用於單分子全基因組分析的方法和裝置的製作方法

2023-10-10 02:13:09 4

專利名稱：用於單分子全基因組分析的方法和裝置的製作方法
技術領域：
本發明涉及納米流體領域和DNA測序領域。
背景技術：
大分子是由許多化學單元彼此相連構成的長的聚合物鏈。多核苷酸是一類大分子，其包括例如DNA和RNA。多核苷酸由核苷酸的長序列構成。核苷酸的序列與生物體的基因組和後基因組的基因表達信息直接相關。對序列區域、基序和功能單元例如開放閱讀框(ORF)、非翻譯區(UTR)、外顯子、內含子、蛋白因子結合位點、表觀基因組位點例如CpG簇、microRNA位點、小幹擾RNA(SiRNA)位點、大型幹涉性非編碼RNA(IincRNA)位點和其他功能單元的直接測序和作圖，在評估個體的基因組組成中都是重要的。在許多情況下，這些核苷酸序列在個體生命期間的複雜重排例如插入、缺失、倒位和移位，導致了疾病狀態例如遺傳異常或惡性細胞。在其他情況下，在個體之間以拷貝數變異(CNV)形式表現的序列差異反映出群體遺傳組成的多樣性及其對環境刺激和信號例如藥物治療的差異響應性。在其他情況下，例如DNA甲基化、組蛋白修飾、染色質摺疊這樣的過程或其他改變DNA或DNA-蛋白質相互作用的變化，影響基因的調控、表達以及最終的細胞功能，導致疾病和癌症。已經發現，即使在健康個體之間，基因組結構變異(SV)也比以前所想像的要廣泛得多。因此，對於人類健康和常見遺傳疾病來說，理解具有結構變異信息的基因組序列的重要性變得越來越明顯。功能單元和共有結構變異被認為涵蓋了從數十鹼基到兆鹼基以上。因此，在多個個體的測序和精細規模作圖計劃中，在沿著大的天然基因組分子上跨越從千鹼基以下到兆鹼基的解析度尺度的直接、廉價且靈活的揭示序列信息和SV的方法，是極為需要的，以便對以前未表徵的基因組特點進行編目。此外，生物系統、特別是在多倍體生物例如人類中的表型多態性或疾病狀態，是從母系和父系遺傳而來的兩個單倍體基因組之間相互影響的結果。具體來說，癌症通常是二倍體染色體病變中雜合性喪失的結果。常規的細胞遺傳學方法例如核型分析、FISH(螢光原位雜交)提供了少至單個細胞中基因組組成的全局視圖，它們能夠有效揭示基因組的大體變化，例如數千和數百萬鹼基對的大片段的非整倍性、獲得、喪失或重排。但是，這些方法的缺點在於在檢測中等到小型序列基序或病變中相對低的靈敏度和解析度。這些方法也是繁瑣的，限制了速度和不一致性。更近些的用於檢測目標序列區域、序列基序和SV的方法，例如aCGH(陣列比較基因組雜交)、fiberFISH或大規模雙末端測序，已經在解析度和通量方面有所改進。但是，這些方法不直接、繁瑣、昂貴並且依賴於現有的參比資料庫。此外，這些方法可能具有有限的固定解析度，並提供依賴於返回到參比基因組作圖進行重新組裝所推斷出的位置信息或比較強度比信息。因此，這樣的方法不能揭示平衡的病變事件例如倒位或移位。目前的測序分析方法受到可用技術的限制，並主要基於源自於具有非常有限的單倍型信息的平均多倍性基因組材料的樣品。目前用於從異源細胞群體提取混合的二倍體基因組材料的前端樣品製備方法，有效地將材料碎裂成較小碎片，導致二倍體基因組天然的決定性重要結構信息的破壞。即使是更近些時候開發的第二代方法，儘管具有改進的通量，但是由於短得多的測序讀取結果的組裝更加困難，使複雜的基因組信息的草圖繪製更加複雜化。總體來說，短的讀取結果更難以單值地排列在複雜的基因組中，並且需要附加序列信息來解譯短的靶區域的線性順序。為了達到類似的組裝置信度，需要將測序覆蓋率提高到25倍的級別，而不是在常規BAC和所謂的鳥槍法Sanger測序中的8-10倍的覆蓋率(Wendl MC, Wilson RK, 醫學DNA測序中的覆蓋率情況(Aspects of coverage in medical DNA測序)，BMC Bioinformatics，16 May 2008 ；9 :239)。這種多倍的測序覆蓋率必然需要高成本，有效上阻止了在本技術領域中將測序費用降低到1000美元的標杆以下的最高目標。因此，大的完整的基因組分子的單分子水平分析，通過不使用克隆過程或擴增而對序列基序進行原位精細作圖，提供了保留精確的天然基因組結構的可能性。基因組片段越大，基因組樣品中樣品群體的複雜度越低，例如，在理想的情形下，為了覆蓋整個正常二倍體人類基因組，在單分子水平上只需要分析46個染色體長度的片段，並且從這種方法產生的序列天然具有完整的單倍型信息。此外，可以從細胞提取兆鹼基規模的基因組片段並將其保留用於直接分析，這極大地降低了複雜的算法和組裝的負擔，同時也將原始背景下的基因組和/或表觀基因組信息與個體的細胞表型更直接地相關聯。除了基因組學之外，在過去20年左右，由於在人類疾病例如癌症中的作用，表觀基因組學領域突出的重要性已經越來越多地被認識到。隨著基因組學和表觀基因組學兩個領域知識的積累，一個主要的挑戰是理解基因組和表觀基因組因素如何直接或間接與人類疾病和惡性腫瘤中多態性或病理生理狀況的發生相關。全基因組分析的概念已經從劃分在幾個主要是獨立進行研究的基因組測序、表觀基因組甲基化分析和功能基因組學領域中的方法，向越來越多方面的整體方法演化。DNA測序、結構變異作圖、CpG島甲基化模式、組蛋白修飾、核小體改構、microRNA功能和轉錄圖譜已經被越來越多地以系統性方式更緊密地看待，但是，檢測細胞分子狀態的每種上述方面的技術通常是獨立的、繁瑣的和不相容的， 嚴重阻礙了具有相關聯的實驗數據結果的整體分析。因此，在本技術領域中，對於能夠對大的、完整的天然生物樣品進行單分子水平分析、以便能夠確定靶樣品的基因組和表觀基因組信息的方法和裝置，存在著需求。這樣的方法和裝置將為研究人員和臨床醫生等提供非常強有力的工具。發明簡述在應對所述挑戰中，要求保護的本發明首先提供了對DNA進行表徵的方法，所述方法包含對包含第一 DNA鏈和第二 DNA鏈的雙鏈DNA進行處理，以產生第一 DNA鏈的未雜交的懸片段(flap)和第二 DNA鏈上的相應區域，未雜交的懸片段包含約1到約1000個鹼基；沿著第二 DNA鏈的相應區域延伸第一 DNA鏈；以及標記未雜交的懸片段的至少一部分、 延伸的第一 DNA鏈的一部分或兩者。還提供了鑑定DNA之間的結構變異的方法，所述方法包含在第一雙鏈DNA上標記兩個或多個第一 DNA上的序列特異性位置；在第二雙鏈DNA上標記兩個或多個第二 DNA上的相應序列特異性位置；將第一雙鏈DNA的至少一部分線性化；將第二雙鏈DNA的至少一部分線性化；以及比較線性化的第一雙鏈DNA上兩個或多個標記物之間的距離與線性化的第二雙鏈DNA上相應標記物之間的距離。還公開了從DNA獲得結構信息的方法，所述方法包含在第一雙鏈DNA上標記一個或多個第一 DNA上的序列特異性位置；在第二雙鏈DNA上標記第二雙鏈DNA上相應的一個或多個序列特異性位置；將第一雙鏈DNA的至少一部分線性化；將第二雙鏈DNA的至少一部分線性化；以及比較線性化的第一雙鏈DNA的至少一個標記物的信號強度與線性化的第二雙鏈DNA的至少一個標記物的信號強度。還提供了從大分子獲得結構信息的方法，所述方法包含將包含至少一個從其伸出的懸片段的大分子，沿著其中置有至少一個縊縮段(constriction)的通道移位；以及檢測對應於大分子的至少一個懸片段從通道的至少一個縊縮段通過的至少一種信號。還提供了從大分子獲得結構信息的方法，所述方法包含標記大分子的至少一部分；將大分子固定化；將大分子的至少一部分置於通道中以使大分子的至少一部分在通道內線性化；以及檢測與大分子的標記部分相關的至少一種信號。還公開了分析系統，其包含包含至少一個寬度在約1到約100納米範圍內的通道的基材；所述基材包含至少一個固定化區域。還提供了對核酸聚合物進行表徵的方法，所述方法包含用一種或多種序列特異性基序標記物標記核酸聚合物的一個或多個區域；將來自一個或多個序列特異性基序標記物的一種或多種信號，與核酸聚合物的一個或多個序列特異性基序標記物的位置相關聯； 對核酸聚合物的一個或多個區段進行測序，所述一個或多個區段包括核酸聚合物的一個或多個序列特異性基序標記物；以及將一個或多個被測序的區段的一種或多種信號與標記的核酸聚合物的一個或多個相應信號進行比較，以便獲得兩個或多個被測序區段在核酸聚合物中的相對位置。


