Vefr-2抑制劑用於治療轉移癌的用途的製作方法

2023-10-04 07:19:44 1

專利名稱：Vefr-2抑制劑用於治療轉移癌的用途的製作方法
技術領域：
本發明涉及利用可阻斷VEGF-VEGFR通路介導生物學和病理學的新蛋白治療轉移 癌。本發明還涉及新蛋白的藥物製劑、所述蛋白的衍生物、以及它們在轉移癌治療中的應用。
背景技術：
惡性腫瘤轉移的形成是由體內遠近不等的遠端原發性腫瘤所引發的。惡性腫瘤 轉移是癌症最嚴重的危害之一，而且目前針對惡性腫瘤轉移形成尚沒有令人滿意的治療方 案。由於患者會發生(succumb to)多發性腫瘤，癌症腫瘤轉移是疾病治療中多數療法失敗 的主因。轉移發生的範圍隨著腫瘤的個體類型而變化。黑色素瘤、淋巴瘤、乳腺癌、肺癌、結 腸癌和前列腺癌屬於特別易於轉移的癌症類型。當轉移發生時，可在體內許多部位形成繼 發性腫瘤，肺、肝、腦和骨是最常見的部位。目前可利用的癌症治療方法，例如手術治療、放射線療法(放療)、化學療法(化 療)和其他免疫生物學方法，或者不能成功阻止轉移，或者引起嚴重的不良副作用。對於許多臨床診斷的實體瘤(其中腫瘤呈局限性生長)，手術切除被認為是最佳 治療方法。然而，手術後和/或經過一段延遲期後，往往觀察到原腫瘤已轉移，以至於癌浸 潤的繼發部位蔓延全身，患者隨後死於繼發性腫瘤生長。在其他實施方案中，由於腫瘤的位 置(例如在腦中某些區域)，手術切除腫瘤是不可行的，放射線、化學療法或其他免疫生物 學方法是僅有的替代手段。報導顯示，在有可切除腫瘤的個體中，原發性腫瘤生長或局部復發通常不是死亡 原因。反而目前幾乎40%患有可行手術的腫瘤的癌症患者在手術後最後患上(succumb to) 轉移性疾病。轉移在某些腫瘤中是不斷發生的。然而，轉移常常由手術本身誘發。在手術過程 中，惡性細胞可從腫瘤塊中被移出並進入循環系統，從而增加轉移的機會。雖然化學療法在癌症治療中廣泛應用，但其是一種全身性的療法，通常以防止細 胞增殖為基礎。因此，化學療法是非特異的治療模式，會影響所有增殖的細胞，包括正常細 胞，從而引起不希望的且往往較嚴重的副作用，例如免疫抑制、全血細胞減少症(骨髓細胞 生長抑制，伴隨貧血、血小板減少和白細胞減少)、腹瀉、噁心或禿髮(脫髮)。通常，現有的全身性療法經常對遠端器官(肺、肝、骨髓或腦)中已存在的微轉移 幾乎無效，而且它們對於預防腫瘤播散至其他組織不是很有效。因此，人們需要有抑制腫瘤轉移的方法。特別是，非常需要不引起嚴重副作用的抑制(微)轉移的方法。

發明內容
本發明的一個方面提供通過單獨施用或者與其他細胞毒劑或治療劑聯合施用本 發明的新型蛋白，來治療患有轉移癌或有轉移癌發病風險的受試者的方法。所述癌症可 為例如以下癌症中的一種或多種乳腺癌、結腸癌、卵巢癌、骨肉瘤、宮頸癌、前列腺癌、肺 癌、滑膜癌、黑色素瘤、皮膚癌、胰腺癌或其他尚待確定的、與非致癌細胞(non-oncogenic cell)相比VEGFR-2水平在生理學上提高、上調、突變或改變的癌症。本發明提供通過單獨施用或者與其他細胞毒劑或治療劑聯合施用本發明的 新型蛋白，來治療患有轉移癌或具有轉移癌發病風險的受試者的方法。特別地，優 選的細胞毒劑和治療劑包括多西他賽(docetaxel)、紫杉醇(paclitaxel)、多柔比 星(doxorubicin)、表柔比星(印irubicin)、環磷酉先胺(cyclophosphamide) >曲妥珠單 抗(trastuzumab) (Herceptin )、卡培他濱(capecitabine)、他莫昔芬(tamoxifen)、 託瑞米芬(toremifene)、來曲唑(letrozole)、阿那曲唑(anastrozole)、氟維司群 (fulvestrant)、依西美坦(exemestane)、戈舍瑞林(goserelin)、奧沙禾丨」鉬(oxaliplain)、 卡 白(carboplatin)、順 白(cisplatin)、地塞米豐公(dexamethasone)、安月太(antide)、 貝伐單抗(bevacizumab) (bevacizumab )、5-氟尿嘧啶(5_f luorouracil)、亞葉酸鈣 (leucovorin)、左方寵咪唑(levamisole)、伊立替康(irinotecan)、依託泊苷(etoposide)、 託泊替康(topotecan)、吉西他濱(gemcitabine)、長春I卷濱(vinorelbine)、雌莫 司汀(estramustine)、米託蒽醌(mitoxantrone)、阿巴瑞克(abarelix)、唑來膦 酸(zoledronate)、鏈佐星(str印tozocin)、利妥昔單抗(rituximab) (Rituxan )、 伊達比星(idarubicin)、白消安(busulfan)、苯丁 酸氮芥(chlorambucil)、氟達 拉濱(fludarabine)、伊馬替尼(imatinib)、阿糖胞苷(cytarabine)、替伊莫單抗 (ibritumomab) (Zevalin )、託西莫單抗(tositumomab) (Bexxar )、幹擾素 a_2b、美法侖 (melphalam)、硼替佐米(bortezomib) (Velcade )、六甲蜜胺(altretamine)、天冬醯胺酶 (asparaginase) > ^ # #M (gefitinib) (Iressa ) > /aIf M (erlonitib) (Tarceva ) > 抗-EGF受體抗體(CetUXimabTM、AbX-EGF)及埃博黴素。更優選地，所述治療劑為鉬劑(例 如卡鉬、奧沙利鉬、順鉬)、紫杉烷(例如紫杉醇、多西他賽)、吉西他濱或喜樹鹼。在一個實施方案中，提供了一種治療醫學狀況(medical condition)的方法，包 括施用本發明的蛋白質。在另外一個實施方案中，施用的蛋白質是血管生成抑制劑。在另 一個實施方案中，還施用第二種試劑。所述第二種試劑可以是本說明書中公開的任一種細 胞毒劑或治療劑，舉例來說可選自下列治療劑SutentTM(即蘋果酸舒尼替尼(simitinib !11&1站6)，描述於美國專利6，573，293)，Tykreb (即拉帕替尼(lapatinib)，描述於美國 專利6，727，256)，Nexavar (即Bayer BAY 43-9006/索拉非尼，描述於美國專利申請 流水號 09/425，228 和 PCT/US00/00648)，AZD2171 (即 Recent in ，在 PCT 國際申請公開 號TO 00/47212中公開)，貝伐單抗(即bevacizumab ,描述於美國專利6，054，297)， VEGF Trap (例如在 Kim et al. (2002) Proc. Natl. Acad. Sci. USA99 11399-404 ；Holash et al. (2002)Proc. Natl. Acad. Sci. USA 99 11393-8 中描述的，以 AVE0005 為例)，mTor 抑制 劑如雷帕黴素(rapamycin)及其衍生物(雷帕黴素羥基酯，包括CC1-779即temsirolimus，
4的製備和應用在美國專利5，362，718中公開)，作用於所述激酶的細胞質部分的激酶抑制 劑，吉西他濱(即Gemzar ，在美國專利4，808，614中公開)，替莫唑胺(temozolomide) ( BP Temodar ，其在癌症治療中的應用在美國專利5，939，098中公開)，達沙替尼(dasatinib) (即Sprycel ，在美國專利6，596，746中公開)，西妥昔單抗(Erbitux ，例如在美國專利 6，217，866 中公開)，伊沙匹隆(ixabepilone) (Bristol-Myers Squibb，s BMS-247550)， 甲磺酸伊馬替尼(imatinib mesylate)(即Gleevac ，在美國專利5，521，184中公開)，曲 妥珠單抗(Here印tin ，例如在美國專利5，677，171中公開)，以及紫杉烷類的成員如紫杉 醇(即Taxol ，在美國專利5，439，686中公開)和多西他賽(即Taxotere ，在美國專利 4，814，470中公開)。在一個實施方案中，本發明的蛋白質每兩周施用一次。在一個實施方 案中，所述治療醫學狀況的方法包括向受試者施以治療有效量的本發明的蛋白質。在另一 個實施方案中，所述治療方法進一步包括向受試者施以治療有效量的第二種治療劑。在一 個方面，接受治療的受試者為人類。此外，可能優選使本發明的蛋白質與第二種治療蛋白質聯合作為單個分子，或者 可能與第三種治療蛋白聯合作為單個分子。這樣一種治療實體包括本發明針對VEGFR-2的 蛋白質，其通過PEG或其他聚合物(例如Cys-Cys 二硫化物或多肽)與一種或多種治療蛋白 連接。所述治療蛋白包括抗體衍生物(例如Fabs、駱駝抗體及其衍生物、結構域抗體(例如 大小小於約50kD)和單鏈(優選大小小於約50kD))，基於纖連蛋白的支架如Adnectins ， 以及優選在約5kd至約40kd範圍內的蛋白質。本發明蛋白質的靶標包括下列蛋白，尤其是它們的人類版本，但某些情況下包括 模型物種例如小鼠、大鼠、猴和狗的版本FGFR1、FGFR2、FGFR3、FGFR4、c_Kit、人pl85受 體樣酪氨酸激酶、HER2/Her2、Her3、c_Met、葉酸鹽受體、PDGFR、VEGFR1、VEGFR2、VEGFR3、 人血管內皮生長因子(VEGF)A、VEGF C、VEGF D、人CD20、人CD18、人CDlla、人細胞凋亡受 體-2(Apo-2)、人0 40 7整聯蛋白、人6 1113-111￡1整聯蛋白、幹細胞因子(SCF)、人表皮生 長因子受體(EGFR)以及人CD3。此外，本發明的方面包括多功能蛋白，其結合第一種靶標和 至少另一種的靶標。優選地，所述蛋白通過本說明書中描述的PEG相關發明被連接，但在許 多實施方案中，所述蛋白可通過多肽或者其他多聚體接頭或非多聚體接頭連接。本發明的穩定連接的蛋白可用於癌症的治療性處理。當本發明的多特異性蛋白指 向2個、3個、4個或更多個治療靶標或表位時，具有調節、阻斷或抑制多於一種治療靶標的 優勢。我們預期，利用治療劑的相應生物學，可以把任何類型的腫瘤和任何類型的腫瘤 抗原作為靶標。癌症可能是以下一種或多種，例如乳腺癌、結腸癌、卵巢癌、骨肉瘤、宮頸癌、 前列腺癌、肺癌、滑膜癌、胰腺癌、黑色素瘤、多發性骨髓瘤、神經母細胞瘤和橫紋肌肉瘤，或 者其他尚待確定的、與不形成腫瘤的細胞相比VEGFR-2水平在生理學上提高、上調、突變或 改變的癌症。其他可能作為靶標的例示性腫瘤類型包括急性淋巴細胞性白血病、急性髓性白血 病、膽管癌、乳腺癌、宮頸癌、慢性淋巴細胞白血病、慢性髓性白血病、結直腸癌、子宮內膜 癌、食道癌、胃癌、頭頸癌、何杰金氏淋巴瘤、肺癌、甲狀腺髓樣癌、非何杰金氏淋巴瘤、多發 性骨髓瘤、腎癌、卵巢癌、胰腺癌、神經膠質瘤、黑色素瘤、肝癌、前列腺癌以及膀胱癌。在某些實施方案中，提供了治療、預防或降低轉移癌播散的方法，所述方法包括向有需要的患者施以治療性VEGFR-2特異性抑制劑。在某些實施方案中，患者罹患乳腺癌。在 某些實施方案中，所述VEGFR-2特異性抑制劑包括與人VEGFR-2結合的第一種多肽，所述多 肽包含具有如下結構組織的約80個至約150個胺基酸，所述結構組織包括分布在至少兩 個日-摺疊片中的至少5-7個0鏈或類0鏈，以及至少一個連接兩條鏈(它們是0鏈或 類3鏈)的環部分，所述環部分參與結合VEGFR-2，其中所述多肽以小於1X10_6M的解離 常數(Kd)結合人VEGFR-2蛋白的胞外區，抑制VEGFR-2介導的血管發生。在某些實施方案 中，所述多肽包含與SEQ NO :1具有至少80%同一性的胺基酸序列。在某些實施方案中，所 述多肽包含選自SEQ IDNOs 2-60中的任一胺基酸序列。在某些實施方案中，所述多肽進一 步包含聚氧化烯部分。在某些實施方案中，所述聚氧化烯部分為聚乙二醇(PEG)部分。在某些實施方案中，治療方法包括施用VEGFR-2特異性抑制劑和第二種化療劑。 在某些實施方案中，所述第二種試劑選自下組蘋果酸舒尼替尼、拉帕替尼(lapatinib)、 索拉非尼、AZD2171、貝伐單抗、阿柏西普(afliberc印t)、mTor抑制劑、雷帕黴素、吉西他 濱、替莫唑胺、達沙替尼(dastinib)、西妥昔單抗、temsirolimus、伊沙匹隆、甲磺酸伊馬替 尼、曲妥珠單抗、紫杉烷、奧沙利鉬、5-氟尿嘧啶。在某些實施方案中，所述VEGFR-2特異性 抑制劑進一步包括第二種多肽，所述多肽包括與SEQ NO 1具有至少80%同一性的胺基酸 序列。所述方法中應用的VEGFR-2特異性抑制劑包括小分子、聚合物、糖類和其他大分 子、多肽(包括抗體)或核酸(包括反義核酸、核酶和小幹擾RNA或siRNA)。VEGFR-2特異 性抑制劑涵蓋任何可調節、影響、改變、抑制或降低VEGFR-2活性的組合物，所述VEGFR-2活 性包括靶結合、酶活性或酪氨酸激酶的酪氨酸磷酸化作用，優選降低至少5%、10 %、20 %、 30%,40%,50%,60%,70%,80%,90%,95%,97%,98%,99%^； 100%。在例示性的實施 方案中，VEGFR-2特異性抑制劑是蛋白質。人們往往希望所述VEGFR-2特異性抑制劑與VEGFR-1和VEGFR-3相比對於 VEGFR-2具有選擇性，特別是在體內應用中是如此。所述選擇性優選為至少約100倍、至少 約1000倍、至少約10，000倍以及至少約100，000倍。此外，可能希望在治療劑或蛋白質的 規定濃度或更低濃度下檢測不到對VEGFR-1和VEGFR-3的結合，特別是對於有高VEGFR-2 親和性的抑制劑是如此，這樣的濃度為約100nM、約liiM或約10iiM。對於與VEGFR-2結 合優先於VEGFR-1和VEGFR-3的抑制劑，它們的選擇性關係還可以通過比較Kd、IC50和 Ki』 s來表示，比較的結果可以因測定法不同通過測量或者計算得到，或者可以用相同生物 化學或生物學參數(例如Kd、IC5Q和Ki』 s)的比值來表示。所述比值優選包括VEGFR-1和 VEGFR-3結合的比值，或其他對VEGFR-2結合的測定值，或其他約100、約1，000、約10，000 或約100,000的測定值。在某些實施方案中，所述VEGFR-2特異性抑制劑包括在美國專利申請流水號 11/482，641和11/448，171，以及PCT國際申請公開號W0 05/056764中公開的VEGFR-2特 異性抑制劑，本文通過援引方式併入這些申請的全部內容。還可對序列進一步進行修飾，例 如在序列倒數第二個胺基酸處添加半胱氨酸。在一些實施方案中，可用於本發明方法中的VEGFR-2特異性抑制劑包括以約10nM 或更低的結合親合力結合人VEGFR-2、且以約1 y M或更高的結合親合力結合VEGFR-1和 VEGFR-3的第一種蛋白質；其中所述第一種蛋白質基本上是一單結構域，該結構域對於人VEGFR-2基本上單價結合，且基本上沒有微生物汙染，使其適合於體內施用。所述VEGFR-2 特異性抑制劑(VEGF-2specific inhibitors)可進一步包括第二種蛋白質，其通過肽鍵 與所述第一種蛋白質連接，其中所述第二種蛋白質以約lOnM或更低的結合親合力結合人 VEGFR-2，且以約liiM或更高的結合親合力結合VEGFR-1和VEGFR-3。VEGFR-2特異性抑 製劑可進一步包括第二種蛋白質，其通過至少一個肽鍵與所述第一種蛋白質連接(包括經 由另一個蛋白質結構域的連接)，其中所述第二種蛋白質以約300nM或更低的結合親合力 結合人血清白蛋白。所述VEGFR-2特異性抑制劑(VEGF-2specific inhibitors)優選包 括以約100pM或更低的結合親合力結合人VEGFR-2、且以約liiM或更高的結合親合力結 合VEGFR-1和VEGFR-3的第一種蛋白質。所述VEGFR-2特異性抑制劑(VEGF-2specific inhibitors)更優選包括以約10pM或更低的結合親合力結合人VEGFR-2、且以約liiM或更 高的結合親合力結合VEGFR-1和VEGFR-3的第一種蛋白質。這樣的第一種蛋白質優選為 基於纖連蛋白的支架(fibronectin-based scaffold)，例如Adnectin ，後者是與VEGFR-2 單價結合的單特異性蛋白質的例子，還可包括其他可操作地連接的蛋白。所述VEGFR-2特 異性抑制劑(VEGF-2specific inhibitors)可進一步包括第二種蛋白質，其通過PEG與 所述第一種蛋白質連接，其中所述第二種蛋白質以約lOnM或更低的結合親合力結合人 VEGFR-2，且以約liiM或更高的結合親合力結合VEGFR-1和VEGFR-3。優選的是，所述第一 和第二種蛋白質是基於纖連蛋白的支架，例如Adnectins ，後者是與VEGFR-2 二價結合的 單特異性蛋白質的例子。優選地，PEG為約5kD至約50kD。本發明方法的一個方面包括VEGFR-2特異性抑制劑 (VEGFjspecificinhibitors)，它們包括特異性結合人VEGFR-2的第一種蛋白質；其中所 述第一種蛋白質分子量為約4kD至約40kD，與人VEGF-A、VEGF-C或VEGF-D有小於約30 %的 胺基酸同一性，且基本上沒有微生物汙染，使其適合於體內施用。所述VEGFR-2特異性抑制 劑可進一步包括本說明書中所述的PK調節部分。所述VEGFR-2特異性抑制劑可以具有這樣 的PK調節部分，其包括與所述第一種蛋白質共價連接的PEG部分。這樣的連接不限於與Cys 或Lys胺基酸，但優選特別是基於纖連蛋白的支架，例如Adnectin ，作為結合VEGFR-2的蛋 白質。所述VEGFR-2特異性抑制劑可以具有這樣的PK調節部分該調節部分包含第二種蛋 白質，該第二種蛋白質能結合能增加所述第一種蛋白質的半衰期的人蛋白質，並且與所述 第一種蛋白質可操作地連接。所述人蛋白質可以是人血清白蛋白。所述VEGFR-2特異性抑 製劑可適當地包含這樣的PK調節部分，該調節部分包括能結合人血清白蛋白的第二種蛋 白質，所述第二種蛋白質與所述第一種蛋白質共價連接，所述第一種蛋白質對於人VEGFR-2 的解離常數為約InM或更低。所述VEGFR-2特異性抑制劑可包括所述第一種蛋白質，其對 於人VEGFR-2的解離常數約為10pM或更低。所述VEGFR-2特異性抑制劑優選在基於細胞 的測定(cellbased assay)中誘導依賴於VEGFR-2活性的細胞系的細胞凋亡。可以設計所 述VEGFR-2特異性抑制劑使它們具有如下性質所述組合物(saidcomposition ofmatter) 阻斷一個或多個配體(如VEGF-A、VEGF-C或VEGF-D)與VEGFR-2結合。所述VEGFR-2特異 性抑制劑優選阻斷VEGF-A、VEGF-C和/或VEGF-D與VEGFR-2的結合，且進一步包括共價搭 接於所述第一種蛋白質的、至少約10kD的PEG。PEG可用在本發明的許多方面，可按照本說明書中的記載使用不同的大小以實現 期望的治療或其他體內作用，例如成像。優選較大的PEG以增加在體內、血液、非血液細胞
7外液或組織內的半衰期。對於體內細胞活性，優選範圍在約10-60kD的PEG，也可以使用小 於約100kD，更優選小於約60kD的PEG，但大於約100kD的大小也可應用。用在本發明方法中的優選蛋白質包括基於纖連蛋白的支架，例如Adnectin 。第一 種或第二種蛋白質或者兩者都可以是基於纖連蛋白的支架，例如Adnectin ，並且可用在本 說明書中所述的實施方案中。它們可包括本發明的單特異性、雙特異性、三特異性和其他多 特異性形式。這包括本發明的包含PEG的方面以及本發明包含多肽接頭或其他非基於PEG 的接頭的方面。通常，Adnectins 是纖連蛋白的衍生物，特別是第十結構域。本發明的方法中還可以使用基於PEG的組合物，所述組合物包括以約lOOnM的結 合親合力與結合人VEGFR-2的第一種蛋白質和可結合人蛋白質的第二種蛋白質連接的第 一 PEG ；其中所述PEG為約5kD至約100kD，所述組合物基本上沒有PEG，且基本上沒有微生 物汙染，使其適合於體內施用。優選地，PEG通過Cys連接至所述第一種蛋白質，並通過Cys 連接至所述第二種蛋白質。或者，可能理想的是，PEG通過Cys連接至所述第一種蛋白質而 通過Lys連接至所述第二種蛋白質。可以利用異功能PEG來生成這些實施方案和本說明書 中所述的其他實施方案。基於PEG的組合物可包括可以約300nM或更低的結合親合力結 合人血清白蛋白的第二種蛋白質。該基於PEG的組合物可包括所述第一種蛋白質，其以約 100pM或更低的結合親合力結合人VEGFR-2，並且以約1 y M或更高的結合親和力結合無關 受體，如人胰島素受體、VEGFR-1和VEGFR-3。優選的是，所述第二種蛋白質以約InM或更低 的結合親和力結合至少一種人酪氨酸受體，並且以約1 P M或更高的結合親和力結合無關 受體，如人胰島素受體。基於PEG的組合物可包括這樣的本發明蛋白質，其結合以下蛋白配體的人源版本 中的至少一種Angl、Ang2、FGF (成纖維細胞生長因子)、EGF(表皮生長因子)、HGF (肝細 胞生長因子)、VEGF-A (血管內皮生長因子A)、VEGF-C和VEGF-D。這樣的本發明蛋白質可 與本發明的其他蛋白質一起使用，來產生可用於本發明治療方法的單特異性或多特異性蛋 白質。優選地，所述蛋白質通過PEG連接。基於PEG的組合物優選包括這樣的分子，其中所述第一種蛋白質是基於纖連蛋白 的支架(如Adnectin )且所述第二種蛋白質是基於纖連蛋白的支架(如Adnectin )。或 者，基於PEG的組合物可以包括第一種或第二種蛋白質或者兩者的單鏈抗體部分。用在本發明方法中的基於蛋白質的組合物包括結合人VEGFR-2的第一種蛋白質， 其與結合人蛋白質的第二種蛋白質可操作地連接；其中所述第一種蛋白質以約lOnM或更 低的結合親和力結合人VEGFR-2並且以約1 y M或更高的結合親和力結合人VEGFR-1和 VEGFR-3，且基本上沒有微生物汙染，使其適合於體內施用。優選地，所述第一種蛋白質和 所述第二種蛋白質總共具有1個或0個二硫鍵。這可能有利於提高基於細胞的系統中的 蛋白質產量。優選地，所述第一種蛋白質基本上是單個結構域，其基本上與VEGFR-2單價 結合。這對於提高基於細胞的系統中的蛋白質產量可能是需要的。優選地，所述第一種蛋 白質以約100pM或更低的結合親和力結合人VEGFR-2，且有至少兩個結構環參與所述第一 種蛋白質與人VEGFR-2的結合。優選地，所述第二種蛋白質是基於纖連蛋白的支架，例如 Adnectin ，其通過至少一個肽鍵與所述第一種蛋白質連接。在一些實施方案中，所述第一 種蛋白質和第二種蛋白質通過至少一個二硫鍵連接。這樣的連接可以在細胞中實現，不過 在體外無細胞條件下進行可能是理想的。基於蛋白質的組合物可包括這樣的第一種蛋白質，其以約300pM或更少的結合親和力結合人VEGFR-2，且有至少兩個結構環參與所述第一 種蛋白質與人VEGFR-2的結合。優選地，所述第一種蛋白質以約InM或更低的結合親和力 結合人VEGFR-2，並且以約1 y M或更高的結合親和力結合人VEGFR-1和VEGFR-3。優選地， 基於蛋白質的組合物進一步包括PEG部分，其與所述第一種蛋白質或者所述第二種蛋白質 可操作地連接。優選地，所述第二種蛋白質結合人類癌症中上調的人酪氨酸激酶受體，其中 所述第二種蛋白質以約lOnM或更低的結合親和力結合人酪氨酸激酶受體，並且以約lyM 或更高的結合親和力結合無關受體，如人胰島素受體。本發明方法有用的蛋白質治療劑包括結合人VEGFR-2的第一種蛋白質部分，其 與結合人治療靶的第二種蛋白質部分可操作地連接；其中所述第一種蛋白質以約lOnM或 更低的結合親和力結合人VEGFR-2，並且以約1 y M或更高的結合親和力結合人VEGFR-1 和VEGFR-3，且基本上沒有微生物汙染，使其適合於體內施用；另外其中所述第二種蛋白 質以約lOnM或更低的結合親和力結合人治療靶，並且以約1 P M或更高的結合親和力結 合無關受體，如人胰島素受體，且基本上沒有微生物汙染使其適合於體內施用。