質，優選鹼性介質處理ECM材料。在某些形式中此類介質 可以具有高於7-約9的pH，在一些實施方案中證明約8-約8.5的pH尤其 有益。鹼性含水介質可以包括緩衝劑，期望生物相容性緩沖劑例如三 (羥曱基)氨基甲烷(TRIS)和/或螯合劑例如乙二胺四乙酸(EDTA)。在一 個優選的形式中，核酸增溶性介質是TRIS-硼酸鹽(bomte)-EDTA (TBE) 緩衝液。在另一個優選的形式中，核酸增溶性介質是氫氧化銨溶液。 用DNA增溶性介質的該處理可以持續有效降低ECM材料的DNA含量 的一段時間，典型的約0.1小時-約10小時，更典型的約0.5小時-約2小 時。
除了用清潔劑和DNA-增溶性介質處理之外，製備本發明的醫學 移植材料的方法可以涉及用導致顯著降低ECM材料的脂質組分水平 的液體介質處理。例如，在某些實施方案中，產生的ECM材料的天然 脂質含量可以被降至不大於約4%。這可以例如通過涉及以下步驟的制 備方法來實現用脂質可溶於其中的液體有機溶劑處理ECM材料。合 適的此類有機溶劑包括例如水互溶性溶劑，包括極性有機溶劑。這些溶劑包括低分子量(例如d-Q)的醇，例如曱醇、乙醇、異丙醇和丁醇、 丙酮、氯仿及其它。另外的有機溶劑包括非極性溶劑例如己烷、苯、
甲苯等。在更優選的實施方案中，處理的ECM材料將被處理至其天然 脂質含量不大於約3%，或不大於約2.5%。用除去脂質的介質的該處理 可以持續有效降低ECM材料的脂質含量的一段時間，典型的約O. 1小時 -約IO小時，更典型的約0.1小時-約1小時。在某些實施方案中，將進行 多次(兩次或多次)此類處理。此外，用如上所述的降低脂質的介質的 處理可以在用如上所述的清潔劑介質和/或含水(優選鹼性)降低DNA 的介質的處理之前或之後進行。在某些優選的實施方案中，用降低脂 質的介質的處理將在用清潔劑介質和/或含水(優選鹼性)介質的處理之 前發生。
ECM材料也可以用消毒液處理。消毒液可以包括消毒劑例如醇、 過氧化物或另一種氧化性或非氧化性消毒劑。在某些形式中，消毒液 將是具有約0.1%-約0.3%過氧乙酸濃度的過氧乙酸溶液。例如，可以 使用過氧乙酸和其它氧化性消毒劑處理溶液，例如在美國專利號 6,206,931中所述的那些。
ECM材料也可以在貫穿其製備的各階段(例如用自來水、高純度 水或緩沖液)衝洗，以便除去保留在材料內或材料上的引進的化學殘留 物。在優選的實施方案中，至少約90%的清潔劑殘留物從材料中除去。 更優選至少約95%，或至少約97%的清潔劑殘留物從材料中除去。
的順序，用清潔劑、DNA增溶性、脂質增溶性、衝洗和可能的其它液 體介質進行處理。例如，在處理期間，可能在攪拌下，可將ECM材料 浸在介質中。也可以使用其它接觸方法例如用介質噴霧或噴'淋ECM材 料。以及，處理可以在任何合適的溫度下進行。優選0。C-約5(TC的溫 度，因為它們確保使ECM材料的膠原和其它期望的組分的顯著變性最 小化或避免其顯著變性。更優選，處理溫度為約0。C-約37。C,且更典 型的為約20。C-約37。C。然而，應理解，本發明的廣義方面內可使用其它溫度。在其中形成管狀或其它可閉合結構的實施方案中，包括腔的 ECM材料可以在一端夾住，以允許該腔充滿介質，並可以在另一端夾
住，以基本上將管狀ECM材料的近端和遠端閉合。具有填充的腔的管 狀ECM材料可以浸在介質中，該介質可以是相同的或不同的介質。以 這種方式，可以處理管狀ECM材料的腔和外表面的每一個，而不必需 要處理介質擴散或通過ECM材料。可以用本文使用的任何介質重複該 方法，包括任何衝洗步驟。
處理例如上述那些處理和/或其它的化學和/或機械處理，將使 ECM組織去細胞化，期望導致不含得自源組織的活細胞的處理的ECM 組織。然而，在某些實施方案，例如以下描述的那些中的某些實施方
源，期望含大量膠原結締組織的一種來源。可以使用人或其它動物組 織來源。非人的動物來源可以是溫血脊推動物包括哺乳動物，並且牛、 羊、山羊和豬來源是合適的。得自這些組織來源的合適的ECM材料可 以包括黏膜下層、腎被膜、皮膚膠原、硬腦脊膜、心包、闊筋膜、漿 膜、腹膜或基底膜層，包括肝基底膜。用於這些目的的合適的黏膜下 層材料包括例如腸黏膜下層包括小腸黏膜下層、胃黏膜下層、膀胱粘 膜下層和子宮黏膜下層。應理解，在分離包括黏膜下層的ECM中，一 些或所有的來自源組織的原始黏膜下層可能連同得自 一 種或多種鄰 近組織層的材料一起被保留。相似的原則應用於其它富含膠原的層或 本文命名的其它組織-回收的ECM材料可包括一些或所有的最初存在 於源組織的特定組織，和/或在最終處理的ECM材料中可保持與鄰近組 織的連接。
本發明處理的、自然衍生的ECM材料將典型地包括豐富的膠原， 最常見由以乾重計，至少約80%重量的膠原構成。此類自然衍生的 ECM材料將在最大程度上包括不隨機定向的膠原纖維，例如一般作為 單軸或多軸但有規則地定向纖維存在。當處理以保留天然生物活性組
1分時，ECM材料可以保留這些組分，作為固體散布在膠原纖維之間、 之上和/或之中。用於本發明的特別期望的自然衍生的ECM材料將包括 在光學顯微鏡檢查下可容易確定的顯著量的此類散布的、非膠原固 體。在某些發明實施方案中，此類非膠原固體可以佔ECM材料乾重的 顯著百分比，例如在本發明的各種實施方案中，佔至少約1%、至少約 3%和至少約5%重量。
本發明處理的ECM材料也可顯示血管源性特徵，並因此有效誘導 在用材料移入的宿主中的血管發生。在這方面，血管發生是以下的過 程機體通過該過程製備新血管以致增加對組織的血液供應。因此， 血管源性材料當與宿主組織接觸時，促進或支持新血管的形成。已開 發出體內血管發生對生物材料植入的響應的測量方法。例如， 一種此 類方法使用皮下植入體模型，以確定材料的血管源性特徵。見，C. Heeschen等，iV""/wwM^fc/"e 7 (2001)，第7期，833-839。當與螢光孩史 血管造影術聯合時，該模型可以提供在生物材料中血管發生的定量和 定性測量。C. Johnson等,Oc由/o" i e鄉/r/ 94 (2004)， No. 2， 262-268。
最好製備用於本發明的醫學移植材料和方法的生物重塑性ECM 材料。生物重塑性並促進細胞侵襲和向內生長的此類材料提供特別的 優點。生物重塑性材料可用於本文中，以促進在植入本發明的醫學移 植材料的部位的細胞生長。
如上所述，處理的黏膜下層(含黏膜下層)的ECM材料和任何其它
的ECM材料可保留對源組織而言是天然的各種生長因子或其它有益 的生物活性組分中的任何一種。例如，黏膜下層或其它ECM可以包括 一種或多種天然的生長因子，例如基本成纖維細胞生長因子(FGF-2)、 轉化生長因子卩(TGF-P)、表皮生長因子(EGF)、結締組織生長因子 (CTGF)、血管內皮生長因子(VEGF)和/或血小板衍生生長因子 (PDGF)。以及，用於本發明的黏膜下層或其它ECM可包括其它生物材 料，例如蛋白聚糖和/或糖胺聚糖，例如肝素、硫酸肝素、透明質酸、纖連蛋白等。因此， 一般而言，處理的ECM材料將包括至少一種天然 生物活性組分，該天然生物活性組分直接或間接地誘導細胞反應例如 在細胞形態、增殖、生長、蛋白質或基因表達中的變化。