當結合隨附的圖閱讀時，發明簡述以及下面的詳細描述得到進一步理解。出於說明本發明的目的，在圖中顯示了本發明的示例性實施方案；但是，本發明不限於所公開的具體方法、組合物和裝置。此外，圖不是必須按比例繪製的。在圖中圖1描繪了本發明的懸片段標記方法的示意圖；圖2描繪了與從第一 DNA鏈產生的懸片段雜交的標記探針和駐留在第一鏈對應於懸片段的區域中的標記物；圖3描繪了將DNA 「條形碼」放置在聚核酸上的可選實施方案；圖4描繪了沿著基因組區域測序；圖5描繪了同時進行的平行測序和空間組裝；
圖6描繪了從核酸聚合物獲得基因組組裝信息；圖7是經歷過圖像分析的被標記DNA聚合物的軟體圖像；圖8描繪了本發明的光學和非光學檢測方案；圖9描繪了在納米通道或納米軌道中線性化的被標記核酸聚合物；圖10描繪了通過各種不同方法固定化在納米通道附近或其中的核酸聚合物；以及圖11描繪了置於納米通道或納米軌道中的核酸聚合物的磁和光捕獲。說明件實施方式的詳細描述通過與形成了本公開的一部分的隨附的圖和實施例相結合，參考下面的詳細描述，可以更容易地理解本發明。應該理解，本發明不限於本文中描述和/或顯示的具體裝置、方法、應用、條件或參數，並且在本文中使用的術語時出於描述僅僅作為實例的具體實施方案的目的，而不打算對本發明進行限制。此外，當在說明書包括隨附的權利要求書中使用時，除非另有指明，否則單數形式的指稱包括複數，並且對具體數值的指稱至少包括該具體數值。本文中使用的術語「多個」是指一個以上。當表述值的範圍時，另一個實施方案包括了從一個具體值和/或到另一個具體值。類似地，當通過使用先行詞「約」將值表示成近似值時，應該理解具體的值形成了另一個實施方案。所有範圍是包含性的和可組合的。應該理解，為了清楚起見，本發明的某些特徵在本文中描述在分開的實施方案的上下文中，它們也可以組合提供在單一實施方案中。相反，出於簡便而描述在單一實施方案的上下文中的本發明的各種不同特徵，也可以獨立或以任何子組合形式提供。此外，以範圍形式陳述的對值的指稱包括該範圍內的每個和所有值。在第一種情況下，本發明提供了對DNA進行表徵的方法，其包含對包含第一 DNA鏈和第二 DNA鏈的雙鏈DNA進行處理，以產生第一 DNA鏈的未雜交的懸片段和第二 DNA鏈上的相應區域，未雜交的懸片段包含約1到約1000個鹼基；沿著第二 DNA鏈的相應區域延伸第一 DNA鏈；以及標記未雜交的懸片段的至少一部分、延伸的第一 DNA鏈的一部分或兩者。適合情況下，懸片段長度為約1到約1000鹼基。適合情況下，懸片段長度為約20 到約100鹼基，或甚至在約30到約50鹼基的範圍內。方法還包含將一個或多個置換鹼基摻入到雙鏈DNA的第一鏈中，以便延伸第一 DNA鏈(懸片段從其揭下)以填補並消除由形成懸片段所留下的間隙(即目前第二 DNA鏈的相應區域)。用戶可以用一個或多個標籤標記被處理的雙鏈DNA的至少一部分(第一DNA 鏈、第二 DNA鏈、懸片段或其任意組合)。懸片段留下的填補空隙可以包括一個或多個被標記的部分。在某些實施方案中(未顯示)，可以使用懸片段移除酶切掉懸片段，留下摻入有一個或多個核苷酸的dsDNA。適合情況下，處理通過在雙鏈DNA的第一鏈上產生切口來完成。適合情況下，這種切口形成在一個或多個序列特異性位置處，儘管切口也可以在一個或多個非特異性位置、 包括隨機或非特異性位置處形成。適合情況下，切口形成通過將雙鏈DNA聚合物暴露於切口核酸內切酶或切口酶來實現。適合情況下，切口酶具有高度序列特異性，意味著它們以高度特異性與特定鹼基序列 (基序)結合。切口酶可以從例如New England BioLabs (www, neb, com)獲得。切口形成也可以通過其他在DNA鏈中執行斷裂或切開的酶來完成。這樣的斷裂或切口也可以通過暴露於電磁輻射(例如UV光)、一種或多種自由基等來實現。切口可以通過一種或多種這樣的技術來實現。適合情況下，將置換鹼基摻入雙鏈DNA的第一鏈(即產生切口的鏈)包含將DNA 與聚合酶、一種或多種核苷酸、連接酶或其任意組合相接觸。其他用於代替懸片段中存在的 「被剝離」鹼基的方法，對於本技術領域的專業人員來說也是已知的。適合情況下，將第一 DNA鏈沿著第二 DNA的相應區域延伸，所述區域是通過形成懸片段而留下/暴露出的。在某些實施方案中，聚合酶與產生懸片段的切口酶同時起作用。這些置換鹼基的摻入在概念上可以理解為填補由懸片段的形成和「剝離」所留下的間隙。通過填補間隙，以前由懸片段佔據的位置被一組適合情況下與位於懸片段上的鹼基具有相同序列的鹼基佔據。填充可以防止懸片段與懸片段以前所結合的DNA的第二鏈的重新雜交。適合情況下，標記可以通過(a)將至少一個互補探針與懸片段的至少一部分結合，所述探針包含一個或多個標籤，(b)利用包含一個或多個標籤的核苷酸作為沿著第二 DNA鏈的相應區域延伸的第一 DNA鏈的一部分的置換鹼基，或(a)和(b)的任意組合來實現。通過這種方式，可以對懸片段、填補空隙的鹼基或兩者進行標記。適合情況下，探針是包含本文別處所述的標籤的核酸(單個或多個)。探針可以是序列特異性的(例如AGGCTA，或某些其他特定鹼基序列)，儘管探針也可以隨機產生。正如本文別處描述的，可以根據用戶的意願選擇或構建探針，以使探針與目標序列結合，或在可選方案中，與特定DNA聚合物上目標序列的上遊或下遊序列或其他區域結合(即探針結合到目標區域的兩側或懸臂上)。探針可以與懸片段一樣長(即長達1000鹼基)。適合情況下，探針長度在1到約100鹼基、或約3到50鹼基的範圍內，或長度甚至在約5到約20鹼基的範圍內。這些方法的示意圖顯示在圖1中。在該圖中，顯示了懸片段的產生和得到的間隙的回填。回填可以使用所謂的「熱」或標記鹼基，並且懸片段可以與一個或多個與懸片段的至少一部分互補的探針相接觸。序列特異性的切口核酸內切酶或切口酶，在雙鏈DNA上產生單鏈切開間隙，聚合酶與切口位點結合併開始鏈延伸，並在同時產生了被置換的鏈或所謂的「剝離懸片段」。然後剝離懸片段產生了可用於測序與被標記探針序列特異性雜交以產生可檢測和可分辨信號的區域(即核酸聚合物的第二 DNA鏈上未雜交的相應區域)。圖Ib顯示了在納米通道中線性展開的標記的大基因組DNA。正如在圖的底部所示，螢光標記的懸片段能夠使用戶觀察到較大的大分子背景中探針的位置。正如所示，帶切口的標記大分子可以在納米通道內線性化。來自標籤的信號之間的空間距離是一致的， 因此可以被定量，這反過來提供了獨特的「條形碼」標誌樣式，其反映出關於所分析區域的特異性基因組序列信息。作為實例，顯示了由特定酶、包括但不限於Nb. BbvCI, Nb. BsmI, Nb. BsrDI、Nb. BtsI、Nt. AlwI、Nt. BbvCI、Nt. BspQI、Nt. BstNBI、Nt. CviPII 以及任何上述酶的組合消化產生的AdsDNA(總長度48. 51Λρ)的多個切口位點。包含了線性化的單個ADNA的圖像，以顯示與預期的切口酶產生位置雜交的螢光標記的寡核苷酸探針。這種沿著長的生物聚合物記錄到的實際條形碼，在本文中的其他地方被描述為觀察到的條形碼。通過將具有標記的懸片段、標記的間隙或兩者的大分子線性化，用戶能夠確定標記物彼此的相對位置。正如在本文別處所描述的，這樣的相對距離信息可用於診斷應用和核酸聚合物的表徵。在某些實施方案中，方法還包括獲得從摻入到雙鏈DNA的第一 DNA鏈中的一個或多個置換鹼基、從一個或多個與懸片段結合的探針、或從兩者衍生的序列信息。該序列信息可以以各種不同方式獲得。在一個實例中，將與特定鹼基序列互補的被標記探針導入懸片段，然後用戶確定該序列特異性探針是否與懸片段結合。這一過程可以使用具有不同序列特異性的探針重複幾次，最終使用戶能夠確定存在於懸片段中的鹼基序列。在另一個實例中，通過確定填補到懸片段留下的間隙中的鹼基序列來獲得序列信息。這可以通過用相同或不同的標記物標記一個或多個鹼基，並測定當鹼基被摻入到間隙中時或它們摻入到間隙中後所發出的信號。在其他實施方案中，用戶可以監測由將鹼基摻入到間隙中的聚合酶所產生的一種或多種信號，以確定鹼基序列。