土壤微生物固碳酶提取的方法
2023-10-28 09:12:57 2
專利名稱：土壤微生物固碳酶提取的方法
技術領域：
本發明涉及生物化學與環境領域，更具體地講涉及一種土壤1，5 - 二磷酸核酮糖羧化酶/加氧酶(RubisCO)的提取和測定的方法。
背景技術：
我國面臨極大的溫室氣體減排壓力，增強陸地生態系統的碳匯功能是重要的溫室氣體減排機制之一。CO2的生物固定主要是通過植物和自養微生物進行。其中，自養微生物廣泛分布於不同的生態系統中，它們具有很強的環境適應能力，可以在多種環境條件包括火山口，海洋深處，湖泊盆地等植物無法生存的生境下，參與(X)2的固定。因而，從整個生物圈的物質、能量流來看，研究微生物固碳的生態環境效益最具現實意義。土壤微生物通過特殊的生物固碳途徑將大氣CO2轉化為有機碳併合成自身細胞物質(微生物量碳)，進入土壤有機碳的循環，對於增加土壤碳固持及減緩全球(X)2濃度升高具有不可忽視的作用。近年來，我們採用同位素標記技術的研究發現，土壤微生物的固碳潛力巨大。目前發現的五條主要生物固碳途徑中，卡爾文循環是自養生物固定(X)2的主要途徑，其中核酮糖-1，5" 二磷酸梭化酶/加氧酶(RubisCO)是卡爾文循環中的關鍵酶，該酶催化卡爾文循環中的第一步CO2固定反應，據估計它每年約固定5X IO14千克的C02。目前自然界存在的不同類型1，5_ 二磷酸核酮糖羧化酶/加氧酶(RubisCO)已被鑑定出來，按照其結構，催化性能和對O2的敏感性可分為I -IV。在目前生境條件下，1，5_ 二磷酸核酮糖羧化酶/加氧酶(RubisCO)I是主要功能者，並普遍存在於高等植物，藻類和原核生物中。1，5 -二磷酸核酮糖羧化酶/加氧酶(RubisCO)首先由Wildman和Bormer於1947年從菠菜可溶性蛋白中發現，並用分光光度法測定了該酶活性，1971年又發現該酶具有雙重功能，除羧化作用外，還具有催化1，5-二磷酸核酮糖(RuBP)氧化作用，從此該酶稱為1，5_ 二磷酸核酮糖羧化酶酶 / 加氧酶(Rubulose Bisphosphate Carboxylase, EC4. 1. 1. 39，簡稱 RubisCO)。 繼Tabtia FR和Kusian B的綜述之後，人們採用分離培養技術和14C標記或者分光光度法測定了光合細菌和化能自養細菌1，5 - 二磷酸核酮糖羧化酶/加氧酶(RubisCO)活性， 並對自養微生物1，5_ 二磷酸核酮糖羧化酶/加氧酶(RubisCO)的結構特性、基因調節等方面進行了較為詳細的研究。然而，由於用傳統的方法只能分離0. 19Γ0. 5%的環境微生物 (Amann et al. , 1995)，因此從環境中簡單提取固碳微生物很難全面了解固碳自養細菌的多樣性及其1，5 - 二磷酸核酮糖羧化酶/加氧酶(RubisCO)活性，更加不能得到其在土壤生態系統中的生活特徵和生態功能的信息。目前，隨著分子生物學技術的迅速發展，通過設計通用PCR引物，對環境樣品固碳微生物1，5_ 二磷酸核酮糖羧化酶/加氧酶(RubisCO)編碼基因進行多樣性研究成為可能，Paul在高鹽條件(5 M MgCl2)下的海水與深海盆地的臨界面獲得了細菌RubisCO的大亞基基因(MM，cbbM)的遺傳信息及其群落結構特徵；2003 年Tolli和King在松樹林和農業生態系統不同土層深度的土壤中許多屬於1，5 - 二磷酸核酮糖羧化酶/加氧酶(RubisCO) I的新基因型，它們僅於兼性化能自養菌有較近的親緣關係。他們的工作是首次在農田生態系統中開展固碳微生物1，5- 二磷酸核酮糖羧化酶/加氧酶(RubisCO)編碼基因的多樣性研究。然而目前的研究並未涉及環境樣品中RubisCO 提取及活性測定方法，尤其是1，5 - 二磷酸核酮糖羧化酶/加氧酶(RubisCO)活性與環境微生物固碳能力的關係更是缺乏系統的研究。因此，發展高效、通用的土壤1，5_ 二磷酸核酮糖羧化酶/加氧酶(RubisCO)提取及活性測定方法對準確評估土壤微生物的固碳潛力具