在優選的實施方案中，處理的ECM材料將顯示其中以下非膠原組 分以指定量存在的組分特性
組分 優選的範圍 更優選的範圍
脂質: 少於5% 少於3%
FGF-2: 大於2ng/g 大於5 ng/g
IgA: 少於5pg/g 少於l嗎/g
HA: 大於50嗎/g 大於100嗎/g
sGAG: 大於1000fxg/g 大於2000 (ig/g
可見細胞核 少於200/0.263 mm2 少於100/0.263 mm:
此外，除了保留天然生物活性組分之外，非天然生物活性組分例 如由重組技術或其它方法合成產生的那些組分，也可4參入到黏膜下層
天然4汙生或重組產生的蛋白質天然存在於ECM組織中，4旦也許是不 同種類的那些(例如應用至來自其它動物例如豬的膠原ECM的人蛋白 質)。非天然的生物活性組分也可以是藥物。可摻入用於本發明的ECM 材料內和/或上的示例性藥物包括例如抗生素、促進血栓的物質例如凝 血因子，例如凝血酶、纖維蛋白原等。這些物質可立即在操作(例如通 過使材料浸泡於含合適抗生素例如頭孢唑林的溶液中)之前，或在材料 移植入患者期間或之後，作為預製備步驟應用至ECM材料。
非天然生物活性組分可以通過任何合適的方式應用至黏膜下層 或其它ECM組織。合適的方式包括例如噴霧、浸漬、浸沒等。非天然 生物活性組分可以在材料被附接至伸長的膜之前或之後應用至ECM 組織。相似地，假如其它化學或生物組分包括於ECM組織中，那麼非
天然生物活性組分可以在與這些其它組分連接之前或之後應用。
本發明處理的黏膜下層或其它ECM組織的內毒素水平優選低於
14約U內毒素單位(EU)/克，更優選低於約5 EU/克，且最優選低於約l EU/克。作為另外的優先選擇，黏膜下層或其它ECM材料的生物負荷 可低於約l集落形成單位(CFU)/克，更優選低於約0.5 CFU/克。真菌水 平期望類似地低，例如低於約l CFU/克，更優選低於約0.5 CFU/克。 核酸水平優選低於約2 pg/mg，更優選低於約l嗎/mg，病毒水平優選 低於約50噬斑形成單位(PFU) /克，更優選低於約5 PFU/克。
在某些實施方案中，內毒素水平可以被認為與一種或多種分離 的、單片ECM材料的表面積有關。在此類情況下，ECM材料片可以顯 示低於約0.25EU/cn^的內毒素水平。在優選的實施方案中，ECM材料 片顯示低於約0.2EU/cm2、低於約O.l EU/cm2、且甚至低於約0.05/cm2 的內毒素水平。在最優選的實施方案中，ECM材料片顯示低於約0.025 EU/cm、々內毒素水平。包括許多粘合或偶合的ECM材料片的多層 ECM結構可以顯示基於整個多層結構表面積的類似內毒素水平。
明醫學移植材料的脫水可以通過本領域中已知的任何方式來實現。雖 然也可以使用其它技術例如風乾，但優選通過凍幹或真空降壓來完成 脫水。當以乾燥狀態貯藏時，通常期望在使用之前再水化處理的ECM 材料。在這方面，任何合適的潤溼介質可以用於將醫學材料再水化， 作為實例包括水或緩衝鹽水溶液。
在某些實施方案中，可以將處理的ECM材料交聯。在醫學移^t材 料內或在醫學移植材料的兩層或多層之間增加交聯的量(或數目)可以 用於增強其強度。然而，在醫學移植材料內交聯也可影響其生物重塑 能力或其它生物活性特徵。因此，在某些實施方案中，將提供基本上 保留其天然交聯水平的生物重塑性ECM材料，或可以審慎地選擇在 ECM材料內增加交聯的量和/或類型，以保留期望水平的生物重塑能力 或其它生物活性特徵。
為了用於本發明，可通過光交耳關技術，或通過交耳關劑例如通過化 學交聯劑的應用，或通過脫水或其它方法誘導的蛋白質交聯，實現處理的ECM材料的任何引入的交聯。可使用的化學交聯劑包括例如醛例
如戊二醛、二醯亞胺例如碳二亞胺，例如l-乙基-3-(3-二曱氨基丙基) 碳二亞胺鹽酸鹽、核糖或其它糖、醯基-疊氮化物、磺基-N-羥基琥珀 醯胺或聚環氧化物，包括例如聚縮水甘油醚例如以商品名DENACOL EX810購自Nagese Chemical Co" Osaka, Japan的乙二醇二縮水甘油醚， 和以商品名DENACOL EX 313也購自Nagese Chemical Co.的甘油聚甘 油醚。通常當使用時，聚甘油醚或其它聚環氧化物將具有2-約10個環 氧化物基團/分子。優選，醫學移植材料用包含轉穀氨醯胺酶的交聯劑 交聯。
本發明處理的ECM材料可以製備成各種物理形式，以適合各種醫 學應用。例如，分離的ECM材料可以一種或多種片、糊、泡沫狀物、 非膠凝水溶液、粉末或凝膠提供。也考慮這些形式的組合。在這方面， 可在ECM材料已經如本文所述處理之前或之後獲得ECM材料的構型。 此外，ECM複合材料可以製備成較大的體積尺寸，然後分成較小的產 品。此外，ECM材料可以天然衍生的層形式提供，或可能它本身就是 從天然衍生的ECM材料製備的製備物品，例如海綿或流延片。
本發明的醫學移植材料可用於各種醫學(包括獸醫)應用。實例包 括〃修復或重建組織例如神經組織、皮膚組織，例如在傷口癒合例如施 用至外部皮膚傷口 ，包括但不限於潰瘍(例如糖尿病性潰瘍或其它慢性 潰瘍)中、心血管組織(包括血管組織和心組織)、心包組織、肌肉組織、 眼組織、牙周組織、骨、結締組織例如腱或韌帶、在胃腸瘻的處理中 (例如處理成栓塞的形式，以至少堵塞瘻例如肛門直腸瘻、直腸陰道瘻 或腸外瘻的主要開口 )和其它。
在一個實施方案中，例如使用在美國專利號5,275,826和5,516，533 中所述的技術，將處理的ECM材料製備成流體化組合物。在這方面， 可以通過碾碎和/或用蛋白酶(例如胰蛋白酶或胃蛋白酶)消化材料，持 續足以溶解材料並形成基本上均勻的溶液的一段時間，來製備ECM材 料的溶液或懸浮液。期望通過撕碎、切割、碾碎、剪斷等粉碎ECM材
16料。最好在冷凍或凍幹狀態下碾磨材料，雖然通過使片狀材料的懸浮 液在高速混合器中進行處理和如有必要，通過離心和傾析過量的廢物 脫水也可以獲得好的結果。粉碎的材料可以乾燥例如冷凍乾燥形成粉 末。此後，如有必要，粉末可以水化，即與水或緩沖鹽水和任選其它 藥學上可接受的賦形劑組合，形成流體組織移植組合物，例如在25。C
下的粘度為約2-約300,000cps。較高粘度的移植組合物可以具有凝月交或 糊的一致性。
對於最典型地需要修復或增加以糾正創傷或疾病誘導的組織缺 損的組織，例如骨或軟組織，本發明的流體化ECM材料發現了作為可 注射異種移植物的用途。本發明流體化組合物最好也用作植入物構建 物的填充劑，該植入物構建物包含例如一片或多片膠原ECM材料，該 膠原ECM材料形成密封(縫線合)嚢，用於整容或創傷治療的手術操作。
在一個示例性的製備中，將如本文所述製備的ECM材料減小成小 片(例如通過切割)，該小片被裝在平底不鏽鋼容器中。將液氮導入容 器中以冷凍樣品，然後將該樣品在冷凍狀態時粉碎形成粗粉末。可以 例如用手^l反壓機，用圓柱狀黃銅4t置於冷凍的樣品頂部，進行此類處 理。4走用作樣品與壓機軸之間的界面。可以將液氮定時性地加入至樣 品，以使樣品保持冷凍。
可以利用粉碎ECM材料樣品的其它方法，產生可依照本發明使用 的粉末。例如，可以冷凍乾燥ECM材料樣品，然後使用手扳壓機或其 它碾磨工具碾磨。或者，可以在高剪切混合器中處理ECM材料，以在 脫水和乾燥之後產生4分末。