序列信息的測定可以在自由溶液中進行，或者可以在納米通道中進行，以便允許對單個DNA聚合物進行高解析度分析。也可以將懸片段用適合的酶切下，然後也可以對切下的懸片段本身進行測序。序列信息可以從單一懸片段、單一間隙或兩者獲得。但是，在某些實施方案中，序列信息從兩個或多個懸片段或間隙獲得，從而能夠對給定的靶進行更快測序。也可以通過使用序列特異性探針並確定這些探針與核酸聚合物的一部分結合的位置(以及是否結合)，來確定序列信息。圖4描繪了沿著相對長的基因組區域的測序。在該圖中，在將「親本」核酸聚合物用序列特異性切口內切核酸酶消化並在聚合物的第一鏈中進行聚合酶延伸後，產生了單鏈懸片段。該結構可以再次用切口內切核酸酶和切開懸片段與第一鏈的連接處(用箭頭顯示)的懸片段內切核酸酶消化，並且可以將得到的dsDNA在適合條件下變性，以產生跨越切口位點的單鏈間隙和懸片段內切核酸酶切割位點。然後可以將該間隙暴露於使用聚合酶延伸或使用特異性探針和酶的雜交和連接的測序反應。圖4b描繪了示意顯示了沿著長的dsDNA產生的多個切口位點、單鏈懸片段位點以及單鏈間隙位點。然後從一個或多個切口、懸片段序列位點或單鏈間隙位點處開始測序反應，其中測序通過聚合酶延伸或利用雜交或連接的測序來執行。各種不同物質可用作本發明方法的標籤。標籤可以是例如螢光團、量子點、樹枝狀聚合物、納米線、珠子、肽、蛋白、磁性珠、甲基、甲基轉移酶、非切割型限制性酶、鋅指蛋白、 抗體、轉錄因子、DNA結合蛋白、髮夾狀聚醯胺、形成三鏈體的寡脫氧核苷酸、肽核酸等。方法可以包括使用兩種或多種不同標籤，因此單一分子可以包含多種標籤。方法還包括從一個或多個標籤檢測一種或多種信號。這樣的信號可以包括螢光信號、化學發光信號、電磁信號、電信號、電勢差等。信號可以與兩個物體之間的物理尺寸差異相關，其可以是例如當與DNA靶相連的珠子被捕獲在橫截面比珠子更小的縊縮段中時所產生的信號。螢光信號被認為是特別適合的，特別是在螢光分子與鹼基、探針或兩者相連的實施方案中。在某些實施方案中，信號可以源自於置換鹼基上的標籤與位於懸片段上的探針上的標籤之間的轉移能量(例如螢光能量轉移「FRET」)、位於懸片段上的探針上的兩個或多個標籤之間的螢光共振能量轉移，或其任意組合。圖2顯示了按照本發明製備的核酸聚合物上的標記物和探針的示例性位置。該圖描繪了位於懸片段上的探針(顯示為A和B)，以及沿著DNA鏈延伸以便填補由懸片段的形成和剝離所留下的間隙的探針(顯示為C)。探針包括例如有機螢光團、量子點、樹枝狀聚合物、納米線、珠子、Au珠子、順磁性珠子、磁性珠子、聚苯乙烯珠子、聚乙烯珠子、肽、蛋白、半抗原、抗體、鏈親和素、親和素、中性親和素、生物素、核苷酸、寡核苷酸、序列特異性結合因子例如工程化的限制性酶、甲基轉移酶、鋅指結合蛋白等。正如所示，一個以上的探針可以位於懸片段上。在示例性實施方案中，間隙中的標籤(或多個標籤)由激發輻射激發。然後被激發的間隙-標籤將能量轉移到本身位於懸片段上的探針上所帶的標籤。間隙標籤和懸片段標籤中的一個或兩個可以發出可以被用戶檢測的信號。在某些實施方案中，間隙標籤、第一懸片段標籤或兩者可以激發第二懸片段標籤。通過這種方式， 用戶可以通過選擇只被特定波長或類型輻射所激發的標籤構建高特異性檢測系統，由此產生只有當一個或多個前體標籤位於適合位置中時用戶所檢測的標籤才被激發的系統。因此，可以通過兩種或多種標記物之間的能量轉移檢測(例如可視化)共定位事件，這增加了結合事件測定的特異性。在某些情況下選擇懸片段區，因為懸片段、間隙或兩者包含雙鏈DNA上的目標特定序列的至少一部分。這樣的目標序列可以包括例如已知編碼特定蛋白或特定情況的序列。在某些實施方案中，懸片段、間隙或兩者包含位於雙鏈DNA上的目標序列兩側的雙鏈DNA的至少一部分。這在例如用戶試圖標記DNA上囊括目標特定基因或其他區域的區域以便突出該區域時是有用的。本發明的方法還包括將包含至少一個懸片段、一個間隙或兩者的雙鏈DNA的至少一部分至少部分線性化(例如解開)。用戶也可以將包含至少兩個懸片段、兩個間隙或其任意組合的雙鏈DNA的至少一部分至少部分線性化。這樣的線性化可以通過例如將DNA移位通過通道或其他結構來實現，所述結構的維度使得利用在通道或其他結構中的物理限制使 DNA線性化。在某些實施方案中，用戶也可以測量兩個懸片段之間、位於兩個或多個懸片段附近的兩個或多個標籤之間、位於兩個或多個間隙中的兩個或多個標籤之間的距離，或其任意組合。適合情況下，然後將該距離與DNA的結構、序列組裝、遺傳或細胞遺傳圖譜、甲基化模式、CpG島的位置、表觀基因組模式、生理特徵或其任意組合相關聯。因為本發明能夠研究結構和其他表觀基因組因子(例如甲基化模式、CpG島的位置等)，因此用戶能夠將與結構和表觀基因組模式相關的結果疊加，以獲得完整的基因組圖。本發明的一個特點是其提供關於核酸或其他遺傳物質的基因組(序列)和表觀基因組(supra-序列)信息的能力。更具體來說，本發明允許用戶通過測序來確定特定基因是否存在，以及通過獲得表觀基因組信息確定該基因的活性。在一個非限制性實例中，用戶可以獲得關於核酸聚合物的基因組信息(通過在本文別處描述的標記方法)，例如特定基因是否存在。然後用戶也可以通過使用例如標記的甲基結合蛋白以鑑定沿著核酸聚合物的甲基的位置，來獲得關於核酸聚合物的甲基化模式的信息(其表明了位於甲基化附近的基因座的活性)。這樣的甲基可以存在於胞嘧啶上和可能與功能性基因座的調控相關的所謂的cpG島簇上。其他結合分子(例如與轉錄因子結合位點結合的分子等)也適合用於獲得表觀基因組信息。因此，在某些實施方案中，用戶可以同時確定一個或多個功能性基因的存在，並通過基於甲基的表觀基因組信息確定這些基因是否有活性。在一個實例中，用戶可以用第一種顏色的標記物標記基因的序列信息並用第二種顏色的標記物標記甲基化區域，從而能夠同時觀察基因位置/序列和基因活性(即甲基化模式)。表觀基因組信息也可以包括轉錄酶能夠或不能結合的位置。表觀基因組信息的用途是顯而易見的。正如在本文別處描述的，基因組信息的用途在於基於寡聚物的探針(或包含條形碼的探針組)提供了關於所研究的核酸聚合物序列的「靜態」信息。表觀基因組信息(例如關於甲基化或轉錄因子結合的信息)提供了關於基因序列的動態信息，有效地提供了關於基因的開/關信息。因此，本發明能夠同時收集基因組和表觀基因組信息兩者。作為一個說明性的非限制性的實例，用戶可以標記來自第一個患者的DNA上的位置(即懸片段、填補間隙或二者的某些組合)，位置的選擇使得它們位於DNA上特定基因例如乳腺癌基因的位置的上遊和下遊(即兩側)。在將標記的DNA線性化後，用戶可以將這些標記物之間的距離與來自己知具有「適合」的乳腺癌基因拷貝數的對照對象的DNA上相應標記物之間的距離進行比較。如果第一個患者的標記物之間的距離大於對照對象的標記物之間的距離，那麼可以知道患者具有附加的或額外的乳腺癌基因拷貝，因此可以設計治療方案。該技術也可用於確定兩個或多個都不是「對照」的個體之間的拷貝數變異，或甚至單一患者中的拷貝數變異(即通過比較在兩個不同時間從患者獲取的DNA)。通過這種方式，本發明的方法便於對來自單一對象或來自較大群體區段的DNA或其他大分子進行快速分析和表徵。用戶也可以測量來自位於懸片段附近的至少一個標籤、位於間隙中的標籤或兩者的至少一種信號的強度。然後用戶可以將至少一種信號的強度與序列組裝、遺傳或細胞遺傳圖譜、生理特性或本文別處描述的其他特徵(例如表觀基因組模式)相關聯。這使用戶能夠得出核酸聚合物來源的病理生理狀態的整個圖譜。這由非限制性的圖5c所示。該圖示意顯示了使用標記的結合因子(BF)例如抗甲基抗體或甲基結合蛋白(MBP)沿著基因組區域定位一個或多個表觀基因組位點，以產生表觀基因組條形碼模式。正如所示，在某些情況下，用戶同時也使用本公開的方法繪製相同區域的「條形碼」(使用例如序列特異性探針)以確定基因組區域的結構。基因組探針可以在與表觀基因組分析所涉及的任何標記物不同的波長處發射或激發，或具有可以與所述標記物辨別開的信號。在一個實施方案中，表觀基因組條形碼包括(但不限於)從轉錄因子結合位點或siRNA或LincRNA結合位點衍生的模式。