有重要意義。
發明內容
本發明的目的是在於提供了一種土壤微生物固碳酶提取的方法(土壤微生物固碳關鍵酶1，5 - 二磷酸核酮糖羧化酶/加氧酶(RubisCO)的提取及活性測定的方法)，該方法操作簡便、快速，技術要求相對較低，測定結果精密度和準確度高、重複性好，適合於大批量土壤固碳酶1，5 - 二磷酸核酮糖羧化酶/加氧酶(RubisCO)活性的精確測定。土壤微生物固碳關鍵酶1，5- 二磷酸核酮糖羧化酶/加氧酶(RubisCO)提取方法包括樣品前處理、土壤微生物蛋白(1，5- 二磷酸核酮糖羧化酶/加氧酶RubisCO粗液)的提取及酶活性測定，一種土壤微生物固碳酶提取的方法，其步驟是
A、土壤樣品的預處理
(1)稱取5克新鮮土樣(土樣去除植物根系混勻後立即進行預處理，否則所測得酶活性與真實值會有偏差)於50毫升無菌離心管中；
(2)加5倍體積預冷的土壤各種離子、無機物以及有機物胞外游離的蛋白去除劑 (TENP緩衝液)渦旋混勻，於室溫(20-25°C，以下相同)10，OOOXg離心10分鐘，收集沉澱， 重複該步驟兩次；用於去除減少土壤中各種離子、無機物以及有機物，胞外游離的蛋白，特別是減少腐殖酸類物質的汙染。所述的離子為鈣離子(Ca2+)、鋁離子(A13+)，鎂離子(Mg2+)，鐵離子(Fe2+)， 鎂離子(Mn2+)、鉀離子(K+)。所述的無機物為硫酸鋁A12(S04)3，硫酸鎂MgS04，硫化亞鐵FeS，硫酸錳MnS04，碳酸鈣CaC03；鹼金屬(Na、K)。所述的有機物為腐植物質，動物毛髮和未被微生物降解的植物根系及枯枝落葉。所述的土壤離子去除劑(TENP緩衝緩)為50毫摩爾/升的三(羥甲基)氨基甲烷鹽酸鹽緩衝溶液(Tris-HCl )，20毫摩爾/升的乙二胺四乙酸(EDTA)，100毫摩爾/升的氯化鈉，0. 01克/毫升的聚乙烯吡咯烷酮(PVPP)，pHlO. 0
(3)加5倍體積預冷的磷酸緩衝液(0.01M，pH 7.4),渦旋混勻，於室溫10，000Xg離心 10分鐘，收集沉澱，重複該步驟兩次；用於平衡滲透壓、維持離子強度和PH (7. 4)。(4)加5倍體積的無菌超淨水，渦旋混勻，於室溫10，OOOXg離心10分鐘，收集沉澱；用於洗滌沉澱並主要去除無機鹽離子。(5)沉澱通過冷凍乾燥後獲得無雜質的土樣凍乾粉，置於-700C備用。土壤微生物蛋白(RubisCO粗液)提取
(1)稱取2.0克上述預處理後的冷凍乾燥樣品於10毫升預冷無菌離心管中，加6mL細胞樣品蛋白提取液，渦旋混勻，每個樣品3次重複；
所述的細胞樣品提取液配比為100毫摩爾/升的三(羥甲基)氨基甲烷鹽酸鹽緩衝溶液(Tris-HCl)，1毫摩爾/升的二硫蘇糖醇(DTT)，pH 7. 8，100微升2. 0微克/毫升的蛋白酶抑制劑(P印statin)；
(2)置於冰浴中用超聲波法徹底破碎細胞(超聲波細胞破碎儀，佔空比50%，輸出功率 600W，破碎時間20分鐘)；