4吏用預冷的研缽和研杵進一步碾磨ECM材料粉末可以用於產生 均勻、更細的產品。並且，在最終的碾磨期間當需要維持固體冷凍顆 粒時，使用液氮。使用例如緩衝鹽水可以使粉末容易地水化，以產生 期望粘度的本發明的流體化組織移4直材料。
為了製備另 一種優選的流體化材料，ECM材料粉末可以篩過金屬 絲網，收集，並經過蛋白質分解消化，形成基本上均勻的溶液。例如，在室溫下48小時內，可以用1 mg/ml的胃蛋白酶(SigmaChemical Co., St. Louis Mo.)和O.l M乙酸消化粉末，用HCl調節至pH2.5。在該處理之後， 可以用氫氧化鈉(NaOH)中和反應介質，以鈍化胃蛋白酶的活性。溶解 的黏膜下層然後可以通過溶液的鹽沉澱而濃縮並分離，以進一步純化 和/或冷凍乾燥，形成粉末形式的蛋白酶溶解的膠原ECM材料。
本發明的流體化組合物在組織置換、增強和/或修復中發現了廣泛 的應用。流體化組合物可以用於誘導在存在缺陷的區域中天然結締組 織或骨的再生。通過將有效量的流體化組合物注射入組織缺陷的部位 或需要癒合的傷口 ，可以容易地利用膠原ECM材料的生物向性。
在矯形外科的應用中，本發明的醫學移植材料可以用於修復骨組 織，例如使用在美國專利號5,641,518中所述的一般技術。因此，材料 的粉末形式可以植入待修復的損壞或患病的骨區域中。粉末可以單獨 使用，或與一種或多種另外的生物活性劑聯合使用，例如在生理學上 相容的礦物質、生長因子、抗生素、化學治療藥物、抗原、抗體、酶 和激素。優選，粉末型植入物將被壓成預定的三維形狀，將其植入骨 區域，在用內源性組織置換移植物期間將基本上保留其形狀。
本發明處理的ECM材料也可以用作細胞生長基體，例如與支持受 試者細月包，例如真核細胞例如內皮細胞、成纖維細胞、胎兒皮膚細胞、 骨肉瘤細胞和腺癌細胞生長的營養素組合的片、糊或凝膠形式(見，例 如國際PCT申請公布號WO 96/24661)。在優選的形式中，基體組合物
將支持哺乳動物細胞包括人細胞的增殖和/或分化。
也可以使用類似於在j朋.戶/^s/. Sw^., 1995， 35:3740380;和/ ^rg.i 仏，1996， 60: 107-114中所述的那些技術的技術，將本發明處 理的ECM材料用於體壁4務復，包括例如用於腹壁缺損例如疝的i'務復。 在此類應用中，本發明的優選的醫學移植材料促進在重塑組織中有利 的組構化、血管形成和一致性。在皮膚病學的應用中，可以使用本領 域和文獻(見，例如4朋fi^o/屍/fl幼'cSwrge^7 1995, 35: 381-388)已知的 一般移植技術，將本發明的醫學移植材料用於部分或全部厚度傷口的修復和用於皮膚的增厚。此外，在燒傷治療的區域中， 一般已知提供 培養的表皮移植物(優選培養的表皮自體移植物或CEA)移植在其上的 皮膚替代物。此類培養的移植物已經典型地包括將角質化細胞和/或成 纖維細胞移植到皮膚替代物上。根據本發明，醫學移植材料可以例如
以片的形式用作皮膚替代物，且CEA因此移植在該材料上。在實踐本 發明的該方面的 一個模式中，可以例如通過接種或轉移角質化細胞 片，將角質化細胞移植在黏膜下層的黏膜側面上。成纖維細胞也可以 移植在黏膜下層的黏膜側面和/或對(內)側面上。
植。例如，可以使用與在美國專利號5,645，860; L/,o/柳,1995， 46: 396-400;和乂 t/ra/ogK, 1996, 155: 2098中一般描述的那些技術相應的 技術，將醫學移植材料用於膀胱修復，以提供用於膀胱再生的支架。 在流體化的形式中，本發明的醫學移植材料也可以發現在內窺鏡注射 操作以糾正膀胱輸尿管返流的用途。在此類應用中，可以例如在患者 輸尿管口以下的區域中進行注射，以誘導在注射部位的平滑肌生長和 膠原形成。
一般而言，當配置用作組織移植物時，本發明處理的ECM材料可 以包括可以切割或另外配置成用於其最終用途的期望尺寸的 一 片或 多片ECM材料。在許多情況下，將移植材料的尺寸製成比其應用的組 織缺陷大。以該方式製成醫學移植材料的尺寸允許容易附接至周圍的 組織。
一旦規定尺寸的ECM移植材料已經置於缺陷上、內或周圍，那麼 可以使用幾種已知的合適附接手段中的任何一種將材料附接至周圍 組織。合適的附接手段包括例如生物相容性粘合劑(例如纖維蛋白膠)、 U形釘固定、縫線合等。優選，通過縫線合將醫學移植材料附接至周 圍組織。當前本領域可得到各種合成材料用作縫線。例如，包含 ProleneTM、 Vicryl 、 Mersilene 、 PanacrylTM和MonocryFM的縫線考 慮用於本發明。本領域的那些技術人員熟知其它縫線材料。因此上述材料僅用作實例，因此決非用於限制。
在其它領域中，用本發明的ECM材料形成的醫學移植材料可以用 於神經病學應用中，例如用於需要硬腦脊膜替代物修復由於創傷、肺 瘤切除或減壓操作的缺陷的技術中。
本發明片形式的處理的ECM醫學移植材料，可以由單層或多層的 材料組成。因此，在某些實施方案中，可以使用單個分離層的ECM材 料或多層的ECM構建物。用於本發明的示例性多層ECM構建物可例如 具有層壓在一起的2-約10個分離的ECM層。
用於本發明的多層ECM構建物可以按任何合適的式樣製備。在這 方面，可以使用各種用於將ECM層層壓在一起的技術。這些技術包括 例如在加熱、不加熱或凍幹條件下脫水熱粘合，使用膠粘劑、膠或其 它粘合劑，用化學試劑或輻射(包括UV輻射)交聯，或這些技術相互之 間或與其它合適方法的任何組合。關於可以用於本發明的多層ECM構 建物的另外信息及其製備方法，可參考例如美國專利號5,711 ，969、 5,755,791、 5,855,619、 5,955,110、 5,968,096,和參考美國專利申請公 布號20050049638。
用於本發明的單層ECM或多層ECM構建物或其它生物相容性材 料在其結構中可以具有或可以缺乏穿孔或裂縫線，在某些實施方案中 可以具有例如在美國申請專利7>布號2005002141中所述的網狀結 構。此類網狀圖案結構可以用於提供用於本發明的可高度形變的ECM 或其它植入物片段。
在另外的實施方案中，本發明的處理的ECM可以經受使材料膨脹 的處理。可以通過控制ECM材料與 一種或多種;鹹性物質的接觸直至材 料膨脹，將膨脹的材料分離，按某些形式形成此類膨脹的材料。例如， 接觸可以足以將ECM材料膨脹至其最初總體積的至少120%(即1.2倍)， 或按某些形式膨脹至其最初體積的至少約2倍。此後，例如通過中和 和/或沖洗，可以任選使膨脹的材料與鹼性介質分離。可以以任何合適 的方式將收集的、膨脹材料用於醫療裝置的製備。例如，在期望的形狀或構型的移植物構建物的形成中，可以將膨脹的材料富集生物活性 組分、乾燥和/或模塑等。在某些實施方案中，用膨脹的ECM材料形成 的醫學移植材料和/或裝置可以是可高度壓縮的(或可膨脹的)，以便材 料可以壓縮，以便例如從帶導管的遞送裝置的腔內遞送，此後從裝置 展開後膨脹，以便被錨定在患者體內和/或引起患者體內管道的閉合。
