伯克霍爾德氏菌及其培養方法和菌劑以及它們的應用與流程

2023-10-08 11:34:59

本發明涉及一株伯克霍爾德氏菌，具體地，涉及一株具有降解百菌清功能的伯克霍爾德氏菌，所述伯克霍爾德氏菌的培養方法，含有所述伯克霍爾德氏菌作為活性成分的菌劑，以及它們在降解百菌清中的應用。

背景技術：

百菌清(四氯間苯二腈)是一種取代苯類的保護性莖葉噴灑殺真菌劑,具有保護和治療作用，由美國鑽石制鹼公司於1963年開發，有多種劑型，廣泛用於蔬菜、果樹以及豆類、水稻、小麥等多種作物上，以防治霜黴病、白斑病、黑斑病和軟腐病等病害。百菌清在植物表面有良好的黏著性，不易受雨水衝刷，藥效穩定。然而，在大棚土中經多次大量噴灑後其含量會較高，通過土壤自身很難降解。

百菌清純品為白色結晶，無臭味，不溶於水，微溶於丙酮等有機溶劑，對高等動物低毒，但對魚類及甲殼類動物毒性較大，對大鼠腎臟有致癌作用，致突變性較強，在防治農作物病蟲草害中發揮了重要作用，但也對環境造成了汙染。並且，百菌清農藥在生產過程中會產生大量含農藥廢水，且農藥不論以何種方式施用，均會不可避免地通過多種途徑進入水體，造成水環境汙染。

百菌清在水土環境中的降解受到很多研究人員的關注，微生物法有著方便，易處理，無二次汙染等優點。因此，發現新高效降解菌株對水土環境中百菌清修復具有重大意義和廣泛應用前景。

技術實現要素：

本發明的目的在於開發一種對水土中的百菌清具有高效降解性能的微生物菌株，從而能夠簡單快捷的對環境中的百菌清進行有效的降解。

為了實現上述目的，一方面，本發明提供了一株伯克霍爾德氏菌(Burkholderia zhejiangensis)，其中，所述伯克霍爾德氏菌的保藏編號為CGMCC No.10848。

第二方面，本發明提供了一種伯克霍爾德氏菌的培養方法：其中，將如上所述的伯克霍爾德氏菌CGMCC No.10848接種至以下培養基中進行培養：

相對於1000重量份的培養基，所述培養基含有45-55重量份的葡萄糖，10-20重量份的七水合硫酸鎂，10-20重量份的硫酸銨，25-35重量份的碳酸鈣，0.4-0.8重量份的磷酸二氫鉀，5-15重量份的蛋白腖，5-15重量份的氯化鈉，3-7重量份的酵母粉。

第三方面，本發明提供了一種菌劑，其中，該菌劑含有如上所述的伯克霍爾德氏菌CGMCC No.10848的菌體作為活性成分。

優選的，所述菌體為活菌體。

第四方面，本發明提供了如上所述的伯克霍爾德氏菌、如上所述的培養方法、如上所述的菌劑在降解百菌清中的應用。

第五方面，本發明提供了一種降解百菌清的方法，其中，該方法包括：將如上所述的伯克霍爾德氏菌CGMCC No.10848和/或如上所述的菌劑與含有百菌清的環境接觸，以對環境中的百菌清進行降解。

將本發明的伯克霍爾德氏菌CGMCC No.10848用於降解百菌清的效果評估，結果顯示，該菌株能夠高效降解水土中的百菌清，如實施例2所示的，2天內，在模擬水相中，該菌株對百菌清的降解率可高達71.99％，在模擬土相中，該菌株對百菌清的降解率可高達98.97％，在實際的土壤環境中，該 菌株對百菌清的降解率可高達99.05％。由此可以看出，本發明提供的伯克霍爾德氏菌CGMCC No.10848能夠對土壤中的百菌清進行有效地修復，具有較高的經濟效益和社會效益。

本發明的其它特徵和優點將在隨後的具體實施方式部分予以詳細說明。

生物保藏

本發明的菌株為伯克霍爾德氏菌(Burkholderia zhejiangensis)，於2015年5月22日被保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(地址：北京市朝陽區北辰西路1號院3號，中國科學院微生物研究所，郵政編碼：100101)(保藏單位的縮寫為CGMCC)，保藏編號為CGMCC No.10848。