所述蛋 白質治療劑可包括第一種蛋白質部分和所述第二種蛋白質部分，它們總共具有至少6個 二硫鍵。優選地，所述第一種蛋白質和所述第二種蛋白質是由微生物表達的單一多肽(a single polypeptide) 0優選地，所述第一種蛋白質以約lOOpM或更低的結合親和力結合 人VEGFR-2，且具有至少兩個結構環參與所述第一種蛋白質與人VEGFR-2的結合。所述蛋 白質治療劑包括這樣的實施方案，其中所述第一種蛋白質部分和所述第二種蛋白質部分中 至少一者是抗體部分。優選地，所述抗體部分小於約50kD。所述蛋白質治療劑包括這樣的 實施方案，其中所述第一種蛋白質部分和所述第二種蛋白質部分中至少一者是單鏈抗體部 分。所述蛋白質治療劑包括這樣的實施方案，其中所述第二種蛋白質部分結合以下蛋白質 之一的人源版本受體EGFR、葉酸鹽受體、Her2、Her3、c_kit、c_Met、FGFRI、FGFR2、PDGFR、 VEGFR1、VEGFR2、VEGFR3和Tie2 ；以及配體Angl、Ang2、FGF (成纖維細胞生長因子)、 EGF (表皮生長因子)、HGF (肝細胞生長因子)、幹細胞因子(SCF)、VEGF_A (血管內皮生長因 子A)、VEGF-C和VEGF-D。所述蛋白質治療劑包括這樣的實施方案，其中所述第一種蛋白質 部分和所述第二種蛋白質部分中至少一者是脂籠蛋白(lipocalin)的衍生物。所述蛋白質 治療劑包括這樣的實施方案，其中所述第一種蛋白質部分和所述第二種蛋白質部分中至少 一者是四連蛋白(tetranectin)的衍生物。所述蛋白質治療劑包括這樣的實施方案，其中 所述第一種蛋白質部分和所述第二種蛋白質部分中至少一者是avimer的衍生物。可用於本發明方法的蛋白質治療劑包括結合人VEGFR-2的第一種蛋白質部分， 其與PEG可操作連接，該PEG與可結合人治療靶的第二種蛋白質部分可操作連接；其中所述 第一種蛋白質部分以約lOnM或更低的結合親和力結合人VEGFR-2，並且以約1 y M或更高的 結合親和力結合人VEGFR-1和VEGFR-3，且基本上沒有微生物汙染，使其適合於體內施用； 另外其中所述第二種蛋白質部分以約lOnM或更低的結合親和力結合人治療靶，並且以約 1 u M或更高的結合親和力結合無關受體，如人胰島素受體，且基本上沒有微生物汙染，使其 適合於體內施用。所述蛋白質治療劑包括這樣的實施方案，其中所述第一種蛋白質部分和 所述第二種蛋白質部分總共具有至少約8個二硫鍵。所述蛋白質治療劑包括這樣的實施方 案，其中所述第一種蛋白質和所述第二種蛋白質是由微生物表達的單個多肽。所述蛋白質治療劑包括這樣的實施方案，其中所述第一種蛋白質以約100pM或更低的結合親和力結合人VEGFR-2，且具有至少兩個結構環參與所述第一種蛋白質與人 VEGFR-2的結合。所述蛋白質治療劑包括這樣的實施方案，其中所述第一種蛋白質部分和所 述第二種蛋白質部分中至少一者是小於約40kD的抗體部分。所述蛋白質治療劑包括這樣 的實施方案，其中所述第一種蛋白質部分和所述第二種蛋白質部分中至少一者是單鏈抗體 部分。所述蛋白質治療劑包括如下實施方案，其中所述第一種蛋白質部分和所述第二種蛋 白質部分中至少一者是脂籠蛋白、四連蛋白、avimer和錨蛋白的衍生物。可用於本發明方法的蛋白質治療劑包括結合人VEGFR-2的第一種蛋白質部分， 其與PEG可操作連接，該PEG與結合人治療靶的第二種蛋白質部分可操作連接；其中所述第 一種蛋白質部分以約lOnM或更低的結合親和力結合人VEGFR-2，並且以約1 y M或更高的結 合親和力結合人VEGFR-1和VEGFR-3，對於人VEGFR-2的結合基本上是單價的，且基本上沒 有微生物汙染，使其適合於體內施用；另外其中所述第二種蛋白質部分以約lOnM或更低的 結合親和力結合人治療靶，並且以約1 P M或更高的結合親和力結合無關受體，如人胰島素 受體，且基本上沒有微生物汙染，使其適合於體內施用。在該實施方案及本發明的其他實施 方案中，與VEGFR-2基本上單價結合有助於降低VEGFR-2活化。在某些情況下，與VEGFR-2 多價結合，如親合力(avidity)，的蛋白質(例如全長抗體或Fab)可能引起VEGFR-2活化。 此外，Fabs和全長抗體具有更剛性的構象，可能模擬激活性配體。這還可能引起受體二聚 化。所述蛋白質治療劑包括這樣的實施方案，其中所述PEG為至少約5kD、至少約10kD、至 少約20kD、至少約40kD以及至少約50kD。所述蛋白質治療劑包括這樣的實施方案，其中所 述第一種蛋白質通過單個Cys或Lys與PEG可操作地連接。優選地，在該實施方案和其他 實施方案中，所述第一種蛋白質至多有一個Cys。所述蛋白質治療劑包括這樣的實施方案， 其中所述第二種蛋白質通過單個Cys或Lys與PEG可操作地連接。優選地，在該實施方案 和其他實施方案中，所述第二種蛋白質至多有一個Cys。所述蛋白質治療劑包括這樣的實施 方案，其中所述單個Cys或Lys位於所述第一種蛋白質的胺基酸序列中的非野生型的部位。 所述蛋白質治療劑包括這樣的實施方案，其中所述單個Cys或Lys位於所述第二種蛋白質 的胺基酸序列中的非野生型的部位。可用於本發明方法的蛋白質治療劑包括結合人VEGFR-2的第一種蛋白質部 分，其可與生物相容性聚合物連接，所述生物相容性聚合物與結合人治療靶的第二種蛋白 質部分可操作連接；其中所述第一種蛋白質部分以約lOnM或更低的結合親和力結合人 VEGFR-2,並且以約1 y M或更高的結合親和力結合無關受體，如人胰島素受體，且基本上沒 有微生物汙染，使其適合於體內施用；另外其中所述第二種蛋白質部分以約lOnM或更低的 結合親和力結合人治療靶，並且以約1 P M或更高的結合親和力結合無關受體，如人胰島素 受體，且基本上沒有微生物汙染，使其適合於體內施用；另外其中所述第一種蛋白質部分和 第二種蛋白質部分對它們各自的靶標的親和力是經過優化，以使非治療性的作用最小而使 與多於一種治療靶結合的治療益處最大。所述蛋白質治療劑包括這樣的實施方案，其中生物相容性聚合物接頭包括多肽。 所述蛋白質治療劑包括這樣的實施方案，其中所述生物相容性聚合物是PEG。所述蛋白質治 療劑包括這樣的實施方案，其中所述PEG為至少約30kD。所述蛋白質治療劑包括這樣的實 施方案，其中所述第一種蛋白質部分誘導細胞凋亡。所述蛋白質治療劑包括這樣的實施方 案，其中所述第一種蛋白質部分在基於細胞的測定中抑制細胞增殖、阻斷VEGF結合、在低
10於IC5(I濃度下不激活人VEGFR-2。在該實施方案及其他實施方案中，所述蛋白質治療劑可 進一步包括用於IV、IP或皮下施用的藥學可接受的配製劑。所述蛋白質治療劑可包括至少約20kD或約30kD的PEG。PEG連同所述第一種蛋白 質部分一起，可有助於誘導細胞凋亡。為此目的，較大的PEG是優選的。特別優選有單特異 性活性以及與VEGFR-2多價(例如二價)結合的PEG實施方案，以阻斷VEGFR-2活性，例如 控制細胞凋亡、磷酸化或二聚化。優選地，所述第一種蛋白質部分在基於細胞的測定中抑制 細胞增殖，阻斷VEGF-A、VEGF-C或/和VEGF-D結合，且在低於IC5(1濃度下不激活人VEGFR-2。 所述蛋白質治療劑可進一步包括用於IV、IP或皮下施用的藥學可接受配製劑。優選地，所 述第一種蛋白質部分在基於細胞的測定中誘導細胞凋亡，其IC5(I小於約InM或約10pM。優 選地，所述第一種蛋白質部分在基於細胞的測定中抑制細胞增殖，阻斷VEGF-A、VEGF-C和/ 或VEGF-D結合，在低於IC5Q濃度下不激活人VEGFR-2，其IC5(1小於約InM或約10pM。可用於本發明方法的蛋白質包括以下實施方案，其中第一種或第二種蛋白質或多 肽接頭具有可被血液或靶組織中的蛋白酶剪切的蛋白酶位點。可以利用這樣的實施方案來 釋放兩種或多種治療性蛋白，以實現與分別產生所述蛋白質相比更好的遞送或治療學性質 或者更高效的生產。可用於本發明方法的蛋白質包括這樣的實施方案，其中兩種或多種蛋白質或者多 肽接頭利用生物相容性聚合物(例如聚合糖)。所述聚合糖可包括可由血液或靶組織中酶 剪切的酶切位點。可以利用這樣的實施方案來釋放兩種或多種治療性蛋白，以實現與分別 產生所述蛋白質相比更好的遞送或治療學性質或者更高效的生產。本發明的方法包括這樣的蛋白質治療劑，包括結合人VEGFR-2的第一種蛋白質， 其與PEG可操作地連接，該PEG與結合人蛋白質的第二種蛋白質可操作地連接；其中所述第 一種蛋白質以約lOnM或更低的結合親和力結合人VEGFR-2，並且以約1 y M或更高的結合親 和力結合人VEGFR-1和VEGFR-3，其是人VEGFR-2的拮抗劑，且基本上沒有微生物汙染，使其 適合於體內施用；另外其中所述第二種蛋白以約lOnM或更低的結合親和力結合人治療靶， 並且以約1 P M或更高的結合親和力結合無關受體，如人胰島素受體，且基本上沒有微生物 汙染，使其適合於體內施用。所述蛋白質治療劑包括這樣的實施方案，其中所述第一種蛋白質抑制細胞增殖， Tm至少55°C，並且在其胺基酸序列的區域中具有基本上不幹擾與人VEGFR-2的結合的非野 生型Cys或Lys。所述蛋白質治療劑包括這樣的實施方案，其中所述第一種蛋白質和所述 第二種蛋白質是由微生物表達的單一多肽。所述蛋白質治療劑包括這樣的實施方案，其中 所述第一種蛋白質以約50pM或更低的結合親和力結合人VEGFR-2，且具有至少兩個結構環 參與所述第一種蛋白質與人VEGFR-2的結合。所述蛋白質治療劑包括這樣的實施方案，其 中所述蛋白質治療劑在IV施用時體內半衰期至少1天。所述蛋白質治療劑包括這樣的實 施方案，其中所述蛋白質治療劑在嚙齒類動物中施用後超過24小時的時間內，具有至少10 倍於所述第一種蛋白質與人VEGFR-2的結合親和力的濃度的接觸程度(exposure level)。 所述蛋白質治療劑包括這樣的實施方案，其中所述蛋白質治療劑在嚙齒類動物中皮下施用 後超過24小時的時間內，具有至少100倍於所述第一種蛋白質與人VEGFR-2的結合親和力 的濃度的接觸程度。所述蛋白質治療劑包括這樣的實施方案，其中所述第一種蛋白質以約 100pM或更低的結合親和力結合人VEGFR-2，且具有至少兩個結構環參與所述第一種蛋白質與人VEGFR-2的結合。優選地，所述第一種蛋白質或第二種蛋白質或者兩者都是基於纖 連蛋白的支架，例如Adnectin 。另外，腫瘤相關靶標(tumor-associated targets)可以作為本發明的方法中的靶 標。在一些實施方案中，抗原靶定作用(antigen targeting)將有助於按照組織分布或以 局部濃度效應增加的方式，使治療作用局部化到組織或所需細胞類型中。或者，其可在治療 劑所針對的本文所述的一種靶標之外，進一步提供一種抗癌作用機制。所述抗原或靶標包 括但不限於碳酸酐酶IX、A3、特異針對A33抗體的抗原、BrE3-抗原、⑶1、⑶la、⑶3、⑶5、 CD15、CD16、CD19、CD20、CD21、CD22、CD23、CD25、CD30、CD45、CD74、CD79a、CD80、HLA-DR、 NCA95、NCA90、HCG 及其亞單位、CEA(CEACAM-5)、CEACAM-6、CSAp、EGFR、EGP-1、EGP-2、 Ep-CAM、Ba 733、HER2/neu、低氧誘導因子(HIF)、KC4-抗原、KS-1-抗原、KS1-4、Le_Y、巨 噬細胞抑制因子(MIF)、MAGE、MUC1、MUC2、MUC3、MUC4、PAM-4-抗原、PSA、PSMA、RS5、S100、 TAG-72、p53、生腱蛋白(tenascin)、IL_6、IL-8、胰島素生長因子-I (IGF-I)、胰島素生長 因子-II(IGF-II)、Tn抗原、Thomson-Friedenreich抗原、腫瘤壞死抗原、胎盤生長因子 (PIGF)、17-1A-抗原、血管生成標誌物(例如ED-B纖連蛋白)、癌基因標誌物、癌基因產物 以及其他腫瘤相關抗原。最近對於腫瘤相關抗原的報導包括Mizukami等(2005，Nature Med. 11 992-97) ；Hatfield 等(2005，Curr. Cancer Drug Targets5 :229_48) ；Vallbohmer 等(2005，J. Clin. Oncol. 23 :3536-44)以及 Ren 等(2005，Ann. Surg. 242 :55_63)，分別在此 通過援引併入本文。在其他實施方案中，血管生成抑制劑可形成治療劑的一部分，並且可與VEGFR-2 特異性抑制劑可操作地連接。使用的例示性血管生成抑制劑包括血管他丁(angiostatin)、 baculostatin、canstatin、乳腺絲抑蛋白(maspin)、抗-VEGF抗體或肽、抗-胎盤生長因子 抗體或肽、抗-Flk-1抗體、抗-Flt-1抗體或肽、層粘連蛋白肽、纖連蛋白肽、纖溶酶原激活 劑抑制劑、組織金屬蛋白酶抑制劑、幹擾素、白細胞介素12、IP-lO、Gro-0、凝血酶敏感蛋白 (thrombospondin)、2_ 甲氧基雌二醇、增殖蛋白相關蛋白(proliferin-relatedprotein)、 羧胺三唑(carboxyamidotriazole)、CM 101、馬立馬司他(Marimastat)、戊聚糖多硫酸酯 (pentosan polysulphate)、血管生成素2、幹擾素-a、除莠黴素A、PNU145156E、16K催乳素 片段、利諾胺(Linomide)、沙利度胺(thalidomide)、己酮可可鹼(pentoxifylline)、染料 木黃酮(genistein)、TNP-470、內皮他丁(endostatin)、紫杉醇、accutin、血管他丁、西多 福韋(cidofovir)、長春新鹼(vinscristine)、博來黴素(bleomycin)、AGM_1470、血小板因 子4或者米諾環素(minocycline)。本發明提供在治療轉移癌中有用的試劑盒，包括本說明書中所述的一種或多種成 分，還包括應用那些成分的說明書。在優選的實施方案中，本發明的試劑盒包括本發明的蛋 白質，單獨或者與第二種治療劑一起。針對該優選實施方案的所述說明書包括對利用本發 明的蛋白質(單獨或者與第二種治療劑一起)抑制癌細胞生長的說明，和/或對利用本發 明的蛋白質治療癌症患者的方法的說明。


圖1顯示了 Comp-I和貝伐單抗在MDA-MB-231原位肺癌轉移模型中的作用。將 MDA-MB-231乳腺腫瘤細胞植入小鼠乳腺脂肪墊，在第24天切除產生的腫瘤。第28天開始藥物治療，第118天處死小鼠，評估局部再生和肺轉移。
具體實施例方式定義本說明書中使用的「轉移(metastasis) 」定義為惡性腫瘤細胞或新生物 (neoplasms)通過循環系統或淋巴系統或者通過天然體腔移動(migration)或轉移 (transfer)，通常從腫瘤(tumor)、癌症(cancer)或新生物(neoplasia)的原發病灶至身體 中的遠處，隨後在一個新的或多個新的部位產生一個或多個繼發性腫瘤或其集落。「轉移」 包括由於轉移形成的繼發性腫瘤或集落，還包括微轉移(micro-metastasis)。如本說明書中使用的，術語「治療(treatment) 」、「治療(treating) 」等，是指獲得 理想的藥理學和/或生理學效應。所述效應可以是預防性的，體現在以完全或部分預防疾 患或其症狀；和/或可以是治療性的，體現在部分或完全治癒疾患和/或可歸因於該疾患的 不良反應。如本說明書中使用的，「治療(treatment) 」涵蓋哺乳動物(特別是人類)疾病的 任何治療，包括(a)增加存活時間；(b)降低疾病引起的死亡風險；(c)預防疾病在可能易 感該疾病但尚未診斷為患有該疾病的受試者中發生；(d)抑制疾病，即阻止其發展(例如降 低疾病進展的速度)；以及(e)緩解疾病，即引起疾病的消退。具體地，所述疾病(disease)/ 疾患(disorder)是轉移或轉移的發展(development)。如本說明書中使用的，可「預防(prevent)」疾患或症候(condition)的治療劑是 這樣的化合物在統計樣本中，相對於未經治療的對照樣本，它減少治療樣本中疾患或症候 的發生，或者相對於未經治療的對照樣本，它延遲疾患或症候的一種或多種症狀的發作或 者降低其嚴重性。預防轉移的試劑，相對於對照，可完全阻斷轉移的發生或降低形成的轉移 灶數目。「多肽(polyp印tide) 」是指任何兩個或多個胺基酸的序列，無論長度、翻譯後修飾 或功能如何。「多肽」、「肽」和「蛋白質」在本文中可互換使用。多肽可包括天然胺基酸和非 天然胺基酸，例如美國專利6，559，126中所描述的那些，本文通過援引併入該專利。多肽還 可以用許多種標準化學方法中的任一種來修飾(例如，胺基酸可用保護基修飾；羧基端氨 基酸可變成末端醯胺基；氨基末端殘基可用基團修飾，以例如增強親脂性；或者多肽可用 化學方法進行糖基化或其它方式修飾以提高穩定性或體內半衰期)。多肽修飾可包括將另 一種結構如環狀化合物或其他分子搭接在多肽上，還可包括具有一個或多個構型改變(即 R或S;或者L或D)的胺基酸的多肽。術語「單域多肽(single domain polyp印tide) 」用 來表示主題多肽的靶結合活性(例如VEGFR-2結合活性)位於單一結構域內，這有別於例 如抗體和單鏈抗體，後者的抗原結合活性通常由重鏈可變域和輕鏈可變域兩者所賦予。我 們預期，可以把多個屬於本說明書中公開類型的單結構域多肽連接起來以產生親合力變強 的複合分子。而且，可把單結構域多肽搭接(例如作為融合蛋白)於任何數目的其他多肽， 例如螢光多肽、靶向性多肽和有不同(distinct)療效的多肽。免疫球蛋白或者免疫球蛋白樣支架的單結構域多肽往往會共有某些的結構特徵。 舉例來說，所述多肽可包括約80個至約150個胺基酸，這些胺基酸在結構上被組織成一組 3鏈或類0鏈，形成0摺疊片，其中這些0鏈或類0鏈通過間插的環部分連接起來。這 些3摺疊片形成單結構域多肽的穩定核心，同時生成兩個由連接0鏈或類0鏈的環構成的「面(faces)」。如本說明書中所述，可以對這些環加以改變來產生定製的配體結合部位， 而且，通過進行適當的控制，可以在不破壞蛋白質的總體穩定性的同時產生所述變化。在抗 體中，這些環中有3個是眾所周知的互補決定區(ComplementarityDetermining Regions) (或 「CDR」)。用於形成單結構域多肽的支架在生理條件下應該極易溶且穩定。免疫球蛋白支架 的例子有單結構域支架，還有單結構域駱駝Vhh結構域(在駱駝中發現的一種重鏈可 變域的形式)或者其他在自然界中發現的或工程化改造的免疫球蛋白可變區。在本說明書 中公開的一種單結構域型式中，免疫球蛋白多肽無需與第二種多肽形成二聚體來獲得結合 活性。因此，對於任何天然地含有可介導與第二種蛋白質形成二硫化物交聯的半胱氨酸(a cysteine which mediates disulfide cross-linking to a second protein)的多月太，可 以加以改變，除去該半胱氨酸。或者，可保留所述半胱氨酸，用來將額外的部分(例如PEG) 偶聯到單結構域多肽上。其他支架可以是非抗體支架蛋白。「非抗體支架蛋白或結構域」是指具有免疫球蛋 白樣摺疊的非抗體多肽。「免疫球蛋白樣摺疊」指的是具有約80-150個胺基酸殘基的蛋白 質結構域，包括兩層反平行的3摺疊片，其中兩個3摺疊片的平坦疏水界面相互擠壓在一 起(packed against each other)。所述支架的一個例子是「基於纖連蛋白的支架蛋白」，其 是指基於III型纖連蛋白結構域(Fn3)的多肽。纖連蛋白是一種大蛋白，它在細胞外基質的 形成和細胞間相互作用中發揮重要作用；纖連蛋白由許多個重複的3種類型(I型、II型和 III 型)的小結構域組成(Baron et al. Philos. Trans. R. Soc. Lond. B. Biol. Sci. 1991May 29；332(1263) :165_70)。Fn3本身是一個大亞家族的範式，該家族包括細胞粘附分子的部 分、細胞表面激素和細胞因子受體、伴侶蛋白(chaperoning)，以及碳水化合物結合域。關 於綜述參見 Bork and Doolittle, Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 19920ct 1 ；89 (19) :8990_4 ; Bork et al.J.Mol. Biol. 1994Sep 30 ；242 (4) 309-20 ；Campbell and Spitzfaden, Structure. 1994Mayl5 ；2 (5) 333-7 ；Harpez and Chothia, J. Mol. Biol. 1994May 13; 238(4) :528-39)。優選地，基於纖連蛋白的支架蛋白為「"^113」支架，其是指一種基於人III型纖連 蛋白第十模塊的多肽變體，其中一個或多個溶劑可及環(solventaccessible loops)被隨 機化或突變，特別是被稱為BC環(胺基酸23-30)、DE環(胺基酸52-56)和TO環(胺基酸 77-87)的3個環中的一個或多個(編號以人纖連蛋白第十個III型結構域上的序列為基 礎，胺基酸Val-Ser-ASp-Val-Pr0(SEQ ID NO 62)為胺基酸編號1_5)被隨機化或突變。野 生型人III型纖連蛋白結構域第十模塊的胺基酸序列為VSDVPRDLEVVAATPTSLLISWDAPAVTVRYYRITYGETGGNSPVQEFTVPGSKSTATISGLKPGVDYT ITGYAVTGRGDSPASSKPISINYRT(SEQ IDN0 1)。因此，野生型BC環包含序列DAPAVTVR(SEQ ID NO :63)；野生型DE環包含序列 GSKST (SEQ ID NO 64)；野生型 FG 環包含序列 GRGDSPASSKP (SEQ ID NO :65)。位於 BC、DE 和re環側翼的序列也稱為框架1、框架2、框架3和框架4。優選地，基於纖連蛋白的支架是 以SEQ ID NO 1為基礎的。已經鑑定了許多種改善的突變型"^113支架。修飾的Asp7，其由非負電荷胺基酸 殘基(如AsruLys等)取代。與野生型形式相比，這些突變都具有促進突變型"^113在中性PH下更高穩定性的作用。支架中許多種其他的改變——它們或者是有益的或者是中
性的-已經被公開。參見例如 Batori et al. Protein Eng. 2002Dec ； 15 (12) :1015_20 ;