可以通過控制如上所述的處理的ECM材料與含氬氧化鈉的水溶 液或其它介質的接觸，來形成膨脹的ECM材料。材料的鹼處理可以引 起材料的物理結構的變化，該變化又引起該材料的膨脹。此類變化可 包括在材料中膠原的變性。在某些實施方案中，優選使材料膨脹至其 最初總體積的至少約3倍、至少約4倍、至少約5倍或至少約6倍或甚至 更多倍。膨脹的幅度涉及幾個因素，包括例如用於待膨脹的材料處理 中的鹼性介質的濃度或pH、暴露時間和溫度。
些ECM材料中的任何一種或其它合適的ECM。典型的此類ECM材料
原纖維網絡。在本文所述的膨脹處理之後，自然發生的分子內交聯和 自然發生的分子間交聯可以保留在處理的膠原基質材料中，足以維持 膠原基質材料作為完整的膠原片材料；然而，在膠原片材料中的膠原 原纖維可以變性，且膠原片材料的鹼處理的厚度可以大於起始材料的 厚度，例如最初厚度的至少120。/。，或最初厚度的至少兩倍。
例如，用於處理重塑性材料的鹼性物質濃度可以為約0.5-約2M, 更優選約l M的濃度。另外，在某些實施方案中鹼性物質的pH可以為 約8-約14。在優選的方面，鹼性物質的pH為約10-約14,且最優選約12-約14。
如上所述，除濃度和pH之外，其它因素例如溫度和暴露時間將有 助於膨脹的程度。在該方面，在某些變體中，在約4-約45。C下進行膠 原材料在鹼性物質中的暴露。在優選的實施方案中，在約25-約40。C下， 最優選在37。C下進行暴露。此外，暴露時間可以為至少約l分鐘-約5
21小時或更長。在一些實施方案中，暴露時間為約l-約2小時。在特別優
選的實施方案中，膠原材料在約37。C下暴露於pH 14的1 MNaOH溶液 中，持續約1.5-2小時。此類處理導致重塑性材料的膠原變性和顯著膨 脹。材料的膠原基質的變性可以觀察為在材料的膠原包裝特徵中的變 化，例如起始材料的緊密結合膠原網絡的明顯破壞。當通過肉眼或在 適度的放大倍數，例如放大100倍下觀察時，非膨脹的ECM或其它膠 原材料可以具有提供基本上一致、連續表面的緊密結合的膠原網絡。 相反，膨脹的膠原材料可以具有相當不同的表面，不同之處在於表面 是不連續的，而是當在相同的放大倍數,例如約100倍下觀察時，在 股或束之間的材料中被大量間隙分離的許多區域中，存在膠原股或 束。因此，膨脹的膠原材料通常似乎比相應的非膨脹膠原材料有更多 的孔。此外，在許多情況下，膨脹的膠原材料可以證明具有增加的孔 隙率，例如通過測量與未處理的起始材料比較增加的對水或其它流體 通過的滲透率可以證明。膨脹的ECM或其它膠原材料的更多泡沫和多 孔結構可以允許該材料流延或製備成各種海綿或泡沫形狀，用於醫學 材料和裝置的製備。它可進一步允許製備可高度壓縮並在壓縮後膨脹 的構建物。此類性質可有用，例如，當製備的醫學移植材料被壓縮並 裝入展開裝置(例如其腔)中時，該裝置用於遞送至患者內，此後展開 在植入部位膨脹。
在此類鹼處理之後，材料可以與鹼性介質分離並為了進一步使用 而處理。例如，收集的材料可以在進一步處理材料以形成本發明的醫 學移植材料之前，被中和和/或用水衝洗以從材料中除去鹼性。
本發明的醫學移植材料也可以與 一種或多種第二組分聯合使用， 以構建各種醫療裝置。在某些實施方案中，處理的ECM材料被附接至 膨脹性元件，例如自膨脹性或強制膨脹性(例如球嚢膨脹性)支架或框 架。本發明的此類裝置可以適用於在心血管系統內，包括在動脈或靜 脈內展開。某些裝置適合作為血管瓣膜，例如用於經皮植入動脈內或 腿部靜脈或足部靜脈內以治療4爭脈機能不全。用本發明處理的ECM材料製備的人工瓣膜裝置可以植入身體的
通道作為無框架的瓣膜裝置，或如上所述，ECM材料可以附接至膨脹 性框架。ECM材料可以用於形成生物相容性覆蓋物例如套筒和/或用於 形成小葉或其它瓣膜結構(見，例如WO 99/6243l和WO 01/19285)。在 形成瓣膜結構的 一種模式中，處理的ECM材料可以按一定方式附接至 支架，由此方式它形成l個、2個或多個小葉、尖突、袋或類似的結構， 該結構阻止沿一個方向相對於另一個方向流動。在此類裝置的具體應 用中，將作為血管瓣膜構建的此類裝置植入，以治療例如在腿部發生 的人靜脈機能不全。
現在參考圖l，描繪了由得自溫血脊推動物組織的本發明的單層處 理的ECM材料ll形成的片狀醫學移植物lO。圖2描繪由本發明的兩層 處理的ECM材料11形成的醫學移植裝置20。如在圖1和圖2中描繪的片 狀醫學移植裝置可以用於本文所述的各種移植應用中，包括但不限於 傷口護理和軟組織支持應用。
現在參考圖3-5，描繪了本發明的人工瓣膜裝置31的各種側視圖。 本發明處理的ECM材料被附接至框架元件33,並提供在植入患者的構 型中的兩個小葉34和35。尤其是，圖3提供在平行於小葉34和35的接 合上邊緣34a和35a的方向取得的人工瓣膜裝置31的側視圖。圖4提供從 左側取得的在圖3中描繪的裝置31的視圖。圖5提供從右側取得的在圖 3中描繪的裝置31的視圖。裝置31特別好地適用於血管應用，例如植 入患者的血管通道。
如從圖3-5可見，小葉34和35包括互相接合的各自的自由邊緣34a 和35a和各自的固定邊緣36和40,在裝置31植入部分限制血管壁的通路 後，該固定邊緣36和40將各自對著血管壁施加力以便各自形成捕獲血 液的元件。在所示裝置31中，小葉邊緣與血管壁接觸的通路包括基本 上沿血管壁縱向延伸的許多部分，該血管壁連接至沿血管壁縱向延伸 和環繞血管壁周圍延伸的杯成形部分。尤其是，小葉34的固定邊緣36 包括相對的縱向延伸部分37和38,它們各自延伸至杯成形部分39的對 23側。因此，小葉35的固定邊緣40包括相對的縱向延伸部分41和42,它 們各自延伸至杯成形部分43的對側。
可以用許多不同的方法表達接觸或接合的小葉面積的數量。在植 入物的最初構型中，接合長度(例如LOC)取決於人工瓣膜的構型，期 望為至少約2mm並可長達約50mm或更長。在本發明的某些實施方案 中，在植入物的最初構型中，接合長度可以是約5-約30 mm,更典型 的約5-約15 mm。接合長度可以代表人工瓣膜的全部長度的實際百分 數，例如該假體全部長度的至少約5%或至少約10%。在某些實施方案 中，小葉的接合長度佔全部裝置長度的10%-80%,典型的約30%-約 60%，且更典型的約35%-約55%。
在另外的方面，可以通過使小葉的外部邊緣在充分距離內互相緊 密接近，沿框架基本上縱向取向來提供長的接合長度。因此，為了例 證的目的參考圖3-5,在充分距離內例如2-50 mm,典型的約5-約30 mm，且更典型的約5-約15mm,將小葉34的小葉外部邊緣部分37配置 成沿血管壁與小葉35的小葉外部邊緣部分41緊密接近接觸。對沿血管 壁的對側循行的小葉邊緣部分(例如邊緣部分38和42，圖3-5)來講是同 樣的。優選小葉邊緣在這些距離內例如在約5 mm內，更優選在約3 mm 內，且最優選在約lmm內保持緊密接近。應理解，該緊密接近可能涉 及使小葉邊緣沿血管壁互相緊密循行，或可能使它們沿基本上同樣的 通路(例如兩者沿框架的單一支柱)附接，並因此顯示當它們沿血管壁 通過時基本上不互相分開。
為了促進對本發明各方面的進一步理解，提供以下具體的實施 例。應理解，這些實施例是示例性的，並不限制本發明。
實施例l
