抗病毒劑的製作方法

2023-10-09 13:53:49

專利名稱：抗病毒劑的製作方法
技術領域：
本發明涉及通過抗病毒作用對病原生物有效的藥物或飲食品。
背景技術：
考慮抗病毒作用時，要考慮抑制細胞被病毒感染、抑制感染細胞中病毒的增殖等誘導產生抵抗病毒能力的作用、把已感染病毒的細胞選擇性殺死的作用以及使病毒自身失活(喪失感染力)的作用。
作為具有使病毒自身失活作用的物質，有對於病毒的中和抗體。另外，誘導產生這種抗體的方法有疫苗。但是，雖然通過投給疫苗誘導產生抗體對於預防病毒感染是有效的，但目前還沒有使用抗體進行有效治療的方法。而且，使用能直接使病毒失活的藥劑進行有效治療的方法也還沒有。
作為誘導產生抵抗病毒能力的作用，可以考慮抑制病毒基因組複製、抑制病毒基因的複製、抑制病毒蛋白的合成、抑制病毒蛋白的摺疊等。這種作用的誘導包括抑制細胞內轉錄因子的活性或表達、抑制來源與病毒的轉錄因子的活性或表達、誘導產生熱休克蛋白等。誘導產生這種作用的物質，例如前列腺素。
另外，選擇性殺死病毒感染細胞的物質有作為抗皰疹病毒藥使用的阿昔洛韋、更昔洛韋、索立夫定等。
本發明所要解決的課題對於病毒採用綜合的作用處理比採用單獨的作用處理更有效。例如，即使投給可以選擇性殺死病毒感染細胞的物質，到感染細胞死亡的這一段時間內，由於病毒增殖感染其它細胞，將病毒完全除去是非常困難的。另一方面，即使投給具有誘導產生抵抗病毒能力作用的物質，也不能除去感染細胞。
本發明的目的在於開發一種具有誘導細胞產生抗病毒性的功能以及選擇性殺死病毒感染細胞的功能的化合物，提供一種以該物質為有效成分的抗病毒劑、肝功能改善劑、熱休克蛋白誘導劑、癌基因致癌防止劑、化學致癌抑制劑等藥物以及抗病毒用食品或飲料。解決課題的手段本發明者為了達到上述目的進行了悉心的研究，結果發現如果使具有誘導細胞產生病毒抵抗性的功能而且具有選擇性殺死病毒感染細胞的功能的化合物發生作用，可以使病毒感染細胞選擇性地受到傷害，同時在直到其死亡的這段時間內可以減少增殖的病毒量；同時，因此直到感染細胞死亡被增殖的病毒新感染的細胞減少；而且由於病毒未感染細胞也可以通過投給該化合物預先獲得病毒抵抗能力，即使是新感染的也可以抑制病毒的增殖；也就是說，具有誘導細胞產生病毒抵抗性的功能而且具有選擇性殺死病毒感染細胞的功能的化合物可以非常有效地除去病毒，例如人類獲得性免疫缺陷病毒或C型肝炎病毒。
本發明中所使用的化合物誘導細胞產生病毒抵抗性的功能可以在化合物對病毒感染前的細胞進行作用後，以抑制病毒對細胞的感染、抑制病毒基因組的複製、抑制病毒基因的複製、抑制病毒蛋白的合成、抑制病毒蛋白的摺疊等為指標進行測定。
另外，選擇性殺死病毒感染細胞的功能可以通過比較病毒感染細胞與非病毒感染細胞的生存率來測定。
作為具有誘導細胞產生病毒抵抗性的功能而且具有選擇性殺死病毒感染細胞的功能的化合物，只要這兩種功能都優良即可，並沒有什麼限定。
而且，作為具有誘導細胞產生病毒抵抗性的功能而且具有選擇性殺死病毒感染細胞的功能的化合物，本發明者發現了式〔I〕的化合物4，5-二羥基-2-環戊烯-1-酮(以下簡稱為環戊烯酮)或其光學活性體或其鹽，從而完成了本發明。
如果對本發明作一概述，本發明的第1個發明涉及抗病毒劑，其特徵在於含有選自下式〔I〕所表示的4，5-二羥基-2-環戊烯-1-酮或其光學活性體或它們的鹽中至少一種以上的化合物作為有效成分。

本發明的第2個發明涉及抗病毒用食品或抗病毒用飲料，其特徵在於含有選自式〔I〕所表示的4，5-二羥基-2-環戊烯-1-酮或其光學活性體或它們的鹽中至少一種以上的化合物。
在本發明的優選實施方案中，作為病毒例如人類獲得性免疫缺陷病毒或C型肝炎病毒。另外，作為抗病毒劑例如人類抗病毒劑、非人類動物用抗病毒劑(例如家畜、家禽、魚類或蝦類用抗病毒劑)、或植物用抗病毒劑。
圖面說明

圖1是表示使用CEM-SS細胞時環戊烯酮濃度與細胞生存率的關係的圖。
圖2表示使用H9細胞時環戊烯酮濃度與細胞生存率的關係的圖。
圖3是表示使用CEM-3B細胞時環戊烯酮濃度與細胞生存率的關係的圖。
圖4是表示使用H9-3B細胞時環戊烯酮濃度與細胞生存率的關係的圖。
圖5是表示環戊烯酮的致癌抑制作用的圖。
圖6是表示(-)體環戊烯酮的對二甲基氨基苯甲醯基衍生物的CD以及(-)體環戊烯酮的立體結構的圖。
圖7是表示(+)體環戊烯酮的對二甲基氨基苯甲醯基衍生物的CD以及(+)體環戊烯酮的立體結構的圖。
發明的實施方式本發明所使用的式〔I〕表示的環戊烯酮包含4位和5位羥基的立體構型為順式的異構體和立體構型為反式的異構體兩種。在本發明中可以使用順式環戊烯酮，也可以使用反式環戊烯酮，還可以使用順式環戊烯酮和反式環戊烯酮的混合物。另外，也可以使用它們的光學活性體。
順式環戊烯酮可以採用化學合成法製得(《瑞士化學學報》Helvetica Chimica Acta，第55卷，第2838～2844頁(1972))。反式環戊烯酮也可以採用化學合成法製得(《碳水化合物研究》Carbohydrate Res.，第247卷，第217～222頁(1993))，另外也可以通過加熱處理糖醛酸(例如葡萄糖醛酸)、糖醛酸衍生物(例如葡萄糖醛酸內酯)或含有它們的物質(參考PCT/JP97/03052號說明書)。在本發明中可以使用含有環戊烯酮的這些加熱處理物、其部分精製物以及精製物。
例如，糖醛酸使用D-葡萄糖醛酸，通過將其1％的溶液在121℃條件下加熱處理4小時，在加熱處理物中可以生成環戊烯酮。用溶劑提取該加熱處理物中的環戊烯酮，濃縮提取物。然後用矽膠柱層析法分離該濃縮物，將洗脫出的環戊烯酮部分濃縮，用氯仿從濃縮物中提取環戊烯酮，提取濃縮物通過正相柱層析法分離得到加熱處理物中的環戊烯酮。
環戊烯酮的物理性質如下所示。另外，環戊烯酮的質量分析是採用DX302質量分析儀(日本電子社生產)進行的。另外，使用重氫氯仿溶劑的NMR波譜測定使用JNM-A500(日本電子社生產)。比旋光度使用DIP-370型旋光計(日本分光社生產)測定、UV吸收光譜使用UV-2500分光光度計(島津製作所生產)測定、紅外吸收光譜(IR)使用FTIR-8000紅外分光光度計(島津製作所生產)測定。MS m/z 115〔M+H〕+1H-NMR(CDCl3)δ4.20(1H，d，J＝2.4Hz，5-H)、4.83(1H，m，4-H)、6.30(1H，dd，J＝1.2，6.1Hz，2-H)、7.48(1H，dd，J＝2.1，6.1Hz，3-H)其中，1H-NMR的化學位移值以CHCl3的化學位移值7.26ppm為準。
旋光度〔α〕D200°(c1.3，水)UVλmax 215nm(水)IR(KBr法)在3400、1715、1630、1115、1060、1025cm-1處有吸收。
分離得到的環戊烯酮通過光學拆分，可以得到(-)-4，5-二羥基-2-環戊烯-1-酮和(+)-4，5-二羥基-2-環戊烯-1-酮。當然，通過合成方法得到的環戊烯酮也可以進行光學拆分。
例如，將環戊烯酮溶解於乙醇。在該乙醇溶液中再加入己烷/乙醇(94/6)，調製環戊烯酮溶液。可以將該試樣溶液，例如使用Chiral PackAS(Daicel化學工業)柱，在柱溫度40℃、流動相己烷/乙醇(94/6)的條件下進行HPLC，從而光學拆分環戊烯酮。
拆分得到的(-)-反式-4，5-二羥基-2-環戊烯-1-酮〔以下稱為(-)體環戊烯酮〕的旋光度為〔α〕D20-105°(c0.30，乙醇)，(+)-反式-4，5-二羥基-2-環戊烯-1-酮〔以下稱為(+)體環戊烯酮〕的旋光度為〔α〕D20+104°(c0.53，乙醇)。另外，旋光度是使用上述DIP-370型旋光計(日本分光社生產)來測定的。
以下，按照上述記載的方法對(-)體環戊烯酮和(+)體環戊烯酮分別進行質量分析、通過核磁共振法(NMR)進行結構解析、測定UV吸收光譜、測定紅外吸收光譜。其結果表明，兩種光學活性體具有與光學拆分前的環戊烯酮相同的結果。
將光學拆分得到的(-)體環戊烯酮與(+)體環戊烯酮分別製成對二甲基氨基苯甲醯基衍生物，使用J-720型圓二色性分散計(日本分光社生產)測定圓二色譜(CD)，將其結果應用於二苯甲酸鹽偏光力規則(J.Am.Chem.Soc.，第91卷，第3989～3991頁(1996))，確定其立體構型。
(-)體環戊烯酮的對二甲基氨基苯甲醯基衍生物的CD及(-)體環戊烯酮的立體結構如圖6所示。圖中縱軸表示摩爾圓二色性，橫軸表示波長(nm)。另外，上述立體結構如下式〔II〕所示