這證實了本發明在單分子水平上，使用直接成像在同一個視野中同時地、實時地將靜態基因組序列和結構信息與動態的調控和功能信息相關聯的能力。作為另一個非限制性的實例，用戶可以標記對應於來自第一個患者的DNA的目標基因(例如乳腺癌基因)內的區域的一個或多個懸片段(或填補間隙)。然後用戶測量從這些標記物產生的一種或多種信號的強度。然後用戶測量從來自「對照」或第二個對象的 DNA上的相應標記物產生的一種或多種信號的強度。如果來自第一個患者的信號的強度與來自對照的信號的強度不同，用戶將獲得兩個對象具有不同基因拷貝數的一些指示。強度信號也可以與在給定聚合物中單一鹼基或特定鹼基序列的普遍性相關聯。信號的強度也可以提供關於與帶有發射信號的標記物的探針互補的序列的空間密度的信息。圖7顯示了在本發明的核酸聚合物上進行的圖像分析。具體來說，圖顯示了捕獲的「原始」DNA圖像，其中端到端的等高線和強度信息被實時提取和測量。顯示了尺寸分布的直方圖以便證實得自異源DNA混合物的讀取結果。本發明還提供了對多個DNA進行表徵的方法。這些方法包括在第一雙鏈DNA上標記第一 DNA上的兩個或多個位置(序列特異性、隨機的或兩者)；在第二雙鏈DNA上標記第二 DNA上的兩個或多個相應序列特異性位置；將第一雙鏈DNA的至少一部分線性化；將第二雙鏈DNA的至少一部分線性化；以及比較線性化的第一雙鏈DNA上兩個或多個標記物之間的距離與線性化的第二雙鏈DNA上相應標記物之間的距離。在某些實施方案中，標記如本文別處所述，通過在雙鏈DNA的第一鏈上產生切口， 以獲得(a)與雙鏈DNA分離的第一鏈的懸片段和(b)由切口位點和懸片段與雙鏈DNA第一鏈的相接位點所定義的在雙鏈DNA的第一鏈中的間隙來實現。方法還可以包括將懸片段暴露於與探針的至少一部分互補的標記的探針，將一個或多個標記的鹼基插入到間隙中，或兩者。正如別處所述，適合情況下，標記通過將第一和第二雙鏈DNA暴露於非切割型限制性酶、甲基轉移酶、鋅指蛋白、抗體、轉錄因子、DNA結合蛋白、髮夾狀聚醯胺、形成三鏈體的寡脫氧核苷酸、肽核酸等來實現。非切割型限制性酶可以包含標籤。如本文別處所述，在適合情況下，然後將距離與DNA的結構、序列組裝、遺傳或細胞遺傳圖譜、甲基化模式、生理特徵、CpG島的位置、表觀基因組模式或其任意組合相關聯。這些方法的一個實施方案顯示在圖5中，其是示意圖，顯示了平行測序和同時的空間組裝。沿著長的基因組區域可以序列基序特異性方式產生許多序列起始位點，在這種情況下是GCTGAxxxx，並檢測這些位點的物理位置並在物理圖譜上登記。隨後通過使用聚合酶延伸的測序或使用特異性探針雜交和連接的測序，通過測序化學方法記錄讀取結果。除了測序讀取結果之外，在物理圖譜上同時記錄和組裝這些多個測序讀取結果的相應線性次序和空間距離與位置。這樣的基於作圖的測序方案與現有方法相比最終提供了更好的組裝準確性、效率和成本降低。圖恥是示意圖，顯示了 DNA結合因子(BF)的使用，包括遺傳工程化的非功能性限制性酶，其僅僅保留了限制性酶的結合結構域但缺乏這些酶的DNA切割功能。以序列特異性方式識別並結合DNA的DNA甲基轉移酶也是有用的，其他酶也是同樣，例如鋅指蛋白、以序列基序特異性方式結合DNA的轉錄因子、與甲基化特異性位點結合的甲基結合蛋白或抗甲基抗體、其他特異性(次級結合)方式的DNA結合因子。例如，DNA甲基轉移酶(MTase) 包括但不限於M. BseCI (使5 『 -ATCGAT-3 『序列中N6位的腺嘌呤甲基化)、M. TaqI (使 5 『 -TCGA-3 『序列中N6位的腺嘌呤甲基化)和M. HhaI (使5 『 -GCGC-3 『序列中C5位的第一個半胱氨酸甲基化)。總的來說，該適合地結合的物體的名單包括(以例如序列特異性方式)與雙鏈DNA結合併且不切開所述dsDNA的物體。在圖中，各種不同的星表示不同標記標籤，例如QD(量子點)、螢光標記物等。這些標籤之間的空間距離以及這些「串成線的點」條形碼圖形的強度，可用於研究其他生物功能例如活性轉錄位點、ORF(開放閱讀框)、低和高甲基化位點寸。另一方面，本發明提供了從DNA獲得結構信息的方法。這些方法包括在第一雙鏈 DNA上標記第一 DNA上的一個或多個序列特異性位置。方法還包括在第二雙鏈DNA上標記第二雙鏈DNA上相應的一個或多個序列特異性位置；使第一雙鏈DNA的至少一部分線性化， 使第二雙鏈DNA的至少一部分線性化；以及比較線性化的第一雙鏈DNA的至少一個標記物的信號強度與線性化的第二雙鏈DNA的至少一個標記物的信號強度。正如本文別處所述，適合情況下，標記通過在雙鏈DNA的第一鏈上產生切口，以獲得(a)與雙鏈DNA分離的第一鏈的懸片段和(b)雙鏈DNA的第一鏈中對應於懸片段的間隙來實現，所述間隙由切口位點和懸片段與雙鏈DNA第一鏈的相接位點所定義。適合情況下， 將懸片段暴露於與探針的至少一部分互補的標記的探針，將一個或多個標記的鹼基插入到間隙中，或兩者，以便沿著第二 DNA鏈的相應區域延伸第一鏈。然後將信號強度與核酸聚合物的供體的至少一種生理特徵相關聯。也可以將強度與核酸聚合物的結構特徵、表觀基因組模式或兩者相關聯。本發明為用戶提供了從給定聚合物獲得和分析結構和表觀基因組信息兩者的能力。正如在本文別處所述，本發明提供了「條形碼」技術，通過其為核酸聚合物區域提供獨特的籤名。可以應用該條形碼(如本文別處所述)以便提供關於結構(利用例如具有序列特異性基序的標記物，第一條形碼)和表觀基因組模式(利用對表觀基因組指示物例如甲基化位點、CpG島等具有特異性的標記物，第二條形碼)的信息。利用從第一和第二條形碼收集的信息，用戶可以獲得關於給定核酸聚合物的結構和表觀基因組信息。還提供了從大分子例如雙鏈DNA獲得結構信息的方法。這些方法包括將包含至少一個從其伸出的懸片段的大分子，沿著其中置有至少一個縊縮段的通道移位；以及檢測對應於大分子的至少一個懸片段從通道的至少一個縊縮段通過的至少一種信號。在某些實施方案中，懸片段被標記，在其他實施方案中，懸片段未標記，並且信號與「裸露」懸片段通過縊縮段相關。適合的通道在本技術領域中是已知的，例如在美國專利申請10/484,293中描述的通道，該專利申請在此以其全文引為參考。在某些實施方案中，懸片段或大分子與懸片段相鄰的區域包含標記物。在某些實施方案中，正如本文別處所述，標記物置於當懸片段形成時留下的填補間隙中。適合情況下，信號是光信號、電信號、電磁信號或甚至其某些組合。信號可以與懸片段通過縊縮段相關，或可以與標記物通過縊縮段相關。懸片段可以被移位通過縊縮段一次以上。這些方法的示例性非限制性實施方案顯示在圖8中。第一個圖(圖8a)描繪了利用光學和非光學檢測方法從核酸聚合物獲得標記的條形碼信息的系統。正如所示，顯示了在具有一個或多個狹窄的溢縮點(被稱為納米門控或納米噴嘴；參見美國專利申請12/374，141，其全部內容在此引為參考)的納米通道中拉伸和線性化的被標記的長核酸分子。
在某些實施方案中，DNA移動和電流測量由與流體裝置和外部儲液器相連的電路控制。條形碼模式的光學圖像和標記物的非光學記錄(即沿著均勻的聚合物的物理「隆起」 的電記錄)，示意顯示在圖8b和圖8c中。光學和非光學結果可以彼此關聯或對比，以獲得更好的數據準確性。圖8d描繪了包含納米門控的流體裝置。這裡顯示了一系列通過前面描述的方法產生的「懸片段」，所述懸片段可以包括附加的標記標籤。懸片段、它們的標籤或兩者，在通過納米門控的過程中被直接檢測，在此過程中懸片段、標籤或兩者產生可檢測的電子信號， 例如反映靶基因組區域的離子電流特徵。正如本文別處所述，在核酸聚合物中由懸片段空出的區域中也可以存在標記的鹼基。這樣的鹼基當通過納米門控時也可以被檢測。還提供了從大分子獲得結構信息的方法。這些方法包括標記大分子的至少一部分；將大分子固定化；將大分子的至少一部分置於通道中以使大分子的至少一部分在通道內線性化；以及檢測與大分子的被標記部分相關的至少一種信號。圖9描繪了限定(tethered)在用於序列成像分析的基質表面上的納米通道或納米軌道內的一個末端或兩個末端處的核酸。正如圖中所示，對核酸聚合物的區域進行修飾， 以便能夠將具有被標記或待分析的序列(似)的核酸聚合物限定在多個位置。