Koide et al. Biochemistry2001Aug 28 ；40 (34) :10326_33。變異體和野生型"^113蛋白特徵都在於有相同的結構，S卩7個3鏈結構域序列(命 名為A至和6個環狀區域(AB環、BC環、⑶環、DE環、EF環和TO環)，所述環連接所述7個 3鏈結構域序列。位置靠近N末端和C末端的0鏈在溶液中可能呈現類0構象。在SEQ ID NO :1中，AB環對應於殘基15-16，BC環對應於殘基22-30，CD環對應於殘基39-45，DE 環對應於殘基51-55，EF環對應於殘基60-66，FG環對應於殘基76-87。BC環、DE環和TO 環都位於多肽的同一端。類似地，免疫球蛋白支架往往具有至少7個0鏈或類0鏈，且常 常有9個0鏈或類0鏈。Adnectins 可包含其他Fn3型纖連蛋白結構域，只要它們顯示 出wfm型結構域的有用的活性和性質。本說明書中公開的單結構域多肽可具有至少5-7個0鏈或類0鏈，它們分布在 至少兩個3摺疊片之間，至少有一個環部分連接兩個3鏈或類3鏈，所述環部分參與和 VEGFR-2的結合，所述結合的特徵在於解離常數小於1 X 10_6M，優選小於1 X 10_8M。如本說明 書中所述，解離常數小於5X 10_9M的多肽特別適合體內治療性應用來抑制VEGF信號傳導。 解離常數在1 X 10_6M至5X 10_9M之間的多肽可能適合用於在離體或體內條件下檢測或標記 VEGFR-2 蛋白。任選地，相對於來自相同物種的其他相關蛋白，「VEGFR-2結合蛋白」將與VEGFR-2 特異性結合。「特異性結合」是指多肽識別靶蛋白(如VEGFR-2)並與之相互作用，但基本上 不識別且不與樣本(例如生物樣本)中其他分子相互作用。在優選的實施方案中，本發明 的多肽將與VEGFR-2特異性結合，Kd至少嚴格到(at least as tight as)500nM。優選地， 所述多肽將以lpM至500nM，更優選lpM至100nM，更優選lpM至10nM，最優選lpM至InM或 更低的Kd與VEGFR-2特異性結合。「功能性Fc區」具有天然序列Fc區的至少一種「效應物功能」。例示性的「效應物 功能」包括Clq結合；補體依賴性細胞毒性(CDC) ；Fc受體結合；抗體依賴細胞介導的細胞 毒性(ADCC)；吞噬作用；細胞表面受體(例如B細胞受體；BCR)的下調等。所述效應物功 能通常需要Fc區與結合區域(例如抗體可變域)結合，可以利用本領域公知的多種評估此 類抗體效應物功能的測定法對其所述效應物功能進行評價。「天然序列Fc區，，包括與在自然界發現的Fc區的胺基酸序列相同的胺基酸序列。「變異Fc區」包括由於至少一個胺基酸修飾而與天然序列Fc區的胺基酸序列不同 的胺基酸序列。優選地，與天然序列Fc區或與親本多肽的Fc區相比，變異Fc區有至少一個 胺基酸取代，例如在天然序列Fc區或親本多肽的Fc區中有約1個至約10個胺基酸取代， 優選約1個至約5個胺基酸取代。本說明書中變異Fc區優選將與天然序列Fc區和/或與 親本多肽的Fc區具有至少約80%序列同一性，最優選與之有至少約90%序列同一性，更優 選與之有至少約95%序列同一性。「抗體依賴性細胞介導的細胞毒性」和「ADCC」指的是一種細胞介導的反應，其中表 達Fc受體(FcR)的非特異性細胞毒性細胞(例如天然殺傷(NK)細胞、中性白細胞和巨噬 細胞)識別結合在靶細胞上的抗體，隨後引起靶細胞的裂解。主要的介導ADCC的細胞，即 NK細胞，僅表達Fc yRIII，而單核細胞表達Fc yRI、FcyRII和FcyRIII。FcR在造血細
15胞上的表達在 Ravetch andKinet, Annu. Rev. Immunol. 9 :457_92 (1991)第 464 頁表 3 中概 述。為了評價感興趣的分子的ADCC活性，可進行體外ADCC測定，例如美國專利5，500，362 或5，821，337中所描述的。對於所述測定有用的效應細胞包括外周血單核細胞(PBMC)和 天然殺傷(NK)細胞。或者/另外，感興趣的分子的ADCC活性可在體內加以評價，例如在動 物模型中，如在 Clynes et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95:652-656(1998)中公開的。「人效應細胞」是表達一種或多種FcR、並發揮效應物功能的白細胞。優選地，所述 細胞至少表達Fc yRIII，發揮ADCC效應物功能。介導ADCC的人白細胞的實例包括外周血 單個核細胞(PBMC)、天然殺傷(NK)細胞、單核細胞、細胞毒T淋巴細胞和中性粒細胞；優選 PBMC和NK細胞。所述效應細胞可從其天然來源，例如從血液或本說明書中所述的PBMC中 分離。術語「Fc受體」和「FcR」用來描述與抗體Fc區結合的受體。優選的FcR是天然 序列人FcR。此外，優選的FcR是結合IgG抗體的FcR(y受體)，包括Fc y RI、Fc y RII和 FcyRIII亞類的受體，包括這些受體的等位變體或者可變剪接形式。Fc y RII受體包括 FcyRIIA( 「活化受體」)和FcyRIIB( 「抑制受體」)，它們具有相似的胺基酸序列，區別主 要在其胞質區。活化受體FcyRIIA在其胞漿區包含免疫受體酪氨酸活化基序(ITAM)。抑 制受體Fc y RIIB在其胞質區包含免疫受體酪氨酸抑制基序(ITIM)(綜述於Daeron，Armu. Rev. Immunol. 15 :203_234 (1997))。FcRs綜述於Ravetch and Kinet,Annu. Rev. Immunol. 9 457-92(1991) ；Capel et al. Immunomethods 4:25—34(1994)；以及 de Haas et al. J. Lab. Clin. Med. 126 =330-41(1995)。其他FcR，包括未來將被鑑定的那些，都包括在本說明書的 術語「FcR」中。該術語還包括新生兒受體FcRn，其負責母體IgGs轉移至胎兒(Guyer et al. J. Immunol. 117 587(1976) ；and Kim et al. J. Immunol. 24 :249(1994))。本說明書中「百分比(％ )胺基酸序列同一性」定義為以獲得最大百分比序列 同一性為目的將候選序列與某個選定序列比對並且視必要引入缺口之後，候選序列中與 選定序列中的胺基酸殘基相阿的胺基酸殘基的百分比，同時不將任何保守置換視為序列 同一性的一部分。為了確定百分比胺基酸序列同一性，可以以本領域技術內的多種方式 實現比對，例如，利用公眾可獲取的計算機軟體，如BLAST、BLAST-2、ALIGN、ALIGN-2或 Megalign(DNASTAR)軟體。本領域技術人員可確定用於測定比對的適當參數，包括實現 覆蓋所比較序列全長的最大比對所需的任何算法。但為了本說明書的目的，如下文所述， 利用序列比較電腦程式ALIGN-2獲得百分比胺基酸序列同一性值。ALIGN-2序列比較 電腦程式由Genentech，Inc編寫，已經以用戶文檔提交到美國版權局(U. S. Copyright Office)，Washington D. C.，20559，其登記為美國版權登記號第TXU510087號，公眾可通過 Genentech, Inc.，South San Francisco，Calif 獲得。所述 ALIGN-2 程序應被編譯用在 UNIX 作業系統上，優選數字UNIX V4.0D。所有序列比較參數由ALIGN-2程序設定，不會改變。
為了本說明書中的目的，給定胺基酸序列A對、與、或針對給定胺基酸序列B的百 分比胺基酸序列同一性(或者可表述為，具有或包含對、與、或針對給定胺基酸序列B的 特定百分比胺基酸同一性的給定胺基酸序列A)可如下計算百分比胺基酸序列同一性= 100*X/Y其中X是在用序列比對程序ALIGN-2作出的A和B的比對中，被該程序記為同一性 匹配的胺基酸殘基數目，Y是B中胺基酸殘基的總數。應了解，在胺基酸序列A的長度不等 於胺基酸序列B的長度的情況下，A對B的百分比胺基酸序列同一性將不等於B對A的百分比胺基酸序列同一性。「多肽鏈」是這樣的多肽其中所述多肽的每個結構域是通過肽鍵，而不是通過非 共價相互作用或二硫鍵，與其他結構域連接的。「分離的」多肽是已經被鑑定並且從其天然環境的組分中分離和/或回收得到的多 肽。其天然環境的汙染組分是會干擾多肽的診斷或治療應用的物質，可能包括酶、激素和其 他蛋白質或非蛋白質溶解物。在優選的實施方案中，所述多肽將被純化成(1)用Lowry法 測定為超過95% (按重量)，最優選超過99% (按重量)，的多肽；(2)足夠使用旋轉杯序 列分析儀測到N末端或內部胺基酸序列的至少15個殘基的程度；或者(3)在還原或非還原 條件下SDS-PAGE，利用考馬斯藍，或優選銀染，表現為均一。分離的多肽包括重組細胞內的 原位多肽，因為多肽天然環境的至少一種組分將不存在。但是，分離的多肽通常將通過至少 一個純化步驟來製備。靶標還可以是所述靶標的片段。因此靶標還是能夠誘導免疫應答的所述靶標的片 段。靶標還是所述靶標的能夠與針對全長靶標的單結構域抗體結合的片段。本說明書中使用的片段，指小於序列的100% (如99%、90%、80%、70%、60%、 50%、40%、30%、20%、10%等)，但包括5個、6個、7個、8個、9個、10個、12個、13個、14 個、15個、16個、17個、18個、19個、20個、21個、22個、23個、24個、25個或更多個胺基酸。 片段有足夠的長度，使得感興趣的相互作用以1 X 10_6M或更好的親和力得以維持。本說明書中使用的片段還指任選的一個或多個胺基酸的插入、刪除和置換，這些 插入、刪除和置換基本上不改變靶標與針對野生型靶標的單結構域抗體的結合能力。氨基 酸插入、刪除或置換的數目優選最多達1個、2個、3個、4個、5個、6個、7個、8個、9個、10個、 11個、12個、13個、14個、15個、16個、17個、18個、19個、20個、21個、22個、23個、24個、 25個、26個、27個、28個、29個、30個、31個、32個、33個、34個、35個、36個、37個、38個、 39個、40個、41個、42個、43個、44個、45個、46個、47個、48個、49個、50個、51個、52個、 53個、54個、55個、56個、57個、58個、59個、60個、61個、62個、63個、64個、65個、66個、 67個、68個、69個或70個胺基酸。「可誘導細胞死亡(induces cell death) 」的本發明蛋白質是可導致活細胞變成 無活力細胞的蛋白質。所述細胞通常是表達蛋白質所結合抗原的細胞，特別是在細胞過 表達抗原的情況下。優選地，所述細胞是癌細胞，例如乳腺、卵巢、胃、子宮內膜、唾液腺、 肺、腎、結腸、甲狀腺、胰腺或膀胱細胞。在體外，所述細胞可以是SKBR3、BT474、Calu 3、 MDA-MB453、MDA-MB-361或SK0V3細胞。可在體外無補體和免疫效應細胞存在下測定細胞 死亡，以區分由抗體依賴性細胞介導的細胞毒性(ADCC)或補體依賴性細胞毒性(CDC)誘導 的細胞死亡。因此，可利用熱滅活血清(即在無補體存在下)和在無免疫效應細胞存在下 進行細胞死亡測定。為了確定本發明的蛋白質是否能夠誘導細胞死亡，可以以未處理細胞 為參照，通過碘化丙啶(PI)、錐蟲藍(參見Moore et al. Cytotechnology 17:1-11(1995)) 或7AAD的吸收來評估膜完整性的喪失。本發明的「可誘導細胞凋亡(「induces apoptos)」的蛋白質是誘導程序性細 胞死亡的蛋白質，通過結合凋亡相關分子或事件來確定，所述分子或事件例如膜聯蛋白 V(annexin V)、DNA碎片、細胞皺縮、內質網膨脹、細胞破碎，和/或囊泡(稱為凋亡小體) 形成。所述細胞是表達所述蛋白質與之結合的抗原的細胞，還可以是過表達該抗原的細
17胞。所述細胞可以是腫瘤細胞，例如乳腺、卵巢、胃、子宮內膜、唾液腺、肺、腎、結腸、甲狀 腺、胰腺或膀胱細胞。在體外，所述細胞可以是SKBR3、BT474、Calu 3細胞、MDA-MB453、 MDA-MB-361或SK0V3細胞。可利用多種方法評估與凋亡有關的細胞事件。例如，可通過膜 聯蛋白結合測定磷脂醯絲氨酸(PS)易位；可通過本說明書實施例中公開的DNA梯狀斷裂 (DNA laddering)來估計DNA的片段化；以及依據亞二倍體細胞的任何增加來評估伴隨DNA 片段化的核/染色質凝聚。優選地，可誘導細胞凋亡的蛋白質是這樣的蛋白質利用表達本 發明蛋白質所結合的抗原的細胞進行膜聯蛋白結合測定時，相對於未經處理的細胞，該蛋 白質導致膜聯蛋白結合的約2-50倍，優選約5-50倍，最優選約10-50倍的誘導。術語「治療有效量」是指有效治療哺乳動物疾病或疾患的藥物的量。就癌症來 說，藥物的治療有效量可減少癌細胞的數量；降低腫瘤大小；抑制(即一定程度上減慢，優 選阻止)癌細胞浸潤至周圍器官中；抑制(即一定程度上減慢，優選阻止)腫瘤轉移；一 定程度上抑制腫瘤生長；和/或一定程度上緩解與疾患有關的一種或多種症狀。以藥物 可阻止癌細胞生長和/或殺死存在的癌細胞為限，藥物可以是細胞生長抑制劑和/或細胞 毒劑。對於癌症治療，體內效力可以通過，例如，評估疾病進展前時間(time to disease progression, TTP)和 / 或確定應答率(response rate, RR)來測定。術語「PK」是「藥物動力學(pharmokinetic)」的縮寫，涵蓋化合物的性質，舉例來 說包括由受試者吸收、分布、代謝和消除。「PK調節蛋白(PKmodulation protein)」是指當 與生物活性分子融合或與生物活性分子一起施用時，影響生物活性分子藥物動力學性質的 任一蛋白質或肽。PK調節蛋白的實例包括PEG，以及美國專利申請流水號11/106，415和 11/331,415中公開的人血清白蛋白(HSA)結合劑。概述本申請提供治療、預防或降低轉移嚴重性的新方法。本申請在某種程度上依 賴於一個令人驚訝的發現，即選擇性抑制VEGFR2可以降低癌症模型中轉移的發生率 (prevalence)0本說明書中所述的方法學已成功用於開發在轉移癌的治療中有用的本發明的蛋 白質，包括但不限於單結構域VEGFR-2結合性多肽，所述VEGFR-2結合性多肽來源於蛋白質 結構的至少兩個相關基團具有免疫球蛋白摺疊片的那些蛋白質和具有免疫球蛋白樣摺疊 片的那些蛋白質。轉移的治療在一個方面，本申請提供治療罹患轉移癌的患者的方法，包括施用VEGFR-2特異 性抑制劑。施用抑制劑使接受治療的患者產生統計學顯著的且臨床上有意義的改善，依據 存活時間、無進展存活(progression freesurvival)、應答率或應答持續時間來量度。在某 些實施方案中，患者罹患轉移的乳腺癌、轉移的結直腸癌或轉移的肺癌。在一些實施方案中，接受治療的患者有轉移癌發病的風險。例如，根據癌症的類 型，癌症患者可能存在高的轉移風險。施用抑制劑降低產生轉移灶的風險，降低轉移灶的數 目，或降低轉移灶的大小。適用本發明治療的癌症包括但不限於癌(carcinoma)、淋巴瘤、母細胞瘤、肉瘤以 及白血病或淋巴惡性腫瘤。所述癌症更具體的例子包括鱗狀細胞癌、肺癌(包括小細胞肺 癌、非小細胞肺癌、肺的腺癌和肺的鱗癌)、腹膜癌症、肝細胞癌症、胃癌(包括胃腸癌)、胰
18腺癌、膠質母細胞瘤、宮頸癌、卵巢癌、肝癌、膀胱癌、肝細胞瘤(hepatoma)、乳腺癌、結腸癌、 結直腸癌、子宮內膜癌或子宮癌、唾液腺癌、腎癌、肝癌(liver cancer)、前列腺癌、外陰癌、 甲狀腺癌、肝癌(h印atic carcinoma)和多種類型頭頸癌，以及B細胞淋巴瘤(包括低級/ 濾泡非何杰金氏淋巴瘤(NHL)；小淋巴細胞(SL)NHL ；中級/濾泡NHL ；中級瀰漫性NHL ；高 級成免疫細胞NHL ；高級成淋巴細胞NHL ；高級小無核裂細胞NHL(small non-cleaved cell NHL)；巨大腫瘤(bulky disease)NHL ；外套細胞淋巴瘤；愛滋病相關淋巴瘤和Waldenstrom 巨球蛋白血症)；慢性淋巴細胞白血病(CLL)；急性淋巴細胞白血病(ALL)；毛細胞白血 病；慢性成髓細胞白血病；和移植後淋巴增生性疾患(PTLD)，以及與斑痣性錯構瘤病相關 的血管增生、水腫(例如與腦瘤相關的水腫)和梅格斯症候群(Meigs' syndrome)。優 選地，所述癌症選自下組乳腺癌、結直腸癌、直腸癌、非小細胞肺癌、非何杰金氏淋巴瘤 (NHL)、腎細胞癌、前列腺癌、肝癌、胰腺癌、軟組織肉瘤、卡波西肉瘤、類癌癌(carcinoid carcinoma)、頭頸癌、黑色素瘤、卵巢癌、間皮瘤和多發性骨髓瘤。本發明的方法特別適合於 治療血管化腫瘤。在一些實施方案中，VEGFR-2特異性抑制劑的施用可抑制至少約10%、20%、 30%、40%、60%、70%、80%、90%或100%的轉移。在一些實施方案中，提供了抑制淋巴結 轉移的方法。在一些實施方案中，提供了抑制肺轉移的方法。聯合化療在其他治療性處理中，VEGFR-2抑制劑與一種或多種另外的治療劑共同施用或相 繼施用。合適的治療劑包括但不限於靶向治療劑、其他靶向生物製品，以及細胞毒劑或細胞 抑制劑。在某些情況下，將優選由同一個或單獨的治療上可接受的貯存液體配製劑的管形 瓶、注射器或其他給藥裝置施用試劑。癌症治療劑是那些旨在殺死癌細胞或限制癌細胞生長而對患者影響極小的藥劑。 因此，這樣的藥劑可利用癌細胞性質(例如代謝、血管化或細胞表面抗原呈遞)與健康宿 主細胞的任何差異。腫瘤形態學的差異是可能的介入位點例如，第二種治療劑可為抗體， 例如抗VEGF抗體，其有用於阻礙實體瘤內部的血管化，從而減慢其生長速率。其他治療 劑包括但不限於輔助劑如鹽酸格拉司瓊(granisetron HC1)，雄激素抑制劑如醋酸亮丙瑞 林(leuprolide acetate)，抗生素如多柔比星，抗雌激素藥如他莫昔芬，抗代謝藥如幹擾素 a -2a,細胞毒劑如泰素(taxol)，酶抑制劑如ras法尼醯基轉移酶抑制劑，免疫調節劑如阿 地白介素(aldesleukin)，以及氮芥衍生物如鹽酸美法侖等。在一些實施方案中，本發明提供一種增加患有轉移癌或具有轉移癌發病風險的人 類患者的存活時間的方法，包括向所述患者施以有效量的VEGFR-2特異性抑制劑和抗腫瘤 組合物，其中所述抗腫瘤組合物包含至少一種化療劑，由此，VEGFR-2特異性抑制劑和抗腫 瘤組合物共同施用可有效地增加存活時間。在一些實施方案中，本發明提供一種增加患有轉移癌或具有轉移癌發病風險的人 類患者的無進展存活的方法，包括向所述患者施以有效量的VEGFR-2特異性抑制劑和抗腫 瘤組合物，其中所述抗腫瘤組合物包括至少一種化療劑，由此，VEGFR-2特異性抑制劑和抗 腫瘤組合物共同施用可有效地增加無進展存活時間。此外，本發明提供一種治療患有轉移癌或具有轉移癌發病風險的人類患者組的方 法，包括向所述患者施以有效量的VEGFR-2特異性抑制劑和抗腫瘤組合物，其中所述抗腫
19瘤組合物包括至少一種化療劑，由此，VEGFR-2特異性抑制劑和抗腫瘤組合物共同施用可有 效地增加患者組中的應答率。還在另一方面，本發明提供一種增加患有轉移癌或具有轉移癌發病風險的人類患 者應答持續時間的方法，包括向所述患者施以有效量的VEGFR-2特異性抑制劑和抗腫瘤組 合物，其中所述抗腫瘤組合物包括至少一種化療劑，由此，VEGFR-2特異性抑制劑和抗腫瘤 組合物共同施用可有效地增加應答持續時間。可用於本發明方法的化療劑包括烷化劑類(alkylating agents)，諸如 塞替派(thiot印a)和CYTOXAN 環磷醯胺(cyclophosphamide)；磺酸烷基 酯類(alkyl sulfonates)，諸如白消安(busulfan)、英丙舒凡(improsulfan)和 哌泊舒凡(piposulfan)；氮丙啶類(aziridines)，諸如苯佐替派(benzocbpa)、卡 波醌(carboquone)、美妥替派(meturecbpa)和烏瑞替派(urecbpa)；乙撐亞胺類 (ethylenimines)禾口甲基蜜胺類(methylamelamines),包括六甲蜜胺(altretamine)、三 乙撐蜜胺(triethylenemelamine)、三乙撐磷醯胺(triethylen印hosphoramide)、三乙撐 硫代磷酉先胺(triethylenethiophosphoramide)禾口三輕甲蜜胺(trimethylolomelamine)； 番荔枝內酯類(acetogenins)(尤其是布拉他辛(bullatacin)和布拉他辛酮 (bullatacinone))；喜樹鹼(camptothecin)(包括合成類似物託泊替康(topotecan)； 苔蘚抑素(bryostatin) ；callystatin ；CC-1065 (包括其阿多來新(adozelesin)、卡折 來新(carzelesin)和比折來新(bizelesin)合成類似物)；隱藻素類(cryptophycins) (特別是隱藻素1和隱藻素8)；多拉司他汀(dolastatin) ；duocarmycin (包括合 成類似物，KW-2189 和 CB1-TM1)；艾槽塞洛素(eleutherobin) ；pancratistatin ； sarcodictyin ；海綿抑素(spongistatin)；氮芥類(nitrogen mustards),諸如苯丁酸 氮芥(chlorambucil)、萘氮芥(chlornaphazine)、膽磷醯胺(cholophosphamide)、雌莫 司汀(estramustine)、異環磷酉先胺(ifosfamide)、雙氯乙基甲胺(mechlorethamine)、 鹽酸氧氮芥(mechlorethamine oxide hydrochloride)、美法倉(melphalan)、新氮 芥(novembichin)、苯芥膽甾酉享(phenesterine)、撥尼莫司汀(prednimustine)、曲磷 胺(trofosfamide)、尿啼唆氮芥(uracil mustard)；亞硝脲類(nitrosoureas),諸如 卡莫司汀(carmustine)、氯脲菌素(chlorozotocin)、福莫司汀(fotemustine)、洛莫司 汀(lomustine)、尼莫司汀(nimustine)和雷莫司汀(ranimustine)；抗生素類，諸如烯 二炔類抗生素(enediyne)(如加利車黴素(calicheamicin)，尤其是加利車黴素y II 和加利車黴素《 II (參見例如 Agnew, Chem. Intl. Ed. Engl. 33 :183-186 (1994))；蒽環 類抗生素(dynemicin)，包括dynemicin A;雙膦酸鹽(bisphosphonates)，諸如氯屈膦 酸鹽(clodronate) ;±矣其if波黴素(esperamicin)；以及新制癌素(neocarzinostatin) 發色團和相關色蛋白烯二炔類抗生素髮色團)、阿克拉黴素(aclacinomycin)、放線 菌素(actinomycin)、氨茴黴素(anthramycin)、偶氮絲氨酸(azaserine)、博來黴素 (bleomycin)、放線菌素 C(cactinomycin)、carabicin、洋紅黴素(carminomycin)、嗜癌 黴素(carzinophilin)、色黴素(chromomycin)、方文線菌素 D(dactinomycin)、柔紅黴素 (daunorubicin)、地託比星(detorubicin)、6_ 二氮-5-氧 _L_ 正亮氨酸、ADRIAMYCIN 多柔比星(doxorubicin)(包括嗎啉代多柔比星、氰基嗎啉代多柔比星、2-吡咯代多柔 比星和脫氧多柔比星)、表柔比星(印irubicin)、依索比星(esorubicin)、伊達比星
