一種採用魚類轉基因方法構建的基於鯉魚mstn幹涉載體及其構建方法

2023-10-09 07:22:44 1

一種採用魚類轉基因方法構建的基於鯉魚mstn幹涉載體及其構建方法
【專利摘要】一種採用魚類轉基因方法構建的基於鯉魚MSTN幹涉載體及其構建方法，它涉及一種基於鯉魚MSTN幹涉載體及其構建方法。本發明要解決傳統基因敲出技術的投入大，群體大，耗時的問題。轉基因供體質粒鯉魚MSTN幹涉載體(pzu6p-siMSTN)，包括魚類啟動子DNA序列和目的基因。該方法通過將真核表達載體PEGFP-C1的啟動子進行改造，得到斑馬魚U6啟動子的質粒pzu6p-siRNA，然後將幹涉片段siMSTN與載體相連接，得到供體基因pzu6p-siMSTN(鯉魚MSTN幹涉載體)。本發明與傳統的基因敲出技術相比，具有操作簡單，投入少，效率高、特異性強、周期短等優點。
【專利說明】一種採用魚類轉基因方法構建的基於鯉魚MSTN幹涉載體 及其構建方法

【技術領域】
[0001] 本發明涉及一種基於鯉魚MSTN幹涉載體及其構建方法，具體涉及的轉基因供體 質粒的構建方法，及其在養殖魚類中的應用。本發明屬於魚類基因工程領域。

【背景技術】
[0002] 隨著基因組研究的不斷深入和發展，越來越多的新基因得以成功克隆，對於從基 因組測序中所獲得的大量未知基因功能的研究顯得日益重要，這也是後基因組時代基因功 能研究的重要研究內容，也是一項複雜的系統工程。RNA幹擾技術是近些年發展起來的一種 阻抑基因表達的新方法，是反映基因功能、表達調控、缺陷識別等重要手段。是通過人為地 引入與靶基因具有同源序列的dsRNA，誘導靶基因的mRNA降解，從而達到阻止基因表達、產 生"功能失活"的目的。因此，RNA幹擾技術已成為一種強有力的工具，廣泛應用於魚類基因 功能研究中。
[0003] MSTN(肌肉生長抑制素）基因是動物肌肉生長發育的負調控基因，對myostatin基 因敲除或抑制其表達，都可以使動物的肌肉快速大量增長。動物肌肉發育不僅依靠激素調 節，而且某些組織特異性效應因子也影響肌肉的發育。肌肉生長抑制素是目前所知的最強 的肌肉生長抑制因子，它通過抑制成肌細胞的增值而發揮作用。抑制myostatin活性，使肌 纖維肥大，而肌肉是由肌纖維組成的，肌纖維就是肌細胞，肌纖維增大，肌纖維的直徑和面 積大，肌纖維數量多，肌肉生長快，就會使肌肉不受限制的生長，達到改變魚類肌肉質量和 重量的目的。在魚類育種中，雖然分子輔助育種技術和基因敲出技術（反義核苷酸技術、基 因打靶技術等）等較傳統的數量遺傳育種都有較多的優點，但研究過程中投入大，群體大， 耗時、效率低等缺點也是有待解決的問題。RNA幹擾技術已成為解決這些問題的重要手段。 與其它方法相比，RNA幹擾技術在基因功能研究上具有簡單易行、試驗周期短、成本低、可進 行高通量基因功能分析及具有高度特異性等許多優點。為了解除MSTN基因對肌肉細胞的 抑制作用，本發明利用RNA幹擾技術幹擾MSTN mRNA的表達，來提高魚類養殖品種肌肉含 量，改善肉質性狀，促進魚類養殖品種的生長。
[0004] 隨著鯉魚基因組測序工作完成，與先進的高通量、高靈敏度的轉錄組測序技術相 結合，將有望成為探索魚類特定基因的功能、疾病致病機理及其防治的新途徑。RNA幹擾技 術能達到基因敲出的結果，從而成為研究這些基因功能的良好工具。目前廣泛應用的RNAi 技術的靶標是mRNA，誘導內源靶基因的mRNA降解，達到阻止基因表達的目的，與傳統的基 因敲出的費時費力相比較，RNA幹擾技術是一種有效的研究工具，同時RNA幹擾本身具有高 效、特異和傳遞性，它不僅可以抑制外培養細胞中目的單一基因的表達，也可以抑制體內目 的單一基因的表達。但是目前沒有報導將此技術應用於鯉魚的肉質性狀改善方面。