作為非限制性的實例，已知R2可以位於特定疾病的基因內，並且聚合物中存在多個R2序列可以證實該序列的異常(或正常)拷貝數。可以將聚合物沿著通道從一個儲液器移位到另一個儲液器，並可以在沿著其移位路徑的任何位點處停止或固定化。固定化可以通過多種方式來實現。在一個實施方案中，如圖IOa中所示，將大分子結合到至少一個珠子上，通過至少一個珠子被橫截面小於珠子的縊縮段捕獲，使分子被固定化。固定化也可以通過將大分子化學限定到表面上、通過大分子的磁固定、通過大分子的光捕獲或其任意組合來實現。在包含珠子的實施方案中，珠子被選擇成使其有效直徑大於納米通道的至少一個橫截面維度。當修飾的核酸分子流入納米通道時，因為修飾的珠子比納米通道的至少一部分大，其流動被阻礙。然後核酸分子的未修飾部分能夠被線性化並用於序列分析。珠子可以是聚合的、磁性的、半導體的、絕緣的、金屬的或其任意組合，並且核酸分子的修飾可以基於共價鍵或非共價相互作用，包括蛋白質相互作用，並可以包含中間連鍵。在所有限定或固定化方式中，可以調節所施加的流動或梯度場，以便能夠形成或鬆開限定。可以選擇用於限定的修飾物質，使得將核酸分子結合在納米通道中的性質是磁、 電、光、化學、摩擦、基於流動、物理阻礙或其任意組合。在其他實施方案中，核酸分子在分子的一個末端處或附近進行化學修飾，如非限制性的圖IOb中所示。化學修飾被選擇成使得在修飾物質與納米通道之間發生的共價或非共價相互作用的強度足以限定核酸分子並阻止其流過納米通道。化學修飾劑的實例包括巰基、矽烷基、羧基、胺基、烷基、磷酸基、可光切割基團、蛋白、生物素、胺基酸殘基、金屬基團或其任意組合。在某些情況下，納米通道的表面可以包括某些化學修飾以促進與修飾物質的相互作用。在另一個實施方案中，核酸分子在分子的一個末端處或附近進行磁性修飾，如圖 Ila中所示。磁性修飾可以是磁性珠子、順磁性珠子、超順磁性粒子或其他能夠在序列分析過程中維持磁性偶極的部分。在這樣的情況下，磁力可以整合在納米通道裝置內或附近，或
16者，也可以是外部施加的磁場的結果，如圖Ila中所示。在另一個實施方案中，核酸在分子的一個末端處或附近用能夠在光學鑷子存在下經歷擊穿力(dielectric force)梯度的粒子或部分修飾。這顯示在非限制性的圖lib中。正如所示，光學鑷子被用於當粒子流過納米通道時捕獲限制在光束中的粒子，從而允許相連的核酸分子在納米通道中被線性化。光學鑷子可用於移動靶以及將其固定化。在另一個實施方案中，使用了多種力固定化或限定DNA。例如，可以同時使用反向流體流動和電場，以將分子在分析區域中保持伸展和靜止。適合情況下，線性化通過適合地定製通道的尺寸以執行大分子的線性化、適合情況下通過物理熵限制來實現。還提供了分析系統。本發明的系統包括含有至少一個寬度在約1到約500納米範圍內的通道的基材；所述基材包含至少一個固定化區域。適合情況下，通道具有約10到約 200nm、或約20到約IOOnm範圍內或甚至約50nm的寬度。通道的深度可以在同樣範圍內， 儘管具體通道的寬度和深度不是必須相同的。通道事實上可以是任何長度，從IOnm直到數釐米。適合情況下，這樣的通道具有毫米範圍內的長度，儘管對於給定應用來說，最適長度對於本技術領域的普通專業用戶來說是顯而易見的。固定化區域能夠固定化大分子。大分子可以包括一種或多種修飾，其可以包括懸片段、珠子、絕緣修飾、磁性粒子等。系統和大分子修飾可以協調地並在其彼此的親和性的基礎上選擇。示例性的固定化區域包括磁性區域、化學活性區域、縊縮段等，如圖10和圖11 中所示。在某些實施方案中，將聚合物固定化並施加梯度，以便將聚合物的至少一部分置於通道中，如圖10和圖11所示。通過這種方式，如本文別處所述可以被標記的聚合物可以被線性化，並通過將其限制在通道中可以保持在線性形式。儘管沒有在圖中顯示，本發明還包括下列實施方案，其中被標記的聚合物被固定化或限定，然後通過施加梯度(壓力、電等)線性化，以便位於聚合物上的一個或多個標記物(或懸片段)可以被檢測，並與聚合物的特徵相關聯。可以通過持續施加梯度或在聚合物被梯度線性化後將其附著到基材上(即聚合物被線性化然後在其線性化形式下附著到基材上)，將聚合物維持在線性形式下。還提供了對核酸聚合物進行表徵的方法，這些方法包含用一種或多種序列特異性基序標記物標記核酸聚合物的一個或多個區域；將來自一個或多個序列特異性基序標記物的一種或多種信號，與核酸聚合物的一個或多個序列特異性基序標記物的位置相關聯；對核酸聚合物的一個或多個區段進行測序，所述一個或多個區段包括核酸聚合物的一個或多個序列特異性基序標記物；以及將一個或多個被測序的區段的一種或多種信號與標記的核酸聚合物的一個或多個相應信號進行比較，以便獲得兩個或多個被測序區段在核酸聚合物中的相對位置。適合情況下，本公開的方法的標記方面通過本文別處描述的標記方法來實現，即在核酸聚合物中形成懸片段，並標記懸片段、由懸片段空出的區域或其任意組合。適合的標記物和標籤在本文別處描述。適合情況下，關聯需要將核酸聚合物的至少一個被標記部分線性化。線性化可以通過在尺寸適合的納米通道中將聚合物的被標記部分線性化、通過向聚合物施加梯度(例如流體、電)等來實現。在其他實施方案中，聚合物被限定或固定化，並通過施加梯度(壓力、電等)線性化。區段可以通過核酸聚合物的隨機或序列特異性切割開產生。關聯可以包括例如測定兩個或多個標記物之間的距離、比較從兩個或多個標記物產生的信號的強度等。在某些情況下被稱為「重疊群」的聚合物區段的測序，可以通過本技術領域中已知的技術來實現。這些技術包括例如Sanger測序、Maxam-Gilbert測序、染料終止物測序、體外克隆擴增、雜交測序等。適合情況下，區段的長度高達301Λ或甚至501Λ， 但是適合情況下在1Λ長度範圍內。被標記區段的信號或多個信號與被標記核酸聚合物的相應信號的比較，通過例如將一個或多個被標記的測序區段針對被標記的核酸聚合物進行比對，使得被標記的測序區段的序列特異性基序標記物被放置成與被標記的核酸聚合物的相應序列特異性基序標記物配準來實現。這有效地允許用戶使用區段上的標記物作為允許鑑定每個單獨區段的「條形碼，，。因此，通過將條形碼重疊群針對「親本」核酸聚合物上的相應條形碼進行匹配，用戶可以確定條形碼重疊群在「親本」核酸聚合物中的位置(和取向)。採用這種方式，通過將來自區段上的標記物的一種或多種信號與「母本」聚合物上的相應標記物進行比對，用戶可以確定區段的適合比對。通過對多個區段重複該過程，用戶就能確定區段的適合次序和取向，允許核酸聚合物的大規模平行測序。該過程進一步描繪在圖6中，該圖描繪了本發明的從核酸聚合物獲得基因組支架 (例如序列)裝配信息的方法。如圖中所示，用戶從聚合物中提取相對長的基因組DNA分子(例如11Λ直到IOOmb 或以上)，並按照例如本文別處描述的標記方法標記分子，以便導致產生沿著線性化長聚合物而檢測和記錄到的序列特異性信號，以產生代表分子基因組的特定區域的特徵性的「觀察到的條形碼」(顯示成「觀察到的條形碼的原始圖像」)；分子可以表示基因組。然後可以將來自個體分子的觀察到的條形碼組裝成相對長的支架，所述支架可以長達完整基因組的尺寸。離散的區段(在某些實施方案中是「重疊群」；從約5到約301Λ)可以根據由當前的測序技術產生的部分重疊的短鹼基讀出結果進行計算機組裝。這樣的重疊群可以是隨機的，或在序列特異性的基礎上產生。正如圖6中所示，可以將基因組片段化成例如50bp到高達IOOObp的重疊群。然後用戶可以產生眾多(數百萬)約35到約850bp的短的讀出結^ ο適合情況下，將一個或多個重疊群用與標記「親本」核酸聚合物所使用的序列特異性基序相同的序列特異性基序(例如Nb. BbvCI位點，GCTGAGG)進行標記，以產生一系列條形碼。當重疊群被虛擬標記(即通過計算機)時，條形碼被當作計算機用(in silico)條形碼。然後用戶將重疊群(區段)的條形碼針對實驗構建的支架的相應的觀察到的條形碼進行比對，然後所述比對為用戶提供了重疊群在支架中的物理位置以及重疊群在支架中的適合取向。這反過來產生了關於支架(以及相應基因組)的信息，例如支架中的序列拷貝數、結構信息(例如翻譯)等。