(3)20000Xg，4°C下離心15分鐘，收集上清液，重複離心操作一次，確保所有的蛋白液均被收集。加入質量比為80%的固體硫酸銨溶解度後，置於4°C振蕩充分混勻，20000Xg， 4°C下離心20分鐘，收集析出的蛋白，加50微升的1，5 - 二磷酸核酮糖羧化酶/加氧酶 (RubisCO)溶解液溶解後，獲得土壤微生物蛋白(RubisCO粗液)後，置於0°C保存待用。所述的1，5 - 二磷酸核酮糖羧化酶/加氧酶(RubisCO)溶解液配比為100毫摩爾 /升PH 7.8的三(羥甲基)氨基甲烷鹽酸鹽緩衝溶液(Tris-HCl)和1毫摩爾/升的的二硫蘇糖醇(DTT)。土壤1，5 - 二磷酸核酮糖羧化酶/加氧酶(RubisCO)酶活性測定
測定前將土壤微生物蛋白(RubisCO粗液)提取溶液置於30°C水浴中2(Γ30分鐘以恢復酶活性，測定時環境溫度保持30°C。每個樣品酶活性測定三次，同時做兩個陰性對照，分別為無反應底物1，5_ 二磷酸核酮糖(RuBP)對照和熱變性細胞蛋白提取物對照。1，5_ 二磷酸核酮糖羧化酶/加氧酶(RubisCO)活性以二磷酸核酮糖羧化酶(RuBPCase)的酶活力大小來表示。二磷酸核酮糖羧化酶(RuBPCase)的活力測定的反應體系為二磷酸核酮糖羧化酶的活力反應體系為75 μ L 5毫摩爾/升的煙醯胺腺嘌呤二核苷酸、75 μ L 50毫摩爾/ 升的三磷酸腺苷、50 μ L的酶提取液、75 μ L 50毫摩爾/升的磷酸肌酸、75 μ L 0. 2毫摩爾/升的碳酸氫鈉、700yL的反應介質(200毫摩爾/升ρΗ 7.8的三(羥甲基)氨基甲烷鹽酸鹽緩衝溶液(Tris-HCl )，2毫摩爾/升的二硫蘇糖醇(DTT)，2毫摩爾/升的氯化鎂)、 IOOuL 150活力單位/毫升的磷酸肌酸激酶、200 μ L 300個活力單位/毫升的磷酸甘油酸激酶和100 μ L 150個活力單位/毫升的磷酸甘油醛脫氫酶。測定前須檢測所使用的磷酸肌酸激酶、磷酸甘油酸激酶和磷酸甘油醛脫氫酶活性達到本方法要求才可繼續下遊操作。(1)將配製好的反應體系搖勻，倒入比色杯內，以蒸餾水為空白，在紫外分光光度計上340 nm處反應體系的吸光度作為零點值。將50微升1，5_ 二磷酸核酮糖(25毫摩爾 /升)加於比色杯內，並馬上計時，每隔30秒測一次吸光度，共測3分鐘。以計時起到第1 分鐘內吸光度下降的絕對值計算酶活力，另外，以相應的熱變性細胞蛋白提取物作對照。(2)不加1，5_ 二磷酸核酮糖(RuBP)的對照，對照的反應體系與上述酶反應體系完全相同，不同之處只是把酶提取液放在最後加，加後立即計時並測定此反應體系在340nm 處的吸光度，記錄前1分鐘內吸光度的變化量，計算酶活力時應減去這一變化量。該步驟可以消除酶提取液中磷酸甘油酸(PGA)，對酶活力測定產生的誤差。(3) 二磷酸核酮糖羧化酶(RuBPCase)的酶活力的計算 (nmol CO2 kg-1 ( 土壤 ^mirT1)= AAXNXC /(6. 22 X 2d At)
式中ΔΑ —反應最初Imin內340nm處吸光度變化的絕對值(減去空白和對照液最初 Imin的變化量)；
酶活力為每分鐘每千克蛋白土壤固定(X)2的納摩爾(nmol)數； N一稀釋倍數；
C 一換算係數，(每千克預處理后土樣凍乾粉所提取的50微升酶液體積當量，值為5X102)；
6. 22 一每微摩爾(μ mol)的煙醯胺腺嘌呤二核苷酸(NADH)在340 nm處的吸光係數； 2 一每固定1摩爾(X)2有2摩爾的煙醯胺腺嘌呤二核苷酸(NADH)被氧化； d—比色光程(釐米) kg—1 —每千克預處理后土樣凍乾粉 At—測定時間為1分鐘。經過計算最後得到每千克無雜質土壤中微生物固碳酶的總活性。採用本發明所提供的方法具有下述突出的特點