(+)體環戊烯酮的對二甲基氨基苯甲醯基衍生物的CD及(+)體環戊烯酮的立體結構如圖7所示。圖中縱軸表示摩爾圓二色性，橫軸表示波長(nm)。另外，上述立體結構如下式〔III〕所示

如圖6、7及式〔II〕、式〔III〕所示，(-)體環戊烯酮為(-)-(4R，5S)-反式-4，5-二羥基-2-環戊烯-1-酮，(+)體環戊烯酮為(+)-(4S，5R)-反式-4，5-二羥基-2-環戊烯-1-酮。
以上本發明所使用環戊烯酮或其光學活性體可以採用任何方法製備，可以採用說明書中描述的方法製備，也可以採用化學合成方法合成，本發明也可以使用環戊烯酮的反式體、順式體及其混合物。當然，採用化學合成法得到的環戊烯酮的光學活性體也可以包含在本發明所描述的光學活性體中。
環戊烯酮或其光學活性體的鹽為可藥用鹽，可以按照公知的方法進行變換。
本發明所使用的具有誘導細胞產生病毒抵抗性的功能、並且具有選擇性殺死病毒感染細胞的功能的化合物，例如環戊烯酮或其光學活性體或它們的鹽，具有抗病毒作用，可以製造以選自這些化合物中的至少一種化合物作為有效成分的抗病毒劑。
也就是說，以具有誘導細胞產生病毒抵抗性的功能、並且具有選擇性殺死病毒感染細胞的功能的化合物為有效成分，將其與公知的藥用載體組合進行製劑化，可以製造抗病毒劑。
抗病毒劑的製造，一般可以將具有誘導細胞產生病毒抵抗性的功能、並且具有選擇性殺死病毒感染細胞的功能的化合物，例如選自環戊烯酮或其光學活性體或它們的鹽中至少1種以上的化合物，與可藥用的液體或固體載體配合，而且在必要時加入溶劑、分散劑、乳化劑、緩衝劑、穩定劑、賦形劑、粘合劑、崩解劑、潤滑劑等，製成片劑、顆粒劑、散劑、粉末劑、膠囊劑等固體製劑；溶液劑、懸濁劑、乳劑等液體製劑。另外，可以將其製成乾燥品，在使用前加入適當的載體可以成為液體。
藥用載體可以根據上述給藥方式及劑型進行選擇，口服製劑的場合可以使用例如澱粉、乳糖、蔗糖、甘露糖醇、羧甲基纖維素、玉米澱粉、無機鹽等。另外，製造口服製劑時還可以加入粘合劑、崩解劑、表面活性劑、潤滑劑、流動性促進劑、矯味劑、著色劑、香料等。
另一方面，非口服製劑的場合可以按照常規方法將本發明的有效成分——具有誘導細胞產生病毒抵抗性的功能、並且具有選擇性殺死病毒感染細胞的功能的化合物，例如選自環戊烯酮或其光學活性體或它們的鹽中的至少1種以上的化合物，溶解乃至懸濁於注射用蒸餾水、生理鹽水、葡萄糖水溶液、注射用植物油、芝麻油、花生油、大豆油、玉米油、丙二醇、聚乙二醇等稀釋劑中，必要時加入殺菌劑、穩定劑、等滲劑、無痛化劑等而製得。
本發明的抗病毒劑可以相應於製劑形態採用適當的給藥途徑給藥。給藥方法也沒有特別的限定，可以內用、外用和注射。注射劑可以靜脈、肌肉、皮下、皮內給藥，外用劑也包括栓劑等。
抗病毒劑的給藥量可以根據其製劑形態、給藥方式、使用目的及其所適用的患者的年齡、體重、症狀適當設定，雖然並不是一定的，但是一般來說，製劑中含有的具有誘導細胞產生病毒抵抗性的功能、並且具有選擇性殺死病毒感染細胞的功能的化合物，例如選自環戊烯酮或其光學活性體或它們的鹽中至少一種以上的物質的量為成人每天0.1μg～20mg/kg。當然，給藥量根據各種條件而有所變動，既有少於上述給藥量就足夠的場合，也有必需超範圍的場合。本發明的藥劑除可以直接口服之外，還可以添加到任意的飲食品中使之進行日常的攝取。另外，具有誘導細胞產生病毒抵抗性的功能、並且具有選擇性殺死病毒感染細胞的功能的化合物，例如環戊烯酮或其光學活性體或它們的鹽，也可以用作抗病毒劑、抗病毒用食品或飲料的原料。
本發明所使用的具有誘導細胞產生病毒抗性的功能、並且具有選擇性殺死病毒感染細胞的功能的化合物，例如環戊烯酮或其光學活性體或它們的鹽，對於DNA病毒、RNA病毒、逆轉錄病毒、類病毒具有抗病毒活性。
因此，可以用作人類用抗病毒劑、非人類動物用抗病毒劑(例如對家畜、家禽、魚類或蝦類等養殖動物的病毒病有效的抗病毒劑)、植物用抗病毒劑(例如對花卉類、蔬菜類等農園藝作物的病毒病有效的抗病毒劑)等有用生物的抗病毒劑。
感染動物的DNA病毒例如有痘病毒、皰疹病毒、腺病毒、B型肝炎病毒、乳頭狀瘤病毒、多瘤病毒、埃-巴二氏病毒和杆狀病毒，感染植物的DNA病毒例如有花椰菜花葉病毒。感染動物的RNA病毒例如有輪狀病毒、風疹病毒、日本腦炎病毒、登革熱病毒、新城疫病毒、麻疹病毒、腮腺炎病毒、瘟熱病毒、流感病毒、水皰性口內炎病毒、人類脊髓灰質炎病毒、A型肝炎病毒、C型肝炎病毒，感染植物的RNA病毒例如有菸草花葉病毒、麥類矮縮病毒、水稻條葉枯病毒、菸草環斑病毒。逆轉錄病毒例如有成人T細胞白血病病毒、人類獲得性免疫缺陷病毒，類病毒例如有馬鈴薯紡錘塊莖病類病毒。
環戊烯酮或其光學活性體或它們的鹽對於治療和預防非人類哺乳動物、鳥(例如雞、火雞)、冷血動物(例如魚)的病毒病是有效的，這些化合物對下述的非人類病毒具有抗病毒活性。sciruid皰疹病毒1型、cavlid皰疹病毒1型、兔皰疹病毒1型、雉皰疹病毒1型、雉皰疹病毒2型、火雞皰疹病毒1型、鴨皰疹病毒1型、鯰魚(catfish)皰疹病毒1型、馬皰疹病毒3型、牛皰疹病毒1型、牛皰疹病毒3型、牛皰疹病毒4型、豬皰疹病毒1型、豬皰疹病毒2型、鼠(murid)皰疹病毒1型、蛛猴皰疹病毒1型、蛛猴皰疹病毒2型、tupalid皰疹病毒1型、犬皰疹病毒1型、貓皰疹病毒1型、馬皰疹病毒1型和馬皰疹病毒2型。
可以採用獸醫和飼養中公知的方法，例如將本發明的抗病毒劑注射給鳥類或者添加到飼料或飲用水中，通過本發明中所使用的化合物預防和/或治療馬萊克氏病(Marek’s disease)等鳥類病毒性疾病。另外，直接將本發明所使用的化合物添加到池塘、水槽、存儲槽或飼養區內的水、海水等中，或者將本發明所使用的化合物混合到飼料中，同樣可以預防和/或治療由於皰疹病毒例如小鯰魚病毒(petitecatfish virus)、Herpesvirus solomons、nerka病毒等病毒感染引起生活在池塘、水槽、存儲槽或飼養區等狹小區域中的魚的病毒病，例如鮭科魚類的傳染性造血器官壞死病、皰疹病毒感染或傳染性胰臟壞死病、鮭屬的病毒性出血性敗血症、鯉魚春季病毒病、各種魚的淋巴結病、海產魚或溯河產卵魚的病毒性紅細胞壞死病、比目魚等的杆狀病毒病、