因此，每個重疊群被精確作圖到基因組上，以便產生所分析的具體聚合物的真實、準確的基因組測序信息。這些方法與現有測序技術相比具有大量優點，包括提供關於拷貝數的信息的能力和將重疊群相對於彼此放置在正確位置/次序的能力。這反過來提供了真實的序列信息； 不適用本文描述的條形碼技術，重疊群沿著被分析基因組的線性次序將是未知的，特別是， 如果沒有以前的參比資料庫可供比較的情況下(從頭測序)。由於具有拷貝數變異(CNV) 和結構性變異(SV)的大基因組的高度複雜性，從隨機的較短讀出結果直接獨立組裝，特別是對於從頭測序或高度不規則的癌症基因組來說，已變得越來越困難並容易出錯。作為一個非限制性的實例，(已知序列的)第一個區段可以包含條形碼A、B和C， 其每個對應於區段上序列特異性標記物的位置、序列特異性標記物的強度或兩者。因此，基於A、B和C條形碼，被標記的區段表現出獨特的圖形。(已知序列的)第二個標記的區段可以包含條形碼C、D和E。通過將第一和第二個區段針對從其切下區段的「母本」聚合物進行比對，用戶能夠確定兩個區段在條形碼C處重疊，並且通過合併兩個區段的序列(沒有兩次計算對應於條形碼C的序列)，可以確定兩個區段所源自的「母本」聚合物的序列。因此， 通過將該過程規模放大以同時處理多個區段，本發明的方法能夠確定長的核酸聚合物的序列信息。一個類似的實施方案顯示在圖3中。該圖顯示了使用ADNA的實例，預測的切口酶Nb.BbvC I的切口位點顯示在序列基序中，並用沿著長的DNA分子的箭頭指示。將切口位點用螢光(Alexa)核苷酸T標記，所述螢光(Alexa)核苷酸T在天然T鹼基被置換並取代時摻入到切口位點中(顯示為綠色)。在該模型系統中，基於在低鹽條件下在SOnm乘SOnm寬的通道中100%伸展的 λ DNA，觀察到的標記的特徵性「條形碼」樣式與在這裡被稱為計算機條形碼的使用切口酶消化產生的基因組的計算機預測序列基序圖譜一致，如圖北所示。在完全伸展的線性化人類BAC克隆DNA上( 170Kbp)顯示了類似的條形碼結果；也顯示了超過17個被標記的位點(螢光顏色)。附加實施例和實施方案附加實施方案正如本文中別處所述，本發明尤其提供了與DNA作圖和測序相關的方法，包括用於製造長的基因組DNA的方法、標記序列特異性標籤並基於單個DNA分子的直接成像和在納米通道(直徑< 500nm)內的單個DNA分子上定位多個序列基序或多態性位點的DNA條形碼策略的方法。方法還提供了在DNA圖譜的背景中提供連續的逐個鹼基測序信息。與現有方法相比，本發明的DNA作圖提供了增加的標記效率、更穩定的標記、高的靈敏度和更好的解析度；我們的DNA測序方法提供了長的模板背景中的鹼基讀出結果，易於組裝，並提供了不能從其他測序技術獲得的信息，例如單倍型和結構變異。在DNA作圖應用中，將單個基因組DNA分子或長範圍PCR片段在特異性序列基序處用螢光染料標記。被標記的DNA分子在納米通道內被拉伸成線性形式(在本文別處描述)，並使用螢光顯微術進行成像。通過確定螢光標記物相對於DNA骨架的位置和在某些情況下其顏色，可以精確地建立序列基序的分布，類似於包裝物上的條形碼。這種DNA條形碼方法被用於鑑定λ噬菌體DNA分子和人類bac克隆。利用在dsDNA上的特異性序列位點處切口的一種實施方案包含下列步驟a)使用在特異性序列基序處導入切口的一種或多種切口內切核酸酶，在長的(例如超過21Λ)雙鏈基因組DNA分子的一條鏈上產生切口 ；
b)使用DNA聚合酶在切口處摻入螢光染料標記的核苷酸；c)將被標記的DNA分子在納米通道內拉伸成線性形式，分子流過通道或分子的一部分被固定化，使DNA的一個末端被置於通道內；d)使用螢光顯微術確定螢光標記物相對於DNA骨架的位置，以獲得DNA的圖譜或條形碼。另一個在序列特異性切口位點處帶有懸片段序列的實施方案包括下列步驟a)使用在特異性序列基序處導入切口的切口內切核酸酶，在長的(>21Λ)雙鏈基因組DNA分子的一條鏈上產生切口 ；b)使用DNA聚合酶在切口處摻入螢光染料標記的核苷酸或沒有螢光染料標記的核苷酸，置換下遊鏈以產生懸片段序列；c)通過聚合酶摻入標記的核苷酸、或與螢光探針直接雜交或用連接酶連接螢光探針，以標記懸片段序列；d)如本文別處所述將被標記DNA分子拉伸成線性形式；e)使用螢光顯微術確定螢光標記物相對於DNA骨架的位置，以獲得DNA的圖譜或條形碼。另一個利用序列特異性切口位點處的ssDNA間隙的實施方案包括下列步驟a)使用在特異性序列基序處導入切口的切口內切核酸酶，在長的(>21Λ)雙鏈基因組DNA分子的一條鏈上產生切口 ；b)使用DNA聚合酶在切口處摻入螢光染料標記的核苷酸探針或沒有螢光染料標記的核苷酸，置換下遊鏈以產生一個或多個懸片段序列；c)使用切口內切核酸酶在新延伸的鏈上產生切口，並用懸片段內切核酸酶切下新形成的懸片段序列。分開的ssDNA可以通過例如增加溫度以釋放它們的鍵來移除；d)通過摻入標記的核苷酸、或與螢光探針直接雜交或用連接酶連接螢光探針，對 ssDNA間隙(通過產生切口和隨後形成懸片段所產生的)進行標記；e)如本文別處所述將被標記DNA分子拉伸成線性形式；f)使用螢光顯微術確定螢光標記物相對於DNA骨架的位置，以獲得DNA的圖譜或條形碼。在其他DNA測序應用中，將單個基因組DNA分子或長範圍PCR片段在特異性序列基序處用螢光染料標記。然後將被標記DNA分子在納米通道內線性化，然後使用螢光顯微術成像。通過測定螢光標記物相對於DNA骨架的位置和顏色，可以與讀取條形碼相似的方式精確地建立序列基序的分布。在DNA圖譜背景中獲得了單個或多個鹼基信息。這種可用於基因組DNA的測序方法的一個實施方案包括下列步驟a)使用在特異性序列基序處導入切口的切口內切核酸酶，在長的(>21Λ)雙鏈基因組DNA分子的一條鏈上產生切口 ；b)通過切口摻入、懸片段標記、ssDNA間隙標記或其某些組合，使產生切口的位點帶上螢光染料分子的標籤；c)如本文別處所述將被標記DNA分子拉伸成線性形式；d)使用螢光顯微術確定螢光標記物相對於DNA骨架的位置，以獲得DNA的圖譜或條形碼；
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e)使用產生切口的位點作為測序反應的起始點。在DNA測序中有用的不同DNA結構，包括但不限於下列結構。在一個測序實施方案中，聚合酶在切口位點的3'末端摻入螢光核苷酸，相繼地檢測每個切口位點處摻入的標記物以獲得序列信息。該過程被重複/循環，以連續獲得許多鹼基上的「讀取結果」。在另一個實施方案中，將測序引物與懸片段序列雜交並使用聚合酶進行延伸，以摻入螢光核苷酸。通過讀取這些各種被摻入的螢光核苷酸的顏色，就可以推斷出序列信息。 該過程被重複/循環，以連續獲得許多鹼基讀取結果。在另一個實施方案中，將一個短的螢光寡核苷酸與懸片段序列直接雜交，序列信息可以從雜交的寡聚物的存在推斷出來。該過程被重複/循環，以連續獲得許多鹼基讀取結果。在另一個實施方案中，將兩個短的寡核苷酸與彼此相鄰的懸片段序列雜交，然後使用例如連接酶連接在一起。序列信息可以從連接產物推斷出來。該過程被重複/循環， 以連續獲得許多鹼基讀取結果。在另一個實施方案中，將一個短的螢光寡核苷酸緊靠切口位點的3，末端直接雜交並連接。然後序列信息從連接的寡核苷酸的存在推斷出來。該過程被重複/循環，以連續獲得許多鹼基讀取結果。方法可以與納米通道陣列相結合來執行。適合情況下，這樣的陣列具有多個位於表面的材料中的通道，所述通道具有小於約500納米的溝槽寬度和小於約500納米的溝槽深度。適合情況下，至少某些通道被密封材料覆蓋，使這些通道至少基本上是封閉的。在某些實施方案中，本發明包括筒或其他模塊化裝置。這樣的筒可以包括，例如在本文中也公開包含納米流體晶片的筒。這樣的筒能夠被插入、使用並取出。可用於本發明的系統之外的分析系統的筒也在本發明的範圍內。在某些實施方案中，納米通道能夠運輸大分子通過其縱向。本發明的裝置可以包含一種或多種可用於執行大分子運輸的部件，所述運輸可以通過跨過通道的壓力或真空梯度、電滲作用和電動效應(electrokinesis)來執行。納米通道的表面材料可以由幾乎任何基材材料形成，例如導電材料、半導體材料或不導電材料。導電材料的實例包括金屬例如鋁、金、銀和鉻。半導體材料的實例包括摻雜的二氧化矽和砷化鎵。不導電材料的實例包括熔融二氧化矽、二氧化矽、氮化矽、玻璃、陶瓷和合成聚合物。上述的僅僅是示例。在某些實施方案中，對核酸分子在一個末端處或附近進行修飾，然後將其置於納米通道或納米軌道(由限制流體通道的邊界例如疏水邊界所限定的區域)中。適合情況下， 修飾允許核酸限定在納米通道入口處或納米通道內。然後，由於納米通道，核酸受到限制以採用線性化形式。適合的核酸是DNA或RNA， 例如dsDNA。納米通道的長度優選< 500nm、更優選< 300nm、最優選< 150nm，能夠容納超過2000鹼基的線性化核酸。下面的實施方案也適用於納米軌道，其是在化學或拓撲學預定義的表面圖樣上定義的線性區域。可以通過系統分析的流體包括來自哺乳動物的流體(例如DNA、細胞、血液、活體組織)、合成的大分子例如聚合物，以及在自然界中發現的材料(例如源自於植物、動物和其他生命形式的材料)。這樣的流體可以使用本發明的自動或手動加樣裝置管理、加樣和注射。