20(idarubicin)、麻西羅黴素(marcellomycin)、絲裂黴素類(mitomycins)諸如絲裂黴素C、 黴酚酸(mycophenolic acid)、諾拉黴素(nogalamycin)、橄欖黴素(olivomycin)、培洛黴 素(peplomycin)、potfiromycin、口票呤黴素(puromycin)、三鐵阿黴素(quelamycin)、羅 多比星(rodorubicin)、鏈黑菌素(str印tonigrin)、鏈佐星(str印tozocin)、殺結核菌素 (tubercidin)、烏苯美司(ubenimex)、淨司他丁(zinostatin)、佐柔比星(zorubicin)；抗 代謝物類，諸如甲氨蝶呤和5-氟尿嘧啶(5-FU)；葉酸類似物，諸如二甲葉酸(denopterin)、 甲氨蝶呤、蝶醯三穀氨酸(pteropterin)、三甲曲沙(trimetrexate)；嘌呤類似物，諸如氟 達拉濱(fludarabine)、6-巰基嘌呤(mercaptopurine)、硫咪嘌呤(thiamiprine)、硫鳥嘌 呤(thioguanine)；嘧啶類似物，諸如安西他濱(ancitabine)、阿扎胞苷(azacitidine)、 6_氮尿苷、卡莫氟(carmofur)、阿糖胞苷(cytarabine)、雙脫氧尿苷(dideoxyuridine)、 去氧氟尿苷(doxifluridine)、依諾他濱(enocitabine)、氟尿苷(floxuridine)；雄激素 類，諸如卡魯睪酮(calusterone)、丙酸屈他雄酮(dromostanolone propionate)、表硫雄醇 (epitiostanol)、美雄燒(mepitiostane—)、辜內酉旨(testolactone)；抗腎上腺類，諸如氛 魯米特(aminoglutethimide)、米託坦(mitotane)、曲洛司坦(trilostane)；葉酸補充劑， 諸如亞葉酸(folinic acid)；醋葡醛內酯(aceglatone)；醛磷醯胺糖苷(aldophosphamide glycoside)；氨基乙酉先丙酸(aminolevulinic acid)；恩尿啼唆(eniluracil)；安口丫 唆(amsacrine) ；bestrabucil ；比生群(bisantrene)；依達曲沙(edatraxate)；地磷酉先 月安(defosfamide)；地美可辛(demecolcine)；地口丫酉昆(diaziquone) ；elfornithine ； He 利醋銨(elliptinium acetate)；埃坡黴素(印othilone)；依託格魯(etoglucid)；硝 酸鎵；羥脲(hydroxyurea)；香菇多糖(lentinan)；氯尼達明(lonidamine)；美登木素 生物喊類(maytansinoids),諸如美登素(maytansine)禾口安絲菌素(ansamitocins)； 米託月瓜月宗(mitoguazone)；米託惠酉昆(mitoxantrone)；莫喊達酉享(mopidamol) ； 二月安 硝吖啶(nitracrine)；噴司他丁 (pentostatin)；蛋氨氮芥(phenamet)；吡柔比星 (pirarubicin)；洛索惠酉昆(losoxantrone)；鬼白酸(podophyllic acid)、2_ 乙基酉先月井 (ethylhydrazide)；丙卡巴胼(procarbazine) ；pSK 多糖複合物(JHS Natural Products, Eugene, OR)；雷佐生(razoxane)；根黴素(rhizoxin)；西索菲蘭(sizofiran)；螺旋鍺 (spirogermanium)；細交鏈於包菌麗酸(tenuazonic acid)；三亞月安酉昆(triaziquone) ；2, 2'，2〃 _三氯三乙胺；單端孢菌素類(trichothecenes)(尤其是T-2毒素、疣孢菌素 (verrucarin)A、杆抱菌素(roridin) A 禾口蛇對亍菌素(anguidin))；烏拉坦(urethan)；長春 地辛(vindesine)；達卡巴嗪(dacarbazine)；甘露酉享氮芥(mannomustine) ；二溴甘露酉享 (mitobronitol) ；二漠衛矛酉享(mitolactol)；喊泊漠燒(pipobroman) ；gacytosine ；阿糖 胞苷(arabinoside) ( 「Ara_C」)；塞替派(thiotepa)；類紫杉醇(taxoids)，例如 TAX0L 紫杉醇(paclitaxel) (Bristol-Myers Squibb Oncology，Princeton，N. J.)、ABRAXANE 不 含克列莫佛(Cremophor)，白蛋白改造的納米顆粒劑型紫杉醇(American Pharmaceutical Partners, Schaumberg, Illinois)禾口 TAXOTERE 多西他塞(doxetaxel) ( Rhone -Poulenc Rorer,Antony,France)；苯丁酸氮芥(chlorambucil)；吉西他濱(gemcitabine) (GEMZAR ) ；6-硫鳥嘌呤(thioguanine)；巰基嘌呤(mercaptopurine)；甲氨蝶呤 (methotrexate)；鉬配位複合物，諸如順鉬(cisplatin)、奧沙利鉬(oxaliplatin)和卡 鉬(carboplatin)；長春鹼(vinblastine)；鉬；依託泊苷(etoposide) (VP-16)；異環磷
21醯胺(ifosfamide)；米託蒽醌(mitoxantrone)；長春新鹼(vincristine) ；NAVELBINE 長春瑞濱(vinorelbine)；能滅瘤(novantrone)；替尼泊苷(teniposide)；依達曲沙 (edatrexate)；道諾黴素(daunomycin)；氨基蝶呤(aminopterin)；希羅達(xeloda)；伊 本膦酸鹽(ibandronate)；伊立替康(irinotecan)(例如CPT-11)；拓撲異構酶抑制劑RFS 2000 ；二氟甲基鳥氨酸(DMFO)；類維A酸(retinoids)，諸如維A酸(retinoic acid)；卡培 他濱(capecitabine)；和任何上述物質的藥學可接受鹽、酸或衍生物；另外的試劑包括阿巴瑞克(abarelix)、六甲蜜胺、氨魯米特、安吖啶、阿那曲唑、安 肽、天冬醯胺酶、AZD2171 (Recentin )、卡介苗/BCG(TheraCys ，TICE )、貝伐單抗(參見 美國專利6，054，297 ；bevacizumab )、比卡魯胺、博來黴素、硼替佐米(Velcade )、布舍瑞 林、白消安、喜樹鹼、卡培他濱、卡鉬、卡莫司、西妥昔單抗(Erbitux )、苯丁酸氮芥、順鉬、克 拉屈濱、氯屈膦酸鹽、秋水仙鹼、環磷醯胺、環丙孕酮、阿糖胞苷、達卡巴嗪、放線菌素D、達沙 替尼(dasatinib)(參見美國專利6，596，746 ；Spryce 1 )、柔紅黴素、己二烯雌酚、己烯雌 酚、地塞米松、多西他賽(Taxotere )、多柔比星、Abx-EGF、埃博黴素(印othilones)、表柔 比星、厄洛替尼(Tarceva )、雌二醇、雌莫司汀、依託泊苷、依西美坦、5_氟尿嘧啶、非格司 亭、氟達拉濱、氟氫可的松、氟尿嘧啶、氟甲睪酮、氟他胺、氟維司群、吉非替尼(Iressa )、吉 西他濱(參見美國專利4，808，614 ；Gemzar )、染料木黃酮(genistein)、戈舍瑞林、羥基脲、 伊達比星、異環磷醯胺、甲磺酸伊馬替尼(參見美國專利5，521，184 ；Gleevac )、幹擾素、 伊立替康、替伊莫單抗(ibritumomab) (Zevalin ), ironotecan、伊沙匹隆(BMS-247550)、 拉帕替尼(參見美國專利6，391，874 ；Tykreb )、來曲唑、亞葉酸鈣、亮丙瑞林、左旋咪唑、 洛莫司汀、氮芥、甲羥孕酮、甲地孕酮、美法侖、巰嘌呤、美司鈉、甲氨蝶呤、絲裂黴素、米託 坦、米託蒽醌、二磷酸莫替沙尼(AMG 706)、尼魯米特、諾考達唑、奧曲肽、奧沙利鉬、紫杉 醇(Taxo 1 )、帕瑪二磷酸(pamidronate)、噴司他丁(pentostatin)、普卡黴素、卩卜菲爾鈉 (porfimer)、丙卡巴胼(procarbazine)、雷替曲塞(raltitrexed)、雷帕黴素、利妥昔單抗 (Rituxan )、索拉非尼(NexaVarTM/Bayer BAY43-9006)、鏈佐星、舒拉明、蘋果酸舒尼替尼 (參見美國專利6，573，293 ；Sutent )、他莫昔芬、temsirolimus (參見美國專利5，362，718 ； CC1-779)、替莫唑胺(參見美國專利5，260，291 ；Temodar )、替尼泊苷、睪酮、硫鳥嘌呤、塞 替派、二氯環戊二烯鈦、託泊替康、託瑞米芬、託西莫單抗(Bexxar )、曲妥珠單抗(美國專 利 5，821，337 ；Here印tin )、維 A 酸(tretinoin)、VEGF Trap (阿柏西普(aflibercept)； 製備描述於美國專利5，844，099)、長春鹼、長春新鹼、長春地辛，以及長春瑞濱、唑來膦酸 (zoledronate)0在一些實施方案中，所述抗腫瘤組合物是以氟尿嘧啶為基礎的聯合給藥方案。所 述聯合給藥方案可例如包括5-FU+亞葉酸鈣、5-FU+亞葉酸鈣+伊立替康(IFL)，或者5-FU+ 亞葉酸鈣+奧沙利鉬(F0LF0X)。化療劑的這個定義中還包括發揮調節或抑制腫瘤上激素活化作用的抗激素 劑，例如抗雌激素類和選擇性雌激素受體調節劑(SERM)，包括例如他莫昔芬(包括 NOLVADEX 他莫昔芬)、雷洛昔芬(raloxifene)、屈洛昔芬(droloxifene)、4_羥基他莫昔 芬 4-(hydroxytamoxifen)、曲沃昔芬(trioxifene)、雷洛昔芬(keoxifene)、LY117018、 奧那司酮(onapristone)和FAREST0N託瑞米芬(toremifene)；抑制芳香酶的芳香酶抑 製劑，其調節腎上腺中的雌激素生成，例如，4(5)-咪唑類、氨魯米特、MEGASE 醋酸甲地孕
22酮、AR0MASIN 依西美坦、福美斯坦(formestanie)、法倔唑、RIVIS0R 伏氯唑(vorozole)、 FEMARA 來曲唑和ARIMIDEXTM阿那曲唑；以及抗雄激素類例如氟他胺、尼魯米特、比卡魯 胺、亮丙瑞林和戈舍瑞林；還有曲沙他濱(一種1，3-二氧戊環核苷胞嘧啶類似物)；反義寡 核苷酸，特別是抑制異常細胞增殖涉及的信號通道中的基因，例如，PKC-α、Ralf和H-Ras， 的表達的那些反義寡核苷酸；核酶類(ribozyme)例如VEGF表達抑制劑(如ANGI0ZYME 核 酶)和HER2表達抑制劑；疫苗例如基因治療疫苗，如ALL0VECTIN 疫苗、LEUVECTIN 疫苗 和 VAXID 疫苗；PR0LEUKIN rIL-2 ；LURT0TECAN 拓撲異構酶 1 抑制劑；ABARELIX rmRH;W 及任何上述物質的藥學可接受鹽、酸或衍生物。用在本說明書中時，「生長抑制劑(growth inhibitory agent) 」是指可在體外和 /或體內抑制細胞生長的化合物或組合物。因此，所述生長抑制劑可以是顯著降低S期細胞 的百分比的抑制劑。所述生長抑制劑的例子包括阻礙細胞周期進展(在除S期外的地方) 的試劑，例如引起Gl期阻滯和M期阻滯的試劑。經典的M期阻滯劑包括長春藥屬(vincas) (長春新鹼和長春鹼)、TAX0L 和拓撲II抑制劑例如多柔比星、表柔比星、柔紅黴素、依託泊 苷和博來黴素。阻滯Gl的那些試劑還影響到S期阻滯，例如，DNA烷化劑如他莫昔芬、潑尼 松、達卡巴嗪、氮芥、順鉬、甲氨蝶呤、5-氟尿嘧啶和阿糖胞苷。更多信息可在The Molecular Basis of Cancer, Mendelsohn and Israel, eds. ， Chapter 1， entitled "Cell cycle regulation, oncogenes, and antineoplasticdrugs"by Murakami et al. (WB Saunders Philadelphia, 1995)，尤其是第13頁中發現。術語「細胞因子(cytokine)」是由一個細胞群釋放的、作為細胞間介質作用於另 一個細胞的蛋白質的總稱。所述細胞因子的例子有淋巴因子、單核因子和傳統的多肽激 素。細胞因子中包括生長激素例如人生長激素、N-甲硫氨醯基人生長激素，和牛生長激素； 甲狀旁腺素；甲狀腺素；胰島素；胰島素原；鬆弛素；鬆弛素原；糖蛋白激素如濾泡刺激激 素(FSH)、促甲狀腺激素(TSH)和促黃體激素(LH)；表皮生長因子；肝細胞生長因子；成纖 維細胞生長因子；催乳素；胎盤催乳激素；腫瘤壞死因子α和腫瘤壞死因子β ；副中腎管 抑制物質；小鼠促性腺素相關肽；抑制素；激活素；血管內皮生長因子；整聯蛋白；血小板 生成素(TPO)；神經生長因子如NGF-α ；血小板生長因子；轉化生長因子(TGF)如TGF-α 和TGF-β ；胰島素樣生長因子-I和胰島素樣生長因子-II ；紅細胞生成素(EPO)；骨誘 導因子；幹擾素如幹擾素-α，幹擾素-β和幹擾素-Y ；集落刺激因子(CSF)如巨噬細 胞-CSF(M-CSF)；粒細胞-巨噬細胞-CSF(GM-CSF)；以及粒細胞-CSF(G-CSF)；白細胞介素 (IL)如 IL-UIL-I α、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10、IL-11、IL-12 ； 腫瘤壞死因子如TNF- α或TNF- β ；以及其他多肽因子包括LIF和kit配體(KL)。如本說 明書中使用的，術語細胞因子包括來自天然來源或來自重組細胞培養物的蛋白質，以及天 然序列細胞因子的生物學活性的等價物。本申請中使用的術語「前藥(prodrug)」是指藥學活性物質的前體或衍生物 形式，其與母體藥物相比對腫瘤細胞的細胞毒性更小，能夠經酶活化或者轉化成更具活 性的母體形式。參見例如 Wilman，"Prodrugs in CancerChemotherapy，，Biochemical Society Transactions,14, pp.375-382,615thMeeting Belfast (1986)禾口 Stella et al. "Prodrugs :A Chemical Approach toTargeted Drug Delivery,，，Directed Drug Delivery, Borchardt et al. (ed.), pp. 247-267，Humana Press(1985)。本發明的前藥包
23括但不限於含磷酸鹽的前藥、含硫代磷酸鹽的前藥、含硫酸鹽的前藥、含肽的前藥、D-氨基 酸修飾的前藥、糖基化的前藥、含內醯胺的前藥、含任選取代的苯氧基乙醯胺的前藥或 含任選性取代的苯乙醯胺的前藥、5-氟胞嘧啶和其他5-氟尿嘧啶前藥，它們可被轉化成更 有活性而無細胞毒性的藥物。可被衍生化成前藥形式用在本發明中的細胞毒藥物的例子包 括但不限於上述那些化療劑。可在施用VEGFR-2特異性抑制劑之前、同時或之後施用一種或多種另外的治療 劑。技術人員將理解，對於每種治療劑，按某種特定順序施用可能具有優勢。同樣，技術人 員將理解，對於每種治療劑，試劑和VEGFR-2特異性抑制劑施用之間的時長將有不同。與放療和手術的聯合療法在另一方面，本發明提供一種治療患有轉移癌或具有轉移癌發病風險的患者的方 法，其包括第一種療法和第二種療法，所述第一種療法包括施用VEGFR-2特異性抑制劑，所 述第二種療法包括放射和/或手術。所述VEGFR-2特異性抑制劑的施用可在放射和/或手術之前、放射和/或手術之 後或者與放射和/或手術同時。例如，所述VEGFR-2特異性抑制劑的施用可在放射和/或 手術治療之前或之後相隔從分鐘計到以周計的時間進行。在一些實施方案中，第一種療法 和第二種療法之間的時間使得所述VEGFR-2特異性抑制劑和放射/手術仍然能對細胞發 揮有利的聯用效果。例如，可以在放射和/或手術之前少於約1小時、3小時、6小時、9小 時、12小時、18小時、24小時、48小時、60小時、72小時、84小時、96小時、108小時、或120 小時施用所述VEGFR-2特異性抑制劑。在一些實施方案中，在放射和/或手術之前不到約 9小時施用所述VEGFR-2特異性抑制劑。在一些實施方案中，在放射/手術之前不到約1 天、2天、3天、4天、5天、6天、7天、8天、9天或10天施用納米顆粒組合物(nanoparticle composition)。在一些實施方案中，在放射和/或手術之後不到約1小時、3小時、6小時、9 小時、12小時、18小時、24小時、48小時、60小時、72小時、84小時、96小時、108小時或120 小時施用所述VEGFR-2特異性抑制劑。在一些實施方案中，顯著地延長治療時間可能是理 想的，其中所述兩種療法之間歷時數日至數周。本說明書中預期的放射包括例如y射線、X射線(外線束)，及將放射性同位素 直接投遞至腫瘤細胞。還預期了其他形式的DNA損傷因素，例如還預期子微波和紫外線照 射。放射線可以單劑量給予，或者按照劑量分次方案分成一系列小劑量給予。本說明書 中涉及的放射線的量從約IGy至約lOOGy，包括例如約5Gy至約80Gy、約IOGy至約50Gy， 或者約10Gy。總劑量可以以分次方案施用。例如，所述方案可以包括多次2Gy的單劑量 (fractionated individual doses of 2Gy)。放射性同位素的劑量範圍差別很大，取決於 同位素的半衰期以及所發射的放射線的強度和類型。當所述放射線包括應用放射性同位素時，可使所述同位素與靶向試劑偶聯。靶向 試劑，例如治療性抗體，攜帶所述放射性核素至靶組織。合適的放射性同位素包括但不限於
砹 21V4 碳、51 鉻、36 氯、58 鈷、銅67、152 銪、鎵67、3 氫、碘123、碘(131、銦 1V7 鐵、59 鐵、32 磷、錸186、 75硒、35硫、鎝99和/或釔9°。在一些實施方案中，對個體施加足夠的放射，使實現相同程度的治療所需的 VEGFR-2特異性抑制劑的正常劑量降低至少約5%、10%、20%、30%、50%、60%、70%、 80%、90%或更多。在一些實施方案中，施用足夠的VEGFR-2特異性抑制劑，使實現相同程
24度的治療所需的放射的正常劑量降低至少約5 %、10 %、20 %、30 %、50 %、60 %、70 %、80 %、
90 %或更多。在一些實施方案中，與各自單獨應用時相應的正常劑量相比，VEGFR-2特異性 抑制劑和放射線兩者的劑量都降低。在一些實施方案中，聯合施用VEGFR-2特異性抑制劑和放射治療產生超疊加作 用。在一些實施方案中，VEGFR-2特異性抑制劑施用一次，放射線以每日一次SOGy應用5 次。本說明書中所述手術包括切除術，其中所有或部分癌組織被物理性移除、切除 (exercise)和/或破壞。腫瘤切除術是指物理性移除至少部分腫瘤。除腫瘤切除術外，手 術治療包括雷射手術、冷凍手術、電外科手術和顯微鏡控制手術(Mohs surgery)。還涉及體 表手術移除初期癌或正常組織。除了施用化療劑外，還可以進行放療和/或手術。例如，可以首先向個體施以含紫 杉烷的納米顆粒組合物和至少一種其他化療劑，隨後對個體進行放療和/或手術。或者，可 以首先用放療和/或手術來治療個體，隨後向其施以納米顆粒組合物和至少一種其他化療 劑。其他組合也在考慮之內。在一個實施方案中，本發明可用於增加對易患轉移癌或被診斷為轉移癌的人類患 者的存活時間。存活時間(duration of survival)定義為自首次施用藥物起至死亡的時 間。在一個優選的方面，向人類患者聯合施用VEGFR-2特異性抑制劑與一種或多種化療劑， 從而使患者的存活時間與單獨化療相比有效增加。例如，用VEGFR-2特異性抑制劑與至少 兩種，優選3種化療劑的化療雞尾酒聯合治療的患者組可有至少2個月，優選約2個月至約 5個月的中值存活期，比單獨用相同的化療雞尾酒治療的患者組的中值存活期長，該增加是 統計學顯著的。存活時間還可以通過治療組與對照組的分層危害比(HR)來測定，其代表患 者在治療期間死亡的風險。優選地，與單獨化療相比，VEGFR-2特異性抑制劑與一種或多種 化療劑的聯合治療將死亡風險顯著地降低至少約30% ( S卩，分層HR約0. 70)，優選至少約 35% (即，分層 HR 約 0.65)。在另一個實施方案中，本發明提供用於增加易患轉移癌或被診斷為轉移癌的人
皿(progression free survival)白勺力夕去。皿IlfBi(time to disease progression)定義為從施用藥物起直至疾病進展的時間。在一個優選的實施方案 中，本發明的利用VEGFR-2特異性抑制劑和一種或多種化療劑的聯合治療，與單獨用化學 療法治療相比，使無進展存活時間顯著地增加至少約2個月，優選約2個月至約5個月。在另一個實施方案中，本發明的治療顯著增加用多種治療劑治療的易患轉移癌或 被診斷為轉移癌的人類患者組中的應答率。應答率定義為對治療有應答的受治療患者的百 分比。在一個方面，本發明的利用VEGFR-2特異性抑制劑和一種或多種化療劑的聯合治療， 與單獨用用化學療法治療組相比，顯著地增加治療患者組的應答率，所述增加的卡方P值 小於0. 005。在一個方面，本發明提供增加易患癌症或被診斷為癌症的人類患者或人類患者組 中應答持續時間的方法。應答持續時間定義為從初始應答至疾病進展的時間。在本發明的 利用VEGFR-2特異性抑制劑和一種或多種化療劑的聯合治療中，應答持續時間統計學上顯 著地增加至少2個月是可以達到的，並且是優選的。VEGFR-2特異性抑制劑
25
如美國專利申請流水號11/482，641、11/448，171和PCT國際申請公開號WO 05/056764所述製備了 VEGFR-2特異性抑制劑，本文援引併入這些文獻。這些抑制劑於美國 臨時專利申請流水號60/899，094中有進一步描述，本文援引併入該文獻。可用於本發明的優選的VEGFR-2結合性kiFM多肽的序列如下SEQ ID NO 2VSDVPRDLEVVAATPTSLLISWRHPHFPTRYYRITYGETGGNSPVQEFTVPLQPPTATISGLKPGVDYT ITVYAVTEGPNERSLFIPISINYRTSEQ ID NO 3EVVAATPTSLLISWRHPHFPTRYYRITYGETGGNSPVQEFTVPLQPPTATISGLKPGVDYTITVYAVTE GPNERSLFIPISINYRTSEQ ID NO 4GEVVAATPTSLLISWRHPHFPTRYYRITYGETGGNSPVQEFTVPLQPPTATISGLKPGVDYTITVYAVT DGRNGRLLSIPISINYRTEIDKPCQSEQ ID NO 5EVVAATPTSLLISWRHPHFPTRYYRITYGETGGNSPVQEFTVPLQPPTATISGLKPGVDYTITVYAVTD GRNGRLLSIPISINYRTSEQ ID NO 6EVVAATPTSLLISWRHPHFPTRYYRITYGETGGNSPVQEFTVPLQPPTATISGLKPGVDYTITGYAVTM GLYGHELLTPISINYRTSEQ ID NO 7 EVVAATPTSLLISffRHPHFPTRYYRITYGETGGNSPVQEFTVPLQPPTATISGLKPGVDYTITGYAVTD GENGQFLLVPISINYRTSEQ ID NO 8EVVAATPTSLLISWRHPHFPTRYYRITYGETGGNSPVQEFTVPLQPPTATISGLKPGVDYTITGYAVTM GPNDNELLTPISINYRTSEQ ID NO 9EVVAATPTSLLISWRHPHFPTRYYRITYGETGGNSPVQEFTVPLQPPTATISGLKPGVDYTITGYAVTA GffDDHELFIPISINYRTSEQ ID NO: 10EVVAATPTSLLISffRHPHFPTRYYRITYGETGGNSPVQEFTVPLQPPTATISGLKPGVDYTITGYAVTS GHNDHMLMIPISINYRTSEQ ID NO: 11EVVAATPTSLLISWRHPHFPTRYYRITYGETGGNSPVQEFTVPLQPPTATISGLKPGVDYTITGYAVTA GYNDQILMTPISINYRTSEQ ID NO: 12EVVAATPTSLLISWRHPHFPTRYYRITYGETGGNSPVQEFTVPLQPPTATISGLKPGVDYTITGYAVTF GLYGKELLIPISINYRTSEQ ID NO: 13EVVAATPTSLLISWRHPHFPTRYYRITYGETGGNSPVQEFTVPLQPPTATISGLKPGVDYTITGYAVTT