魚苗等的病毒性胰臟肝臟壞死病、虎河豚(torafugu)等的口白病(snout ulcer)。另外，投給本發明所使用的化合物、本發明的抗病毒劑時，正確的管理必然要看對於被治療的各個被測體的必要性、治療的種類和飼養者的判斷。
投給了本發明抗病毒劑的非人類動物，可以通過保持其健康，顯著地改善生存率、成長率、產卵率等。
本發明所使用的具有誘導細胞產生病毒抵抗性的功能、而且具有選擇性殺死病毒感染細胞的功能的化合物，例如環戊烯酮或其光學活性體或它們的鹽，可以通過抑制這些病毒蛋白的合成、抑制病毒基因組的合成，顯示出很強的抗病毒活性。另外，可以選擇性的殺死這些病毒感染細胞。
例如，對於感染了人類獲得性免疫缺陷病毒(以下簡稱為HIV)的患者，並不是所有的CD4陽性細胞都被HIV感染，而僅是一部分細胞被感染。本發明的抗病毒劑可以在抑制該感染細胞中HIV增殖的同時選擇性殺死感染細胞、誘導未感染細胞產生病毒抵抗能力、從而可以從細胞中除去HIV。
環戊烯酮或其光學活性體或它們的鹽除具有上述抗病毒作用之外還具有改善肝功能的作用、熱休克蛋白誘導作用，以選自環戊烯酮或其光學活性體或它們的鹽中的1種以上作為有效成分的肝功能改善劑或熱休克蛋白誘導劑可以按照上述抗病毒劑進行製劑化，也可以按照抗病毒劑的方法給藥。
作為肝功能改善劑或熱休克蛋白誘導劑的給藥量可以根據其製劑形態、給藥方法、使用目的及其所適用的患者的年齡、體重、症狀適當設定，並不是一定的，但一般製劑中含有的選自環戊烯酮或其光學活性體或它們的鹽中1種以上的化合物的量為成人每天0.1μg～20mg/kg。當然，由於給藥量根據各種條件發生變動，既有少於上述給藥量就足夠的場合，也有必須超範圍的場合。本發明的藥劑除可以直接經口給藥之外，還可以添加到任意的飲食品中使之進行日常的攝取。另外，選自環戊烯酮或其光學活性體或它們的鹽中1種以上的化合物也能用作肝功能改善用飲食品、熱休克蛋白誘導用飲食品的原料。
通過攝取環戊烯酮或其光學活性體或它們的鹽，可以改善肝功能，使GOT、GPT值正常化。
另外，環戊烯酮或其光學活性體或它們的鹽具有70k道爾頓(HSP70)等熱休克蛋白誘導活性，對於肝炎病毒、愛滋病病毒、流感病毒、水皰性口內炎病毒、皰疹病毒等RNA病毒、DNA病毒具有抗病毒作用。另外，熱休克蛋白與癌免疫有關，同時具有生物體防禦作用。通過攝取環戊烯酮或其光學活性體或它們的鹽，可以預防、治療流感病毒引起的感冒等病毒性疾病。
另外，熱休克蛋白是細胞或個體接受比平常溫度高5～10℃的急劇溫度變化時誘導產生的蛋白質的總稱，廣泛分布在原核生物直到高等真核生物中。真核生物的熱休克蛋白，已知有HSP90、HSP70、遍在蛋白質、HSP26等。其中，HSP70是分子伴侶的一種，與摺疊未完成或不完全摺疊的蛋白結合，有助於立體結構的形成。熱休克蛋白的胺基酸序列在進化過程中可以很好的保存，HSP70與大腸桿菌的DnaK蛋白相同。人類存在約10個HSP70基因，其中有的是自然表達的，有的是由於各種刺激誘導產生的。熱休克蛋白的合成也可以通過熱休克以外的各種化學物質、氧化應激反應等細胞障礙誘導產生。
C.Amici等〔《病毒學雜誌》Journal of Virology，第68卷，第6890～6899頁(1994)〕報告指出如果在具有α，β-不飽和羰基的前列腺素A1存在條件下，培養感染了仙臺病毒(副流感病毒)的動物細胞，可以誘導HSP70和HSP90的合成，誘導HSP70合成期間可以抑制病毒蛋白的合成。另外，A.Rossi等〔《生物化學雜誌》The Journalof Biological Chemistry，第271卷、第32192～32196頁(1996)〕報告指出2-環戊烯-1-酮與前列腺素A1一樣可以誘導HSP70的合成，抑制水皰性口內炎病毒蛋白的合成。
本發明所使用的環戊烯酮誘導HSP70的能力在10μM即可見到，20～30μM達到最大，而2-環戊烯-1-酮誘導HSP70時則需要數百μM的濃度，與之相比可以說誘導能力非常高。它可以與前列腺素A1的HSP70誘導能力相匹敵，由於環戊烯酮的分子量在前列腺素A1的1/3以下，如果用重量濃度比較的話，也可以說具有的誘導能力比前列腺素A1高。
本發明所使用的環戊烯酮或其光學活性體或它們的鹽由於具有這樣高的熱休克蛋白誘導作用，對於DNA病毒、RNA病毒、逆轉錄病毒和類病毒具有抗病毒活性。這些病毒、類病毒例如上述各種病毒、類病毒。
環戊烯酮或其光學活性體或它們的鹽對於癌基因轉化生成的癌細胞也具有抑制增殖的活性，具有防止癌基因引起癌變的作用。
例如乳頭瘤病毒是乳頭多瘤空泡病毒科(papovaviridae)乳頭瘤病毒屬(papillomavirus)的DNA病毒，作為人乳頭瘤病毒(HPV)，已知例如誘發子宮頸癌等的HPV16型。
環戊烯酮或其光學活性體或它們的鹽對於由HPV16型癌基因E7引起癌變的細胞具有抑制增殖的效果，可以提供以選自環戊烯酮或其光學活性體或它們的鹽中的至少一種化合物為有效成分的病毒癌變細胞增殖抑制劑，可以防止癌基因引起的癌變。
另外，環戊烯酮或其光學活性體或它們的鹽對於引發劑和助催化劑引起的2階段癌變具有抑制作用，可以提供一種以選自這些化合物中至少一種化合物作為有效成分的化學癌變抑制劑。
因此，可以提供一種含有選自環戊烯酮或其光學活性體或它們的鹽中至少一種化合物的癌變預防用食品或癌變預防用飲料。
含有選自環戊烯酮或其光學活性體或它們的鹽中至少一種化合物作為有效成分的癌基因癌變防止劑或化學癌變抑制劑，可以按照抗病毒劑進行製劑化，按照抗病毒劑的方法給藥。
在本發明的抗病毒用食品或抗病毒用飲料的製造中，可以使用具有誘導細胞產生病毒抵抗性的功能、而且具有選擇性殺死病毒感染細胞的功能的化合物，例如環戊烯酮或其光學活性體或它們的鹽。另外，也可以使用含有環戊烯酮的糖醛酸加熱處理物、由該加熱處理物得到的部分精製環戊烯酮和精製環戊烯酮。
另外，在具有肝功能改善作用、熱休克蛋白誘導作用、癌變防止作用等的效力體現用食品或效力體現用飲料的製造中，也可以使用環戊烯酮或其光學活性體或它們的鹽、含有環戊烯酮的加熱處理物、由該加熱處理物得到的部分精製環戊烯酮和精製環戊烯酮。
也就是說，稀釋和/或添加選自這些環戊烯酮或其光學活性體或它們的鹽、含有環戊烯酮的加熱處理物、由該加熱處理物得到的部分精製環戊烯酮和精製環戊烯酮的原料所製得的食品或飲料包括在本發明的抗病毒用食品或飲料中。