1.採用土壤離子去除劑(TENP緩衝緩)和磷酸緩衝液對土樣進行預處理，減少了土壤中各種離子、無機物以及有機物，胞外游離的蛋白，特別是減少腐殖酸類物質的汙染。其中土壤離子去除劑(TENP緩衝緩)中含有的PVPP (聚乙烯吡咯烷酮)，有效去除了對土壤蛋白提取及含量測定影響較大的腐殖酸類物質，因此，測定的土壤蛋白結果重複性，精密度和準確度高。2.採用超聲波破碎法(佔空比50%，輸出功率600瓦特，破碎時間20分鐘)。提取土壤微生物胞內蛋白，不僅蛋白產量高，而且能很好保留土壤中生物活性物質如酶活性，相比較常用的土壤蛋白質提取方法，提高了 10(Γ200%，如化學裂解破碎和液氮凍融法。本發明的土壤微生物蛋白提取可以用於土壤其他活性物質的提取和相關分子生物學的(功能基因)分析。3.本發明中1，5 - 二磷酸核酮糖羧化酶/加氧酶(RubisCO)的酶活性測定過程中試劑使用量較常規方法減半，但測定的靈敏度相應提高，而且無任何放射性或高毒性物質， 具有典型的環境友好特性。4.本發明中1，5 - 二磷酸核酮糖羧化酶/加氧酶(RubisCO)酶活性測定增加了一個失活酶陰性對照，在一定程度上減少了土壤蛋白共提雜質對測定結果的幹擾，極大提高了酶活性測定結果可靠性。5.本發明的酶活性測定操作簡便、快速，技術要求相對較低，適合大批量樣品的分析測定。6.實用性廣，適合於旱地土壤、淹水稻田土壤、汙泥等環境樣品中RubisCO酶活性測定中的應用。
圖1為一種光照和遮光培養條件下，土壤微生物固碳關鍵酶1，5 - 二磷酸核酮糖羧化酶/加氧酶(RubisCO)酶活性示意圖。圖2為一種土壤固碳量(14C-SOC)與固碳關鍵酶1，5 - 二磷酸核酮糖羧化酶/加氧酶(RubisCO)酶活性的相關關係示意圖。
具體實施例方式實施例1
土壤微生物固碳關鍵酶1，5_ 二磷酸核酮糖羧化酶/加氧酶(RubisCO)酶的提取及活性測定方法，其步驟如下稱取樣品土壤5克於50毫升無菌離心管中，加入25毫升預冷的土壤各種離子、無機物、以及有機物胞外游離的蛋白去除劑(TENP緩衝液)，渦旋混勻，然後於室溫10，OOOXg離心10分鐘，收集沉澱。重複該步驟兩次；然後加入25毫升預冷的磷酸緩衝液(0. 01摩爾/ 升，pH7. 4)，渦旋混勻，於室溫10，000 X g離心10分鐘，收集沉澱，重複該步驟兩次；最後加入25毫升的無菌超淨水，渦旋混勻，於室溫10，OOOXg離心10分鐘，收集沉澱。沉澱即為提取的粗蛋白沉澱物。沉澱通過冷凍乾燥後置於_70°C備用。所述的離子為鈣離子(Ca2+)、鋁離子(A13+)，鎂離子(Mg2+)，鐵離子(Fe2+)， 鎂離子(Mn2+)、鉀離子(K+)。所述的無機物為硫酸鋁A12(S04)3，硫酸鎂MgS04，硫化亞鐵FeS，硫酸錳MnS04，碳酸鈣CaC03；鹼金屬(Na、K)。所述的有機物為腐植物質(富理酸、胡敏酸、胡敏素)，動物毛髮(鼠類、鳥類)和未被微生物降解的植物根系(水稻、小麥、黑麥草、玉米根系、樹木細根和粗根系)及枯枝落葉 (水稻、小麥、黑麥草、玉米落葉和樹木的落枝)。所述的土壤離子去除劑(TENP緩衝液)配方50毫摩爾/升的三(羥甲基)氨基甲烷鹽酸鹽緩衝溶液(Tris-HCl)，20毫摩爾/升的乙二胺四乙酸(EDTA)，100毫摩爾/升的氯化鈉，0. 01克/毫升的聚乙烯吡咯烷酮(PVPP)，pHlO. 0