該實施例描述本發明的一種處理的ECM材料的製備。 豬的小腸得自包裝工廠並切開和剖開，以顯示其內部的部分。在 最初的清潔以除去在腸內包含的內容物之後，用機械在各側面摩擦各個腸，以除去黏膜層和漿膜層，並以分離主要的結締組織層包括黏膜
下層，用於進一步處理。在37。C下在1: IO(重量體積)0.1%十二烷基 硫酸鈉(SDS)溶液中處理黏膜下層1小時,.接著在37。C下在1: 10 (重量 體積)89 mM tris、硼酸鹽、乙二胺四乙酸(TBE)溶液中處理1小時。 在這些最初的處理之後，在室溫下用l: 10 (重量體積)高純度水衝洗 黏膜下層5分鐘。在室溫下在l: 5 (重量體積)100。/。異丙醇(IPA)溶液中 處理黏膜下層30分鐘之前，第二次重複該沖洗步驟。第二次重複該IPA 處理步驟，接著如上所述衝洗黏膜下層兩次。然後在室溫下在l: 10 (重 量體積)0.2。/。PAA/5。/。特別變性的醇溶液中處理黏膜下層2小時。最 後，在室溫下在l: IO(重量體積)高純度水中衝洗黏膜下層5分鐘。在 測試黏膜下層的SDS殘留之前，重複該衝洗步驟共4次衝洗。通過使用 清潔劑檢測試劑盒(Chemetrics)測量SDS的含量，其表明除去了超過 97%的最初清潔劑。得到的黏膜下層組織用於以下的實施例。
實施例2
該實施例證明與用於製備黏膜下層ECM材料的另 一種方法相比， 使用在實施例1中所述的方法提高了脂質含量的減少。
獲得10批切開的豬小腸，並分成大約相等的兩組。如在美國專利 號6,206，931的實施例1中所述處理一組(在下文中稱為"對照組")。簡而 言之，未加工的腸首先用過氧乙酸處理，接著用機械摩擦各側面以分 離黏膜下組織層，並沖洗以除去化學殘留物。如在上面的實施例l中 所述製備第二組(在下文中稱為"測試組")。
通過疊加4個黏膜下層(溼的)並凍幹得到的疊層，將各^t比的材料用 於製備3個4層的凍乾片。使用低溫環氧乙烷循環對四層的片滅菌。從 各片中切割lcmxl cm樣品，用於脂質的含量分析。每批每組分析3個 樣品(3個樣品xlO批)，每組共30個樣品。將各樣品稱重(初始重量)，然 後用100%的乙醇溶液處理24小時，接著用丙酮溶液處理24小時，以提 取脂質。隨後乾燥樣品約48小時並稱重(最終重量)。通過(初始重量-最終重量)/初始重量，來計算脂質含量。
進行分布分析，以確定何種分布(正態、對數正態、威布爾或Y)
最適合各組數據。分布分析表明，對照組的脂質含量最適合對^:正態 分布，它對應的平均脂質含量為8.06 +/- 5.59%。分布分析表明，測試 組的脂質含量最適合威布爾分布，它對應的平均脂質含量為2.51 +/-2.51%。
所有的樣品使用未配對t檢驗，p值達1.08xl(T5。使用配對t檢驗， 比較批匹配對照組的結果與相應的測試組結果，p值達6.2x10—5。兩種p 值均小於0.05，表明與對照材料相比，測試材料的脂質含量統計學上 顯著減少。
實施例3
該實施例證明使用在實施例1中所述的方法提高了 IgA含量的減少。
獲得10批切開的豬小腸，並分成大約相等的兩組。如在美國專利 號6,206,931的實施例1中所述處理一組(在下文中稱為"對照組")。簡而 言之，未加工的腸首先用過氧乙酸處理，接著在各側面上摩擦以分離 黏膜下組織層，並衝洗以除去化學殘留物。如在上面的實施例l中所 述製備第二組(在下文中稱為"測試組")。
通過疊加4個黏膜下層(溼的)並凍幹得到的疊層，將各批的材料制 備成3個、4層的凍乾片。使用低溫環氧乙烷循環對四層的片滅菌。從 各片中切割l cmxl cm樣品，用於免疫球蛋白A(IgA)的含量分析。每 批每組分析3個樣品(3個樣品xlO批)，每組共30個樣品。將各樣品稱重 (初始重量)，置於1.5 mL離心管中，並在400 (il的磷酸鹽緩衝鹽水(PBS) 中碾磨90秒。接著離心樣品，並分離上清液，用無菌的PBS稀釋1:5。 4吏用得自Bethyl Laboratories, Bethyl ， Texas的試劑盒，通過ELISA, 測定這些稀釋的樣品的IgA含量。通過測試組的IgA含量/對照組的初始 重量，來計算IgA的重量含量。進行分布分析，以確定何種分布(正態、對數正態、威布爾或力 最適合各組數據。分布分析表明對照組的IgA含量最適合正態分布，
它對應的平均IgA含量為50.4 +/- 27.7 pg/g。 一個測試組樣品測試為 1.54(ig/g，而所有的其它測試組樣品測試為0嗎/g。因此不進行測試組 的分布分析，因為分布基本上為單點。
所有的樣品使用未配對t檢驗，p值達1.7xl(T13。使用配對t檢驗， 比較批匹配對照組的結果與相應的測試組結果，p值達1.88xl04。兩種 p值均小於0.05，表明與對照組相比，測試組的材料的IgA含量統計學 上顯著減少。
實施例4
該實施例證明使用在實施例1中所述的方法提高了細胞核數量的 減少。
獲得10批切開的豬小腸，並分成大約相等的兩組。如在美國專利 號6,206,931的實施例1中所述處理一組(在下文中稱為"對照組")。簡而 言之，未加工的腸首先用過氧乙酸處理，接著摩擦各側面以分離黏膜 下組織層，並衝洗以除去化學殘留物。如在上面的實施例l中所述制 備第二組(在下文中稱為"測試組")。
切割各組中各批的樣品，並用Hoechst33258染色，用於鑑定細胞 核。使用帶紫外線過濾器的01ympus螢光顯微鏡，從隨機部位獲得各 樣品中細胞核的三個圖像。圖像通過Spot Insight數位照相機在共放大 200倍下拍攝，並通過Spot RT計算機軟體獲得。這些圖像代表0.263 mn^的總面積。三個獨立的分析者對各個獲得圖像的細胞核計數。按 這3個計數的均值取得每個圖像的細胞核數目。
進行分布分析，以確定何種分布(正態、對數正態、威布爾或力 最適合各組數據。分布分析表明對照組的細胞核計悽t最適合威布爾分 布，它對應的對照組平均每區域細胞核為473 +/- 193個細胞核。分布 分析表明測試組的細胞核計數最適合y分布，它對應的測試組平均每區
27域細胞核為26.7 +/- 36.1個細胞核。
使用配對t檢驗，比較批匹配對照組的結果與相應的測試組結果，
p值達1.66xl0'6。 p值小於0.05,表明與對照材料相比，測試材料的細 胞核含量統計學上顯著減少。
實施例5
該實施例證明如在實施例1中所述處理的ECM材料保留天然的 FGF-2。
獲得10批未加工的豬小腸，並依照實施例l處理。如在上面的實 施例2中所述，將各批的材料製備成3個、4層的凍乾片，並使用低溫 環氧乙烷循環滅菌。從各片中切割l cmxl cm樣品，用於FGF-2的含量 分析。每批分析3個樣品(3個樣品xlO批)，共30個樣品。將各樣品稱重 (初始重量)，置於1.5mL離心管中，並在400(il的磷酸鹽緩衝鹽水(PBS) 中碾磨3x30秒。接著離心樣品，並分離上清液，用無菌的PBS稀釋1: 5。 使用R&D Systems FGF-2 ELISA試劑盒， 一式兩份測定這些稀釋的樣 品的FGF-2含量。通過由ELISA確定的FGF-2含量/樣品的初始重量，來 計算FGF-2的重量含量。