本發明的抗病毒用食品或抗病毒用飲料的製造方法沒有特別的限定，例如可以採用烹調、加工以及通常所使用的食品或飲料的製造方法來製造，製得的食品或飲料中優選含有有效量的具有誘導細胞產生病毒抵抗性的功能、而且具有選擇性殺死病毒感染細胞的功能的化合物，例如選自環戊烯酮或其光學活性體或它們的鹽中至少一種以上的化合物。
作為本發明的抗病毒用食品或抗病毒用飲料，只要含有、添加和/或稀釋了具有誘導細胞產生病毒抵抗性的功能、而且具有選擇性殺死病毒感染細胞的功能的化合物，例如選自環戊烯酮或其光學活性體或它們的鹽中1種以上的化合物，其形狀並無特別的限定，包括片狀、顆粒狀、膠囊狀、凝膠狀、溶膠狀等可以經口攝取的形狀。
另外，作為肝功能改善用、熱休克蛋白誘導用、癌變預防用食品或肝功能改善用、熱休克蛋白誘導用、癌變預防用飲料，只要含有、添加和/或稀釋了具有肝功能改善作用、熱休克蛋白誘導作用、癌變預防作用的環戊烯酮或其光學活性體或它們的鹽中至少一種化合物，其形狀並無特別的限定，包括片狀、顆粒狀、膠囊狀、凝膠狀、溶膠狀等可以經口攝取的形狀。
本發明的食品或飲料含有具有生理活性的環戊烯酮或其光學活性體或它們的鹽，由於這些化合物所具有的各種生理活性如抗病毒作用、肝功能改善作用、熱休克蛋白誘導作用、癌變預防作用等，是通過對其的攝取具有預防、治療病毒性疾病、肝功能改善效果、癌變預防效果等的健康食品或飲料，是對於維持生物體的內環境穩定有用的食品或飲料。
本發明所使用的化合物即使按其生理活性的有效量給藥也沒有毒性，例如經口給藥時，即使將環戊烯酮或其光學活性體或它們的鹽中任意一種按照100mg/kg一次投給大白鼠，確認也沒有死亡例。
以上，本發明的藥劑可以用作病毒性疾病、肝疾病、癌等的治療劑或預防劑，特別是對於HIV引起的獲得性免疫缺陷綜合症的治療、症狀的改善是很有用的。
實施例以下結合實施例更具體的說明本發明，但本發明並不受這些實施例的任何限制。另外，實施例中的％是指重量％。參考例1將D-葡萄糖醛酸(Sigma生產G 5269)10g溶解於1升水中，在121℃加熱4小時後，在減壓條件下濃縮至約10ml。將醋酸丁酯∶醋酸∶水＝3∶2∶2混合液的上層40ml加入到其中混合後，將離心分離得到的上清液在減壓條件下濃縮至約10ml。
將上述提取液於採用柱層析法的矽膠BW-300SP(2×28cm，富士Silycia化學社生產)中上樣，以醋酸丁酯∶醋酸∶水＝3∶2∶2的上層為洗脫液，用壓縮機加壓至0.2kg/cm2，以每分鐘5ml的流速進行分離。分出流分，使每1流分為10ml，取各流分的一部分採用薄層色譜法進行分析，第61-80號流分中含有高純度的環戊烯酮。集中這些流分，在減壓條件下濃縮後用40ml氯仿提取，將提取液在減壓條件下濃縮，從而得到100mg環戊烯酮。
用使用Palpack型S柱的正相HPLC分離該成分，用215nm紫外線吸收檢測，純度為98％。
將上述環戊烯酮113.9mg溶於乙醇2.85ml中。再在該乙醇溶液中加入己烷/乙醇(94/6)3.85ml，調製成17mg/ml的環戊烯酮溶液。用0.5μm的過濾器過濾該溶液，得到光學拆分HPLC的試樣溶液。
在以下條件下，對該試樣溶液進行光學拆分HPLC，分別收集前峰的(-)體環戊烯酮和後峰的(+)體環戊烯酮，減壓乾燥，分別得到(-)體環戊烯酮43.2mg，(+)體環戊烯酮43.0mg。
光學拆分HPLC條件柱Chiral Pack AS(Daicel化學工業生產)2.0cm×25.0cm柱溫40℃流動相己烷/乙醇(94/6)流速14.0ml/min檢測UV210nm進樣量150μl(2.55mg)由於得到的(-)體環戊烯酮與(+)體環戊烯酮兩者均含有約1％的對映體，在上述條件下再度進行光學拆分。其結果分別從前峰的(-)體環戊烯酮30.0mg得到不含有對映體的(-)體環戊烯酮19.7mg，從後峰的(+)體環戊烯酮37.4mg得到不含有對映體的(+)體環戊烯酮27.7mg。另外，(-)體環戊烯酮、(+)環戊烯酮的光學拆分HPLC的洗脫時間分別為33分、40分。實施例1(1)在6孔板的各個孔中加入含有2×105細胞/ml的人早幼粒細胞性白血病細胞HL-60(ATCC CLL-240)的含胎牛血清10％的RPMI1640培養基5ml，在37℃、5％CO2存在條件下培養24小時後，加入參考例1所述的環戊烯酮使最終濃度為0、10、20、30、40、50、100μM，再繼續培養8小時。
培養結束後測定細胞數，然後通過離心分離回收細胞，用磷酸緩衝鹽水(PBS)洗淨，製得環戊烯酮處理的細胞。另外，還製得在45℃熱處理10分鐘後同樣培養的細胞。
使用這些處理細胞，按照《分子克隆》Molecular Cloning〔冷泉港實驗室出版社Cold Spring Harb or Laboratory Press(1989)〕記載的方法進行SDS聚丙烯醯胺凝膠電泳(SDS-PAGE)。將處理細胞懸濁在SDS-PAGE試樣緩衝液(SDS-PAGE sample buffer)中，使之達到2.5×106細胞/ml，將該細胞懸濁液在100℃條件下處理10分鐘後，分別取5μl塗於2片SDS-PAGE凝膠(5％堆積膠、10％分離膠)，進行電泳。一片凝膠進行考馬斯(coomassie)染色，另一片凝膠被轉印至聚二氟乙烯轉移膜(ImmobilonTMMILLPORE公司生產Cat.#IPVH000-10)。在4℃條件下用Block Ace(大日本製藥株式會社Cat.#UK-B25)封閉該薄膜1夜。
使該被封閉的薄膜與單克隆抗體HSP 72/73(Ab-1)〔OncogeneResearch Products公司生產Cat.#HSP01〕進行反應，該單克隆抗體HSP72/73(Ab-1)可以與熱誘導的70kDa的熱休克蛋白進行特異的反應，然後用含有0.05％Tween 20的Tris-緩衝鹽溶液(TBS)洗滌，再用TBS洗滌。然後與結合過氧化物酶的二次抗體HRP兔抗鼠IgG(H+L)(ZYMED Laboratolies，Inc.生產Cat.#61-6520)進行反應，採用與前面相同的操作進行洗滌。使這種與一次抗體、二次抗體進行了反應後的薄膜再與化學發光試劑RENAISSANCETM(Dupont NEN公司生產Cat.#NEL-100)進行反應，使X射線膠片感光，確認70kDa的熱休克蛋白的誘導。
其結果確認通過添加環戊烯酮20-30μM誘導產生70kDa的熱休克蛋白與在45℃條件下熱處理10分鐘誘導產生70kDa的熱休克蛋白幾乎是相同的。其誘導的強度如表1所示。另外，在表1中，+表示誘導的強度，+越多表示誘導越強。另外，-表示沒有誘導，±表示輕微誘導。表1<