26GPNDRLLFVPISINYRTSEQ ID NO: 14EVVAATPTSLLISWRHPHFPTRYYRITYGETGGNSPVQEFTVPLQPPTATISGLKPGVDYTITGYAVTD VYNDHEIKTPISINYRTSEQ ID NO: 15EWAATPTSLLISWRHPHFPTRYYRITYGETGGNSPVQEFTVPLQPPTATI SGLKPGVDYT I TGYAVTD GKDGRVLLTPISINYRTSEQ ID NO: 16EWAATPTSLLISWRHPHFPTRYYRITYGETGGNSPVQEFTVPLQPPTATI SGLKPGVDYT ITGYAVTE VHHDREIKTPISINYRTSEQ ID NO: 17 EVVAATPTSLLISffRHPHFPTRYYRITYGETGGNSPVQEFTVPLQPPTATISGLKPGVDYTITGYAVTQ APNDRVLYTPISINYRTSEQ ID NO: 18EVVAATPTSLLISWRHPHFPTRYYRITYGETGGNSPVQEFTVPLQPPTATISGLKPGVDYTITGYAVTR EENDHELLIPISINYRTSEQ ID NO: 19EVVAATPTSLLISWRHPHFPTRYYRITYGETGGNSPVQEFTVPLQPPTATISGLKPGVDYTITGYAVTV THNGHPLMTPISINYRTSEQ ID NO:20EVVAATPTSLLISffRHPHFPTRYYRITYGETGGNSPVQEFTVPLQPPTATISGLKPGVDYTITGYAVTL ALKGHELLTPISINYRTSEQ ID NO 21VSDVPRDLEVVAATPTSLLISWRHPHFPTRYYRITYGETGGNSPVQEFTVPLQPPTATISGLKPGVDYT ITGYAVTVAQNDHELITPISINYRTSEQ ID NO:22 VSDVPRDL/QEVVAATPTSLLISWRHPHFPTRYYRITYGETGGNSPVQEFTVPLQPPAATISGLKPGVD YTITGYAVTMAQSGHELFTPISINYRTSEQ ID NO:24EVVAATPTSLLISWRHPHFPTRYYRITYGETGGNSPVQEFTVPLQPPTATISGLKPGVDYTITGYAVTV ERNGRVLMTPISINYRTSEQ ID NO:25EVVAATPTSLLISWRHPHFPTRYYRITYGETGGNSPVQEFTVPLQPPTATISGLKPGVDYTITGYAVTV ERNGRHLMTPISINYRTSEQ ID NO:26EVVAATPTSLLISWRHPHFPTRYYRITYGETGGNSPVQEFTVPLQPPTATISGLKPGVDYTITGYAVTL ERNGRELMTPISINYRTSEQ ID NO:27EVVAATPTSLLISWRHPHFPTRYYRITYGETGGNSPVQEFTVPLQPPTATISGLKPGVDYTITGYAVTE
27ERNGRTLRTPISINYRT
SEQ ID NO:28 EVVAATPTSLLISffRHPHFPTRYYRITYGETGGNSPVQEFTVPLQPPTATISGLKPGVDYTITGYAVTV ERNDRVLFTPISINYRTSEQ ID NO:29EVVAATPTSLLISWRHPHFPTRYYRITYGETGGNSPVQEFTVPLQPPTATISGLKPGVDYTITGYAVTV ERNGRELMTPISINYRTSEQ ID NO:30EVVAATPTSLLISWRHPHFPTRYYRITYGETGGNSPVQEFTVPLQPPTATISGLKPGVDYTITGYAVTL ERNGRELMVPISINYRTSEQ ID NO 31EVVAATPTSLLISWRHPHFPTRYYRITYGETGGNSPVQEFTVPLQPPTATISGLKPGVDYTITGYAVTD GRNDRKLMVPISINYRTSEQ ID NO:32EVVAATPTSLLISWRHPHFPTRYYRITYGETGGNSPVQEFTVPLQPPTATISGLKPGVDYTITGYAVTD GQNGRLLNVPISINYRTSEQ ID NO:33 EVVAATPTSLLISWRHHPHFPTRYYRITYGETGGNSPVQEFTVPLQPPTATISGLKPGVDYTTTGYAVT VHWNGRELMTPISINYRTSEQ ID NO:34EVVAATPTSLLISWRHPHFPTRYYRITYGETGGNSPVQEFTVPLQPPTATISGLKPGVDYTITGYAVTE EffNGRVLMTPISINYRTSEQ ID NO:35EVVAATPTSLLISWRHPHFPTRYYRITYGETGGNSPVQEFTVPLQPPTATISGLKPGVDYTITGYAVTV ERNGHTLMTPISINYRTSEQ ID NO:36EVVAATPTSLLISWRHPHFPTRYYRITYGETGGNSPVQEFTVPLQPPTATISGLKPGVDYTITGYAVTV EENGRQLMTPISINYRTSEQ ID NO:37EVVAATPTSLLISWRHPHFPTRYYRITYGETGGNSPVQEFTVPLQPPTATISGLKPGVDYTITGYAVTL ERNGQVLFTPISINYRTSEQ ID NO:38 EVVAATPTSLLISffRHPHFPTRYYRITYGETGGNSPVQEFTVPLQPPTATISGLKPGVDYTITGYAVTV ERNGQVLYTPISINYRTSEQ ID NO:39EVVAATPTSLLISWRHPHFPTRYYRITYGETGGNSPVQEFTVPLQPPTATISGLKPGVDYTITGYAVTff GYKDHELLIPISINYRTSEQ ID NO:40EVVAATPTSLLISWRHPHFPTRYYRITYGETGGNSPVQEFTVPLQPPTATISGLKPGVDYTITGYAVTL
28GRNDRELLTPISINYRTSEQ ID NO 41EVVAATPTSLLISWRHPHFPTRYYRITYGETGGNSPVQEFTVPLQPPTATISGLKPGVDYTITGYAVTD GPNDRLLNIPISINYRTSEQ ID NO 42EVVAATPTSLLISWRHPHFPTRYYRITYGETGGNSPVQEFTVPLQPPTATISGLKPGVDYTITGYAVTF ARDGHEILTPISINYRTSEQ ID NO 43 EVVAATPTSLLISWRHPHFPTRYYRITYGETGGNSPVQEFTVPLQPPTATISGLKPGVDYTITGYAVTL EQNGRELMTPISINYRTSEQ ID NO 44EVVAATPTSLLISWRHPHFPTRYYRITYGETGGNSPVQEFTVPLQPPTATISGLKPGVDYTITGYAVTV EENGRVLNTPISINYRTSEQ ID NO 45EVVAATPTSLLISWRHPHFPTRYYRITYGETGGNSPVQEFTVPLQPPTATISGLKPGVDYTITGYAVTL EPNGRYLMVPISINYRTSEQ ID NO 46EVVAATPTSLLISWRHPHFPTRYYRITYGETGGNSPVQEFTVPLQPPTATISGLKPGVDYTITGYAVTE GRNGRELFIPISINYRTSEQ ID NO 47VSDVPRDLEVVAATPTSLLISWRHPHFPTRYYRITYGETGGNSPVQEFTVPLQPPAATISGLKPGVDYT ITGYAVTffERNGRELFTPISINYRTSEQ ID NO:48 VSDVPRDLEVVAATPTSLLISWRHPHFPTRYYRITYGETGGNSPVQEFTVPLQPPAATISGLKPGVDYT ITGYAVTKERNGRELFTPISINYRTSEQ ID NO:49VSDVPRDLEVVAATPTSLLISWRHPHFPTHYYRITYGETGGNSPVQEFTVPLQPPAATISGLKPGVDYT ITGYAVTTERTGRELFTPISINYRTSEQ ID NO:50VSDVPRDLEVVAATPTSLLISWRHPHFPTHYYRITYGETGGNSPVQEFTVPLQPPAATISGLKPGVDYT ITGYAVTKERSGRELFTPISINYRTSEQ ID NO 51VSDVPRDLEVVAATPTSLLISWRHPHFPTHYYRITYGETGGNSPVQEFTVPLQPPAATISGLKPGVDYT ITGYAVTLERDGRELFTPISINYRTSEQ ID NO:52VSDVPRDLEVVAATPTSLLISWRHPHFPTRYYRITYGETGGNSPVQEFTVPLQPPLATISGLKPGVDYT ITG/VYAVTKERNGRELFTPISINYRTSEQ ID NO 53VSDVPRDLEVVAATPTSLLISWRHPHFPTRYYRITYGETGGNSPVQEFTVPLQPTTATISGLKPGVDYT
29ITGYAVTffERNGRELFTPISINYRTSEQ ID NO 54VSDVPRDLEVVAATPTSLLISWRHPHFPTRYYRITYGETGGNSPVQEFTVPLQPTVATISGLKPGVDYT ITGYAVTLERNDRELFTPISINYRTSEQ ID NO 55MGEVVAATPTSLLISffRHPHFPTRYYRITYGETGGNSPVQEFTVPLQPPTATISGLKPGVDYTITVYAV TDGRNGRLLSIPISINYRTEIDKPSQSEQ ID NO 56MGEVVAATPTSLLISffRHPHFPTRYYRITYGETGGNSPVQEFTVPLQPPTATISGLKPGVDYTITVYAV TDGRNGRLLSIPISINYRTEIDKPCQSEQ ID NO 57MVSDVPRDLEVVAATPTSLLISWRHPHFPTRYYRITYGETGGNSPVQEFTVPLQPPTATISGLKPGVDY TITVYAVTDGRNGRLLSIPISINYRTEIDKPSQSEQ ID NO 58MGEVVAATPTSLLISffRHPHFPTRYYRITYGETGGNSPVQEFTVPLQPPTATISGLKPGVDYTITVYAV TDGffNGRLLSIPISINYRTSEQ ID NO 59MGEVVAATPTSLLISffRHPHFPTRYYRITYGETGGNSPVQEFTVPLQPPTATISGLKPGVDYTITVYAV TEGPNERSLFIPISINYRTSEQ ID NO 60MVSDVPRDLEVVAATPTSLLISWRHPHFPTRYYRITYGETGGNSPVQEFTVPLQPPTATISGLKPGVDY TITVYAVTEGPNERSLFIPISINYRT本發明的蛋白質包含本文所公開的胺基酸序列，其中前8個胺基酸缺失，可能在N 末端或C末端包含額外的胺基酸。例如，N末端可以具有額外的MG序列。所述M通常將被 剪切掉，在N末端留下GEV...序列。將這8個正常的胺基酸重新添加到N末端也可產生具 有所需性質的VEGFR-2結合蛋白。在一些實施方案中，N末端甲硫氨酸被剪切掉。為了體 內應用，可產生適合於聚乙二醇化的形式。在一個實施方案中，可添加包含半胱氨酸的C末 端尾巴(例如，在C末端添加EIDKPCQ(SEQ ID N0:61))。附加的蛋白質實施方案可用在本發明方法中的蛋白質包括本說明書中所述的單結構域多肽，通常為與靶 標，例如VEGFR-2，結合的多肽，且其中靶結合活性位於單個結構域內，這一點區別於例如抗 體和單鏈抗體_抗體和單鏈抗體中抗原結合活性通常由重鏈可變區和輕鏈可變區二者提 供。本文的公開還提供可包含與靶標結合的單結構域多肽的更大的蛋白。例如，可將多個 單結構域多肽連接，以產生親合力更高或多價的複合分子。而且，可將單結構域多肽搭接到 (例如作為融合蛋白)任何數目的其他多肽上。在某些方面，單結構域多肽可包括分布在至 少兩個β摺疊片中的至少5-7條β鏈或類β鏈，例如免疫球蛋白和免疫球蛋白樣結構域。 類β鏈是一串胺基酸(a string of aminoacids)，它參與單結構域多肽的穩定作用，但並 不一定採取β鏈構象。關於類β鏈是否參與蛋白質的穩定作用，可以通過刪除該串或者 改變該串的序列，再分析蛋白質穩定性是否降低來加以估計。對於穩定性，可以例如通過熱
30變性和復性研究來估計。優選地，單結構域多肽將包括不超過兩條類β鏈。類β鏈通常 將不採取α螺旋構象，但可採取無規捲曲結構。在免疫球蛋白結構域或免疫球蛋白樣結構 域的情況下，類β鏈最常出現在結構中本應由最靠N末端的β鏈或最靠C末端的β鏈佔 據的位置。如果某個胺基酸串位於蛋白質序列的內部時通常會形成β鏈，當其位於更靠近 N末端或C末端的位置時，可採取不明顯為β鏈的構象，在本說明書中稱之為類β鏈。在某些實施方案中，本文的公開提供與VEGFR-2結合的單結構域多肽。優選地，所 述單結構域多肽與人VEGFR-2或模型物種的VEGFR-2結合。單結構域多肽可包括具有如下 結構組織的約80個至約150個胺基酸，所述結構組織包括分布在至少兩個β摺疊片之間 的至少7條β鏈或類β鏈，以及至少一個連接兩條β鏈或類β鏈的環部分，所述環部分 參與結合VEGFR-2。換言之，環部分可連接兩條β鏈、兩條類β鏈或者連接一條β鏈與 一條類β鏈。通常，有一個或多個環部分將參與VEGFR-2結合，但有可能一個或多個β鏈 或類β鏈部分也將參與VEGFR-2結合，特別是最靠近環部分的那些β鏈或類β鏈部分。 單結構域多肽可包含免疫球蛋白結構域或免疫球蛋白樣結構域作為結構單位。單結構域多 肽可與VEGFR-2的任一部分結合，但優選與VEGFR-2胞外域結合的多肽。結合可以用平衡 常數(例如解離常數，Kd)和動力學常數(例如開啟速率(on rate)常數，k。n和關閉速率 (offrate)常數，k。ff)來評價。通常將選擇單結構域多肽使其與VEGFR-2結合的Kd小於約 1(Γ6Μ，或小於1(Γ7Μ，約5Χ 1(Γ8Μ，約ICT8M或小於約1(T9M。VEGFR-2結合性多肽可與VEGF家 族的一個或兩個或更多個成員(特別是VEGF-A、VEGF-C和/或VEGF-D)競爭結合，並可抑 制一種或多種VEGFR-2介導的生物學事件，例如癌細胞增殖和癌症轉移。VEGFR-2結合性多 肽可用於治療學目的，還可用於與VEGFR-2的檢測或結合有關的任何目的。用於治療應用 的多肽通常Kd將小於5X 10_8M、小於10_8M或小於10_9M，但在k。ff足夠低或k。n足夠高的情 況下可容忍更高的Kd值。在某些實施方案中，所述單結構域多肽包括免疫球蛋白(Ig)可變區。所述Ig可 變區可例如選自下組人\域、人Vh域和駱駝Vhh域。Ig可變域的一個、兩個、三個或更多 個環可參與結合VEGFR-2，通常地，稱作CDR1、CDR2或CDR3的任一個環將參與VEGFR-2結
口 O在某些實施方案中，所述單結構域多肽包括免疫球蛋白樣結構域。所述免疫球蛋 白樣結構域的一個、兩個、三個或更多個環可參與結合VEGFR-2。優選的免疫球蛋白樣結構 域為III型纖連蛋白(Fn3)結構域。所述結構域可包括，按從N末端至C末端的順序β鏈 或類β鏈，A ；環，AB ； β鏈，B ；環，BC； β鏈C ；環CD ； β鏈D ；環DE ； β鏈F ；環TO ；以及 β鏈或類β鏈G。任選地，環AB、BC、CD、DE、EF和TO中任一個或全部可參與VEGFR-2結合，但優選 的環為BC、DE和TO。優選的Fn3結構域為衍生自人纖連蛋白的Fn3結構域，特別是纖連蛋 白的第十個Fn3結構域，稱作uiFr^tj應當注意，本說明書中公開的任何VEGFR-2結合性多 肽的胺基酸序列都不與天然wFM相同；所述序列已經過修飾以獲得VEGFR-2結合蛋白，但 是，本文中仍然把具有kiFM的基本結構特徵的蛋白質，特別是那些保留對天然kiFM可識別 的序列同源性的蛋白質在本說明書中稱作「卞113多肽」。該命名法與抗體領域中的某些情 況類似，例如其中針對特定靶蛋白產生的重組抗體\域可能與任何天然存在的\域都不相 同，但是蛋白質可公認為\蛋白。kiFM多肽可與SEQ ID NO 1中顯示的人kiFM結構域有
31至少60%、65%、70%、75%、80%、85%或90%同一性。大部分的變異會在於一個或多個環 中發生。wFM多肽的每條β鏈或類β鏈可基本上由與SEQ ID NO 1的相應β鏈或類β 鏈的序列有至少80 %、85 %、90 %、95 %或100 %同一性的胺基酸序列組成，只要所述變異 不破壞多肽在生理條件下的穩定性。kiFM多肽可以在環AB、CD和EF中各自具有這樣序列， 所述序列基本上由與SEQ IDNO 1的相應環的序列有至少80%、85%、90%、95%或100%同 一性的胺基酸序列構成。在許多情況下，環BC、DE和TO中任一個或全部相對於SEQID NO 1將是低保守的。例如，環BC、DE和FG全部可能與SEQ ID NO 1中它們相應的環具有小於 20%、10%或者0%同一性。在某些實施方案中，本文的公開提供一種可與VEGFR-2結合的非抗體多肽，所述 非抗體多肽包含具有免疫球蛋白樣摺疊的結構域。所述非抗體多肽分子量可小於20kD，或 小於15kD，通常由參比蛋白或「支架」蛋白(例如Fn3支架)衍生而來(例如通過改變氨基 酸序列)。所述非抗體多肽可以以小於10_6M、或小於10_7M、小於5X 10_8M、小於10_8M或小於 10_9M的Kd結合VEGFR-2。未改變的參比蛋白或者不與VEGFR-2有意義地結合，或者結合的 Kd大於10_6M。所述非抗體多肽可抑制VEGFR-2信號，特別是在非抗體多肽Kd小於5 X 10_8M、 小於10_8M或小於10_9M的情況下，但在k。ff足夠低(例如小於5 X ICT4iT1)的情況下可容忍 更高的Kd值。所述免疫球蛋白樣摺疊可以是kiFM多肽。在某些實施方案中，本文的公開提供一種可結合VEGFR-2的多肽，所述多肽包含 具有免疫球蛋白摺疊的單個結構域。所述多肽分子量可小於20kD，或小於15kD，通常由免 疫球蛋白的可變域衍生而來(例如通過改變胺基酸序列)。所述多肽可以以小於10_6M、 或小於10_7M、小於5X 10_8M、小於IO-8M或小於ΙΟ—、的Kd結合VEGFR-2。所述多肽可抑制 VEGFR-2信號，特別是在多肽Kd小於5 X 10_8M、小於ICT8M或小於ICT9M的情況下，但在k。ff足 夠低或者k。n足夠高的情況下可容忍更高的Kd值。在某些優選實施方案中，具有衍生自免 疫球蛋白輕鏈可變域的免疫球蛋白摺疊且能夠與VEGFR-2結合的單結構域多肽可包括選 自下組的胺基酸序列表格中公開的那些胺基酸序列。在一些實施方案中，所述多肽包含與 SEQ NO :1有至少80%同一性的胺基酸序列。在一些實施方案中，所述多肽包含選自SEQID NOs 2-60中的胺基酸序列。在一些實施方案中，所述多肽進一步包含PEG。在某些優選實施方案中，本文的公開提供VEGFR-2結合性多肽，所述VEGFR-2結合 性多肽包括表格中公開的具有最理想的生物化學特徵的任一種胺基酸序列。就包含這樣的 胺基酸序列的多肽來說，可使PEG部分或其他感興趣的部分與約第85-100位(取決於蛋白 質)上的半胱氨酸共價結合。所述PEG部分還可以與多肽中胺部分共價結合。所述胺部分 可以是，例如，出現於多肽N末端的伯氨基或者胺基酸(例如賴氨酸或精氨酸)中存在的氨 基。在某些實施方案中，使PEG部分聯結在多肽上選自下組的位置a)N末端；b)N末端與最 靠近N末端的β鏈或類β鏈之間；c)位於多肽中與靶結合部位相對的面上的環；d)C末端 和最靠近C末端的β鏈或類β鏈之間；以及e) C末端。在某些方面，本文的公開提供了介導VEGFR-2結合的短肽序列。所述序列可以在 分離的形式下，或者在插入特定蛋白質結構中時，介導VEGFR-2結合，所述特定蛋白質結構 例如免疫球蛋白或免疫球蛋白樣結構域。這樣的序列的例子包括公開的那些序列(例如 SEQ ID NO 2-60)以及其他與SEQID NO 1或所述序列有至少85%、90%或95%同一性且 保留VEGFR-2結合活性的序列。因此，本文的公開提供基本上純的多肽，其包含與所述序列
32中的任一個有至少85%同一性的胺基酸序列，其中所述多肽與VEGFR-2結合，且與VEGF種 類競爭與VEGFR-2的結合。所述多肽的例子包括一種多肽，其包含與SEQ ID :2_60的氨基 酸序列有至少80%、85%、90%、95%或100%同一性的胺基酸序列。優選地，所述多肽將抑 制VEGF的生物活性，並以小於1(Γ6Μ、或小於1(ΤΜ、小於5Χ1(Γ8Μ、小於ICT8M或小於ICT9M的 Kd 與 VEGFR-2 結合。在某些實施方案中，任一種本說明書中所述的VEGFR-2結合性多肽都可以結合有 一個或多個額外的部分，這樣的部分包括，例如也可與VEGFR-2結合的部分(如另一個相 同或不同的VEGFR-2結合性多肽)、可與另一不同靶標結合(例如產生雙特異性結合試劑) 的部分、標記部分、有助於蛋白質純化的部分或者提供改善的藥動學的部分。改善的藥動學 可根據人們理解的治療需求來估計。通常，生物利用度的提高和/或給藥間隔時間的增加 是理想的，這可能通過增加給藥後蛋白質在血清中保持可利用的時間來實現。在某些情況 下，理想的是提高蛋白質的血清濃度隨時間的連續性(例如，減少施用後即刻和下一次施 用前即刻的蛋白質血清濃度的差異)。易於減慢蛋白質從血液中的清除的部分包括聚乙二 醇、糖類(如唾液酸)和耐受良好的蛋白質部分(如Fc片段或血清白蛋白)。可使單結構 域多肽與可降低哺乳動物(如小鼠、大鼠或人)體內多肽清除速率的部分聯結，該部分相對 於未修飾多肽可降低清除率超過3倍。改善的藥動學的其他衡量標準可包括血清半衰期， 血清半衰期通常分成α相和β相。兩相中任一相或兩相都可通過添加適當的部分而顯著 提高。在應用聚乙二醇的情況下，可將一個或多個PEG分子聯結在蛋白質中不同位置，所述 聯結可通過與胺、硫醇或其他適當的活性基團反應而實現。聚乙二醇化可通過定點聚乙二 醇化實現，在定點聚乙二醇化中，將適當的活性基團引入蛋白質中以產生優先發生聚乙二 醇化的位點。在優選的實施方案中，所述蛋白質經修飾，從而在希望的位置上有半胱氨酸殘 基，使得在所述半胱氨酸上進行定點聚乙二醇化成為可能。PEG的分子量可以有很大的差 別，可以是分枝的或直鏈的。值得注意的是，本文的公開已經證明，聚乙二醇化與kiFM多肽 的靶結合活性是相容的，另外，聚乙二醇化確實可改善這樣的多肽的藥動學。因此，在一個 實施方案中，本文的公開提供了 kiFM多肽的聚乙二醇化的形式，無論所述多肽可結合何種 靶標。附加的雙特異性和多特異性實施方案在許多實施方案中，製備多特異性組合物，例如結合超過一種靶標或其他感興趣 的蛋白質的組合物。在一個方面，用在本發明方法中的蛋白質包括第一種蛋白質及與其連接或搭接 的第二種蛋白質，所述第一種蛋白質與第一種期望的靶標(如VEGFR-2)的結合親和力為 約IOnM(其它適當的親和力在本文中有描述)或更低，而結合不需要的、相關的靶標(如 VEGFR-I和VEGFR-3)的結合親和力為約1 μ M(其它適當的親和力在本文中有描述)或更 高，該第一種蛋白質優選為單結構域的或基本上單價的；所述第二種蛋白與第二種期望的 靶標(例如，c-kit、Her-2、FGFR-l、VEGFR-l、VEGF-A、VEGF-C、VEGF-D、葉酸鹽受體、c-Met、 EGFR)的結合親合力約為IOnM(其它適當的親和力在本文中有描述)或更低，而結合不需要 的、相關的靶標(如人胰島素受體)的親合力為約1 μ M(其它適當的親和力在本文中有描 述)或更高，該第二種蛋白質優選為單結構域的或基本上單價的。所述有雙特異性親和力 的分子可進一步搭接於其他分子，包括本說明書中所述的其他蛋白質。