進行分布分析，以確定何種分布(正態、對數正態、威布爾或力 最適合各組數據。分布分析表明FGF-2含量最適合正態分布，它對應 的FGF-含量的平均值為25.0 ng/g +/- 12.9 ng/g。
實施例6
該實施例證明如在實施例1中所述處理的ECM材料保留天然的 透明質酸(HA)。
獲得10批未加工的豬小腸，並依照實施例l處理。如在上面的實 施例2中所述，將各批的材料製備成3個、4層的凍乾片，並使用低溫 環氧乙烷循環滅菌。從各片中切割l cmxl cm樣品，用於透明質酸(HA) 的含量分析。每批分析3個樣品(3個樣品xl0批)，共30個樣品。將各樣品稱重(初始重量)，置於1.5mL離心管中，並在450 pl的磷酸鹽緩衝鹽 水(PBS)中用50jiil蛋白酶K在56-C下消化45分鐘。接著離心樣品，並分 離上清液，用無菌的PBS稀釋1:40。使用得自Corgenics， Westminster, Colorado的試劑盒，通過ELISA，按一式兩份測定這些稀釋的樣品的 HA含量。通過由ELISA確定的HA含量/樣品的初始重量，來計算HA 的重量含量。
進4亍分布分析，以確定4可種分布(正態、對悽t正態、威布爾或力 最適合各組數據。分布分析表明測試樣品的HA含量最適合對數正態分 布，它對應的測試樣品HA含量平均為303 +/- 209 (ig/g。
實施例7
該實施例證明如在實施例1中所述處理的ECM材料保留天然硫 酸酯化糖胺聚糖(sGAGs)。
獲得10批未加工的豬小腸，並依照實施例l處理。如在上面的實 施例2中所述，將各批的材料製備成三個、四層的凍乾片，並使用低 溫環氧乙烷循環滅菌。從各片中切割l cmxi cm樣品，用於s(GAG)的 分析。每批分析3個樣品(3個樣品xlO批)，共30個樣品。將各樣品稱重 (初始重量)，置於1.5mL離心管中，並在450)il的磷酸鹽緩衝鹽水(PBS) 中用50iil蛋白酶K在56。C下消化45分鐘。所有樣品均渦旋震蕩5秒，接 著加入l.O mL的Blyscan染料試劑。用分光光度計在685 nm按一式三份 取得各樣品的吸收度讀數，並從肝素標準曲線計算sGAG的濃度。通 過由吸收度讀數確定的s(GAG)含量/樣品的總重量，來計算sGAG的重 量含量。
進行分布分析，以確定何種分布(正態、對數正態、威布爾或力 最適合各組數據。分布分析表明sGAG含量最適合正態分布，它對應 的s(GAG)含量的平均值為7588嗎/g+A 6505嗎/g。
實施例8該實施例證明與另 一種方法相比，已經依照實施例1處理的ECM
材料的隔膜破裂力(burst force)。
獲得10批切開的豬小腸，並分成大約相等的兩組。如在美國專利 號6,206，931中所述處理一組(在下文中稱為"對照組")。簡而言之，未 加工的腸首先用過氧乙酸處理，接著在兩側面摩擦，以分離黏膜下組 織層，並衝洗以除去化學殘留物。如在上面的實施例l中所述製備第 二組(在下文中稱為"測試組")。
如在上面的實施例2中所述，將各批材料製備成3個、4層的凍幹 片，或通過將八個潤溼的黏膜下層重疊並真空下壓該構建物，製備成 3個、8層真空壓製片。使用低溫環氧乙烷循環將這些片滅菌。從各片 中切割2.5英寸x2.5英寸的樣品，用於隔膜破裂力的測試。對於4層的 凍幹組每批分析3個樣品(3個樣品x9批)，共27個樣品。對於8層真空壓 制組每批分析3個樣品(3個樣品xl0批)，共30個樣品。在測試前，各樣 品在磷酸鹽緩沖鹽水(PBS)中再水化至少15分鐘。使用Mullen破裂力測 試器在斷裂之前測量隔膜破裂力。
進行分布分析，以確定何種分布(正態、對數正態、威布爾或力 最適合各組數據。分布分析表明對照4層凍幹的破裂力最適合威布爾 分布，它對應的平均破裂力為359 +/- 98 kPa。分布分析表明測試的4 層凍幹的隔膜破裂力最適合對數正態分布，它對應的平均破裂力為 378+/-79kPa。在兩組之間隔膜破裂力的平均差異為5.3%。所有的樣 品使用未配對t^r驗，達到0.458的p值。使用配對t4企驗，比較批匹配的 對照組的結果與相應的測試組的結果，達到0.060的p值。這些p值均大 於0.05，表明本發明的4層凍乾材料的隔膜破裂力與通過當前使用的方 法製備的4層凍乾材料相比，無統計學上顯著性降低。
關於8層真空壓制的材料，分布分析表明對照的8層真空壓制的破 裂力最適合對數正態分布，它相應的平均破裂力為915+A234kPa。分 布分析表明測試的8層真空壓制的破裂力最適合對數正態分布，它相 應的平均破裂力為872 +/- 269 kPa。兩組之間破裂力的平均差異為4.8%。所有樣品使用未配對t檢驗，達到0.516的p值。使用配對t檢驗， 比較批匹配的對照組的結果與相應的測試組的結果，達到0.217的p值。 這些p值均大於0.05，表明8層真空壓制的測試材料的破裂力與8層真空 壓制的對照材料相比，無統計學上顯著性降低。
實施例9
該實施例證明與用於製備滅菌、分離黏膜下層組織的另 一種方法 相比，已經依照實施例1處理的ECM材料的縫線保持強度。
獲得10批切開的豬小腸，並分成大約相等的兩組。如在美國專利 號6,206，931中所述處理一組(在下文中稱為"對照組")。簡而言之，未 加工的腸首先用過氧乙酸處理，接著在兩側面摩擦，以分離黏膜下組 織層，並衝洗以除去化學殘留物。如在上面的實施例l中所述製備第 二組(在下文中稱為"測試組")。
如在實施例8中所述，將各批材料製備成3個、4層的凍乾片或3個、 8層真空壓製片。使用低溫環氧乙烷循環將這些片滅菌。從各片中切 割lcmx3cm的樣品，用於縫線保持強度的測試。每批每組分析3個樣 品(3個樣品xlO批)，每組共30個樣品。4層的凍千材料在兩個主要的方 向縱向和橫向上切割，而8層的材料^f又在一個方向上切割，因為該材 泮十由於層的正交重疊而沒有主要的方向。在測試之前，將各樣品在磷 酸鹽緩衝鹽水(PBS)中再水化至少15分鐘。將302/304不鏽鋼絲(與臨床 使用的5-0縫線的尺寸相等)穿過各測試物品的 一端，咬合深度為2 mm，並附接至拉伸試驗機的可移動爪。用拉伸試驗機的固定爪抓住 各測試物品的另一端，並按150mm/min的恆定速率向上拉金屬絲。記 錄各樣品的最大力、斷裂時拉伸率和失敗模式。由於鋼絲從SIS材料拉 出，所以所有的測試樣品(180/180， 100%)失敗。在所有的情況下，鋼 絲保持完整而SIS材料不完整。
測試的結果如下(平均值+/-標準差)8層真空壓制的對照組= 12.22 +/- 2.68 N, 8層真空壓制的測試組=12.77 +/- 1.81 N (p = 0.3714);
314層凍幹的對照組橫向=7.58 +/- 1.68 N, 4層凍幹的測試組橫向==7.99 +/-1.90N(p = 0.3801); 4層凍幹的對照組縱向=6.19+/-1.46N， 4層凍 幹的測試組縱向- 6.14 +/- 1.41 N (p = 0.8929)。在數據集上正態性擬合 良度糹企驗顯示，沒有數據集具有與正態分布的任何顯著性偏差。因此， 對各組數據(8層真空壓制的、4層凍幹的橫向和4層凍幹的縱向)進行兩 組樣品的t檢驗(對照組與測試組比較)。所有p值均大於0.3714,表明測 試材料與對照材料相比，縫線保持強度無統計學上顯著性降低。