土壤微生物蛋白(1，5 - 二磷酸核酮糖羧化酶/加氧酶(RubisCO)酶液)提取 取粗蛋白沉澱物2. 0克於10毫升的預冷無菌離心管中，加入6毫升細胞樣品蛋白提取液，渦旋混勻，每個樣品3次重複；置於冰浴中，用超聲波法徹底破碎細胞(超聲波細胞破碎儀，佔空比50%，輸出功率600W，破碎時間20分鐘)；20000 X g，4°C下離心15分鐘，收集上清液，重複離心操作一次，確保所有的蛋白液均被收集。加入固體硫酸銨至80%溶解度後， 置於4°C振蕩充分混勻，20000 X g，4°C下離心20分鐘，收集析出的蛋白，加50微升的1，5 -二磷酸核酮糖羧化酶/加氧酶(RubisCO)溶解液溶解後，溶解液即1，5_ 二磷酸核酮糖羧化酶/加氧酶(RubisCO)酶液，然後置於0°C保存待用。所述的細胞樣品提取液配比為100毫摩爾/升的三(羥甲基)氨基甲烷鹽酸鹽緩衝溶液(Tris-HCl)，1毫摩爾/升的二硫蘇糖醇(DTT)，pH7. 8，100微升2. 0微克/毫升的蛋白酶抑制劑(P印statin)；
所述的RubisCO溶解液配比為100毫摩爾/升的三(羥甲基)氨基甲烷鹽酸鹽緩衝溶液(Tris-HCl) (pH 7. 8)和1毫摩爾/升的二硫蘇糖醇(DTT) 土壤RubisCO酶活性測定
測定前將前述置於0°C的1，5 - 二磷酸核酮糖羧化酶/加氧酶(RubisCO)蛋白溶液置於30°C水浴中20分鐘以恢復酶活性，測定時環境溫度保持30°C。每個樣品酶活性測定三次，同時做兩個陰性對照，分別為無反應底物1，5_ 二磷酸核酮糖(RuBP)對照和熱變性細胞蛋白提取物對照。1，5_ 二磷酸核酮糖羧化酶/加氧酶(RubisCO)活性以二磷酸核酮糖羧化酶(RuBPCase)的酶活力大小來表示。二磷酸核酮糖羧化酶的活力反應體系為75 μ L 5毫摩爾/升的煙醯胺腺嘌呤二核苷酸、75 μ L 50毫摩爾/升的三磷酸腺苷、50 μ L的酶提取液、75 μ L 50毫摩爾/升的磷酸肌酸、75 UL 0. 2毫摩爾/升的碳酸氫鈉、700μ L的反應介質(200毫摩爾/升pH 7.8 的三(羥甲基)氨基甲烷鹽酸鹽緩衝溶液(Tris-HCl)，2毫摩爾/升的二硫蘇糖醇(DTT)，2毫摩爾/升的氯化鎂)、100 μ L 150活力單位/毫升的磷酸肌酸激酶、200 μ L 300個活力單位/毫升的磷酸甘油酸激酶和100 μ L 150個活力單位/毫升的磷酸甘油醛脫氫酶。測定前須檢測所使用的磷酸肌酸激酶、磷酸甘油酸激酶和磷酸甘油醛脫氫酶活性達到本方法要求才可繼續下遊操作。(1)將配製好的反應體系搖勻，倒入比色杯內，以蒸餾水為空白，在紫外分光光度計上340nm處反應體系的吸光度作為零點值。將50微升1，5_ 二磷酸核酮糖(25毫摩爾/ 升)加於比色杯內，並馬上計時，每隔30秒測一次吸光度，共測3分鐘。以計時起到第1分鐘內吸光度下降的絕對值計算酶活力，另外，以相應的熱變性細胞蛋白提取物作對照。(2)不加1，5_ 二磷酸核酮糖(RuBP)的對照，對照的反應體系與上述酶反應體系完全相同，不同之處只是把酶提取液放在最後加，加後立即計時並測定此反應體系在340nm 處的吸光度，記錄前1分鐘內吸光度的變化量，計算酶活力時應減去這一變化量。該步驟可以消除酶提取液中磷酸甘油酸(PGA)，對酶活力測定產生的誤差。(3) 二磷酸核酮糖羧化酶(RuBPCase)的酶活力的計算 (nmol CO2 kg-1 ( 土壤 ^mirT1)= AAXNXC /(6. 22 X 2d At)