具體實施方式

以下對本發明的具體實施方式進行詳細說明。應當理解的是，此處所描述的具體實施方式僅用於說明和解釋本發明，並不用於限制本發明。

第一方面，本發明提供了一株伯克霍爾德氏菌(Burkholderia zhejiangensis)，其中，所述伯克霍爾德氏菌的保藏編號為CGMCC No.10848。

本發明的伯克霍爾德氏菌(Burkholderia zhejiangensis)分離自安徽土壤。

本發明提供的伯克霍爾德氏菌經過培養能夠產生大量的伯克霍爾德氏菌的活菌體，所述培養的方法沒有特別的要求，只要是能使所述伯克霍爾德氏菌增殖即可，例如可以按照107CFU/mL的接種量將伯克霍爾德氏菌的活菌體接種於細菌培養基中，並且在好氧條件下，在20-38℃的溫度下培養8-72小時後，得到培養液。

本發明可以進一步分離上述培養液中的伯克霍爾德氏菌的活菌體，所述分離的方法沒有特別的限制，只要是能從培養液中富集菌體即可，例如可以通過離心和/或過濾的方法實現，所述離心和所述過濾的條件可以為公知的條 件，本發明在此不再贅述。

本發明提供的伯克霍爾德氏菌(Burkholderia zhejiangensis)的16s rDNA的核苷酸序列如SEQ ID No：1所示。

根據本發明，用於培養伯克霍爾德氏菌的培養基可以為本領域常規的細菌培養基，例如，LB培養基，但本發明的發明人發現，在含有如下成分的培養基中對伯克霍爾德氏菌進行培養，能夠進一步促進菌體的生長：相對於1000重量份的培養基，所述培養基含有45-55重量份的葡萄糖，10-20重量份的七水合硫酸鎂，10-20重量份的硫酸銨，25-35重量份的碳酸鈣，0.4-0.8重量份的磷酸二氫鉀，5-15重量份的蛋白腖，5-15重量份的氯化鈉，3-7重量份的酵母粉。

本發明的發明人在研究的過程中發現，如上所述的伯克霍爾德氏菌能夠對百菌清農藥進行有效的降解，且能夠以百菌清為唯一碳源進行生長。

基於此，第二方面，本發明提供了一種伯克霍爾德氏菌的培養方法：其中，將如上所述的伯克霍爾德氏菌接種至以下培養基中進行培養：

相對於1kg的培養基，所述培養基含有45-55g的葡萄糖，10-20g的七水合硫酸鎂，10-20g的硫酸銨，25-35g的碳酸鈣，0.4-0.8g的磷酸二氫鉀，5-15g的蛋白腖，5-15g的氯化鈉，3-7g的酵母粉。

另外，如需在固體平板上對所述伯克霍爾德氏菌進行培養，還可以在如上所述的培養基中添加適量的瓊脂粉，從而製備成固體培養基。

根據本發明，對所述伯克霍爾德氏菌進行培養的條件可以為本領域常規對細菌進行培養的條件，例如，在有氧條件下，培養的溫度可以為20-38℃。

第三方面，本發明提供了一種菌劑，其中，該菌劑含有如上所述的伯克霍爾德氏菌(Burkholderia zhejiangensis)的菌體作為活性成分。

本發明的發明人在研究的過程中意外的發現，本發明的伯克霍爾德氏菌的死菌體和活菌體均能夠有效的環境中的百菌清進行降解。因此，如上所述 的伯克霍爾德氏菌的菌體可以為活菌體，也可為死菌體，還可以為活菌體和死菌體的混合菌體，但優選為活菌體。

根據本發明，所述菌劑中所述伯克霍爾德氏菌的濃度沒有特別的限制，可以根據具體的情況進行具體的選擇，在此不再詳細贅述。

另外，根據預定的用途不同，本發明提供的菌劑可以製備為不同的劑型，並添加相應的輔料等成分。其中，在何種劑型的菌劑中添加何種輔料為本領域技術人員所公知，在此不再詳細贅述。