【發明內容】

[0005] 本發明的目的是為了解決傳統基因敲出技術的投入大，群體大，耗時的問題，而提 供了一種採用魚類轉基因方法構建的基於鯉魚MSTN幹涉載體及其構建方法。
[0006] 本發明的一種採用魚類轉基因方法構建的基於鯉魚MSTN幹涉載體，它包括骨架 載體和siMSTN幹涉片段，所述的siMSTN幹涉片段的核苷酸序列如序列表Seq ID No :1所 /_J、1 ο
[0007] 本發明的一種採用魚類轉基因方法構建基於鯉魚MSTN幹涉載體的方法，它是按 照以下步驟進行的：
[0008] 一、pzu6p_siRNA重組載體的構建
[0009] (1)提取斑馬魚尾鰭中的DNA ;
[0010] (2)根據斑馬魚U6啟動子區域設計引物U6-1、U6-2和U6-3,然後以U6-1的上遊 引物和U6-2下遊引物為引物，以步驟一提取的DNA為模板，通過PCR，得到兩端分別為asel 與bamhl酶切位點的U6啟動子片段；其中，U6-1含有asel酶切位點，U6-2含有含有bamh-1 酶切位點，U6-3含有含有mlul酶切位點；
[0011] 其中，U6-1的序列：
[0012] 上遊引物 5' GTCACAGAACTCATCCAATCACA3'
[0013] 下遊引物 5' AACCTCTTCAGGGCAAACC3'，
[0014] U6-2 的序列：
[0015] 上遊引物 5' CACAGAACTCATCCAATCACACT3'
[0016] 下遊引物 5' CTTATTCAACTCATTTACCTCAAACA3'，
[0017] U6-3 的序列：
[0018] 上遊引物 5' CGAGAGTCTGTGAATGTTTCG3'
[0019] 下遊引物 5'CCAGCAGITTTGTGGAGGT3' ；
[0020] (3)以步驟⑵得到的U6啟動子片段為模板，採用U6-1的上遊引物和U6-3的下 遊引物為引物，進行PCR，得到5 '端含有asel酶切位點、3'端含有bamhl和mlul酶切位點 的斑馬魚U6啟動子片段；
[0021] (4)用限制性內切酶asel和mlul雙酶切PEGFP-C1載體，並用限制性內切酶asel 和mlul雙酶切步驟（3)獲得的斑馬魚U6啟動子片段，同過T4連接酶，將酶切後的PEGFP-C1 載體與酶切後的斑馬魚U6啟動子片段進行連接，得連接產物；
[0022] (5)將步驟（4)得到的連接產物轉化至toplO感受態細胞中，培養，挑取陽性克隆 菌落，進行PCR驗證，篩選出驗證為陽性的菌落，提取質粒，採用asel和mlul酶進行雙酶切 驗證，將驗證為陽性的片段，進行測序，測序成功後的載體，即為pzu6p-siRNA重組載體；
[0023] 二、pzu6p_siMSTN重組載體的構建
[0024] (6)依據鯉魚mstn基因的⑶S區，設計出MSTN幹涉片段，MSTN幹涉片段兩端帶有 bamhl和mlul酶切位點，將MSTN幹涉片段連接到puc57載體上，構建得到puc57-siRNA重 組載體；其中，含有頸環結構的MSTN幹涉片段的核苷酸序列如序列表Seq ID No :2所示；
[0025] (7)用限制性內切酶bamhl和mlul雙酶切分別酶切步驟一構建的pzu6p-siRNA 重組載體以及puc57-siRNA重組載體，然後將酶切後回收得到的MSTN幹涉片段與 pzu6p-siRNA重組載體採用T4連接酶連接；
[0026] (8)將上一步採用T4連接酶連接後的重組載體轉化至toplO感受態細胞中，挑取 陽性克隆，進行菌液PCR鑑定，提取陽性克隆菌的質粒，進行bamhl和mlul雙酶切鑑定，將 鑑定結果均為陽性的載體，命名為pzu6p-siMSTN重組載體，即完成基於鯉魚MSTN幹涉載體 載體的構建。
[0027] 本發明包含以下有益效果：
[0028] 本發明根據鯉魚肌肉生長抑制素 myostation基因的RNA序列設計1個針對 myostation基因的siRNA序列：5'-CGCACCGCCTTTGCAACAA-3'，將其設計為中間連有9個鹼 基loop環結構：5' -TTCAAGAGA-3'的發卡DNA序列，並在序列兩端加入BamHl和Mlul酶切 位點，連入PEGFP-C1載體的斑馬魚U6啟動子後，構建鯉魚MSTN幹涉載體（pzu6p-siMSTN)。 用人工合成的鯉魚MSTN幹涉載體通過顯微注射技術將pzu6p-siMSTN基因導入野鯉受精卵 內，分析其生長發育結果。因此本發明旨在構建一種基於鯉魚MSTN幹涉載體的魚類轉基因 方法。藉助於RNA幹擾技術，採用通過抑制MSTN活性，提高養殖魚類的肌肉含量，促進養殖 魚類的生長。也進一步證實了轉RNA幹擾質粒技術是可行的育種技術之一。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0029] 圖1為鯉魚mstn幹涉片段序列圖；
[0030] 圖2為鯉魚MSTN幹涉載體pzu6p_siMSTN圖；
[0031] 圖3為轉鯉MSTN基因幹涉載體基因鯉PCR檢測結果；其中，D為正常魚電泳圖；G 為供體基因電泳圖；Μ為分子量；1-39為轉基因鯉實驗魚電泳圖；
[0032] 圖4、轉鯉MSTN基因幹涉載體基因鯉產物凝膠測序結果。