式中ΔΑ —反應最初Imin內340nm處吸光度變化的絕對值(減去空白和對照液最初 Imin的變化量)；
酶活力為每分鐘每千克蛋白土壤固定(X)2的納摩爾(nmol)數； N一稀釋倍數；
C 一換算係數，(每千克預處理后土樣凍乾粉所提取的50微升酶液體積當量，值為 5X102)；
6. 22 一每微摩爾(μ mol)的煙醯胺腺嘌呤二核苷酸(NADH)在340 nm處的吸光係數； 2 一每固定1摩爾(X)2有2摩爾的煙醯胺腺嘌呤二核苷酸(NADH)被氧化； d—比色光程(釐米) kg—1 —每千克預處理后土樣凍乾粉 At—測定時間為1分鐘實施例2
採用wC-CO2連續標記技術，探討光照和遮光對土壤微生物固碳關鍵酶1，5 - 二磷酸核酮糖羧化酶/加氧酶(RubisCO)活性的影響及其與固碳量的關係
分別選取亞熱帶區4種典型旱地和稻田土壤，設置旱土和水稻土的裸土和遮光處理， 每處理重複4次。應用碳同位素(14C)連續示蹤技術，通過室內密閉模擬系統，探討土壤微生物固碳關鍵酶1，5 - 二磷酸核酮糖羧化酶/加氧酶(RubisCO)活性及其與固碳量(14C-SOC) 的關係。標記培養80d後取樣，採用本發明的方法測定土壤微生物固碳關鍵酶1，5_ 二磷酸核酮糖羧化酶/加氧酶(RubisCO)活性大小(圖1)及其與土壤固碳量的關係(RubisCO活性=13. 7*固碳量+69. 9，圖2)。其它實施步驟與實施例1相同。
權利要求
1. 一種土壤微生物固碳酶提取的方法，其步驟是A、土壤樣品的預處理a、稱取新鮮土樣於無菌離心管中；b、加5倍體積預冷的土壤各種離子、無機物以及有機物，胞外游離的蛋白去除劑渦旋混勻，於室溫10，OOOXg離心10分鐘，收集沉澱，重複該步驟兩次；用於去除減少土壤中各種離子、無機物以及有機物，胞外游離的蛋白；所述的離子為鈣離子、鋁離子、鎂離子、鐵離子、鎂離子、鉀離子；所述的無機物為硫酸鋁、硫酸鎂、硫化亞鐵、硫酸錳、碳酸鈣、鹼金屬；所述的有機物為富理酸、胡敏酸、胡敏素、鼠類、鳥類、水稻、小麥、黑麥草、玉米根系、 樹木細根和粗根系及水稻、小麥、黑麥草、玉米落葉和樹木的落枝；所述的土壤離子去除劑為50毫摩爾/升的三(羥甲基)氨基甲烷鹽酸鹽緩衝溶液， 20毫摩爾/升的乙二胺四乙酸，100毫摩爾/升的氯化鈉，0.01克/毫升的聚乙烯吡咯烷酮，ρΗΙΟ.Ο ；c、加5倍體積預冷的磷酸緩衝液，0.01M, pH 7. 4，渦旋混勻，於室溫10，000 X g離心10 分鐘，收集沉澱，重複該步驟兩次；用於平衡滲透壓、維持離子強度和PH7. 4 ；d、加5倍體積的無菌超淨水，渦旋混勻，於室溫10，OOOXg離心10分鐘，收集沉澱；用於洗滌沉澱並主要去除無機鹽離子；e、沉澱通過冷凍乾燥後獲得無雜質的土樣凍乾粉，置於-70°C備用；B、土壤微生物蛋白提取a、稱取2.0克上述預處理後的冷凍乾燥樣品於10毫升預冷無菌離心管中，加6mL細胞樣品蛋白提取液，渦旋混勻，每個樣品3次重複；所述的細胞樣品提取液配比為100毫摩爾/升的三(羥甲基)氨基甲烷鹽酸鹽緩衝溶液，1毫摩爾/升的二硫蘇糖醇，PH 7. 8，100微升2. 