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附加的PEG實施方案在治療方法的一些實施方案中，VEGFR-2特異性抑制劑是基於纖連蛋白的支架，例 如Adnectins ，還進行半胱氨酸或賴氨酸的工程化。PEG(或功能上類似的分子)用於連接兩種蛋白質，所述兩種蛋白質是結合兩個或 多個不同靶標的非抗體部分或所需蛋白質(例如PK調節蛋白)，特別是其中每個結合蛋白 都由單個結構域或多結構域構成的蛋白質，通常其中每個結構域有約50個或約60個或約 75個胺基酸或更多(相對於5-20個胺基酸的小肽)。優選地，基於纖連蛋白的支架，例如 Adnectins ，可在所述實施方案中有利地使用，更優選還進行適當的半胱氨酸或賴氨酸工 程化。另外，VEGFR-2特異性抑制劑的非PEG方面和PEG方面包括抗體部分(例如，駱駝 抗體及其衍生物，以及單鏈和單結構域抗體；特別是由微生物表達的那些)和類抗體部分 (例如，脂籠蛋白、錨蛋白、多個Cys-Cys結構域和四連蛋白的衍生物；特別是由微生物表達 的)，特別是小於約40kD、由PEG連接的，更特別的是具有少數(limited number of)半胱 氨酸的。PEG連接蛋白具有許多性質和優點。當所述蛋白在微生物中表達時，可能優選的是 把多個結構域分離出來，並通過PEG或其他多聚物接頭將它們連接起來。PEG，或其他功能 上可操作的聚合物接頭，可用於最優地調整各個蛋白質部分之間的距離，以產生具有以下 一種或多種特性的蛋白質1)當與感興趣的蛋白質(例如靶標)結合時，減少或增加一個 或多個蛋白質結構域的結合位阻，2)連接兩個或多個結合不同靶標的結構域，3)增加蛋白 質穩定性或可溶性，而無需尋找額外的胺基酸取代來增加穩定性或可溶性(例如，至少約 20mg/mL、或至少約50mg/mL的溶解度)，4)減少蛋白質聚集，而無需尋找額外的胺基酸取代 來降低穩定性(例如，依照SEC所測定的)，5)通過增加額外的結合域來增加所述蛋白質對 感興趣的蛋白質的總親合力或親和力。PEG連接蛋白的其它優點包括取決於PEG連接蛋 白中所包括的蛋白質尋靶部分的數目，可迅速地製備單特異性、多價結合形式，以及多特異 性、單價或多價結合形式。可用於本發明方法的kiFM多肽可被聚乙二醇化，並保留配體結合活性。在一個 優選的實施方案中，聚乙二醇kiFM多肽通過定點聚乙二醇化產生，特別是通過將PEG與N 末端或C末端處的半胱氨酸部分偶聯而產生。因此，本文的公開提供具有改善的藥動學性 質的、靶標結合性的kiFM多肽，所述多肽包括有約80個至約150個胺基酸的kiFM結構 域，其中所述kiFM結構域的至少一個環參與靶標結合；以及共價結合的PEG部分，其中所述 kiFM多肽可以以小於IOOnM的Kd與靶標結合，在哺乳動物中清除速率小於30mL/hr/kg。所 述PEG部分可通過定點聚乙二醇化聯結到kiFM多肽，例如通過與半胱氨酸殘基聯結，其中 所述半胱氨酸殘基可位於kiFM多肽的N末端或在N末端和最靠近N末端的β鏈或類β 鏈之間，或者位於kiFM多肽的C末端或在C末端和最靠近C末端的β鏈或類β鏈之間。 半胱氨酸還可以位於其他位置，特別是任何不參與靶結合的環。PEG部分還可以通過其他化 學作用聯結，包括與胺偶聯。另外，本發明包括通過這種類型N末端或C末端PEG偶聯抗體 部分(例如，駱駝抗體及其衍生物，以及單鏈和單結構域抗體；特別是由微生物表達的)和 類抗體部分(例如，脂籠蛋白、錨蛋白、多個Cys-Cys結構域和四連蛋白的衍生物；特別是由 微生物表達的)，特別是由PEG連接的小於40kD的，更特別的是具有少數Cys胺基酸的。
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在本發明的一個具體實施方案中，主題可溶多肽的修飾形式包括使主題可溶多肽 連接到非蛋白質性聚合物。在一個具體實施方案中，所述聚合物為聚乙二醇(「PEG」)、聚 丙二醇或聚氧化烯，以美國專利 4，640，835 ；4, 496，689 ；4, 301，144 ；4, 670，417 ；4, 791，192 或4，179，337中所述的方式。本發明修飾的多肽的例子包括本說明書中另外描述的聚乙二
醇化蛋白質。PEG是眾所周知的水溶性聚合物，可以商購的或者可根據本領域公知的方法通過 乙二酉享的開環聚合製備(Sandler and Karo, Polymer Synthesis, Academic Press, New York, Vol. 3，pages 138-161)。術語「PEG」以其廣義使用，涵蓋任何聚乙二醇分子，無論其 大小或在PEG末端的修飾，可用下式表示X-O (CH2CH2O) ^1CH2CH2OH(I)其中η為20-2300，X為H或末端修飾，例如CV4烷基。在一個實施方案中，本發明 的PEG在一端以羥基或甲氧基終止，即X為H或CH3 (「甲氧基PEG」)。PEG可包含其它結合 反應必需的化學基團；其由分子的化學合成產生；或者其是該分子的各部分具有最佳距離 的間隔物(spacer)。另外，這樣的PEG可包括一條或多條被連接在一起的PEG側鏈。有超過 一條PEG鏈的PEG稱為多臂PEG或分枝PEG。分枝PEG可例如通過聚氧化乙烯與各種多元 醇加成而製備，所述多元醇包括甘油、季戊四醇(pentaerythritol)和山梨醇。例如，具有 四條臂的分枝PEG可由季戊四醇和環氧乙烷製備。分枝PEG例如在歐洲專利EP-A 0473084 和美國專利5，932，462中有描述。有一種形式的PEG包括兩條PEG側鏈(PEG2)，它們通過 賴氨酸的伯氨基連接(Monfardini，C. et al. Bioconjugate Chem. 6 (1995) 62-69)。在一個優選的實施方案中，聚乙二醇化kiFM多肽通過定點聚乙二醇化，特別是通 過PEG與N末端或C末端半胱氨酸部分偶聯而產生。因此，本文的公開提供藥動學性質改善 的靶標結合性的kiFM多肽，所述多肽包括有藥80個至約150個胺基酸的kiFM結構域，其 中所述wFM結構域的至少一個環參與靶標結合；以及共價結合的PEG部分，其中所述wFM 多肽以小於IOOnM的Kd與靶標結合，在哺乳動物中清除速率小於30mL/hr/kg。所述PEG部 分可通過定點聚乙二醇化聯結到kiFM多肽，例如通過與半胱氨酸殘基聯結，其中所述半胱 氨酸殘基可位於kiFM多肽的N末端或在N末端和最靠近N末端的β鏈或類β鏈之間，或 者位於kiFM多肽的C末端或在C末端和最靠近C末端的β鏈或類β鏈之間。半胱氨酸 還可以位於其他位置，特別是任何不參與靶標結合性的環。PEG部分還可以通過其他化學作 用聯結，包括通過與胺偶聯。PEG與肽或蛋白質偶聯通常包括活化PEG以及活化的PEG-中間體直接與靶蛋 白/肽偶聯或與接頭偶聯，所述接頭隨後被激活並與靶蛋白/肽偶聯(參見Abuchowski， A.et al, J. Biol. Chem. , 252, 3571 (1977) and J. Biol. Chem.，252，3582 (1977)，Zalipsky， et al. and Harris et.al., in :Poly (ethylene glycol)Chemistry :Biotechnical and Biomedical Applications ； (J. M. Harris ed.)PlenumPress :New York,1992 ；Chap. 2land 22)。有人指出，含PEG分子的結合多肽也稱為結合蛋白，而沒有聯結PEG分子的蛋白質可 稱為非結合蛋白。可選擇PEG的許多種分子量形式，如約1，000道爾頓(Da)至100，OOODa(η為 20-2300)，用於與本發明的結合多肽偶聯。PEG中重複單位「η」的數目近似於以道爾頓描述 的分子量。優選的是，活化的接頭上PEG的總分子量是適合於藥學應用的。因此，在一個實
35施方案中，PEG分子的分子量不超過100，OOODa0例如，如果將3個PEG分子聯結到一個接 頭上，其中每個PEG分子有相同的12，OOODa的分子量(每個η約為270)，那麼接頭上PEG 的總分子量約為36，OOODa(總η約為820)。聯結到接頭的PEG的分子量還可以是不同的， 例如，接頭上的3個分子中，有兩個PEG分子可各為5，OOODa (η各約為110)，有一個PEG分 子可為12，OOODa (η約為270)。在本發明一個具體的實施方案中，VEGFR-2特異性抑制劑共價連接到一個如下式 所示的聚(乙二醇)基團:-C0-(CH2)x-(0CH2CH2)m-0R，該聚(乙二醇)基團的-CO(即羰基) 與結合多肽(binding polypeptide)的一個氨基形成醯胺鍵；R為低級烷基；χ為2或3 ;m 為約450至約950 ；選擇η和m以使得偶聯物減去結合多肽後的分子量為約10-40KD。在一 個實施方案中，結合多肽的賴氨酸的氨基是可利用的(游離的)氨基。以上偶聯物可更具體地用式(II)表示=P-NHCO-(CH2)x-(OCH2CH2)m-OR(II)，其中 P為本說明書中所述的結合多肽的基團，即沒有所述一個或多個氨基與式(II)中所示羰基 形成醯胺鍵；其中R為低級烷基；X為2或3 ;m為約450至約950，選擇m以使得偶聯物減 去結合多肽後的分子量為約IOkD至約40kD。如本說明書中使用的，「m」的給定範圍具有方 向意義(orientationalmeaning)。在任何情況下，「m」的範圍都確切地由PEG基團的分子 量確定。本領域技術人員可選擇適當的PEG分子量，例如根據聚乙二醇化結合多肽將如何 在治療上應用、期望的劑量、循環時間、對蛋白水解的抗性、免疫原性以及其他考慮因素。 關於PEG及其用於增強蛋白質性質的討論，參見N. V. Katre, Adv. Drug Delivery Rev. 10 91-114(1993)。在本發明的一個實施方案中，可使PEG分子活化，以與結合多肽上的氨基反 應，例如與賴氨酸反應(Bencham C. 0. et al. Anal. Biochem.，131，25 (1983) ；Veronese, F. Μ. et al. Appl. Biochem. ,11,141 (1985). ；Zalipsky, S. et al. Polymeric Drugs and Drug Delivery Systems, adrs 9-1IOACS Symposium Series469(1999) ；Zalipsky, S. et al. Europ. Polym. J. ,19,1177-1183(1983) ；Delgado, C. et al. Biotechnol. Appl. Biochem. ，12，119-128(1990))。在一個具體的實施方案中，使用PEG的碳酸酯形成PEG-結合多肽偶聯物。N， N』-二琥珀醯亞胺碳酸酯(DSC)可用在與PEG的反應中，以形成活性的混合PEG-琥珀醯亞 胺碳酸酯，其隨後可與接頭的親核基團或結合多肽的氨基反應(參見美國專利5，281，698 和5，932，462)。在一個相似類型的反應中，1，1』 -( 二苯並三唑基)碳酸酯和二 _(2_吡 啶基)碳酸酯可分別與PEG反應，形成PEG-苯並三唑和PEG-吡啶混合碳酸酯(美國專利 5，382，657)。kiFM多肽的聚乙二醇化可根據現有技術的方法實現，例如通過結合多肽 與親電性的 PEG (供應商Shearwater Corp.，USA, www, shearwatercoro. com)的反 應。本發明優選的PEG試劑例如為N-羥基琥珀醯亞胺丙酸酯(PEG-SPA)、丁酸酯或 鹽(butanoates) (PEG-SBA)、PEG-琥珀醯亞胺丙酸酯或分枝N-羥基琥珀醯亞胺例如 mPEG2-NHS (Monfardini, C.，et al. BioconjugateChem. 6 (1995) 62-69)。所述方法可用於在 結合多肽賴氨酸的ε"氨基或結合多肽的N末端氨基處進行聚乙二醇化。在另一個實施方案中，可將PEG分子偶聯至結合多肽上的巰基(Sartore，L.，et
36al. Appl. Biochem. Biotechnol. 27,45(1991) ；Morpurgo et al.Bioconjugate Chem. 7, 363-368(1996) ；Goodson et al. Bio/Technology(1990) 8，343 ;U. S. Pat. No. 5，766，897)。 美國專利6，610，281和5，766，897描述了可偶聯至巰基的例示性活性PEG種類。在一些PEG分子偶聯到結合多肽上的半胱氨酸殘基的實施方案中，所述半胱氨酸 殘基對於結合多肽而言是天然的，而在其他實施方案中，一個或多個半胱氨酸殘基被工程 化到結合多肽中。可將突變引入結合多肽編碼序列中，以產生半胱氨酸殘基。這可以通過， 例如，使一個或多個胺基酸殘基突變成半胱氨酸來實現。優選突變成半胱氨酸殘基的氨基 酸包括絲氨酸、蘇氨酸、丙氨酸和其他親水性殘基。優選地，欲突變成半胱氨酸的殘基是暴 露於表面的殘基。根據蛋白質的一級序列來預測殘基表面的可及性的算法是本領域眾所 周知的。或者，由於設計和演變結合多肽的基礎框架的晶體結構已經得到了解析(參見 Himanen et al. Nature (2001) 20-27 ；414 (6866) :933_8)，可通過比較結合多肽的胺基酸序 列來預測表面殘基，從而鑑定暴露於表面的殘基。在一個實施方案中，將半胱氨酸殘基引入 到結合多肽的N末端和/或C末端或靠近N末端和/或C末端的地方，或者引入環區內。在一些實施方案中，聚乙二醇化結合多肽包括共價聯結到N末端胺基酸α氨基 的PEG分子。位點特異性N末端還原氨基化在P印insky et al. (2001) J. Pharmacol. Exp. Ther. 297，1059，及美國專利5，824，784中有描述。利用PEG-醛和其他可用的親核氨基進 行的蛋白質還原氨基化在美國專利4，002，531，Wieder et al. (1979) J. Biol. Chem. 254， 12579，以及 Chamow et al. (1994)Bioconjugate Chem. 5，133 中有記載。在另一個實施方案中，聚乙二醇化結合多肽包括一個或多個共價聯結於接頭的 PEG分子，而所述接頭與結合多肽的N末端胺基酸殘基的α氨基聯結。所述方法在美國專 利申請流水號09/967，223和PCT國際申請公開號WO 94/01451中公開。在一個實施方案中，結合多肽的C末端被聚乙二醇化。在一個具體的實施方案 中，通過在C末端引入疊氮基-甲硫氨酸，隨後通過Staudinger反應偶聯甲基-PEG-三 芳基膦化合物，將蛋白質的C末端聚乙二醇化。這種C末端偶聯方法描述於Cazalis et al.Bioconjugate Chem. 2004 ； 15 (5) :1005_1009。結合多肽的單聚乙二醇化還可以根據PCT國際申請公開號W094/01451中所述的 一般方法製備。WO 94/01451描述了一種製備重組多肽的方法，所述重組多肽帶有修飾的末 端胺基酸α碳活性基團。所述方法的步驟包括形成重組多肽並通過在N末端α氨基和C 末端α羧基處以生物學方式添加一個或多個保護基團對其進行保護。然後可將所述多肽 與化學保護劑反應，以選擇性保護活性側鏈基團，從而防止側鏈基團被修飾。接著用特異針 對生物保護基團的剪切試劑剪切所述多肽，以形成無保護的末端胺基酸α碳活性基團。用 化學改性劑修飾所述無保護的末端胺基酸α碳活性基團。然後，對該側鏈被保護且末端被 修飾的單拷貝多肽，將其側鏈基團脫保護，形成末端被修飾的重組單拷貝多肽。所述方法中 步驟的數目和順序可變化，以實現選擇性地修飾多肽的N末端和/或C末端胺基酸。偶聯反應中結合多肽與活化PEG的比值可為約1 0.5至1 50，從約1 1至 1 30之間，或從約1 5至1 15之間。在本方法中可使用多種含水緩衝液以催化PEG 共價添加到結合多肽上。在一個實施方案中，使用的緩衝液PH為約7.0-9.0。在另一個實 施方案中，PH在稍為鹼性的範圍內，如約7. 5-8. 5。可使用pKa接近於中性pH範圍的緩衝 液，例如磷酸鹽緩衝液。當製備多特異性PEG連接蛋白時，將使用其他比值，例如約1 4
37至1 8，或約1 3至1 5。本領域公知的常規分離和純化技術可用於純化聚乙二醇化結合多肽，例如大小排 阻(如凝膠過濾)和離子交換層析。還可以利用SDS-PAGE分離產物。可被分離的產物包 括單聚乙二醇化、雙聚乙二醇化、三聚乙二醇化、多聚乙二醇化和非聚乙二醇化結合多肽， 以及游離的PEG。通過匯集洗脫峰周圍較寬的級分以增加組合物中單-PEG的百分比，可以 控制單-PEG偶聯物的百分比。約90%單-PEG偶聯物表示收率和活性的平衡較好。例如， 其中至少92%或至少96%的偶聯物是單-PEG種類的組合物可能是理想的。在本發明的一 個實施方案中，單-PEG偶聯物的百分比為90 % -96 %。在一個實施方案中，本發明的PEG化結合多肽包含一個、兩個或更多個PEG部分。 在一個實施方案中，所述PEG部分與這樣的胺基酸殘基結合，所述胺基酸殘基在蛋白質的 表面和/或遠離接觸靶配體的表面。在一個實施方案中，PEG-結合多肽中PEG的組合分子 量或總分子量約為3，000Da-60, OOODa，任選地約為10，000Da-36, OOODa0在一個實施方案 中，聚乙二醇化結合多肽中的PEG基本上是線性、直鏈PEG。在本發明一個實施方案中，利用羥胺測定，例如450mM羥胺(pH6. 5)於室溫處理 8-16小時，聚乙二醇化結合多肽中的PEG不從聚乙二醇化胺基酸殘基上被水解下來，因此 是穩定的。在一個實施方案中，組合物中大於80%是穩定的單-PEG結合多肽，更優選至少 90%，最優選至少95%。在另一個實施方案中，本發明的聚乙二醇化結合多肽將優選保留至少約25%、 50%、60%、70%、80%、85%、90%、95%或100%與未修飾蛋白質相關的生物活性。在一個 實施方案中，生物活性是指其與VEGFR-2結合的能力，用Kd、1^或1^。 評價。在一個具體 的實施方案中，相對於非聚乙二醇化結合多肽，所述聚乙二醇化結合多肽蛋白質顯示出與 VEGFR-2的結合增加。相對於未修飾的結合多肽的清除速率，PEG修飾的多肽血清清除速率可減少約 10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%或甚至90%。相對於未修飾蛋白的半衰期， PEG修飾的多肽的半衰期(t1/2)可增加。相對於未修飾結合多肽的半衰期，PEG-結合多肽 的半衰期可增加至少 10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、100%、125%、 150%,175%,200%,250%,300%,400% or 500%或者甚至 1000%。在一些實施方案中， 所述蛋白質半衰期在體外測定，例如在緩衝鹽水溶液或在血清中。在其他實施方案中，所述 蛋白質半衰期是體內半衰期，例如該蛋白質在動物血清或其他體液中的半衰期。附加的載體和聚核苷酸實施方案編碼本說明書中公開的多種蛋白質或多肽中任一種的核酸可用化學方法合成。 為了提高在細胞中的表達，可進行密碼子用法的選擇。所述密碼子用法將依賴於所選擇 的細胞類型。已經為大腸桿菌和其他細菌，以及哺乳動物細胞、植物細胞、酵母細胞和昆 蟲細胞開發了專用的密碼子用法模式。參見例如Mayfield et al. Proc. Natl. Acad. Sci.USA.2003Jan21 ； 100 (2) 438-42 ；Sinclair et al. Protein Expr. Purif. 20020ct ； 26(1) 96-105 ；Connell ND.Curr.Opin. Biotechnol. 20010ct ； 12(5) 446-9 ；Makrides et al. Microbiol Rev. 1996Sep ；60 (3) :512_38 ；以及 Sharp et al. Yeast. 19910ct -J(J) 657-78。核酸操作的常規技術描述於例如Sambrook et al. Molecular Cloning
38ALaboratory Manual, Vols. 1-3, Cold Spring Harbor Laboratory Press,2ed. ,1989,或 者 F. Ausubel et al. Current Protocols in Molecular Biology (GreenPublishing and Wiley-Interscience =New York, 1987)及其定期更新，在此通過提述併入本文。編碼多肽 的DNA與來自哺乳動物、病毒或昆蟲基因的適當轉錄或翻譯調控元件可操作地連接。所述 調控元件包括轉錄啟動子、可任選的控制轉錄的操縱基因序列、編碼適當的mRNA核糖體結 合部位的序列，以及控制轉錄和翻譯終止的序列。另外包括在宿主中複製的能力(通常由 複製起點賦予)和有利於識別轉化子的選擇基因。蛋白質不僅可以直接重組產生，而且可以作為與異源多肽或者其他在成熟蛋白或 多肽N末端具有特異性剪切位點的多肽的融合多肽來產生，所述異源多肽優選為信號序 列。所選異源信號序列優選是被宿主細胞識別並加工(即，被信號肽酶剪切)的序列。對 於不識別和加工天然信號序列的原核宿主細胞，所述信號序列由例如選自下組的原核信號 序列代替鹼性磷酸酶、青黴素酶、Ipp或耐熱腸毒素II前導序列。為了酵母分泌，所述天 然信號序列可例如由酵母轉化酶前導序列、因子前導序列(包括酵母屬(Saccharomyces) 和克魯維酵母屬(Kluyveromyces) α因子前導序列)或酸性磷酸酶前導序列、白色念珠菌 (C. albicans)葡糖澱粉酶前導序列或者PCT國際申請公開號WO 90/13646中所述的信號序 列所代替。在哺乳動物細胞表達中，可使用哺乳動物信號序列以及病毒的分泌前導序列，例 如單純皰疹gD信號。可以把這樣的前體區的DNA與編碼蛋白質的DNA按讀碼框連接。表達載體和克隆載體都包含使載體能夠在一種或多種選定的宿主細胞中複製的 核酸序列。通常，在克隆載體中，該序列是使載體能夠不依賴宿主染色體DNA複製的序列， 包括複製起點或自主複製序列。對於許多種細菌、酵母和病毒，這樣的序列是眾所周知的。 來自質粒PBR322的複製起點適合於多數革蘭氏陰性細菌，2微米質粒起點適合於酵母，各 種病毒起點(SV40、多瘤病毒、腺病毒、VSV或BPV)可用於哺乳動物細胞中的克隆載體。通 常，哺乳動物表達載體不需要複製起點組件(可能通常會使用SV40起點，僅僅是因為其包 含早期啟動子)。表達載體和克隆載體可包含選擇基因，也稱為選擇標記。典型的選擇基因編碼如 下蛋白質(a)賦予對抗生素或其他毒素(例如氨苄青黴素、新黴素、甲氨蝶呤或四環素) 的抗性的蛋白，(b)補充營養缺陷型的不足的蛋白，或(c)供給從複合培養基得不到的關鍵 營養素的蛋白，例如編碼芽孢桿菌D-丙氨酸消旋酶的基因。選擇方案的一個例子利用藥物阻止宿主細胞生長。被異源基因成功轉化的那些細 胞產生賦予抗藥性的蛋白質，因而在經歷選擇方案之後還存活。所述優勢選擇(dominant selection)的例子利用藥物新黴素、黴酚酸和潮黴素。另外，衍生自1. 6微米環狀質粒pKDl的載體可用來轉化克魯維酵母屬酵母。或 者，有人報導了乳克魯維酵母(K. Iactis)大規模生產重組牛凝乳酶的表達系統(參見Van den Berg, Bio/Technology, 8 135 (1990))。還有人公開了利用克魯維酵母屬工業菌株分泌 成熟的重組人血清白蛋白的穩定的多拷貝表達載體(參見Fleer et al. Bio/Technology, 9 968-975(1991))ο表達載體和克隆載體通常包含被宿主生物體所識別的啟動子，其與編碼本發明蛋 白質的核酸可操作地連接，所述蛋白質例如基於纖連蛋白的支架，如Adnectins 。適合原 核宿主使用的啟動子包括PhoA啟動子、β-內醯胺酶和乳糖啟動子系統、鹼性磷酸酶、色氨