根據本發明一種具體的實施方式，所述菌劑含有本發明如上提供的伯克霍爾德氏菌CGMCC No.10848和10重量％的蛋白腖，10重量％的氯化鈉，15重量％的葡萄糖以及5重量％的酵母粉。

另外，本發明提供的伯克霍爾德氏菌CGMCC No.10848還可以和其他菌體進行復配製備成混合菌劑，以進一步提高其效率。

根據本發明，所述菌劑可以為菌液的形式，也可以為乾粉的形式，本領域技術人員可以根據實際的需要自行選擇。

第四方面，本發明提供了如上所述的伯克霍爾德氏菌、如上所述的培養方法、如上所述的菌劑在降解百菌清中的應用。

第五方面，本發明提供了一種降解百菌清的方法，其中，該方法包括：將如上所述的伯克霍爾德氏菌(Burkholderia zhejiangensis)和/或如上所述的菌劑與含有百菌清的環境接觸，以對環境中的百菌清進行降解。

本發明優選在所述伯克霍爾德氏菌能夠存活的條件下對環境中的百菌清進行降解。其中，術語「伯克霍爾德氏菌能夠存活」是指在含有百菌清的環境中，至少大於5％，優選至少大於10％，更優選至少大於60％的菌體能夠存活。術語「伯克霍爾德氏菌能夠存活的條件」是指環境中至少包括伯克霍爾德氏菌能夠存活的最基本條件，例如，溫度、營養源等，此為本領域技術人員所公知，在此不再贅述。

根據本發明，優選的，為了進一步提高所述伯克霍爾德氏菌在環境中的生存能力，還可以向需要修復的環境中加入適宜所述伯克霍爾德氏菌生長的營養源，例如，在本發明的第二方面所提及的培養基。

根據本發明，含有百菌清的環境可以包括任何含有百菌清的環境，例如，所述含有百菌清的環境可以包括含有百菌清的土壤或水體。

根據本發明，加入至所述含有百菌清的環境中的伯克霍爾德氏菌的形式並沒有特別的限定，只要保證加入後所述伯克霍爾德氏菌能夠在所述含有百菌清的環境中起作用並且對所述百菌清進行有效降解即可，加入的所述伯克霍爾德氏菌的形式，例如，可以為菌液的形式，也可以為菌體沉澱的形式，還也可以為乾粉的形式。

本發明的發明人發現，本發明提供的伯克霍爾德氏菌對百菌清的降解具有劑量和時間效應，例如，在一定的範圍內，對百菌清的降解率會隨著所述伯克霍爾德氏菌濃度的升高或者時間的延長而提高。

因此，本發明對加入的伯克霍爾德氏菌的數量沒有特別的限制，這可以根據所述含有百菌清的環境中的百菌清的含量來決定，例如，當所述環境中的百菌清含量較高或所述環境對於所述伯克霍爾德氏菌的生存較不利時，可以提高所述伯克霍爾德氏菌的接種量；當所述環境中的百菌清含量較低或所述環境對所述伯克霍爾德氏菌的生存的影響較小時，可以減少所述伯克霍爾德氏菌的接種量。

根據本發明，當所述含有百菌清的環境為土壤時，為了進一步促進本發明提供的伯克霍爾德氏菌對百菌清的降解效率，優選的，將土壤中的水含量控制在至少15重量％，更優選為18-30重量％。

以下將通過實施例對本發明進行詳細描述。

以下實施例中：

發酵培養基：以1L的培養基為基準，所述培養基含有50g的葡萄糖，15g的七水合硫酸鎂，15g的硫酸銨，30g的碳酸鈣，0.6g的磷酸二氫鉀，10g的蛋白腖，10g的氯化鈉，5g的酵母粉。

無機鹽液體培養基：1.5g的NH4NO3，0.5g的KH2PO4，1.5g的K2HPO4，1.0g的NaCl，0.2g的MgSO4·7H2O，PH＝7，去離子水補齊至1000ml。

無機鹽固體培養基：在如上的無機鹽液體培養基中添加適量的瓊脂後形成的固體培養基。

本發明的菌株為伯克霍爾德氏菌(Burkholderia zhejiangensis)，並於2015年5月22日被保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(地址：北京市朝陽區北辰西路1號院3號，中國科學院微生物研究所，郵政編碼：100101)(保藏單位的縮寫為CGMCC)，保藏編號為CGMCC No.10848，簡稱P-6。