實施例實施例1 在雙鏈DNA分子上產生單鏈DNA懸片段將基因組DNA樣品稀釋到50ng以用於切口產生反應。將10 μ L λ DNA (50ng/μ L) 加入到0. 2mL PCR離心管中，然後加入2μ L IOX NE緩衝液#2和3 μ L切口內切核酸酶， 包括但不限於 Nb. BbvCI、Nb. BsmI, Nb. BsrDI, Nb. BtsI, Nt. AlwI、Nt. BbvCI、Nt. BspQI、 Nt. BstNBI、Nt. CviPII。將混合物在37°C下溫育1小時。在切口反應完成後，在切口位點處使用有限聚合酶延伸繼續實驗，以置換3'下遊鏈並形成單鏈懸片段。懸片段產生反應混合物由15μ 1切口產物和5μ 1摻入混合物構成， 所述摻入混合物含有2 μ 1 IOX緩衝液、0. 5 μ 1包括但不限於vent (外切)、Bst和PhU9聚合酶的聚合酶以及1 μ 1從1 μ M到ImM的各種不同濃度的核苷酸。將懸片段產生反應混合物在55°C下溫育。懸片段的長度由溫育時間、使用的聚合酶和使用的核苷酸量來控制。實施例2 在雙鏈DNA分子上產生單鏈DNA間隙在懸片段產生後，使用原始的切口內切核酸酶在填充的雙鏈DNA上產生切口，並使用包括但不限於FEW的懸片段內切核酸酶切掉懸片段序列。通過升高溫度，將帶切口的單鏈DNA分子從雙鏈DNA分子中除去，以產生雙鏈DNA分子上的單鏈DNA間隙。實施例3 產生長的單鏈DNA分子在切口產生反應完成後，在切口位點處使用完全聚合酶、包括但不限於Wii29、Bst 聚合酶延伸繼續進行實驗，以置換3'下遊鏈並產生單鏈DNA分子。實施例4 在雙鏈DNA分子上螢光標記序列特異性切口的方法將基因組DNA樣品稀釋到50ng以用於切口產生反應。將IOyL λ DNA (50ng/μ L) 加入到0. 2mL PCR離心管中，然後加入2μ L IOX NE緩衝液#2 (New England BioLabs, www. neb. com)和 3μ L 包括但不限於 Nb. BbvCI、Nb. BsmI、Nb. BsrDI、Nb. BtsI、Nt. AlwI、 Nt. BbvCI、Nt. BspQI、Nt. BstNBI、Nt. CviPII的切口內切核酸酶。將混合物在37°C下溫育1 小時。在切口產生反應完成後，使用聚合酶延伸繼續進行實驗，以在切口位點上摻入染料核苷酸。在一個實施方案中，摻入單一螢光核苷酸終止物。在另一個實施方案中，摻入多個螢光核苷酸。摻入混合物由15 μ 1切口產物和5 μ 1摻入混合物構成，所述摻入混合物含有2 μ 1 IOX緩衝液、0. 5μ 1包括但不限於vent(外切)的聚合酶、1 μ 1螢光染料核苷酸或包括但不限於cy3、alexa標記的核苷酸的核苷酸終止物。將摻入混合物在55°C下溫育約30分鐘。實施例5 在雙鏈DNA分子上序列特異性標記單鏈DNA懸片段的方法在懸片段序列產生後，可以將懸片段用螢光染料分子進行標記，標記方法包括但不限於下列方法探針的雜交、使用聚合酶摻入螢光核苷酸和螢光探針的連接。實施例6 在雙鏈DNA分子上序列特異性標記單鏈DNA間隙的方法使用毛細作用，將寬度、深度或兩者為500nm或以下的納米流體晶片用含有染色的基因組DNA的緩衝溶液進行填充，以便使用電場將DNA大分子拉入通道。將λ細菌噬菌體DNA分子(48. 51Λ)和人類BAC克隆(1701Λ)用染料Υ0Υ0-1染色。將該染色的DNA溶液在含有0. IM作為抗氧化劑的二硫蘇糖醇和0. 用作抗粘劑的線性丙烯醯胺的0. 5ΧΤΒΕ中稀釋到0. 5μ g/mL。使用帶有100X (N. Α. 1. 35)油浸物鏡的Olympus Ιχ-71倒置顯微鏡，並使用固態雷射器(例如二極體泵浦固態雷射器)，所述雷射器可以具有不同的激發波長(例如對於 Υ0Υ0-1染料來說473nm)。其他雷射器(例如用於Alexa系列染料Cy3、Cy5等的雷射器) 包括532nm DPSS雷射器、6；35雷射二極體雷射器、543nm氣體雷射器、591nm DPSS雷射器和 633nm氣體雷射器。使用具有512X 512像素陣列和16位數字輸出的ANDOR冷卻的EMCXD 相機對分子進行成像。數字圖像使用數據處理器通過J-image和其他分析軟體進行分析。實施例7:檢測流程在檢測流程的一個實例中，通過時間延遲和集成(TDI)相機捕獲在流動狀態下移動的DNA的視頻圖像。在這樣的實施方案中，DNA的移動與TDI同步。在檢測流程的另一個實例中，通過CCD或CMOS相機捕獲在流動狀態下移動的DNA 的視頻圖像，將幀通過軟體或硬體進行整合，以鑑定和重構DNA的圖像。在檢測流程的另一個實例中，通過在一組分離的傳感器上同時捕獲不同波長來收集DNA的視頻圖像。這通過使用一個相機和雙或多視圖分割器、或使用濾光器和多個相機來實現。相機可以是TDI、CXD或CMOS檢測系統。在另一個實例中，使用同時的多波長視頻檢測器，使用骨架染料來鑑定獨特的DNA 片段，並使用標記物作為標誌物來追蹤DNA的運動。這在DNA的長度大於相機視野的情況下是有用的，並且標誌物可用於協助對DNA的重構圖像進行作圖。
權利要求
1.一種對DNA進行表徵的方法，所述方法包括對包含第一 DNA鏈和第二 DNA鏈的雙鏈DNA進行處理，以產生第一 DNA鏈的未雜交的懸片段和第二 DNA鏈上的相應區域，未雜交的懸片段包含約1到約1000個鹼基；沿著第二 DNA鏈的相應區域延伸第一 DNA鏈；以及標記未雜交的懸片段的至少一部分、延伸的第一 DNA鏈的至少一部分或兩者。
2.權利要求1的方法，其中處理包含產生第一DNA鏈的切口。
3.權利要求2的方法，其中產生切口在一個或多個序列特異性位置處實現。
4.權利要求2的方法，其中產生切口在一個或多個非特異性位置處實現。
5.權利要求2的方法，其中產生切口通過將雙鏈DNA暴露於產生切口的核酸內切酶、電磁輻射、自由基或其任意組合來實現。
6.權利要求1的方法，其中沿著第二DNA鏈的相應區域延伸第一DNA鏈包括將第一DNA 鏈與聚合酶、一種或多種核苷酸、連接酶或其任意組合相接觸。
7.權利要求1的方法，其中標記通過下列手段來實現(a)使至少一個互補探針與未雜交的懸片段的至少一部分結合，所述探針包含一個或多個標籤，(b)使用一種或多種包含一個或多個標籤的核苷酸，沿著第二 DNA鏈的相應區域延伸第一 DNA鏈，或(a)和(b)的任意組合。
8.權利要求7的方法，其還包括獲得源自於一個或多個標籤的序列信息。
9.權利要求8的方法，其中序列信息源自於雙鏈DNA上的兩個或多個位置。
10.權利要求7的方法，其中標記包括連接標籤，所述標籤包含螢光團、量子點、樹枝狀聚合物、納米線、珠子、肽、蛋白、磁性珠、甲基、甲基轉移酶、非切割型限制性酶、鋅指蛋白、 抗體、轉錄因子、DNA結合蛋白、髮夾狀聚醯胺、形成三鏈體的寡脫氧核苷酸、肽核酸或其任思組合。
11.權利要求7的方法，其還包括從一個或多個標籤檢測一種或多種信號。
12.權利要求11的方法，其中信號包含螢光信號、化學發光信號、電磁信號、電信號、電勢差、物理尺寸差或其任意組合。