另外，(-)體環戊烯酮、(+)體環戊烯酮均得到同樣的結果。實施例2(1)使用10cm培養皿，在含有10％胎牛血清的Dulbecco改良Eagle’s培養基(DMEM，日水公司生產)中，在5％二氧化碳存在條件下、37℃培養HeLa細胞，使之達到80％鋪滿，然後加入環戊烯酮使最終濃度達到0、5、10、20或40μM，在上述條件下再培養6小時。棄去培養基，在各個孔中加入1ml 10％三氯醋酸後，通過刮刀回收細胞。
採用實施例1的方法對上述得到的細胞進行SDS-PAGE和顯影，檢測到70kd熱休克蛋白的出現。
其結果發現添加環戊烯酮至5μM～40μM的部分出現70kd熱休克蛋白的誘導。其結果如表2所示。另外，在表2中，+表示通過顯影觀察得到的70kd熱休克蛋白的信號的強度，+越多表示信號越強。另外，±表示信號非常弱。表2

(2)使用10cm培養皿，在含有10％胎牛血清的DMEM中在5％二氧化碳存在條件下、37℃培養HeLa細胞，使之達到80％的鋪滿，加入環戊烯酮使最終濃度達到0、5、10、20或40μM，在上述條件下再培養6小時。之後，用含有5％胎牛血清的DMEM將細胞洗淨，將含有腺病毒Ad5 dlX〔Saito等，《病毒學雜誌》Journal of Virology，第54卷，第711～719頁(1985)〕的含5％胎牛血清的DMEM加入到細胞中使之感染，培養20小時。其中感染多重度(m.o.i.)設定為50。棄去培養基，在各個孔中加入1ml 10％三氯醋酸後，用刮刀回收細胞。
採用實施例1的方法對這樣得到的細胞進行SDS-PAGE和顯影，檢測腺病毒異己酮蛋白(hexon proteins)的出現。其中一次抗體使用抗腺病毒異己酮抗體(anti-adenovirus hexon antibody)〔ChemiconInternational Inc.生產，AB1056〕。
添加環戊烯酮至10μM以上的部分與未添加環戊烯酮的部分相比，異己酮蛋白的量顯著減少。另外，發現添加環戊烯酮至20μM以下的部分與未添加環戊烯酮部分的細胞增殖相同。
(3)按照「病毒試驗草案」〔Medical View公司發行〕24～25頁記載的方法，從與實施例2-(2)相同經環戊烯酮處理後使之感染腺病毒進行培養得到的Hela細胞中提取出病毒DNA。
也就是說，用磷酸緩衝鹽水將病毒感染細胞洗淨，在1ml 0.6％月桂基硫酸鈉(SDS)/10mM EDTA水溶液中懸浮後，加入3.0ml的5M NaCl水溶液。在0℃放置1小時，在離心分離得到的上清液中加入3ml乙醇，混合。將離心得到的沉澱溶解於0.2ml TE緩衝液〔10mM Tris-HClpH8.0、1mM EDTA〕，加入2μl 10％ SDS和4μl 10mg/ml蛋白酶K(寶酒造公司生產)，在37℃保溫1小時。用苯酚和氯仿的等量混合液提取2次，在水層中加入20μl 3M醋酸鈉和400μl乙醇後離心分離，將沉澱溶解於50μl TE緩衝液中，得到DNA溶液。在10μl DNA溶液中加入10單位的EcoT22I(寶酒造公司生產)和1μl 10mg/ml核糖核酸酶A進行消化，通過瓊脂糖膠電泳測定病毒DNA量。其結果是，添加環戊烯酮至5μM以上的部分與未添加環戊烯酮的對照試驗相比，病毒DNA的量顯著減少。
(4)與實施例2-(2)同樣培養HeLa細胞，不添加環戊烯酮，在細胞中加入含有5型腺病毒(Adenoid 75 ATCC VR-5)的含有5％胎牛血清的DMEM使之感染。其中，感染多重度(m.o.i.)設定為50。之後，加入環戊烯酮使最終濃度達到0、5、10、20或40μM，培養20小時。培養後，與實施例2-(2)相同的方法進行腺病毒的異己酮蛋白檢測。其結果，添加環戊烯酮至10μM以上的部分與未添加環戊烯酮的對照試驗相比，異己酮蛋白的量顯著減少。另外，添加環戊烯酮在20μM以下的部分與未添加環戊烯酮部分可以見到同樣的細胞增殖。
(5)與實施例2-(2)同樣培養HeLa細胞，用環戊烯酮處理。之後，與實施例2-(4)相同，使之感染5型腺病毒(Adenoid 75 ATCCVR-5)，用添加了環戊烯酮的培養基培養。培養後，與實施例2-(2)相同的方法檢測腺病毒的異己酮蛋白。其結果，添加環戊烯酮至10μM以上的部分與未添加環戊烯酮的對照試驗相比，異己酮蛋白的量顯著減少。另外，在20μM以下添加環戊烯酮的部分與未添加環戊烯酮的部分可以見到同樣的細胞增殖。
(6)採用與實施例2-(3)相同的方法，從與實施例2-(5)同樣經環戊烯酮處理後使之感染5型腺病毒(Adenoid 75 ATCC VR-5)進行培養得到的細胞中測定病毒DNA的量。其結果是，添加環戊烯酮達到5μM以上的部分與未添加環戊烯酮的對照試驗相比，病毒DNA的量顯著減少。
從上述實施例2-(2)～(6)的結果可以看出，通過在感染前、感染後或感染前後投給環戊烯酮，對腺病毒具有抗病毒活性。另外，(-)體環戊烯酮、(+)體環戊烯酮也得到了同樣的結果。實施例3(1)用限制性內切酶BamHI消化具有報告基因——《美國科學院院刊》Proceedings of the National Academy of Sciences of theU.S.A.，第84卷，第156～160頁(1987)記載的β-半乳糖苷酶基因和新黴素抵抗基因的重組逆轉錄病毒載體BAG，通過使其自身絡合形成除去了β-半乳糖苷酶基因的DOL載體。
(2)將實施例3-(1)記載的DOL載體質粒轉染大腸桿菌(E.coli)HB101，用L-肉湯培養基培養，從收集的菌體中提取出質粒，採用氯化銫密度梯度超速離心分離的方法純化DOL質粒。
通過使用陽離子脂質體〔Tran 2T LT-1(寶酒造公司生產)〕將純化的DOL質粒10μg引入逆轉錄病毒包裝細胞ψCRIP〔《美國科學院院刊》Proceedings of the National Academy of Sciences of theU.S.A.，第85卷，第6460-6464頁(1988)〕。
在37℃、5％CO2條件下用含有0.4mg/ml G418(Gibco公司)的含10％小牛血清Dulbecco改良Eagle’s培養基經過2周對引入後的細胞進行選擇，將20個得到的克隆純株培養，在直徑為100mm的培養皿中進行繁殖，在半鋪滿狀態下交換培養基，24小時後回收上清液並用0.45μm濾器(Milex HV，Millipore公司)過濾，得到病毒上清液。另外，用胰蛋白酶剝離細胞，在液氮中保存。
採用下述實施例3-(3)所示的方法測定由各克隆得到的病毒上清液的效價，將得到最高效價病毒液的克隆確定為重組逆轉錄病毒生產者細胞ψCRIP/DOL。確定由生產者細胞得到的病毒上清液的效價為1×106克隆形成單位(cfu)/ml。確定的生產細胞保存在含有G4180.2mg/ml的含10％小牛血清的Dulbecco改良Eagle’s培養基中。
(3)病毒效價的測定使用NIH3T3細胞(ATCC CRL-1658)。將在含有10％小牛血清的Dulbecco改良Eagle’s培養基中培養後的NIH3T3細胞按照50000個/孔的比例移植到6孔板(巖城硝子)上，第2天用含有8μg/ml聚凝胺(Sigma公司)的病毒稀釋液1ml使NIH3T3細胞感染3小時。病毒稀釋使用的是含有10％小牛血清的Dulbecco改良Eagle’s培養基。感染結束後，為了稀釋聚凝胺，再加入2ml含有10％小牛血清的Dulbecco改良Eagle’s培養基。從第2天開始換成含有G418 0.4mg/ml的含10％小牛血清的Dulbecco改良Eagle’s培養基，每3-4天換一次培養基，進行2周的選擇，使之形成菌落。採用常規方法用Giemsa染色液(Gibco公司)使得到的菌落染色，計數。以得到的菌落數乘以稀釋倍率得到的值作為cfu並做為病毒效價。
(4)將實施例3-(2)所述的重組逆轉錄病毒生產者細胞ψCRIP/DOL移植到6孔板中，在達到半鋪滿狀態時換成含有環戊烯酮0～20μM的含10％小牛血清的Dulbecco改良Eagle’s培養基，24小時後回收上清液1.5ml。採用實施例2-(3)所述的方法測定回收上清液的病毒效價，考察通過添加環戊烯酮對重組逆轉錄病毒生產者細胞的病毒產生能力的影響。
由未添加環戊烯酮的對照試驗部分得到的病毒液的效價為9.5×104cfu/ml，與此相對，在0.1、0.5、1.0、2.0、5.0、10、20μM環戊烯酮存在條件下，病毒液的效價分別為8.3×104、6.4×104、6.1×104、3.8×104、5.6×104、5.1×104、4.1×104cfu/ml，確認通過添加環戊烯酮可以降低從生產者細胞得到的病毒液的效價。也就是說，環戊烯酮對重組逆轉錄病毒生產者細胞的病毒產生能力具有抑制作用。
(5)將可以表達G418抵抗基因的對照質粒pcD2-Y〔《分子細胞生物學》Mol.Cell.Biol.第7卷，第2745～2752頁(1987)〕，以及可以表達HPV16型E7和G418抵抗基因兩者的質粒pcD2-16E7〔《日本癌研究雜誌》Jpn.J.Cancer Res.第82卷，第1340～1343頁(1991)〕轉染大腸桿菌E.coli HB101，用L-肉湯培養基培養，從收集的菌體提取出質粒，通過氯化銫密度梯度超離心分離進行純化，得到用於引入基因的載體質粒。
在37℃，5％CO2存在的條件下，在含10％小牛血清的Dulbecco改良Eagle’s培養基中培養NIH3T3細胞。
通過使用陽離子脂質體〔Tran 2T LT-1，寶酒造公司生產〕將純化的質粒10μg引入NIH3T3細胞。在37℃、5％CO2條件下用含有0.4mg/ml G418(GIBCO公司)的含10％小牛血清Dulbecco改良Eagle’s培養基進行2周的選擇，將得到的菌落克隆培養，在直徑為100mm的組織培養皿中培養，然後在液氮中保存。
這樣，分別得到了9株引入了對照質粒的NIH3T3細胞、以及由HPV16型E7使之癌變的NIH3T3細胞。
把引入了對照質粒的NIH3T3細胞株命名為NIH3T3/Y-1、NIH3T3/Y-2、NIH3T3/Y-3、NIH3T3/Y-4、NIH3T3/Y-5、NIH3T3/Y-6、NIH3T3/Y-7、NIH3T3/Y-8和NIH3T3/Y-9。
把引入E7的細胞株命名為NIH3T3/E7-1、NIH3T3/E7-2、NIH3T3/E7-3、NIH3T3/E7-4、NIH3T3/E7-5、NIH3T3/E7-6、NIH3T3/E7-7、NIH3T3/E7-8和NIH3T3/E7-9。
(6)使用100mm的組織培養皿在含有10％小牛血清的Dulbecco改良Eagle’s培養基中培養NIH3T3細胞、引入了對照質粒的細胞株以及引入了E7的細胞株，使之達到50～70％鋪滿，用PBS洗淨後，用0.25％胰蛋白酶-EDTA溶液剝離細胞，懸濁於5ml含有10％小牛血清的Dulbecco改良Eagle’s培養基中。
取懸濁液的一部分，用Newbauer型血細胞計數器計算細胞密度。以得到的數據為基礎，用含有10％小牛血清的Dulbecco改良Eagle’s培養基稀釋懸濁液，散布在直徑為60mm的組織培養皿中使之達到200細胞/培養皿，在3ml的培養基中開始培養。培養開始24小時後，換成新的培養基，加入環戊烯酮使之達到5μM。
以後每2～3天換一次培養基，加入環戊烯酮使之達到5μM。作為對照試驗，準備未添加環戊烯酮的培養皿，同樣的變換培養基。培養分別進行3次。培養9天後，用甲醇固定，用Giemsa液(GIBCO)將菌落染色。
另外，使用NIH3T3、NIH3T3/Y-1以及NIH3T3/E7-2進行評價。
對染色菌落計數的結果如表3所示。引入了E7的細胞與對照細胞相比，對環戊烯酮的敏感度高，環戊烯酮可以選擇性的作用於癌基因轉化細胞。表3