【具體實施方式】

【具體實施方式】 [0033] 一：本實施方式的一種採用魚類轉基因方法構建的基於鯉魚MSTN 幹涉載體，它包括骨架載體和siMSTN幹涉片段，所述的siMSTN幹涉片段的核苷酸序列如序 列表Seq ID No :1所示（大小為470bp)。

【具體實施方式】 [0034] 二：本實施方式與一的不同是：所述的siMSTN幹涉片 段是由MSTN幹涉片段通過其兩端的bamh-1和mlul酶切位點分別與斑馬魚U6啟動子和骨 架載體連接而成的；其中，斑馬魚U6啟動子的核苷酸序列如序列表Seq ID No :2所示（大 小為400bp) ;MSTN幹涉片段的核苷酸序列如序列表Seq ID N〇:3所示（大小為70bp)。其 它與一相同。

【具體實施方式】 [0035] 三：本實施方式與一或二的不同是：所述的MSTN幹涉 片段為中間連有5'-TTCAAGAGA-3'鹼基的發卡DNA序列，並在MSTN幹涉片段序列兩端加入 bamh-1和mlul酶切位點。其它與一或二相同。

【具體實施方式】 [0036] 四：本實施方式與一至三之一的不同是：所述的骨架 載體為pzu6p載體。其它與一至三之一相同。

【具體實施方式】 [0037] 五：本實施方式的一種採用魚類轉基因方法構建基於鯉魚MSTN幹 涉載體的方法，其特徵在於它是按照以下步驟進行的：
[0038] 一、pzu6p_siRNA重組載體的構建
[0039] (1)提取斑馬魚尾鰭中的DNA ;
[0040] (2)根據斑馬魚U6啟動子區域設計引物U6-1、U6-2和U6-3,然後以U6-1的上遊 引物和U6-2下遊引物為引物，以步驟一提取的DNA為模板，通過PCR，得到兩端分別為asel 與bamhl酶切位點的U6啟動子片段；其中，U6-1含有asel酶切位點，U6-2含有含有bamh-1 酶切位點，U6-3含有含有mlul酶切位點；
[0041] 其中，U6_1的序列：
[0042] 上遊引物 5' GTCACAGAACTCATCCAATCACA3'
[0043] 下遊引物 5' AACCTCTTCAGGGCAAACC3'，
[0044] U6-2 的序列：
[0045] 上遊引物 5' CACAGAACTCATCCAATCACACT3'
[0046] 下遊引物 5, CTTATTCAACTCATTTACCTCAAACA3,，
[0047] U6-3 的序列：
[0048] 上遊引物 5' CGAGAGTCTGTGAATGTTTCG3'
[0049] 下遊引物 5'CCAGCAGITTTGTGGAGGT3' ；
[0050] (3)以步驟⑵得到的U6啟動子片段為模板，採用U6-1的上遊引物和U6-3的下 遊引物為引物，進行PCR，得到5 '端含有asel酶切位點、3'端含有bamhl和mlul酶切位點 的斑馬魚U6啟動子片段；
[0051] (4)用限制性內切酶asel和mlul雙酶切PEGFP-C1載體，並用限制性內切酶asel 和mlul雙酶切步驟（3)獲得的斑馬魚U6啟動子片段，同過T4連接酶，將酶切後的PEGFP-C1 載體與酶切後的斑馬魚U6啟動子片段進行連接，得連接產物；
[0052] (5)將步驟（4)得到的連接產物轉化至toplO感受態細胞中，培養，挑取陽性克隆 菌落，進行PCR驗證，篩選出驗證為陽性的菌落，提取質粒，採用asel和mlul酶進行雙酶切 驗證，將驗證為陽性的片段，進行測序，測序成功後的載體，即為pzu6p-siRNA重組載體；
[0053] 二、pzu6p-siMSTN重組載體的構建
[0054] (6)依據鯉魚mstn基因的⑶S區，設計出MSTN幹涉片段，MSTN幹涉片段兩端帶有 bamhl和mlul酶切位點，將MSTN幹涉片段連接到puc57載體上，構建得到puc57-siRNA重 組載體；其中，含有頸環結構的MSTN幹涉片段的核苷酸序列如序列表Seq ID No :2所示；
[0055] (7)用限制性內切酶bamhl和mlul雙酶切分別酶切步驟一構建的pzu6p-siRNA 重組載體以及puc57-siRNA重組載體，然後將酶切後回收得到的MSTN幹涉片段與 pzu6p-siRNA重組載體採用T4連接酶連接；
[0056] (8)將上一步採用T4連接酶連接後的重組載體轉化至toplO感受態細胞中，挑取 陽性克隆，進行菌液PCR鑑定，提取陽性克隆菌的質粒，進行bamhl和mlul雙酶切鑑定，將 鑑定結果均為陽性的載體，命名為pzu6p-siMSTN重組載體，即完成基於鯉魚MSTN幹涉載體 載體的構建。