13.權利要求11的方法，其中信號源自於用於延伸第一DNA鏈的鹼基上的標籤與位於懸片段上的探針上的標籤之間的螢光共振能量轉移、位於懸片段上的探針上的兩個或多個標籤之間的螢光共振能量轉移，或其任意組合。
14.權利要求1的方法，其中懸片段包含雙鏈DNA上目標鹼基序列的至少一部分。
15.權利要求1的方法，其中第一DNA鏈的未雜交的懸片段、第二 DNA鏈的相應區域或兩者，包含位於雙鏈DNA上目標鹼基序列兩側的雙鏈DNA的至少一部分。
16.權利要求10的方法，其還包括將包含未雜交的懸片段的雙鏈DNA的至少一部分、第一 DNA鏈的延伸區域的至少一部分或兩者，至少部分線性化。
17.權利要求16的方法，其還包括測量兩個或多個標籤之間的距離。
18.權利要求17的方法，其還包括將所述距離與結構、序列組裝、遺傳或細胞遺傳圖譜、甲基化模式、CpG島的位置、表觀基因組模式、生理特徵或其任意組合相關聯。
19.權利要求16的方法，其中線性化通過將DNA限制在通道中來實現。
20.權利要求10的方法，其還包括測量來自至少一個標籤的至少一種信號的強度。
21.權利要求20的方法，其還包括將至少一種信號的強度與結構、序列組裝、遺傳或細胞遺傳圖譜、甲基化模式、生理特徵、CpG島的位置、表觀基因組模式或其任意組合相關聯。
22.權利要求1的方法，其還包括從DNA獲得表觀基因組信息。
23.—種對DNA進行表徵的方法，所述方法包括在第一雙鏈DNA上標記第一 DNA上的兩個或多個序列特異性位置；在第二雙鏈DNA上標記第二 DNA上的兩個或多個相應序列特異性位置；將第一雙鏈DNA的至少一部分線性化；將第二雙鏈DNA的至少一部分線性化；以及將線性化的第一雙鏈DNA上兩個或多個標記物之間的距離與線性化的第二雙鏈DNA上相應標記物之間的距離相比較。
24.權利要求23的方法，其中標記通過在雙鏈DNA的第一鏈上產生切口，以獲得雙鏈 DNA的(a)第一鏈的未雜交的懸片段和(b)第二鏈中的相應區域來實現。
25.權利要求對的方法，其還包括將懸片段暴露於與所述探針的至少一部分互補的標記的探針，使用一種或多種標記的鹼基沿著第二鏈的相應區域延伸DNA的第一鏈，或兩者。
26.權利要求23的方法，其中標記通過將第一和第二雙鏈DNA暴露於非切割型限制性酶、甲基轉移酶、鋅指蛋白、抗體、轉錄因子、DNA結合蛋白、髮夾狀聚醯胺、形成三鏈體的寡脫氧核苷酸、肽核酸或其任意組合來實現。
27.權利要求沈的方法，其中非切割型限制性酶包含標籤。
28.權利要求23的方法，其還包括將所述距離與DNA的結構、序列組裝、遺傳或細胞遺傳圖譜、甲基化模式、生理特徵、CpG島的位置、表觀基因組模式或其任意組合相關聯。
29.權利要求23的方法，其還包括從DNA獲得表觀基因組信息。
30.一種對DNA進行表徵的方法，所述方法包括在第一雙鏈DNA上標記第一雙鏈DNA上的一個或多個序列特異性位置；在第二雙鏈DNA上標記第二雙鏈DNA上相應的一個或多個序列特異性位置；將第一雙鏈DNA的至少一部分線性化；將第二雙鏈DNA的至少一部分線性化；以及將線性化的第一雙鏈DNA的標記物的信號強度與線性化的第二雙鏈DNA的標記物的信號強度相比較。
31.權利要求30的方法，其中標記通過在雙鏈DNA的第一鏈上產生切口，以獲得雙鏈 DNA的(a)第一鏈的未雜交的懸片段和(b)第二鏈中的相應區域來實現。
32.權利要求31的方法，其還包括將懸片段暴露於與所述探針的至少一部分互補的標記的探針，使用一種或多種標記的鹼基沿著第二 DNA鏈的相應區域延伸DNA的第一鏈，或兩者ο
33.權利要求30的方法，其還包括將所述信號強度與DNA的結構、序列組裝、遺傳或細胞遺傳圖譜、甲基化模式、生理特徵、CpG島的位置、表觀基因組模式或其任意組合相關聯。
34.權利要求30的方法，其還包括從DNA獲得表觀基因組信息。
35.一種對大分子進行表徵的方法，所述方法包括將包含至少一個從其延伸出的懸片段的大分子，沿著其中置有至少一個縊縮段的通道移位；以及檢測對應於大分子的至少一個懸片段從通道的至少一個縊縮段通過的至少一種信號。
36.權利要求35的方法，其中懸片段包含標記物。
37.權利要求35的方法，其中大分子包含標記物。
38.權利要求35的方法，其中信號是光信號、電信號或其任意組合。
39.權利要求35的方法，其中大分子包含雙鏈DNA或染色質纖維。
40.權利要求35的方法，其還包括將至少一個懸片段移位通過至少一個縊縮段一次以上。
41.一種對大分子進行表徵的方法，所述方法包括 標記大分子的至少一部分；將大分子固定化；將大分子的至少一部分置於通道中以使大分子的至少一部分在通道內被線性化；以及檢測與大分子的標記部分相關的至少一種信號。
42.權利要求41的方法，其中大分子結合在至少一個珠子上，被至少一個珠子固定化的分子被橫截面小於珠子的縊縮段捕獲。
43.權利要求41的方法，其中固定化通過將大分子化學限定到表面上、通過大分子的磁固定化、通過大分子的光捕獲或其任意組合來實現。
44.權利要求41的方法，其中大分子包含至少一種絕緣修飾，並通過光捕獲進行固定化。
45.權利要求41的方法，其中定製通道的尺寸以實現大分子的線性化。
46.一種分析系統，其包含含有至少一個寬度在約1到約100納米範圍內的通道的基材； 所述基材包含至少一個能夠相對於周圍介質選擇性固定化大分子的區域。
47.權利要求46的分析系統，其中通道包含約10到約50納米範圍內的寬度。
48.權利要求46的分析系統，其中固定化區域包含磁性區域、化學活性區域、縊縮段或其任意組合。
49.權利要求46的分析系統，其還包含能夠施加梯度的裝置，以便將選擇性固定化的大分子的至少一部分置於至少一個通道中。
50.一種對核酸聚合物進行表徵的方法，所述方法包括用一種或多種序列特異性基序標記物標記核酸聚合物的一個或多個區域； 將來自一個或多個序列特異性基序標記物的一種或多種信號，與核酸聚合物的一個或多個序列特異性基序標記物的位置相關聯；對核酸聚合物的一個或多個區段進行測序，所述一個或多個區段包括核酸聚合物的一個或多個序列特異性基序標記物；以及將一個或多個被測序的區段的一種或多種信號與標記的核酸聚合物的一個或多個相應信號進行比較，以便獲得兩個或多個被測序區段在核酸聚合物中的相對位置。
51.權利要求50的方法，其中標記通過在核酸聚合物中形成懸片段並標記懸片段、由懸片段空出的區域或其任意組合來實現。
52.權利要求50的方法，其中關聯包括將核酸聚合物的至少一個被標記部分線性化。
53.權利要求52的方法，其中線性化包括將核酸聚合物的至少一個被標記部分置於能夠使核酸聚合物的至少一個被標記部分線性化的通道中。
54.權利要求48的方法，其還包括向核酸聚合物的至少一個被標記部分施加梯度，以便使核酸聚合物的至少一個被標記部分線性化，將核酸聚合物的至少一個被標記部分維持在線性形式下，或其任意組合。
55.權利要求50的方法，其中關聯包括確定兩個或多個標記物之間的距離，將從兩個或多個標記物產生的信號強度進行比較，或其任意組合。
56.權利要求50的方法，其中測序包括Sanger測序、Maxam-GiIbert測序、染料終止物測序、體外克隆擴增、經合成測序、經雜交測序、經連接測序或其任意組合。
57.權利要求50的方法，其中區段包含約5到約30個千鹼基。
58.權利要求47的方法，其中比較包括將一個或多個被標記、測序的區段與被標記的核酸聚合物進行比對，以便將被標記、測序的區段的序列特異性基序標記物與被標記核酸聚合物的相應的序列特異性基序標記物配準。
全文摘要
本發明提供了用於單分子基因組分析的方法和裝置。在一個實施方案中，方法需要對雙鏈核酸進行處理並對所述核酸進行表徵。這些方法可用於例如確定個體之間的結構變異和拷貝數變異。
文檔編號C12Q1/68GK102292451SQ200980125335
公開日2011年12月21日 申請日期2009年6月30日 優先權日2008年6月30日
發明者坎達斯瓦米·維賈彥, 帕裡克希特·A·德什潘德, 曹涵, 肖明, 麥可·博伊斯-亞契諾, 麥可·奧斯汀, 阿列克謝·Y·沙羅諾夫 申請人:生物納米芯股份有限公司