使用實施例3-(5)以外的其它細胞株時，得到相同的結果。另外，(-)體環戊烯酮、(+)體環戊烯酮也得到相同的結果。實施例4(1)在24孔微孔板中使用含有10％胎牛血清的Eagle’s MEM在5％二氧化碳存在下、37℃條件下培養單層MDCK細胞(大阪府立公眾衛生研究所保存株)中添加環戊烯酮使最終濃度達到0、5、10、20或40μM，在上述條件下再繼續培養6小時。
之後，用PBS將細胞洗淨，在細胞中加入流感病毒A/PR/8/34株(大阪府立公眾衛生研究所保存株)使之感染，在37℃條件下恆溫培養30分鐘。其中，將感染多重度(m.o.i.)設定為0.01。培養後，用PBS將細胞洗淨，用含有10μg/ml胰蛋白酶的Eagle’s MEM培養。
0、1、2、3天後提取感染細胞上清液，通過採用PAP法的焦點計數法(focus counting method)〔《臨床微生物學雜誌》J.Clin.Microbiol.第28卷，第1308～1313頁(1990)〕求出病毒效價。
其結果是，添加環戊烯酮至10μM以上的部分與未添加環戊烯酮的對照試驗相比，病毒效價顯著降低。其結果如表4所示。另外，在各添加了環戊烯酮的部分中，細胞都沒有游離而是粘附的。表4