39酸(trp)啟動子系統，以及雜合啟動子如tac啟動子。但其他已知的細菌啟動子也是適合 的。用於細菌系統中的啟動子還將包含Shine-Dalgarn0(S. D.)序列，其與編碼本發明蛋白 質的DNA可操作地連接。真核生物啟動子序列是公知的。幾乎所有的真核基因都具有富AT區，它位於轉錄 起始的位點上遊約25-30個鹼基處。另一種在許多基因的轉錄起點上遊70-80個鹼基處發 現的序列為CNCAAT區，其中N可為任一核苷酸。多數真核基因3』端為AATAAA序列，其可 能是向編碼序列3』端添加多聚A尾的信號。所有這些序列都適宜地插入真核表達載體中。適合酵母宿主使用的啟動序列的例子包括3-磷酸甘油酸激酶或其他糖酵解酶， 如烯醇化酶，3-磷酸甘油醛脫氫酶，己糖激酶，丙酮酸脫羧酶，磷酸果糖激酶，6-磷酸葡萄 糖異構酶，3-磷酸甘油酸變位酶，丙酮酸激酶，磷酸丙糖異構酶，磷酸葡糖異構酶和葡糖激 酶的啟動子。還有的酵母啟動子是誘導型啟動子，具有可通過生長條件控制轉錄的額外優點， 它們是下列酶的啟動子區醇脫氫酶2、異細胞色素C、酸性磷酸酶、與氮代謝相關的降解 酶、金屬硫蛋白、3-磷酸甘油醛脫氫酶，以及負責麥芽糖和半乳糖利用的酶。酵母表達中應 用的合適載體和啟動子在歐洲專利EP 73，657中有詳述。將酵母增強子與酵母啟動子一起 應用也是有利的。哺乳動物宿主細胞中，從載體發生的轉錄可例如受以下啟動子控制從病毒基因 組中獲得的啟動子，所述病毒如多瘤病毒、禽痘病毒、腺病毒(如腺病毒2)、牛乳頭瘤病毒、 禽肉瘤病毒、巨細胞病毒、反轉錄病毒、B型肝炎病毒，以及最優選的，猴病毒40 (SV40)；來 自異源哺乳動物的啟動子如肌動蛋白啟動子或免疫球蛋白啟動子，熱休克啟動子，只要所 述啟動子與宿主細胞系統相容。SV40病毒的早期啟動子和晚期啟動子方便地作為SV40限制性片段獲得，該片段 還包含SV40病毒複製起點。人巨細胞病毒的立即早期啟動子作為HindIII E限制性片段方 便地獲得。美國專利4，419，446中公開了利用牛乳頭瘤病毒作為載體在哺乳動物宿主中表 達DNA的系統。美國專利4，601, 978中描述了對該系統的修改。還參見Reyes et al. Nature 297 :598-601(1982)，其涉及人β幹擾素cDNA在來自單純皰疹病毒的胸苷激酶啟動子控制 下在小鼠細胞中的表達。或者，可使用Rous肉瘤病毒長末端重複序列作為啟動子。經常通過向載體中插入增強子序列來增加高等真核生物對編碼本發明蛋白質的 DNA的轉錄。目前已知許多來自哺乳動物基因(珠蛋白、彈性蛋白酶、白蛋白、甲胎蛋白和胰 島素)的增強子序列。但通常將使用來自真核細胞病毒的增強子。實例包括位於複製起點 晚期側的SV40增強子(bpl00-270)、巨細胞病毒早期啟動子增強子、位於複製起點晚期側 的多瘤病毒增強子以及腺病毒增強子。還參見Yaniv，Nature 297 17-18 (1982)，其涉及用 於真核生物啟動子活化的增強元件。可將所述增強子拼接到載體中多價抗體編碼序列5』 或3』側的位置，但優選位於啟動子的5』方向。用在真核生物宿主細胞(如酵母、真菌、昆蟲、植物、動物、人或來自其他多細胞生 物體的有核細胞)中的表達載體還將包含終止轉錄和穩定mRNA所必需的序列。所述序列 通常可從真核生物或病毒的DNA或cDNA的5』非翻譯區得到，偶爾從3』非翻譯區得到。這 些區域包含轉錄成在編碼多價抗體的mRNA的非翻譯部分中多聚腺苷酸化片段的核苷酸區 段。牛生長激素多聚腺苷酸化區是一種有用的轉錄終止元件(參見PCT國際申請公開號WO
4094/11026及該說明書中公開的表達載體)。重組DNA還可包括可能對純化蛋白質有用的任何類型的蛋白質標籤序列。蛋白 質標籤的例子包括但不限於組氨酸標籤、FLAG標籤、myc標籤、HA標籤或GST標籤。細菌、 真菌、酵母和哺乳動物細胞宿主使用的適當克隆載體和表達載體可在Cloning Vectors =A Laboratory Manual, (Elsevier,New York, 1985)中找到，其相關公開內容在此通過提述並 入本文。利用適合於宿主細胞的方法將表達構建體導入宿主細胞，這對於本領域技術人員 是顯而易見的。許多種將核酸導入宿主細胞的方法是本領域公知的，包括但不限於電穿 孔；用氯化鈣、氯化銣、磷酸鈣、DEAE-葡聚糖或其他物質轉染；微粒轟擊；脂質轉染；及感染 (其中載體是感染原)。合適的宿主細胞包括原核生物、酵母、哺乳動物細胞或細菌細胞。合適的細菌包括 革蘭氏陰性或革蘭氏陽性生物體，例如大腸桿菌或芽孢桿菌(Bacillus spp.)。酵母(優選 來自酵母屬物種，如釀酒酵母(S. erevisiae))也可以用來製備多肽。還可以應用多種哺乳 動物或昆蟲細胞培養系統表達重組蛋白。Luckow和Summers綜述了杆狀病毒系統在昆蟲細 胞中製備異源蛋白(Bi0/Techn0l0gy，6 :47，1988)。合適的哺乳動物宿主細胞系的例子包 括內皮細胞、C0S-7猴腎細胞、CV-1、L細胞、C127、3T3、中國倉鼠卵巢(CHO)、人胚腎細胞、 HeLa.293.293T以及BHK細胞系。通過培養適當的宿主/載體系統來表達重組蛋白從而制 備純化的多肽。對於許多應用，本說明書中公開的許多小尺寸多肽將使得在大腸桿菌中的 表達成為優選的表達方法。然後從培養基或細胞提取物中純化蛋白質。附加的表達和細胞實施方案優選用於生產的蛋白質和細胞的實施方案為基於纖連蛋白的支架(例如 Adnectins )及相關蛋白質。本說明書中用於克隆或表達載體中DNA的合適宿主細胞為上文所述的原核 生物、酵母或高等真核生物細胞。為此目的，合適的原核生物包括真細菌如革蘭氏陰 性或革蘭氏陽性生物體，例如腸桿菌科(Enterobacteriaceae)諸如大腸桿菌，腸桿菌 屬(Enterobacter)，歐文氏菌屬(Erwinia)，克雷伯氏菌屬(Klebsiella)，變形桿菌屬 (Proteus),沙門氏菌屬(Salmonella)如鼠傷寒沙門氏菌(Salmonella typhimurium)，沙 雷氏菌屬如黏質沙雷氏菌(Serratiamarcescans)，和志賀氏菌屬(Shigella)，以及芽孢杆 菌如枯草芽孢桿菌(B. subtilis)和地衣芽孢桿菌(B. Iicheniformis)(例如1989年4月 12日出版的DD266，710中公開的地衣芽孢桿菌41P)，假單胞菌屬(Pseudomonas)如銅綠假 單胞菌(P. aeruginosa)，以及鏈黴菌屬(Str印tomyces)。一種優選的大腸桿菌克隆宿主為 大腸桿菌294 (ATCC 31，446)，但其他菌株例如大腸桿菌B、大腸桿菌X1776 (ATCC 31，537) 和大腸桿菌W3110(ATCC 27，325)也是合適的。這些例子用作說明而非限制。除原核生物之外，真核微生物例如絲狀真菌或酵母是用於蛋白質編碼載體的 適當的克隆或表達宿主。在低等真核宿主微生物中，釀酒酵母，或稱普通麵包酵母， 是最常使用的。但許多其他屬、種和菌株通常可得到並且在本發明中有用，例如粟酒 裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)；克魯維酵母屬宿主例如乳克魯維酵母、脆 壁克魯維酵母(K. fragilis) (ATCC12, 424)、保加利亞克魯維酵母(K. bulgaricus) (ATCC 16,045)、K. wickeramii (ATCC 24，178)、K. waltii (ATCC 56，500)、果蠅克魯維酵
41母(K. drosophilarum) (ATCC 36，906)、耐熱克魯維酵母(K. thermotolerans)和馬克思 克魯維酵母(K. marxianus)；耶氏酵母屬(yarrowia) (EP 402, 226)；巴斯德畢赤酵母 (Pichiapastoris) (EP 183,070)；念珠菌屬(Candida)；瑞氏木黴(Trichoderma reesia) (EP244, 234)；粗糙脈孢黴(Neurospora crassa)；許旺酵母屬(Schwanniomyces)如西方許 旺酵母(Schwanniomyces occidentalis)；以及絲狀真菌例如脈抱霄屬(Neurospora)、青 黴屬(Penicillium)、彎頸黴屬(Tolypocladium)和麴黴屬(Aspergillus)宿主如構巢麴黴 (A. nidulans)禾口黑曲霄(A. niger)。用於糖基化的本發明蛋白表達的適當宿主細胞來源於多細胞生物。無脊椎動物細 胞的例子包括植物和昆蟲細胞。已經從例如以下宿主中鑑定了許多杆狀病毒毒株和變體以 及相應的許可型昆蟲宿主細胞草地貪夜蛾(Spodoptera frugiperda)(毛蟲)、埃及伊蚊 (Aedes aegypti)(蚊子)、白紋伊蚊(Aedes albopictus)(蚊子)、黑腹果蠅(Drosophila melanogaster)(果蠅)和家蠶(Bombyx mori)。許多轉染用病毒毒株是公眾可獲得的，例 如苜蓿銀紋夜蛾(Autographa californica)核型多角體病毒(NPV)的L-I變體和家蠶核 型多角體病毒的Bm-5毒株，所述病毒可用作根據本說明書的病毒，特別是用於轉染草地貪 夜蛾細胞。在某些情況下，將需要在脊椎動物細胞中製備蛋白質，例如糖基化，脊椎動物細胞 在培養基中(組織培養)增殖已成為常規操作。有用的哺乳動物宿主細胞系的例子有SV40 轉化的猴腎CVl細胞系(C0S-7，ATCC CRL1651)；人胚腎細胞系(經亞克隆可在懸浮培養基 中生長的293細胞或293細胞，Graham et al. J. Gen Virol. 36 59. (1977))；幼倉鼠腎細胞 (BHK，ATCC CCL10)；中華倉鼠卵巢細胞/-DHFR(CHO，Urlaub et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA77 4216(1980))；小鼠 Sertoli 細胞(TM4, Mather, Biol. Reprod. 23 243-251 (1980))； 猴腎細胞(CVIATCC CCL 70)；非洲綠猴腎細胞(VERO-76，ATCCCRL-1587)；人宮頸癌細 胞(HELA，ATCC CCL 2)；犬腎細胞(MDCK, ATCCCCL 34) ；buffalo 大鼠肝細胞(BRL 3A, ATCC CRL 1442)；人肺細胞(W138, ATCC CCL 75)；人肝細胞(Hep G2，HB 8065)；小鼠乳 腺腫瘤(MMT 060562，ATCC CCL51) ；TRI 細胞(Mather et al. Annals N. Y. Acad. Sci. 383 44-68(1982)) ；MRC 5細胞；FS4細胞；人肝細胞瘤細胞系Ofep G2)；以及骨髓瘤或淋巴瘤 細胞(如YO、J558L、P3和NSO細胞)(參見美國專利5，807，715)。棉花、玉米、馬鈴薯、大豆、牽牛花、西紅柿和菸草的植物細胞培養物也可用作宿 主。用本說明書中所述的表達或克隆載體轉化宿主細胞從而生產蛋白質，將所述宿主 細胞在經改進的常規營養培養基中培養，所述常規營養培養基適合於誘導啟動子、選擇轉 化子或擴增編碼感興趣的序列的基因。培養細胞用於生產本發明蛋白質的宿主細胞可以在多種培養基中培養。商業上可得到的 培養基，例如 Ham，s FlO(Sigma)、最小必需培養基((MEM)，Sigma)、RPMI-1640 (Sigma)以 及Dulbecco改進的Eagle培養基((DMEM)，Sigma)，適合用於培養宿主細胞。另外，在Ham et al. Meth. Enz. 58 44 (1979)，Barnes etal. Anal. Biochem. 102 255 (1980),美國專利 4，767，704 ；4，657，866 ；4，927，762 ；4，560，655 或 5，122，469 ；公開的 PCT 國際申請公開號 WO 90/03430 ；W087/00195 ；或者美國專利Re. 30, 985中所述的任一種培養基可用作宿主細
42胞的培養基。必要時這些培養基中任一種都可補充激素和/或其他生長因子(如胰島素、 轉鐵蛋白或表皮生長因子)，鹽(如氯化鈉、鈣、鎂和磷酸鹽)，緩衝液(如HEPES)，核苷酸 (如腺苷和胸苷)，抗生素(如GENTAMYCIN 藥物)，痕量元素(定義為通常以終濃度微克 分子範圍存在的無機化合物)，以及葡萄糖或等價能源。還可以以合適的濃度包括本領域技 術人員公知的任何其他必要的添加物。培養條件，例如溫度、PH等，是先前所選擇的宿主細 胞表達使用的條件，對普通技術人員來說將是顯而易見的。本說明書中公開的蛋白質還可以利用無細胞翻譯系統產生。為此目的，編碼多肽 的核酸必須被修飾，以允許體外轉錄產生mRNA並允許mRNA在所利用的特定無細胞系統 (真核生物例如哺乳動物或酵母的無細胞翻譯系統或者原核生物例如細菌的無細胞翻譯系 統)中進行無細胞翻譯。本發明的蛋白質還可通過化學合成產生(例如用Solid Phase PeptideSynthesis, 2nd ed. , 1984, The Pierce Chemical Co. , Rockford, IL 中描述的方 法)。還可以通過化學合成生成對蛋白質的修飾。可以用蛋白質化學領域中通常公知的蛋白質分離/純化方法純化本發明的蛋白 質。非限制實例包括萃取、重結晶、鹽析(如用硫酸銨或硫酸鈉)、離心、透析、超濾、吸附層 析、離子交換層析、疏水層析、正相層析、反相層析、凝膠過濾、凝膠滲透層析、親和層析、電 泳、逆流分配法或這些方法的任意組合。純化後，可用本領域公知的多種方法中任一種將多 肽換至不同緩衝液中和/或濃縮，所述方法包括但不限於過濾和透析。經純化的多肽優選至少為85%純，更優選至少95%純，最優選至少98%純。不管 純度的確切數值是多少，所述多肽的純度足夠用作藥品。附加的糖基化實施方案在一些實施方案中，可能優選將用於本發明的蛋白糖基化。優選地，這樣的蛋白質 為基於纖連蛋白的支架，例如Adnectins 。但Adnectins 通常不包含糖基化位點，可將所 述糖基化位點工程構建到所述蛋白質中。蛋白質的糖基化通常或者是N-連接的或者是0-連接的。N-連接的是指碳水化 合物部分聯結到天冬醯胺殘基的側鏈。三肽序列天冬醯胺-X-絲氨酸和天冬醯胺-X-蘇氨 酸，其中X是除了脯氨酸之外的任何胺基酸，是碳水化合物部分酶促聯結到天冬醯胺側鏈 的識別序列。可將這些三肽序列工程構建到本發明的蛋白質中，特別是基於纖連蛋白的支 架，例如Adnectins ，以及它們相應的多核苷酸中。因此，這些三肽序列中的任一個在多肽 中的存在都可潛在地產生糖基化位點。0-連接的糖基化是指N-乙醯半乳糖胺、半乳糖或木 糖等糖類中的一種聯結到羥基胺基酸，最常見為絲氨酸或蘇氨酸，但也可使用5-羥脯氨酸 或5-羥賴氨酸。通過改變本發明的蛋白質的胺基酸序列以使其包含一種或一種上述三肽序列 (對於N-連接糖基化位點)，方便地實現向本發明的蛋白質添加糖基化位點。所述改變還 可通過添加一個或多個絲氨酸或蘇氨酸殘基至原始抗體的序列或用一個或多個絲氨酸或 蘇氨酸殘基加以取代而達到(對於0-連接糖基化位點)。編碼本發明蛋白質的此類胺基酸序列變體的核酸分子可利用本領域公知的多種 方法製備。這些方法包括但不限於從天然來源分離(對天然存在的胺基酸序列變體而言) 或者通過對預先製備的蛋白質的變體或非變體形式施加寡核苷酸介導的(或定點的)誘
43變、PCR誘變、以及蛋白質(例如基於纖連蛋白的支架，如Adnectins )的盒式誘變來加以 製備。理想的是，修飾本發明的蛋白質的效應物功能，以實現，例如，增強抗體的抗原依 賴細胞介導的細胞毒性(ADCC)和/或補體依賴性細胞毒性(CDC)的目的。這可通過引入 Fc區的活性部分，以及在蛋白質(例如基於纖連蛋白的支架，如Adnectins )的Fc區中引 入一個或多個胺基酸修飾從而產生變體Fc區來實現。所述Fc區變體可包括在一個或多個 胺基酸部位包括一個胺基酸修飾(例如取代)的人Fc區序列(例如人IgGl、IgG2、IgG3或 IgG4Fc 區)。在一個實施方案中，與天然序列Fc區相比，變體Fc區在人效應細胞存在下可更 有效地介導抗體依賴細胞介導的細胞毒性(ADCC)或者以更高的親合力結合Fcy受體 (Fe y R) ο 所述 Fc 區變體可在 Fc 區的位點 256、290、298、312、326、330、333、334、360、378 或430中任一個或多個位點處包含一個胺基酸修飾，其中Fc區中殘基的編號是Kabat中EU 索引的編號。附加的基於抗體的蛋白質，包括部分和衍生物本發明中有用的蛋白質的另外的實施方案包括單結構域抗體、其互補決定區是單 結構域的一部分的多肽(優選針對VEGFR-2)以及包括在本發明PEG連接蛋白中的抗體。實 例包括但不限於重鏈抗體、天然缺失輕鏈的抗體、衍生自常規的4鏈抗體的單結構域抗體、 工程化抗體和除衍生自抗體的那些之外的單結構域支架。單結構域抗體可以是現有技術中 的任何抗體，或任何未來的單結構域抗體。單結構域抗體可來自於任何物種，包括但不限於 小鼠、人、駱駝、駱馬、山羊、兔、牛。根據本發明的一個方面，本說明書中使用的單結構域抗 體為天然存在的單結構域抗體，稱為缺失輕鏈的重鏈抗體。這樣的單結構域抗體例如在PCT 國際申請公開號WO 94/04678中公開。為清晰起見，這種從天然缺失輕鏈的重鏈抗體衍生 的可變域在本說明書中稱為Vhh或納米抗體(nanobody)，以使其與4鏈免疫球蛋白的常規Vh 相區別。所述Vhh分子可來源於在駱駝科(Camelidae)物種中產生的抗體，所述駱駝科物種 例如路馬它(camel)、單峰駱駝(dromedary)、駱馬(llama)、小羊駝(vicuna)、羊駝(alpaca) 和大羊駝(guanaco)。除駱駝科之外還有其他物種可產生天然缺失輕鏈的重鏈抗體；這樣 的Vhh在本發明的範圍內。根據本發明，且本領域技術人員公知，Vhh是來自於天然缺失輕鏈的免疫球蛋白的 重鏈可變區，例如在PCT國際申請號WO 94/04678中所述的來自於駱駝科的(以下稱之為 Vffl域或納米抗體)。Vra分子約比IgG分子小10倍。它們是單一的多肽，而且很穩定，耐得 住極端PH和溫度條件。此外，它們對蛋白酶的作用有抵抗力，這是常規抗體不具備的。此 外，Vhh體外表達產生高收率、正確摺疊的、有功能的V,另外，與通過應用抗體文庫而在體 外產生的抗體或通過免疫哺乳動物(除駱駝科外)產生的抗體所識別的表位相比，在駱駝 科動物中產生的抗體將識別不同的表位(參見PCT國際申請公開號WO 9749805)。因此， 與常規抗體相比，抗VEGFR-2Vhh可與VEGFR-2更有效地相互作用，從而更有效地阻斷其與 VEGFR配體的相互作用。由於已知Vhh可結合到「不尋常的(unusual)，，表位例如腔或溝中 (參見PCT國際申請公開號WO 97/49805)，所以所述Vhh的親和力可能更適合於治療處理。在本發明方法中有用的VEGFR-2特異性抑制劑另一個例子是由這樣的序列組成 的抗VEGFR-2，該序列相應於針對VEGFR-2或其近緣的家族成員的駱駝科Vra序列。本發明
44還涉及所述多肽的同源序列、功能性部分、或同源序列的功能性部分。本發明還涉及能夠編 碼所述多肽的核酸。本發明的單結構域抗體可針對VEGFR-2或其近緣的家族成員。用在本發明方法中的多肽構建體可以進一步包括針對其他靶標(例如血清白蛋 白)的單結構域抗體。針對靶標的單結構域抗體指的是能夠以好於IiT6M的親和力與所述 靶標結合的單結構域抗體。本發明進一步涉及Vhh單結構域抗體的應用，所述Vhh單結構域抗體屬於具有人源 樣序列(human-like sequences)的類別。一個這樣的類別具有這樣的特徵Vra在45位帶 有選自下組的胺基酸甘氨酸、丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、酪氨 酸、色氨酸、甲硫氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、天冬醯胺或穀氨醯胺，例如L45 ；且在103位具有色 氨酸，其中位置根據Kabat編號法。由此，屬於該類別的多肽與AVh框架區顯示較高的氨 基酸序列同源性，所述多肽可以直接向人施用，預期不會導致不良的免疫應答，且無需進一 步人源化。另一人源樣類別的駱駝科單結構域抗體已在PCT國際申請號W003/035694中描 述，它們包含通常在人源或來自其他物種的常規抗體中發現的疏水性FR2 (框架2)殘基，但 通過以103位荷電的精氨酸殘基取代雙鏈抗體來源的Vh中存在的保守色氨酸殘基而補償 該親水性損失。因此，屬於這兩個類別的肽顯示出與人Vh框架區有較高的胺基酸同源性， 所述多肽可以直接向人施用，不會導致不良的免疫應答，且無需進一步人源化。本發明還涉 及能夠編碼所述多肽的核酸。多肽可包括全長駱駝科抗體，即Fc和Vhh域。抗-白蛋白Vra可以更高效地與血清白蛋白——一種已知的載體蛋白——相互作 用。作為載體蛋白，血清白蛋白的一些表位可能由於結合著蛋白、肽和小的化合物而無法達 到。由於已知Vra可結合到「不尋常的(unusual)」或非常規的表位例如腔(參見PCT國際 申請公開號WO 97/49805)，所以所述Vhh對循環中的白蛋白的親和力可能更適合於治療處 理。所述血清蛋白可以是在受試者血清中發現的任何合適的蛋白質，或其片段。在本發明 的一個方面，所述血清蛋白為血清白蛋白、血清免疫球蛋白、甲狀腺素結合蛋白、轉鐵蛋白 或纖維蛋白原。取決於預期的應用，例如有效治療感興趣的半衰期和/或靶抗原的區隔化 (compartmentalization)，Vhh-伴侶可針對至上述血清蛋白之一。「抗體片段(antibody fragments) 」僅包括完整抗體的一部分，通常包括完整抗 體的抗原結合部位，因此保留結合抗原的能力。本定義包含的抗體片段的例子包括(i) Fab片段，具有\、CL, Vh和CHl域；(ii)Fab'片段，其是在CHl域的C末端具有一個或多 個半胱氨酸殘基的Fab片段；(iii)具有Vh和CHl域的Fd片段；(iv)具有Vh和CHl域並 且在CHl域的C末端具有一個或多個半胱氨酸殘基的Fd』片段；(ν)具有抗體單臂的\和 Vh 域的 Fv 片段；(vi)包含 Vh 域的 dAb 片段(Ward et al. Nature 341,544-546(1989))； (vii)分離的⑶R區；(viii)F(ab』)2片段，為包含兩個Fab』片段的二價片段，通過鉸 鏈區的二硫橋連接；(ix)單鏈抗體分子(如單鏈Fv ;scFv) (Bird et al. Science 242 423-426(1988)；和 Huston et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA85 5879-5883 (1988)) ； (χ)有 兩個抗原結合部位的「雙抗體(diabodies)」，包括重鏈可變區(Vh)連接到同一多肽鏈中的 輕鏈可變區(Vl)(參見例如歐洲專利EP 404，097 ；PCT國際申請公開號WO 93/11161 ；和 Hollinger et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90 6444-6448 (1993)) ；(xi)包括一對串聯