實施例IO
該實施例證明與用於製備滅菌、分離的黏膜下層組織的另 一種方 法相比，已經依照實施例1處理的ECM材料的拉伸強度。
獲得10批切開的豬小腸，並分成大約相等的兩組。如在美國專利 號6,206,931中所述處理一組(在下文中稱為"對照組")。簡而言之，未 加工的腸首先用過氧乙酸處理，接著在兩側面摩擦，以分離黏膜下組 織層，並衝洗以除去化學殘留物。如在上面的實施例l中所述製備第 二組(在下文中稱為"測試組")。
如在實施例8中所述，將各批材料製備成3個、4層的凍乾片或3個、 8層真空壓制的片。使用低溫環氧乙烷循環將這些片滅菌。從各片中 切割"狗骨"狀樣品，用於拉伸試驗。每批每組分析3個樣品(3個樣品x10 批)，每組共30個樣品。4層的凍乾材料在兩個主要的方向縱向和橫向 上切割，而8層的材料僅在一個方向上切割。各樣品在磷酸鹽緩衝鹽 水(PBS)中再水化，並使用Instron在lOO mm/分鐘的形變速率下測試在 斷裂前的最終拉力(UTF)。
進行分布分析，以確定何種分布(正態、對lt正態、威布爾或Y) 最適合各組數據。分布分析表明對照的4層凍幹的縱向UTF最適合對數 正態分布，它對應的平均UTF為3.72+A 1.051bs。分布分析表明4層凍 千的測試材料的縱向UTF最適合正態分布，它對應的平均UTF為2.92 +/-0.881bs。在這些兩組之間UTF的平均差異為21。/。。所有的樣品使用未配對t檢驗，達到3.6xl(^的p值。使用配對t檢驗，比較批匹配的對照 組的結果與相應的測試組的結果，達到3.4xl(^的p值。這些p值均小於 0,05,表明4層凍幹的試驗材料的縱向UTF與4層凍幹的對照材料相比， 統計學上顯著性降低。
類似地，分布分析表明對照的4層凍幹的橫向UTF最適合對數正 態分布，它對應的平均UTF為3.2 +/- 0.96 lbs。分布分析表明4層凍幹 的測試材料的縱向UTF最適合對數正態分布，它對應的平均UTF為 2.48+/-0.90 lbs。在這些兩組之間UTF的平均差異為22。/。。所有的樣品 使用未配對t檢驗，達到7.1xl0-s的p值。使用配對t檢驗，比較對照組的 結果與相應的測試組的結果，達到5.11xl(^的p值。這些p值均小於 0.05，表明4層凍幹的試驗材料的橫向UTF與4層凍幹的對照材料相比， 統計學上顯著性降低。
關於8層材料，分布分析表明對照的8層真空壓制的UTF最適合威 布爾分布，它相應的平均UTF為10.78 +/- 3.35 lbs。分布分析表明8層 真空壓制的試驗材料的UTF最適合正態分布，它相應的平均UTF為 7.46+/-2.45 lbs。這些兩組之間UTF的平均差異為31。/。。所有樣品使用 未配對t檢驗，達到6.4x 10—s的p值。使用配對t才企驗，比較批匹配的對照 組的結果與相應的測試組的結果，達到9.9xl0々的p值。這些p值均小於 0.05，表明8層真空壓制的測試材料的UTF與8層真空壓制的對照材料 相比，統計學上顯著性降低。
實施例ll
該實施例證明實施例1的處理的ECM材料顯示血管原性特徵。 由按以下方法處理的豬小腸黏膜下層(SIS)形成植入圓盤對照 的凍幹(按美國專利號6,206,931的實施例1中所述製備)、對照的真空壓 制(按美國專利號6,206,931的實施例1中所述製備)、測試的凍幹(按實 施例l中所述製備)、測試的真空壓制(按實施例l中所述製備)和傷口護 理產品Promogran⑧(PR)。在才直入前用低溫環氧乙烷循環將對照和測試圓盤滅菌。PR產品接受無菌和消毒處理。將各圓盤植入小鼠的皮下背 側，持續3周。在3周之後，探查各圓盤的毛細血管形成。使用螢光微 血管造影術、完整功能性微血管系統的成像方法，定性測量血管發生。 使用螢光微球的血管輸注，接著使用二曱苯從植入物提取螢光物質，
然後用螢光板讀數器定量，測量血管(Vessell)容量作為血管發生的度 量。最後，通過薄切片和H&E染色在組織學上檢測檔人物，以說明細 胞向內生長。
焚光微血管造影術表明所有圓盤支持血管發生。測試的凍幹圓盤 具有與對照的凍幹圓盤相似的結果。測試的真空壓制圓盤表現優於對 照的真空壓制圓盤。PR圓盤具有明顯少的血管生長，並且研究的兩個 樣品僅一個區域具有任何的向內生長。PR圓盤的血管容量結果顯著小 於對照。測試的任何其它圓盤統計學上均沒有差異。組織學證實孩丈血 管造影術的發現。凍幹的對照圓盤和凍幹的測試圓盤具有顯著的纖維 血管向內生長。真空壓制的對照圓盤僅具有較少的滲透。真空壓制的 測試圓盤具有更多的細胞向內生長，反映微血管造影術的結果，但可 能由於該材料的緻密性質，所以在近邊緣處還具有未結合SIS的跡象。 在PR圓盤中明顯可見非常少的細胞向內生長，提示非常少的功能性重 塑的證據。
實施例12
該實施例提供在用於大鼠腹壁修復模型時，實施例1的處理的 ECM與另 一種處理的ECM的比較。
獲得10批切開的豬小腸，並分成大約相等的兩組。如在美國專利 號6,206,931的實施例2中所述處理一組(在下文中稱為"對照組")。簡而 言之，未加工的腸首先用過氧乙酸處理，接著在兩側面摩擦，以分離 黏膜下組織層，並衝洗。如在上面的實施例l中所述製備第二組(在下 文中稱為"測試組")。
將各批材料製備成4層真空壓制的試驗移植物或4層真空壓制的
34對照移植物。在大鼠腹部筋膜中形成2 cmx2 cm的缺損，並植入各移 植物以提供修復。在2、 4或8周之後，處死大鼠並除去移植物。從各 移植物切除狗骨狀片，測試其機械強度。
比較測試的移植物與其對照物在各時間點斷裂時的機械強度。另 外，在外植體記錄任何併發症。記錄的併發症包括感染、形成腹部粘 連和形成血清肺。在各時間點，測試的移植物與相應的對照移植物相 比具有相似的斷裂時UTF。測試的移植物引發較少的宿主負反應。尤 其是，在試驗材料中在所有點僅記錄到一個血清肺，而在對照移植物 中看見了5個血清腫。最後，組織學表明測試的移植物重塑如果不比 對照的移植物好，也與對照的移;f直物一樣好。
實施例13
該實施例描述本發明的另 一種處理的ECM材料的製備。 豬小腸得自包裝工廠並切開和剖開，以顯示其內部部分。在最初 的清潔以除去在腸內包含的內容物之後，用機械在各側面摩擦各腸， 以除去黏膜層和漿膜層，並分離主要的結締組織層包括黏膜下層，用 於進一步處理。在室溫下在l: 5 (重量體積)99。/。異丙醇(IPA)溶液中 處理黏膜下層30分鐘。第二次重複該IPA處理步驟，接著用自來水衝 洗黏膜下層兩次。然後在37。C下在1: IO(重量體積)0.1%十二烷基>5危 酸鈉(SDS)熱溶液中處理黏膜下層1小時，接著在37。C下在1: 10 (重量: 體積)89mMtris、硼酸鹽、乙二胺四乙酸(TBE)熱溶液中處理1小時。 然後用自來水衝洗處理的黏膜下層兩次。在衝洗之後，在室溫下用l: 10 (重量體積)0.2。/。PAA/5。/。特別變性的醇溶液處理黏膜下層2小時。 在這些處理步驟之後，在室溫下用l: 10 (重量體積)高純度水沖洗粘 膜下層5分鐘。在測試和釋放之前重複該衝洗步驟共4次沖洗。測試衝 洗水的pH、電導率和PAA含量。在消毒之後測試黏膜下層樣品的生物 負荷以及物理性質。一"和"該"以及相似的指示物的使用視為涵蓋單數和複數，除非本文另 有說明或與上下文明顯的矛盾。本文數值的範圍的引用僅將用作對落 在該範圍內的各單獨的值分別提及的速記方法，除非本文另外指出， 並且如同本文分別引用的那樣，各單獨的值結合到說明書中。可以按 任何合適的順序實施本文描述的所有方法，除非本文另有說明或另外 與上下文明顯地矛盾。本文提供的任何和所有實施例或示例性語言(例 如"例如")的使用，僅用於更好地闡述本發明，並不是對本發明的範圍 提出限制，除非另有要求。本說明書中的語言均不應解釋為表示本發 明的實踐所必需的任何不要求的元件。