【具體實施方式】 [0057] 六：本實施方式與五不同的是：步驟（2)和（3)中所 述的？〇?反應程序為：941：預變性1〇1^11，941：變性3〇8,551：退火3〇8,721：延伸3〇8,30個 循環；循環後72°C延伸10min ;
[0058] PCR反應體系為25 μ L，成分如下：
[0059] 成分 川.Μ: 30?50ng/uL DNΑ 概板 I pL 10pmol4iL 引物 2pL 10XPCR buffer (10XPCR buffer ( fi Mg2' (25mmol/L) 18{iL ΙμΙ、dATP、dGTP、dTTP、dCTP 各 2mmol/L ) TaqDNA 聚爐 0.5pL 無眞水 4.5pL
[0060] 其它與【具體實施方式】五相同。

【具體實施方式】 [0061] 七：本實施方式與五或六不同的是：步驟（4)中限制 性內切酶asel和mlul雙酶切的酶切反應條件為：37°C水浴酶切2小時，4°C保存備用；
[0062] 酶切體系為10 μ L，成分如下：
[0063] 戚分 用S 56ng/uL PEGFP-C1 載體 3,6pL asel 0,5 μ L mlul LOpL K) X Buffer LOpL dd H20 4,4μΕ〇
[0064] 其它與【具體實施方式】五或六相同。

【具體實施方式】 [0065] 八：本實施方式與五至七之一不同的是：步驟（4)中 的連接條件為：16°C循環水浴連接16h ;
[0066] 連接體系為10 μ L，成分如下：
[0067] 成分 PEGFP-C1 載體 LOpL 斑馬魚U6啟動子片段 3.0pL T4 DNA m l'0pL 2xT4 Ligase Buffer 5.0μ?〇
[0068] 其它與【具體實施方式】五至七之一相同。

【具體實施方式】 [0069] 九：本實施方式與五至八之一不同的是：步驟（7)中 的限制性內切酶bamhl和mlul雙酶切的酶切反應條件為：37°C水浴酶切2小時，4°C保存備 用；
[0070] 酶切體系為10 μ L，成分如下：
[0071] 成分 ）IJM: 54ng/uL ρζιι?ιρ-siRNA 我體 40pL bamh l 0.5μ? mini 1.0μ L 10X Buffer \Α)μΙ dd H2O 4.0pL〇
[0072] 其它與【具體實施方式】五至八之一相同。