2)在按照與實施例4-(1)相同的操作在無環戊烯酮存在的條件下培養成單層的MDCK細胞中與實施例4同樣加入流感病毒使細胞感染，用添加了環戊烯酮使最終濃度達到0、5、10、20或40μM的含有胰蛋白酶10μg/ml的Eagle-MEM進行培養。之後，與實施例4-(1)相同，求出病毒效價。其結果是，添加環戊烯酮至10μM以上的部分與未添加環戊烯酮的對照試驗相比，病毒效價顯著降低。其結果如表5所示。另外，在各添加了環戊烯酮的部分，細胞沒有剝離而是粘著的。表5

>(3)使按照與實施例4-(1)相同的操作單層培養並用最終濃度為0、20或40μM的環戊烯酮處理6小時後的DMCK細胞與實施例4-(1)同樣被流感病毒感染，然後用含有與感染相同濃度環戊烯酮的含10μg/ml胰蛋白酶的Eagle’s MEM培養基繼續培養。之後，與實施例4-(1)同樣，求出病毒效價。其結果是，添加環戊烯酮至20μM以上的部分與未添加環戊烯酮的對照試驗相比，病毒效價顯著降低。其結果如表6所示。另外，在各添加了環戊烯酮的部分，細胞沒有剝離而是粘附的。表6

4)將感染多重度(m.o.i.)設定為0.001進行與實施例4-(1)相同的試驗。其結果是，添加環戊烯酮至10μM以上的部分與未添加環戊烯酮的對照試驗相比，病毒效價顯著降低。其結果如表7所示。另外，在各添加了環戊烯酮的部分，細胞沒有剝離而是粘附的。表7<

5)將感染多重度(m.o.i.)設定為0.001進行與實施例4-(2)相同的試驗。其結果是，添加環戊烯酮至10μM以上的部分與未添加環戊烯酮的對照試驗相比，病毒效價顯著降低。其結果如表8所示。另外，在各添加了環戊烯酮的部分，細胞沒有剝離而是粘附的。表8

6)將感染多重度(m.o.i.)設定為0.001進行與實施例4-(3)相同的試驗。其結果是，添加環戊烯酮至10μM以上的部分與未添加環戊烯酮的對照試驗相比，病毒效價顯著降低。其結果如表9所示。另外，在各添加了環戊烯酮的部分，細胞沒有剝離而是粘附的。表9

從以上實施例4-(1)～(6)的結果可以看出，環戊烯酮對流感病毒具有抗病毒活性。另外，(-)體環戊烯酮、(+)體環戊烯酮也得到同樣的結果。實施例5(1)環戊烯酮對人T細胞的作用在2×105個/ml的CEM-SS細胞(ATCC CCL-119)或H9細胞(ATCCHTB-176)中加入0.5～5μM環戊烯酮，培養3天，計算出活細胞數和死細胞數，求出細胞存活率。
其結果發現，任何一種細胞都沒有由於添加了環戊烯酮造成細胞存活率的顯著減少。其結果如圖1和圖2所示。也就是說，圖1與圖2表示添加的環戊烯酮濃度與細胞存活率的關係，橫軸表示添加的環戊烯酮濃度(μM)，縱軸表示培養3天後的細胞存活率(％)。圖1是使用CEM-SS細胞時的結果，圖2是使用H9細胞時的結果。
(2)環戊烯酮對HIV感染的T細胞的作用在被HIV-1IIIB感染的CEM-SS細胞(簡稱為CEM-3B)或被HIV-1IIIB感染的H9細胞(簡稱為H9-3B)中加入1～5μM環戊烯酮，培養3天。兩種細胞90％以上被HIV-1IIIB感染。計算出活細胞數和死細胞數，求出細胞存活率。
其結果發現，對於任何一種細胞均由於添加了3μM環戊烯酮使細胞存活率的顯著減少，添加5μM環戊烯酮可以進一步降低細胞存活率。也就是說與實施例5-(1)相比，環戊烯酮具有抗HIV作用。其結果如圖3和圖4所示。也就是說，圖3與圖4表示添加的環戊烯酮濃度與細胞存活率的關係，橫軸表示添加的環戊烯酮濃度(μM)，縱軸表示培養3天後的細胞存活率(％)。圖3是使用CEM-3B細胞時的結果，圖4是使用H9-3B細胞時的結果。實施例6測定實施例5-(2)培養3天後的培養上清液中含有的p24抗原的濃度。其結果發現，相應於添加的環戊烯酮的濃度p24濃度減少，確認有抗HIV病毒作用。其結果如表10所示。其中，表10中括號內的數字表示相對於未添加環戊烯酮時各細胞培養上清液中p24濃度的比。表10

實施例7將Vero細胞(ATCC CCL-81)懸濁於含有10％胎牛血清的Eagle’sMEM中，使細胞濃度達到5×104細胞/100μl，在96孔微孔效價板中每1孔裝入100μl細胞懸濁液，在5％二氧化碳存在下、37℃培養一夜，製得形成單層的Vero細胞。
將添加了環戊烯酮使最終濃度達到0、5、10、20或40μM的Eagle’sMEM培養基加入到該細胞中，在5％二氧化碳存在下、37℃培養7小時。
培養結束後，除去培養基，用PBS洗滌2次，接種日本腦炎病毒(JEV JaOAr-363-70株)使之達到4.9×102pfu/ml，在5％二氧化碳存在下、37℃培養30小時後，用乙醇將細胞固定，通過採用PAP法的焦點計數法〔Arch.Virol.第86卷，第129～135頁(1985)〕進行焦點計數。
其結果，添加環戊烯酮至40μM的部分與未添加環戊烯酮的對照試驗相比，定點(focus)數顯著降低。其結果如表11所示。另外，在各添加了環戊烯酮的部分，細胞沒有剝離而是粘附的。表11<

>(2)將在24孔微孔板中使用含有10％胎牛血清的Eagle’s MEM在5％二氧化碳存在下、37℃培養成單層的Vero細胞用PBS洗淨後，在細胞中加入4.9×102pfu/ml的日本腦炎病毒(JEV JaOAr-363-70株)使之感染，在37℃恆溫培養90分鐘。
培養後用PBS將細胞洗淨，用添加了環戊烯酮使最終達到0、5、10、20或40μM的MEM培養。
0、1、2、3天後收集感染細胞上清液，通過採用PAP法的焦點計數法〔《臨床微生物學雜誌》(J.Clin.Microbiol.)第28卷，第1308～1313頁(1990)〕求出病毒效價。
其結果，添加環戊烯酮至10μM以上的部分與未添加環戊烯酮的對照試驗相比，病毒效價顯著降低。其結果如表12所示。另外，各添加了環戊烯酮的部分，細胞沒有剝離而是粘著的。表12