0微克/毫升的蛋白酶抑制劑；b、置於冰浴中用超聲波法徹底破碎細胞；20000Xg，4°C下離心15分鐘，收集上清液，重複離心操作一次，所有的蛋白液均被收集，加入質量比為80%的固體硫酸銨溶解度後，置於4°C振蕩充分混勻，20000Xg，4°C下離心20分鐘，收集析出的蛋白，加50微升的1，5 - 二磷酸核酮糖羧化酶/加氧酶溶解液溶解後，獲得土壤微生物蛋白後，置於0°C保存待用；所述的1，5-二磷酸核酮糖羧化酶/加氧酶溶解液配比為100毫摩爾/升pH 7.8的三(羥甲基)氨基甲烷鹽酸鹽緩衝溶液和1毫摩爾/升的的二硫蘇糖醇；C、土壤1，5- 二磷酸核酮糖羧化酶/加氧酶酶活性測定測定前將土壤微生物蛋白提取溶液置於30°C水浴中2(Γ30分鐘以恢復酶活性，測定時環境溫度保持30°C，每個樣品酶活性測定三次，同時做兩個陰性對照，分別為無反應底物 1,5- 二磷酸核酮糖對照和熱變性細胞蛋白提取物對照，1,5- 二磷酸核酮糖羧化酶/加氧酶活性以二磷酸核酮糖羧化酶的酶活力大小來表示；a、將配製好的反應體系搖勻，倒入比色杯內，以蒸餾水為空白，在紫外分光光度計上 340 nm處反應體系的吸光度作為零點值，將50微升1，5_ 二磷酸核酮糖加於比色杯內，並計時，每隔30秒測一次吸光度，共測3分鐘，以計時起到第1分鐘內吸光度下降的絕對值計算酶活力；b、不加1，5-二磷酸核酮糖的對照，對照的反應體系與上述酶反應體系完全相同，不同之處只是把酶提取液放在最後加，加後計時並測定此反應體系在340nm處的吸光度，記錄前1分鐘內吸光度的變化量，計算酶活力時應減去這一變化量；c、二磷酸核酮糖羧化酶的酶活力的計算nmol CO2 kg-1 ( 土壤).mirT1 = AAXNXC /(6. 22 X 2d At) 式中ΔΑ —反應最初Imin內340nm處吸光度變化的絕對值； N一稀釋倍數； C一換算係數；·6. 22 一每微摩爾的煙醯胺腺嘌呤二核苷酸在340 nm處的吸光係數； 2 一每固定1摩爾(X)2有2摩爾的煙醯胺腺嘌呤二核苷酸被氧化； d-比色光程；kg—1 —每千克預處理后土樣凍乾粉； At—測定時間為1分鐘。
2.根據權利要求1所述的一種土壤微生物固碳酶提取的方法，其特徵在於所述的二磷酸核酮糖羧化酶的活力反應體系為75 μ L 5毫摩爾/升的煙醯胺腺嘌呤二核苷酸、75 μ L 50毫摩爾/升的三磷酸腺苷、50 μ L的酶提取液、75 μ L 50毫摩爾/升的磷酸肌酸、75 μ L 0. 2毫摩爾/升的碳酸氫鈉、700 μ L的反應介質200毫摩爾/升ρΗ 7. 8的三(羥甲基)氨基甲烷鹽酸鹽緩衝溶液，2毫摩爾/升的二硫蘇糖醇，2毫摩爾/升的氯化鎂、100 μ L 150活力單位/毫升的磷酸肌酸激酶、200 μ L 300個活力單位/毫升的磷酸甘油酸激酶和 IOOuL 150個活力單位/毫升的磷酸甘油醛脫氫酶。
全文摘要
本發明公開了一種土壤微生物固碳酶提取的方法，其步驟A把土壤依次加入預冷的離子去除劑、磷酸緩衝液，混勻後，於室溫離心，收集沉澱；B取A的沉澱物於細胞樣品蛋白提取液中，渦旋混勻，冰浴中用超聲波法破碎細胞，離心收集上清液，加入固體硫酸銨至溶解度後，振蕩混勻，離心收集析出的蛋白，加溶解液溶解後，保存；C將B的1，5–二磷酸核酮糖羧化酶/加氧酶蛋白溶液置於水浴中恢復酶活性，紫外分光光度計上測定1，5–二磷酸核酮糖羧化酶/加氧酶活性以每千克土壤固定CO2的納摩爾數數的酶活力。方法簡便、快速，測定結果重複性好，適合於大批量土壤微生物固碳關鍵酶1，5–二磷酸核酮糖羧化酶/加氧酶的提取及活性的測定。
文檔編號C12Q1/527GK102174496SQ201110036309
公開日2011年9月7日 申請日期2011年2月11日 優先權日2011年2月11日
發明者劉守龍, 吳金水, 童成立, 肖和艾, 葛體達, 袁紅朝 申請人:中國科學院亞熱帶農業生態研究所