本文描述了本發明優選的實施方案，包括發明人已知的實施本發 明的最佳模式。當然，在閱讀前述說明書之後，那些優選的實施方案 的變化對本領域的普通技術人員將是顯而易見的。發明人期望熟練的 技術人員必要時採用此類變化，且發明人打算按本文特別描述以外的 方式實踐本發明。因此，本發明包括在適用的法律允許的權利要求中 所述主題的所有修改和等同物。此外，本發明包括上述元件在其所有 可能的變化中的任何組合，除非本文另有說明或另外與上下文明顯地 矛盾。另外，本文引用的所有出版物均表現出本領域的普通技術人員 的能力，並且如同通過引用和全文描述而單獨結合那樣，通過引用而 整體結合到本文中。
權利要求
1.一種醫學移植材料，所述醫學移植材料包含無菌、去細胞化細胞外基質(ECM)材料，所述材料包括膠原和非膠原組分，其中所述非膠原組分包括(i)不大於約20μg/g水平的天然IgA；(ii)不大於約4％重量水平的天然脂質；(iii)至少約10ng/g水平的天然FGF-2；(iv)至少約50μg/g水平的天然透明質酸；(v)至少約500μg/g水平的天然硫酸酯化糖胺聚糖。
2. 權利要求1的醫學移植材料，其中所述ECM材料包含黏膜下層。
3. 權利要求2的醫學移植材料，其中所述黏膜下層是腸、膀胱或 胃黏膜下層。
4. 權利要求3的醫學移植產品，其中所述黏膜下層是小腸黏膜下 層(SIS)。
5. —種醫學移植材料，所述醫學移植材料包含無菌、去細胞化細胞外基質(ECM)材料，所述材料包括膠原和非 膠原組分，其中所述非膠原組分包括不大於20嗎/g水平的天然IgA 和至少一種以下物質天然FGF-2、天然透明質酸和天然糖胺聚糖。
6. 權利要求5的醫學移植材料，其中所述ECM材料包括不大於 15pg/g水平的天然IgA。
7. 權利要求5的醫學移植材料，其中所述ECM材料包括不大於 10嗎/g水平的天然IgA。
8. 權利要求5的醫學移植材料，其中所述ECM材料包括不大於 5昭/g水平的天然IgA。
9. 權利要求5的醫學移植材料，其中所述ECM材料基本上不含 天然IgA。
10. 權利要求5的醫學移植材料，其中所述ECM材料的脂質含 量不大於約4%。
11. 權利要求5的醫學移植材料，其中所述ECM材料包括的脂 質含量不大於約3%。
12. 權利要求5的醫學移植材料，其中所述ECM材料成形為片、 凝膠、非膠凝含水組合物、粉末或海綿中的一種或多種。
13. 權利要求12的醫學移植材料，其中將所述ECM材料成形為 片並凍幹。
14. 權利要求13的醫學移植材料，其中所述ECM材料形成至少 兩個ECM層，且其中所述至少兩個ECM層互相偶合。
15. 權利要求5的醫學移植材料，其中所述ECM材料包含天然 FGF-2、天然透明質酸和天然糖胺聚糖。
16. 權利要求5-15中任一項的醫學移植產品，其中所述ECM材 料包含黏膜下層。
17. 權利要求16的醫學移植產品，其中所述黏膜下層是腸、膀胱 或胃黏膜下層。
18. 權利要求17的醫學移植產品，其中所迷黏膜下層是小腸黏膜 下層(SIS)。
19. 一種醫學移植材料，所述醫學移植材料包含無菌、去細胞化細胞外基質材料，所述材料顯示血管源性特徵並 包括不大於20 jig/g水平的天然IgA。
20. 權利要求19的醫學移植材料，其中所述ECM包含黏膜下層。
21. 權利要求20的醫學移植材料，其中所述黏膜下層是腸、膀胱 或胃黏膜下層。
22. 權利要求21的醫學移植產品，其中所述黏膜下層是小腸黏膜 下層(SIS)。
23. —種治療患者的方法，所述方法包括 提供權利要求1-22中任一項的醫學移植材料，和將所述醫學移^i材料移植至所述患者。
24. —種製備醫學移植材料的方法，所述方法包括 提供含有天然IgA和天然FGF-2的起始細胞外基質(ECM)材料；和有效地處理所述起始ECM材料，以將所述天然FGF-2保留在至 少約10 ng/g的水平，而將所述天然IgA含量減少至低於20嗎/g的水 平，其中所迷處理包括使所述起始細胞外基質材料與清潔劑水溶液接 觸。
25. 權利要求24的方法，所述方法還包括在所述處理步驟之後衝 洗所述ECM材料，以便從所述材料除去至少90%的清潔劑殘留物。
26. —種細胞外基質材料，所述材料包含 從溫血脊推動物分離的基本上無細胞的細胞外基質(ECM)材料，所述ECM材料的天然FGF-2含量為至少約10ng/g,且脂質含量不大 於約4%。
27. —種細胞外基質材料，所述細胞外基質材料包含 從溫血脊推動物分離的基本上無細胞的細胞外基質(ECM)材料，所述ECM材料保留至少一種生物活性組分，且具有水平低於200個 /0.263 mm2的可見細胞核。
28. 權利要求27的ECM材料，其中所述至少一種生物活性組分 是生長因子。
29. —種細胞外基質材料，所述細胞外基質材料包含 從溫血脊推動物分離的基本上無細胞的細胞外基質(ECM)材料，所述ECM材料保留至少一種生物活性組分，且具有含量低於約2微 克/克的核酸。
30. 權利要求29的ECM材料，其中所述至少一種生物活性組分 是生長因子。
31. —種細胞外基質材料，所述細胞外基質材料包含 從溫血脊推動物分離的基本上無細胞的細胞外基質(ECM)材料，所述ECM材料保留至少一種生物活性組分，且具有水平低於200個 /0.263 mmS的可見細胞核。
32. 權利要求31的ECM材料，其中所述至少一種生物活性組分 是生長因子。
33. —種細胞外基質材料，所述細胞外基質材料包含 從溫血脊推動物分離的基本上無細胞的細胞外基質(ECM)材料，所述ECM材料保留至少一種生物活性組分，且具有含量低於20微克 /克的免疫球蛋白。
34. 權利要求28的ECM材料，其中所述至少一種生物活性組分 是生長因子。
35. —種細胞外基質材料，所述細胞外基質材料包含 從溫血脊推動物分離的基本上無細胞的細胞外基質(ECM)材料，所述ECM材料具有不大於約4%的脂質含量，且顯示低於約12 EU/ 克的內毒素水平。
36. 權利要求35的細胞外基質材料，其中所述材料顯示低於約5 EU/克的內毒素水平。
37. 權利要求35的細胞外基質材料，其中所述材料包含黏膜下層。
全文摘要
描述的是具有改善的性質的醫學移植材料和裝置，該改善的性質涉及它們的組分特性。
文檔編號A61L27/36GK101616698SQ200780046919
公開日2009年12月30日 申請日期2007年10月23日 優先權日2006年10月23日
發明者C·E·詹森 申請人:庫克生物科技公司