本菌劑：含有10體積％的本發明的菌株以及10ml上述無機鹽液體培養基。

參比菌株為假鼻疽伯克霍爾德氏菌：分離自農殘土。

參比菌劑：含有10體積的％的參比菌株以及10ml上述無機鹽液體培養基。

百菌清的測定方法：

水相中，將含有百菌清的液體倒入50ml離心管中，加入10ml石油醚振蕩萃取5分，再加入10ml石油醚振蕩萃取5分，靜置後取上清液10ml向其中加入無水硫酸鈉0.4g，脫水振蕩1分，之後取4ml於40℃旋轉蒸發儀旋轉至幹，再用2ml色譜純丙酮溶解再稀釋10倍，使用氣相色譜進行檢測

土相中，稱量5g烘乾土，加入體積比例為1:1的丙酮和水10ml，靜置30分鐘，振蕩5分後離心取上清液，加入5ml石油醚振蕩萃取5分，如此重複三次，靜置後取上清液10ml向其中加入無水硫酸鈉0.4g，脫水振蕩1 分，之後取4ml於40℃旋轉蒸發儀旋轉至幹，再用2ml色譜純丙酮溶解再稀釋10倍，使用氣相色譜進行檢測。

水相中和土相中的用於檢測的氣相色譜條件為：

柱子：HT-Pesticides 1；檢測器：ECD檢測器；進樣口溫度：260℃；柱溫：240℃；檢測器溫度：280℃；分流比：60；進樣量：1μL；尾吹60mL/min；柱壓：60kpa；載氣流量：1.25mL/min。

百菌清降解率＝(未處理的樣本中百菌清的含量-處理後樣本中百菌清的含量)/未處理的樣本中百菌清的含量×100％

製備例

將保存的本發明的菌種以及參比菌種至如上的經滅菌的發酵培養基中，並於37℃下活化兩次。活化後的本菌株以及參比菌株的濃度均為109CFU/mL。

實施例1

本實施例用於說明本發明的伯克霍爾德氏菌的形態學、生理生化特性

(1)形態學特性

將活化好的本發明的菌株用生理鹽水進行梯度稀釋，並選擇合適的濃度塗布於平板固體LB培養基上，濃度的選擇以在LB固體培養基上能夠形成分散開的單菌落為準。然後將平板倒置於37℃溫箱中進行培養，待單菌落形成後觀察菌落形態。

經觀察，該菌株在LB固體培養基上培養24小時後能夠形成直徑1-2mm的菌落，菌落為乳白色，圓形，邊緣完整，凸狀，且不透明。

(2)過氧化氫酶試驗

取以上經活化的培養液，直接滴加3％過氧化氫，立即觀察，有大量氣泡產生，為陽性反應「+」。

(3)氧化酶試驗

在LB培養物上分別滴加Kovacs氏試劑和Ewing氏試劑1-2滴，在數分鐘內觀察結果，有顏色改變，為陽性反應「+」。

(4)革蘭氏染色

塗菌：取乾淨載玻片一塊，在載玻片上加一滴生理鹽水，按無菌操作法將活化的菌液塗在載玻片上，注意取菌不要太多。

乾燥：讓塗片自然晾乾或用酒精燈烘乾。

固定：手執載玻片一端，菌膜朝上，在火焰上固定2-3次。

初染：滴加結晶紫(剛好覆蓋菌膜為宜)，染色1-2min，水洗。

媒染：用碘液衝去殘水，並用碘液覆蓋約1min，水洗。

脫色：用濾紙吸去載玻片上的殘水，將玻片傾斜，在白色背景下，用滴流管滴加95％乙醇脫色，直至流下的乙醇無紫色時，立即水洗。

復染：用番紅液復染約2min，水洗。

鏡檢：乾燥後，用油鏡觀察，菌體被染成紫色，為革蘭氏陰性菌。

實施例2

本實施例用於說明本發明的伯克霍爾德氏菌對百菌清的降解性能

(1)在水體中對百菌清的降解性

在無機鹽液體培養基中添加百菌清農藥，添加量使得在每升培養基中，百菌清的含量為20mg，然後接入10體積％的如上活化兩次的本發明的伯克 霍爾德氏菌CGMCC No.10848，於37℃下培養2天後測定培養液中百菌清的濃度，並計算降解率，結果見表1。