從上述實施例7-(1)、(2)的結果可以看出，環戊烯酮對日本腦炎病毒具有明顯的抗病毒活性。而且，日本腦炎病毒與C型肝炎病毒是同一類型，目前由於C型肝炎病毒體外培養系統還沒有確立，用日本腦炎病毒作為丙性肝炎病毒的模型。因此，環戊烯酮作為C型肝炎的治療藥也是有效的。
另外，(-)體環戊烯酮、(+)環戊烯酮也得到了相同的結果。實施例8五年前在診斷為C型肝炎後使用幹擾素、強力碳酸精氨酸(minofagen)注射液進行治療，但GOT、GPT均在150左右未見肝功能改善的女性每日飲用下述實施例13得到的飲料50ml(含環戊烯酮2mg)，飲用2個月後GOT、GPT均改善到80。再繼續同樣飲用1個月後，GOT、GPT均為30，肝功能得到顯著改善。實施例9將ICR系小鼠(由日本SLC購入，7周齡，雌性)背部的毛剃去後，塗敷引發劑DMBA(二甲基苯並蒽，dimethylbenzanthracene)的丙酮溶液，DMBA的劑量為50μg/小鼠，經過1周之後，在塗敷引發劑的部位塗敷促進劑TPA(12-o-Tetrasecanoylphorbol 13-acetate)的丙酮溶液，TPA的量為1μg/小鼠，每周2次直至試驗結束之後，在每次塗敷TPA 1小時前塗敷環戊烯酮的80％乙醇溶液或作為對照的80％乙醇溶液，觀察對於2階段癌變的皮膚癌變抑制作用20周。
對照組(塗敷賦形劑的組)15周以後顯示出100％(12隻/12隻)的癌變率，與此相對，環戊烯酮有強的抑制癌變作用，2.5mg/小鼠所顯示出的癌變抑制作用為15周以後的癌變率是8.3％(12隻中1隻癌變)，19周以後的癌變率是25％(12隻中3隻癌變)。結果如圖5所示。也就是說，圖5表示環戊烯酮的癌變抑制作用，縱軸表示癌變率，橫軸表示時間(周)。圖中白三角表示環戊烯酮2.5mg/小鼠處理組(12隻)，黑三角表示環戊烯酮0.8mg/小鼠處理組(11隻)，白圓圈表示對照組(12隻)。
另外，在小鼠外耳的TPA炎症試驗中，按2.5mg/小鼠將環戊烯酮塗敷於小鼠的外耳，不顯示抗炎症活性。
以上，環戊烯酮對2階段化學癌變顯示出了抗促進劑作用。含有環戊烯酮的葡萄糖醛酸的加熱處理物、(-)體環戊烯酮、(+)體環戊烯酮也顯示出相同的結果。實施例10注射劑(1)在生理鹽水(日本藥典收載品)中以1％的濃度加入環戊烯酮，製得注射劑。
(2)在生理鹽水(與上述相同)中分別以0.5％和0.1％的濃度加入(-)體環戊烯酮和甘草酸，製得注射劑。實施例11片劑(1)調製含有環戊烯酮10mg和微晶纖維素適量的片劑，包上糖衣，製成片劑。
(2)調製含有(+)體環戊烯酮0.1mg、甘草酸二鉀10mg和微晶纖維素適量的片劑，包上糖衣，製成片劑。實施例12軟膏環戊烯酮 1g吸水軟膏(日本藥典收載)99g先將環戊烯酮與少量的吸水軟膏充分混合，再慢慢加入餘下的吸水軟膏，使之混合均勻，製成軟膏。
該軟膏1日4～5次塗於患部。實施例13(1)將果膠(Pomosin Pectin LM-13CG，Hercules公司生產)5kg添加到自來水100升中，通過通入水蒸氣使液體溫度由28℃經35分鐘升高到液體溫度120℃，然後在攪拌條件下於120℃保溫5小時，然後冷卻，製得冷卻物135升。然後在冷卻物中加入過濾助劑硅藻土#545(Celite公司生產)1.35kg以及二氧化矽#600-S(中央二氧化矽公司生產)1.35kg，然後使用預先塗有硅藻土#545 0.1kg以及二氧化矽#600-S 0.1kg的緻密濾器(6英寸16級濾紙，ADVANTEC#327)進行過濾。使用金屬板加熱器(日阪製作所生產)將得到的濾液連續瞬間加熱處理(98℃，60秒)後冷卻，製得150升含有環戊烯酮的果膠加熱處理液。
含有環戊烯酮的果膠加熱處理液的pH為約3.5，酸度為6.2ml，糖度為5.8Brix％。另外，pH是用pH計測定的，酸度是用將試樣10ml中和到pH7.0所需要的0.1N NaOH的量(ml)表示的。而且糖度的從測定是用白利糖度計(Brix saccharomter)測定的。
(2)按照下述組成調製飲料果糖葡萄糖液糖 5.00％砂糖4.00％酸味成分1.20％香料0.30％含有環戊烯酮的物質 0.5％
精製水 餘量合計 100.00％含有環戊烯酮的物質使用的是實施例13-(1)所述的含有環戊烯酮的果膠加熱處理物，添加其固體物質換算量。該飲料100ml中含有4mg環戊烯酮。
發明的效果按照本發明可以提供一種以具有誘導細胞產生病毒抵抗性的功能、而且具有選擇性殺死病毒感染細胞的功能的化合物，例如選自環戊烯酮或其光學活性體或它們的鹽的化合物為有效成分的抗病毒劑。本發明的抗病毒劑可以選擇性的殺死病毒感染細胞，並對未感染病毒的正常細胞賦予病毒抵抗性，通過其協同作用對難治性病毒疾病例如ADIS、C型肝炎等的治療以及症狀的改善是非常有用的。另外，按照本發明還可以提供一種含有具有肝功能改善作用、熱休克蛋白誘導作用、病毒癌變預防作用、抗促癌劑作用等生理活性的環戊烯酮或其光學活性體或它們的鹽的醫藥品，該醫藥品對於維持生物體的內環境穩定，特別是保持胃腸健康是很有用的。
另外，按照本發明還可以提供一種以具有誘導細胞產生病毒抵抗性的功能、並且具有選擇性殺死病毒感染細胞的功能的化合物，例如環戊烯酮或其光學活性體或它們的鹽為有效成分的抗病毒用食品或抗病毒用飲料，這些飲食品作為病毒引起的各種疾病的症狀改善用飲食品或預防用飲食品是很有用的。另外，按照本發明還可以提供一種含有具有肝功能改善作用、熱休克蛋白誘導作用、病毒癌變預防作用、抗促癌劑作用等生理活性的環戊烯酮或其光學活性體或它們的鹽的飲食品，該飲食品對於維持生物體的內環境穩定，特別是保持胃腸健康是很有用的。
權利要求
1.抗病毒劑，其特徵在於含有有效成分——選自下述式〔I〕表示的4，5-二羥基-2-環戊烯-1-酮或其光學活性體或它們的鹽中至少一種以上的化合物。
2.如權利要求1所述的抗病毒劑，所述病毒為人類獲得性免疫缺陷病毒或C型肝炎病毒。
3.如權利要求1所述的抗病毒劑，該抗病毒劑為人用抗病毒劑、非人類動物用抗病毒劑或植物用抗病毒劑。
4.如權利要求3所述的抗病毒劑，該抗病毒劑為家畜、家禽、魚類或蝦類用抗病毒劑。
5.抗病毒用食品或抗病毒用飲料，其特徵在於含有選自下述式〔I〕表示的4，5-二羥基-2-環戊烯-1-酮或其光學活性體或它們的鹽中至少一種以上的化合物。
全文摘要
以含有有效成分——選自下述式(Ⅰ)表示的4,5－二羥基－2－環戊烯－1－酮或其光學活性體或它們的鹽中至少一種以上的化合物——為特徵的抗病毒劑。
文檔編號A61P31/12GK1248164SQ98802654
公開日2000年3月22日 申請日期1998年2月26日 優先權日1997年3月17日
發明者佐川裕章, 小山信人, 蝶野英人, 竹迫一任, 加藤鬱之進 申請人:寶酒造株式會社