45Fd區段(VH-CH1-VH-CH1)的「線性抗體(linear antibodies) 」，其與互補的輕鏈多肽一起 形成一對抗原結合區(Zapata et al. Protein Eng. 8(10) 1057-1062 (1995)；及美國專利 5，641，870)。已開發了多種技術用於生產抗體片段，可將其用於製備本發明中使用的抗體 片段。傳統上，這些片段通過完整抗體的蛋白水解消化而得到(參見例如Morimoto et al.J.Biochem. Bioph. Methods 24 107-117(1992)；禾口 Brennan et al. Science,229 81(1985))。但是，現在這些片段可以直接利用重組宿主細胞產生。例如，所述抗體片段可 從以上討論的抗體噬菌體文庫中分離。或者，Fab』-SH片段可直接從大腸桿菌中回收，並以 化學方法偶聯以形成 F(ab，)2 片段(Carter et al. Bio/Technology 10:163-167(1992))。 根據另一種方法，F(ab』)2片段可直接從重組宿主細胞培養物中分離。其他製備抗體片段 的技術對技術人員將是顯而易見的。在其他實施方案中，選擇的抗體是單鏈Fv片段(scFv) (參見PCT國際申請公開號WO 93/16185以及美國專利5，571，894和5，587，458)。所述抗 體片段還可以是「線性抗體」，例如美國專利5，641，870中所描述的。所述線性抗體片段可 為單一特異性的或雙特異性的。可供選擇的革巴向性蛋白治療法(targeted protein therapeutics)在某些實施方案中，可用於本說明書中描述的本發明方法中的蛋白質可包括一 個或多個avimer序列。avimers是一類結合蛋白，對多種靶分子有親和力和特異性，包 括本說明書中所述的那些靶分子。這些蛋白質可以包括在本發明的PEG連接的實施方案 中。它們是從人胞外受體結構域出發，通過體外外顯子改組和噬菌體展示而產生的(參見 Silverman et al. 2005，Nat. Biotechnol. 23 1493-94 ；禾口 Silverman et al. 2006，Nat. Biotechnol. 24 220)。由此產生的多結構域蛋白可包括多個獨立的結合域，與單表位結合 蛋白相比，其可顯示出更好的親和力(在某些情況下為亞納摩爾級)和特異性。在許多實 施方案中，avimers可例如與PEG或多肽接頭聯結。關於avimers的構建方法和應用的更 多細節例如在美國專利申請流水號10/693，057,10/693, 056,10/840, 723,10/871, 602和 10/966，064中公開，本文援引併入其中每一件專利申請的實施例部分以及整個文檔。在某些實施方案中，本說明書中描述的用在本發明方法中的蛋白質可包括一個或 多個脂籠蛋白相關的序列，例如anticalins或脂籠蛋白衍生物。anticalins或脂籠蛋白衍 生物是一類結合蛋白，對多種靶分子有親和力和特異性，包括本說明書中所述的那些靶分 子。所述蛋白質描述於美國專利申請流水號11/224，071-Anticalins，美國專利申請流水 號 10/490，953— "Muteinsof human neutrophil gelatinase-associated lipocalin and related proteins」，美國專利申請流水號 10/491, 001- "Muteins of apolipoprotein d」 以及PCT國際申請公開號WO 06/056464中。這些蛋白質可以包括在本發明的PEG連接的 實施方案中。在某些實施方案中，可用於本說明書中描述的本發明方法中的蛋白質可包括一個 或多個四連蛋白C型凝集素相關序列或三連蛋白(trinectins)，例如四連蛋白C型凝集素 或四連蛋白C型凝集素衍生物。四連蛋白C型凝集素或四連蛋白C型凝集素衍生物是一類 結合蛋白，對多種靶分子有親和力和特異性，包括本說明書中所述的那些靶分子。不同的四 連蛋白C型凝集素和相關蛋白質描述於PCT國際申請公開號WO 06/053568 ；W005/080418 ； WO 04/094478 ；WO 04/039841 ；WO 04/005335 ；WO 02/048189 ；和 WO 98/056906，以及美國
46專利申請流水號11/064，115。這些可以包括在蛋白質本發明的PEG連接的實施方案中。與本發明蛋白質連接的毒素和其他分子可用於本說明書中公開的本發明方法中的蛋白質可與細胞毒劑連接。所述實施方 案可酌情用體內或體外方法製備。體外方法包括本領域眾所周知的偶聯化學，包括與蛋白質相容的化學，例如對特 定胺基酸(如半胱氨酸和賴氨酸)的化學。為了使細胞毒劑連接到本發明的蛋白質上，利 用連接基團或活性基團。合適的連接基團是本領域眾所周知的，包括二硫化物基團、硫醚 基團、酸敏感基團、光敏感基團、肽酶敏感基團和酯酶敏感基團。優選的連接基團是二硫化 物基團和硫醚基團。例如，可以利用二硫化物交換反應，或通過在抗體和細胞毒劑之間形 成硫醚鍵，來構建偶聯物。優選的細胞毒劑是美登素類化合物(maytansinoids)、紫杉烷和 CC-1065類似物。體內方法包括使毒性蛋白、標記蛋白或標籤蛋白連接到本發明的蛋白質上作為融 合蛋白。利用編碼感興趣多肽的多核苷酸來產生單個多肽。對於毒性蛋白，可通過在毒素 抗性或不敏感細胞中表達來加以控制，或者用敏感細胞中的誘導型啟動子來進行控制。儘管並非限制，但在各實施方案中，可使本發明的蛋白質連接到以下蛋白質，例如 細菌毒素、植物毒素、篦麻毒蛋白、相思豆毒蛋白、核糖核酸酶(RNase)、DNA酶I、蛋白酶、葡 萄球菌腸毒素-A、美洲商陸抗病毒蛋白、白樹毒素(gelonin)、白喉毒素、假單胞菌外毒素、 假單胞桿菌內毒素、豹蛙酶(Ranpirnase) (Rap)、Rap (N69Q)、酶或螢光蛋白。美登素類化合物和美登素類化合物類似物屬於優選的細胞毒劑。合適的美登素 類化合物的例子包括美登醇(maytansinol)和美登醇類似物。合適的美登素類化合物 公開於美國專利 4，424，219 ；4，256，746 ；4，294，757 ；4，307，016 ；4，313，946 ；4，315，929 ； 4，331，598 ；4，361，650 ；4，362，663 ；4，364，866 ；4，450，254 ；4，322，348 ；4，371，533 ； 6，333，410 ；5，475，092 ；5，585，499 ；和 5，846，545。紫杉烷也是優選的細胞毒劑。適合用在本發明中的紫杉烷在美國專利6，372，738 和6，340，701中公開。CC-1065及其類似物也是優選用在本發明中的細胞毒劑。CC-1065及其類似物在 美國專利 6，372，738 ；6，340，701 ；5，846，545 和 5，585，499 中公開。一種用於製備所述細胞毒性偶聯物的引人注意的候選物為CC-1065，其是從澤耳 鏈黴菌(Str印tomyces zelensis)的培養基肉湯中分離的有效的抗腫瘤抗生素。在體外 CC-1065比通常使用的抗癌藥更有效約1000倍，所述通常使用的抗癌藥例如多柔比星、甲 氨蝶呤和長春新鹼(B. K. Bhuyan et al. Cancer Res.，42，3532-3537 (1982))。細胞毒類藥例如甲氨蝶呤、柔紅黴素、多柔比星、長春新鹼、長春鹼、美法侖、絲裂 黴素C、苯丁酸氮芥和加利車黴素也適合於製備本發明的偶聯物，所述藥物分子也可通過中 間載體分子(如血清白蛋白)與抗體分子連接。偶聯可以應用本領域公知的任一方法使蛋白質與可檢測部分偶聯，所述方法包括 由 Hunter, et al. Naturel44 945(1962) ；David, et al. Biochemistryl3 1014(1974)； Pain, et al. J. Immunol. Meth. 40 219 (1981)；禾口 Nygren, J. Histochem. and Cytochem. 30 407(1982)所描述的那些方法。
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體外方法包括本領域眾所周知的偶聯化學，包括與蛋白質相容的化學作用，例如 對特定胺基酸(如半胱氨酸和賴氨酸)的化學作用。為了使部分(例如PEG)與本發明的 蛋白質連接，使用連接基團或活性基團。合適的連接基團是本領域眾所周知的，包括二硫化 物基團、硫醚基團、對酸敏感基團、對光敏感基團、對肽酶敏感基團和對酯酶敏感基團。根據 實際應用，優選的連接基團是二硫基團和硫醚基團。對於基於纖連蛋白的支架，如Adnectins ，或其他沒有半胱氨酸的蛋白質，可將半 胱氨酸工程化到一定的位置，以便在創建偶聯部位時蛋白質的活性存在。配製和施用通過使所述具有感興趣的純度的蛋白質與可任選的生理學可接受載體、賦形劑 或穩定劑混合(Remington』 s Pharmaceutical Sciences 16th edition，Osol，A. Ed. (1980))，以水溶液、凍幹配方或其他乾燥配方的形式，製備本發明的治療配方用於貯存。可 接受的載體、賦形劑或穩定劑在所應用的劑量和濃度下對接受者無毒，包括緩衝液如磷酸 鹽、檸檬酸鹽和其他有機酸；抗氧化劑包括維生素C和甲硫氨酸；防腐劑(例如十八烷基 二甲基苄基(octadecyldimethylbenzyl)氯化銨；氯己雙銨；苯扎氯銨、苄索氯銨；苯酚、 丁醇或苯甲醇；烷基對羥苯甲酸類如對羥基苯甲酸甲酯或對羥基苯甲酸丙酯；鄰苯二酚； 間苯二酚；環己醇；3-戊醇；以及m-甲酚)；低分子量(小於約10個殘基)多肽；蛋白質 如血清白蛋白、明膠或免疫球蛋白；親水聚合物例如聚乙烯吡咯烷酮；胺基酸如甘氨酸、 穀氨醯胺、天冬醯胺、組氨酸、精氨酸或賴氨酸；單糖、二糖和其他碳水化合物包括葡萄糖、 甘露糖或右旋糖酐；螯合劑如EDTA ；糖類如蔗糖、甘露醇、海藻糖或山梨醇；形成鹽的抗衡 離子如鈉；金屬絡合物(如Zn-蛋白質絡合物)；和/或非離子型表面活性劑如TWEEN 、 PLUR0NICS 或聚乙二醇(PEG)。必要時對於要治療的特殊適應症，本說明書中的配製劑還可包含超過一種活性化 合物，優選具有互補活性而彼此之間無不利影響的那些活性化合物。本說明書中提供了活 性化合物的組合的實例。所述分子以對預期目的有效的劑量適當地聯合存在。在膠體給藥系統(例如脂質體、白蛋白微球體、微乳、納米顆粒和納米囊)或粗乳 狀液中，所述活性成分還可以被分別包封到微囊中。微囊例如通過凝聚技術或通過界面聚 合法製備的微囊，如羥甲基纖維素或明膠-微囊和聚_(甲基丙烯酸甲酯)微囊。所述技術 在 Remington』 s Pharmaceutical Sciencesl6th edition, Osol, A. Ed. (1980)中公幵。體內給藥使用的配製劑必須是無菌的。這通過無菌過濾膜過濾很容易實現。可以製備緩釋製劑。緩釋製劑合適的例子包括包含本發明蛋白質的固體疏水性聚 合物的半滲透性基質，該基質為定型產品的形式，例如薄膜或微囊。緩釋基質的例子包括多 元酯，水凝膠(例如聚(2-羥乙基-甲基丙烯酸酯)或聚(乙烯醇))，多乳酸化合物(美國 專利3，773，919)，L-穀氨酸和、乙基-L-穀氨酸鹽的共聚物，非降解性乙烯醋酸乙烯酯， 可降解的乳酸-羥基乙酸共聚物如LUPRON DEPOT (由乳酸-羥基乙酸共聚物和醋酸亮丙 瑞林組成的可注射微球)，以及聚-D- (-) -3-羥丁酸。聚合物如乙烯醋酸乙烯酯和乳酸-羥 基乙酸能夠實現超過100天分子釋放，而某些水凝膠釋放蛋白質的時間短一些。當本發明 的包封蛋白質在體內保留較長時間時，它們可能因為37°C暴露於溼氣中而變性或聚集，導 致生物活性喪失並且免疫原性可能改變。可根據有關機制針對穩定性設計合理的策略。例 如，如果發現聚集機制是通過硫代_ 二硫化物互換的分子間S-S鍵形成的，則可通過修飾巰
48基殘基、從酸性溶液凍幹、控制溼度、使用適當的添加劑和開發特異的聚合物基質組合物從 而獲得穩定性。雖然技術人員將理解，各治療劑的劑量將取決於藥劑本身，但優選的劑量範圍可 為約10mg/m2至約2000mg/m2，更優選50mg/m2至約1000mg/m2。對於優選的試劑如鉬劑(卡 鉬、奧沙利鉬、順鉬)優選的劑量為約10mg/m2至約400mg/m2，對於紫杉烷(紫杉醇、多西他 賽)優選的劑量為約20mg/m2至約150mg/m2，對于吉西他濱優選的劑量為約100mg/m2至約 2000mg/m2，對於喜樹鹼優選的劑量為約50mg/m2至約350mg/m2。這種治療劑及其他治療劑 的劑量可取決於本發明的抗體、抗體片段或偶聯物是與治療劑同時施用還是相繼施用。VEGFR-2特異性抑制劑以藥學可接受藥物劑型向受試者施用。它們可以靜脈內 施用(推注，或者通過連續輸注一段時間施用)，通過肌內、皮下、關節內、滑膜內、鞘內、眼 內、口服、局部或吸入途徑施用。所述蛋白質還可以通過瘤內、腫瘤旁、病灶內或病灶周圍 途徑施用，以發揮局部以及全身療效。合適的藥學可接受載體、稀釋劑和賦形劑是眾所周知 的，可由本領域技術人員視臨床情況需要確定。合適的載體、稀釋劑和/或賦形劑的例子 包括(I)Dulbecco磷酸緩衝鹽溶液，pH約7. 4，包含約lmg/mL至25mg/mL人血清白蛋白， (2)0. 9%鹽水(0.9%w/v NaCl)，以及(3)5% (w/v)葡萄糖。本發明的方法可體外、體內或 離體實施。配製劑的實例包括5-100mM乙酸鈉、甘露醇或類似的賦形劑(如山梨醇)，濃度 從50mM至且包括高滲濃度，任選地氯化鈉濃度從O至約200mM，pH約4至約7. 5。在一個 實施方案中，所述配方包括約IOmM乙酸鈉、約IOOmM氯化鈉和約IlOmM甘露醇，pH約4. 5。 在另一個實施方案中，所述配製劑包括IOmM乙酸鈉和IOOmM甘露醇，pH約4. 5至約6。抑 製劑在配製劑中的濃度可以是l_15mg/mL。在一個實施方案中，蛋白質的濃度為約9mg/mL 至約llmg/mL。VEGFR-2特異性抑制劑，及一種或多種其它治療劑的施用，不管是同時施用 還是相繼施用，都可如上所述進行。技術人員將理解，同時施用的合適的藥學可接受載體、 稀釋劑和賦形劑取決於同時施用的特定治療劑本身。當以含水劑型而不是凍幹劑型存在時，所述蛋白質通常可以以約0. lmg/mL至約 lOOmg/mL的濃度配製，但在這些範圍之外較大變動也是允許的。對於疾病治療，抗體或偶聯 物的適當劑量將取決於以上確定的要治療的疾病類型、疾病的嚴重性和病程、抗體施用是 為了預防目的還是治療目的、先前治療的過程、患者的臨床病史和對抗體的反應，以及主治 醫師的判斷。蛋白質視情況一次性或者經一系列治療向患者施用。取決於疾病的類型和嚴重性，優選約lmg/m2至約2000mg/m2蛋白質為向患者施用 的起始候選劑量，更優選例如約10mg/m2至約lOOOmg/m2抗體，不管例如是通過一次或多次 單獨施用還是通過連續輸注。對於重複施用數天或更長，根據情況重複治療直到產生理想 的疾病症狀抑制。但其他給藥方案也可能是有用的，並不排除在外。本發明還包括在治療患有或有轉移癌發病風險的患者中有用的試劑盒，其包括本 說明書中所述的一種或多種成分以及應用這些成分的說明書。在優選的實施方案中，本發 明的試劑盒包括VEGFR-2特異性抑制劑和抗腫瘤組合物。用在試劑盒中的抗腫瘤組合物 可包含如本說明書中先前描述的任何合適的化療劑，用於如本說明書中先前描述的任何癌 症。提供試劑盒時，組合物的不同成分可包裝在單獨的容器中，即將使用前混合。所述 成分單獨地包裝可允許長期貯存，而不喪失活性成分的功能。
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試劑盒中包括的試劑可在任何種類的容器中提供，以便於不同成分的壽命得以保 持，而不被容器材料吸附或改變。例如，密封玻璃安瓿可盛放凍幹的治療劑或者已包裝在中 性非活性氣體(例如氮氣)中的緩衝劑。安瓿可由任何適當的材料構成，例如玻璃，有機聚 合物如聚碳酸酯、聚苯乙烯等、陶瓷、金屬或通常用於容納類似試劑的任何其他材料。合適 的容器其他例子包括可由如安瓿類似的物質製造的簡單瓶子，以及可能包含襯箔內面(例 如鋁或合金)的包封。其他容器包括試管、管形瓶、細頸瓶、瓶子、IV袋、注射器等。容器可 以有無菌進入口，例如帶有可用皮下注射針穿透的塞子的瓶子。其他容器可以有兩個隔室， 隔室由可容易移去的膜隔開，一旦移去所述膜，將使成分得以混合。可移去的膜可以是玻 璃、塑料、橡膠等。試劑盒還可提供說明材料。說明書可印刷在紙或其他物質上，和/或可以以電子 可讀介質提供，所述電子可讀介質例如軟盤、⑶_R0M、DVD-R0M、Zip光碟、錄像帶、錄音磁帶、 快閃記憶體設備等。詳細的說明書可能不是在物理上與試劑盒一起提供的，而是在用戶可直接訪 問試劑盒的廠商或經銷商指定的網際網路站點上提供，或者以電子郵件提供。本領域技術人員可容易地確定在本說明書所述方法中施用的細胞毒劑或治療劑 的劑量。當確定適當的劑量時，還可參考藥物的藥品說明書。舉例來說，以下藥品的說明書 可在下列全球資訊網上獲得且通過提述併入Sutentm :pfizer. com/pfizer/download/news/asco/sutent—fact—sheet, pdf ；Nexavar :univgraph. com/bayer/inserts/nexavar. pdf ；貝伐單抗(bevacizumab) :gene. com/gene/products/information/oncology/ bevacizumab/insert.jsp ；曲妥珠單抗(trastuzumab) :gene. com/gene/products/information/oncology/ herceptin/index, jsp ；吉西他濱(gemcitabine) :pi. lilly. com/us/gemzar. pdf ；替莫唑胺(temozolomide):fda. gov/cder/foi/label/1999/210291bl. pdf ；Gleevac :accessdata. fda. gov/scripts/cder/onctools/labels. cfm ？ GN = imatinib% 20mesylate ；紫杉酉享(paclitaxel) :accessdata. fda. gov/scripts/cder/onctools/labels. cfm ？ GN = paclitaxel ；多西他賽(doxetaxel) :http:// www. accessdata. fda. gov/scripts/cder/ onctools/labels. cfm ？ GN = docetaxel ；附加的專利文獻以下附加的專利申請及專利中描述的方法和組合物也包括在本文的公開中 美國專禾Ij 申請流水號 10/897, 406 ；10/735, 916 ； 10/886，838 ； 10/800，197 ； 10/363，552 ； 10/309，722 ；11/259，232 ；11/154，103 ；10/553，105 ；10/650，592 ；10/650，591 ； 10/792，498 ；10/676，873 ；10/728，078 ；10/989，723 ；11/483，918 ；11/448，171 ；禾口 11/482,641 ；美國專利 5，707,632 ；6，818，418 ；和 7，115，396 ；以及 PCT 國際申請公開 號 W 05/085430 ；WO 04/019878 ；WO 04/029224 ；WO 05/056764；WO 01/064942 ；和 WO 02/032925。以提述方式併入
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本說明書中所述的所有文檔和文獻，包括專利文獻和網站，都分別以提述的方式 併入本文檔，達到與在本文檔中全部或部分載明相同的程度。現在參照以下實施例描述本發明，所述實施例僅用作說明而並非意欲限制本發 明。儘管已經詳細地並參考本發明的具體實施方案描述了本發明，但對於本領域技術人員 來說將顯然可對本發明進行各種變化和修飾而不背離本發明的精神和範圍。實施例實施例1在腫瘤轉移的原位(orthotopic)模型中，Comp-I顯著地比貝伐單抗更有活性。在 第O天將人MDA-MB-231乳腺癌細胞植入小鼠乳腺脂肪墊中(1 X 106MDA_MB_231乳腺癌細 胞)。在第24天切除產生的腫瘤，4天後開始治療(切除時平均腫瘤體積為400mm3)。治療 組如下對照:PBS, Comp-I :30mg/kg,貝伐單抗5mg/kg(100 μ L IP注射，每周兩次)。處死 小鼠時，評估了局部再生(regrowth)的程度和肺轉移灶的數目。與貝伐單抗相比，Comp-I 在每隻小鼠中產生的肉眼可見轉移灶更少。此外，在研究中Comp-I對轉移的發生率有顯著 影響。與74%貝伐單抗治療的動物和84%對照組相比，僅有30% Comp-I治療的小鼠顯示 出了肺轉移(見圖1)。序列表SEQ ID NO 1為人III型纖連蛋白結構域的第十模塊。SEQ ID NO 2~60 為 VEGFR-2 結合性 lclFn3 多肽。SEQ ID NO 61為適合於聚乙二醇化的C末端尾。SEQ ID NO :62_65為片段，具體為人III型纖連蛋白結構域的第十模塊的環結構。
5權利要求
一種治療、預防或降低轉移癌的播散的方法，所述方法包括向有需要的患者施以治療性VEGFR-2特異性抑制劑。
2.權利要求1的方法，其中所述患者患有乳腺癌。
3.權利要求1的方法，其中所述VEGFR-2特異性抑制劑包含與人VEGFR-2結合的第一 種多肽，所述多肽包含具有如下結構組織的約80個至約150個胺基酸，所述結構組織包括 a)分布在至少兩個β-摺疊片中的至少5-7個β鏈或類β鏈，以及b)至少一個連接兩條 鏈的環部分，所述兩條鏈是β鏈或類β鏈，所述環部分參與對VEGFR-2的結合，其中所述 多肽以小於1x10_6M的解離常數(Kd)結合人VEGFR-2蛋白的胞外區，並抑制VEGFR-2介導 的血管發生。
4.權利要求3的方法，其中所述多肽包含與SEQNO :1具有至少80%同一性的胺基酸 序列。
5.權利要求3的方法，其中所述多肽包含選自SEQID NO 2-60中的任意胺基酸序列。
6.權利要求3的方法，其中所述多肽進一步包括聚氧化烯部分。
7.權利要求6的方法，其中所述聚氧化烯部分為聚乙二醇(PEG)部分。
8.權利要求1的方法，進一步包括施用第二種化療劑。
9.權利要求8的方法，其中所述第二種試劑為蘋果酸舒尼替尼。
10.權利要求8的方法，其中所述第二種試劑為拉帕替尼。
11.權利要求8的方法，其中所述第二種試劑為索拉非尼。
12.權利要求8的方法，其中所述第二種試劑為AZD2171。
13.權利要求8的方法，其中所述第二種試劑為貝伐單抗。
14.權利要求8的方法，其中所述第二種試劑為阿柏西普。
15.權利要求8的方法，其中所述第二種試劑為mTor抑制劑。
16.權利要求15的方法，其中所述mTor抑制劑為雷帕黴素。
17.權利要求8的方法，其中所述第二種試劑為吉西他濱。
18.權利要求8的方法，其中所述第二種試劑為替莫唑胺。
19.權利要求8的方法，其中所述第二種試劑為達沙替尼。
20.權利要求8的方法，其中所述第二種試劑為西妥昔單抗。
21.權利要求8的方法，其中所述第二種試劑為temsirolimus。
22.權利要求8的方法，其中所述第二種試劑為伊沙匹隆。
23.權利要求8的方法，其中所述第二種試劑為甲磺酸伊馬替尼。
24.權利要求8的方法，其中所述第二種試劑為曲妥珠單抗。
25.權利要求8的方法，其中所述第二種試劑為紫杉烷。
26.權利要求8的方法，其中所述第二種試劑為奧沙利鉬。
27.權利要求8的方法，其中所述第二種試劑為5-氟尿嘧啶。
28.權利要求3的方法，其中所述VEGFR-2特異性抑制劑進一步包含第二種多肽，所述 多肽包含與SEQ NO 1具有至少80%同一性的胺基酸序列。
全文摘要
本申請提供治療轉移癌的組合物及方法。有轉移瘤或有發展成轉移瘤風險的患者可得到治療。用於本發明的組合物包括VEGFR-2特異性抑制劑。
文檔編號A61P35/04GK101883578SQ200880110085
公開日2010年11月10日 申請日期2008年8月20日 優先權日2007年8月20日
發明者羅尼·馬姆盧克 申請人:百時美施貴寶公司