(2)在土相中對百菌清的降解性

在沒有受百菌清汙染的土壤中加入百菌清，並使得相對於1kg的土壤，百菌清的含量為10mg，然後分別加入5ml、10ml、15ml和20ml的上述經活化2次的本發明的伯克霍爾德氏菌CGMCC No.10848培養液，在37℃下進行降解，並分別在第2天、第4天和第6天測定土壤中的百菌清濃度，並計算降解率，結果見表1。

同時，採用相同的方法向如上相同含量的百菌清土壤中加入0.05g、0.15g、0.25g和0.5g的菌劑，在相同的條件下對土壤中的百菌清進行降解，並分別在第2天、第4天和第6天測定土壤中的百菌清濃度，並計算降解率，結果見表1。

對比例2-1

本對比例用於說明自然狀態下百菌清的降解性能

按照實施例2的步驟(1)和(2)的方法配置相同百菌清濃度的水相和土相，並按照相同的條件進行處理，不同的是，接入相同量的不含任何菌體的發酵培養基(空白對照)。測定的百菌清的濃度，並計算降解率，結果見表1。

對比例2-2

本對比例用於說明參比菌株的百菌清的降解性能

按照實施例2的步驟(1)和(2)的方法配置相同百菌清濃度的水相和土相介質，並按照相同的條件進行處理，不同的是，分別接入相同量的如上活化2次的假鼻疽伯克霍爾德菌以及參比菌劑。測定的百菌清的濃度，並計 算降解率，結果見表1。

由表1可以看出，伯克霍爾德氏菌和菌劑對土壤和水體中的百菌清有明顯的去除效果，可廣泛應用於修復含有百菌清汙染的環境，對修復土壤和生態環境問題有著重大的意義。

表1

實施例3

本實施例用於說明本發明的伯克霍爾德氏菌對煙植土壤的修復能力

在移栽煙苗和未移栽煙苗的土壤中噴灑百菌清農藥，並測定土壤中的百菌清濃度，然後向穴內噴散本發明的經活化的伯克霍爾德氏菌培養液，噴灑量為每穴20ml。30天後測定穴內百菌清的濃度，並計算百菌清的降解率。每種情況取3穴，然後取均值，結果見表2。

對比例3-1

本對比例用於說明自然狀態下煙植土壤的修復能力

在移栽煙苗和未移栽煙苗的土壤中噴灑百菌清農藥，並測定土壤中的百菌清濃度，同時向穴內噴散不含任何菌體的培養液(空白對照)，噴灑量為每穴20ml。30天後測定穴內百菌清的濃度，並計算百菌清的降解率。每種情況取3穴，然後取均值，結果見表2。

對比例3-2

本對比例用於說明參比的菌株對煙植土壤的修復能力

在移栽煙苗和未移栽煙苗的土壤中噴灑百菌清農藥，並測定土壤中的百菌清濃度濃度，然後向穴內噴散如上的參比菌株，噴灑量為每穴20ml。30天後測定穴內百菌清的濃度，並計算百菌清的降解率。每種情況取3穴，然後取均值，結果見表2。

表2

由以上結果可以看出，本發明提供的菌株對水土中的百菌清具有高效地降解性能，並且方便快捷，簡單易行，較同屬的菌株具有突出的降解效果。

以上詳細描述了本發明的優選實施方式，但是，本發明並不限於上述實施方式中的具體細節，在本發明的技術構思範圍內，可以對本發明的技術方 案進行多種簡單變型，這些簡單變型均屬於本發明的保護範圍。

另外需要說明的是，在上述具體實施方式中所描述的各個具體技術特徵，在不矛盾的情況下，可以通過任何合適的方式進行組合。為了避免不必要的重複，本發明對各種可能的組合方式不再另行說明。

此外，本發明的各種不同的實施方式之間也可以進行任意組合，只要其不違背本發明的思想，其同樣應當視為本發明所公開的內容。