【具體實施方式】 [0073] 十：本實施方式與五至九之一不同的是：步驟（8)的 PCR鑑定的PCR反應程序為：94°C預變性lOmin，94°C變性30s，55°C退火30s，72°C延伸30s， 38個循環；循環後72°C延伸lOmin ;
[0074] PCR反應體系為25 μ L，成分如下：
[0075] 成分 30?50ng/uL DNA 校板 IpL lOpmol/pL *J| 物 2pL 10 X PCR bufTcr ( !0 X PCR buffer (Mg21 (25mnioi/L) 18pL ?L、dATP、dGW、dTW、dCTP 各 2nimol/L ) TaqDNA 聚介_ 0.5μΙ AiW 水 4.5pL;
[0076] 其中，PCR所用的引物為siMSTN幹涉片段引物，其序列為：
[0077] 上遊引物：5' -CTGCGATTAATTCTTTAGCCTCCGAGAG-3'
[0078] 下遊引物：5 ' -GCAAAGGCGGTGCGGGAT-3 '。
[0079] 其它與【具體實施方式】五至九之一相同。

【具體實施方式】 [0080] i^一 ：本實施方式與五至十之一不同的是：所述的 pzu6p-siMSTN重組載體中的siMSTN幹涉片段的核苷酸序列如序列表Seq ID No :1所示。 其它與五至十之一相同。
[0081]

【具體實施方式】十二：本實施方式與【具體實施方式】五至i^一之一不同的是：所述的 siMSTN幹涉片段是由MSTN幹涉片段通過其兩端的bamh-l和mlul酶切位點分別與斑馬魚 U6啟動子和骨架載體連接而成的；其中，斑馬魚U6啟動子的核苷酸序列如序列表Seq ID No :2所示；MSTN幹涉片段的核苷酸序列如序列表Seq ID No :3所示。其它與具體實施方 式五至i 之一相同。
[0082]

【具體實施方式】十三：本實施方式與【具體實施方式】五至十二之一不同的是：所述的 MSTN幹涉片段為中間連有5' -TTCAAGAGA-3'鹼基的發卡DNA序列，並在MSTN幹涉片段序 列兩端加入bamh-l和mlul酶切位點。其它與【具體實施方式】五至十二之一相同。
[0083] 通過以下實施例驗證本發明的有益效果：
[0084] 本實施例首先進行生物信息統計，針對物種的基因組進行RNA序列設計；然後根 據設計結果構建表達載體庫；本實施例選取能夠進行改造的的載體，最終選用了真核表達 載體 PEGFP-C1，長度 4. 7kb ;
[0085] 本實施例的一種採用魚類轉基因方法構建的基於鯉魚MSTN幹涉載體的方法，具 體操作步驟如下：
[0086] (l)pzu6p_siRNA重組載體的構建
[0087] 一、獲取斑馬魚U6啟動子，GenBank:FJ911603. 1，長度大小為414bp，用裂解法提 取斑馬魚尾鰭中的DNA，根據U6的啟動子區域設計3條引物，分別命名U6-1U6-2U6-3,其中 通過U6-1中（含有asel酶切位點）與U6-2中（含有bamh-1酶切位點）從基因組DNA上 克隆U6啟動子區域，斑馬魚U6啟動子兩端分別是asel與bamhl酶切位點；
[0088] 其中，U6-1的序列：
[0089] 上遊引物 5' GTCACAGAACTCATCCAATCACA3'
[0090] 下遊引物 5' AACCTCTTCAGGGCAAACC3'，
[0091] U6-2 的序列：
[0092] 上遊引物 5' CACAGAACTCATCCAATCACACT3'
[0093] 下遊引物 5' CTTATTCAACTCATTTACCTCAAACA3'，
[0094] U6-3 的序列：
[0095] 上遊引物 5' CGAGAGTCTGTGAATGTTTCG3'
[0096] 下遊引物 5'CCAGCAGITTTGTGGAGGT3' ；
[0097] PCR 反應程序為：94°C預變性 10min，94°C變性 30s，55°C退火 30s，72°C延伸 30s， 30個循環；循環後72°C延伸lOmin ;
[0098] PCR反應體系為25 μ L，成分如下：
[0099] 成分 IIJW 30?50ng/uL DNA 模板 .1 μι 10pmo〖4iL *j|物（U6-i 的 I:遊和 U6-2 的 K遊*j|物） 2pL lOXPCRlmffer (含 Mg2+-(25mmol/L》IjiL、dATP、dGTP、 18μ? dTTP, dCTP2 mmol/L ) TaqDNA 聚介Hi OJpL 無窗水 4·5μ[;
[0100] 二、以步驟一得到的U6啟動子片段為模板，採用U6-1和U6-3為引物，進行二次 PCR，得到5 '端含有asel酶切位點、3'端含有bamhl和mlul酶切位點的斑馬魚U6啟動子 片段；
[0101] PCR 反應程序為：94°C預變性 10min，94°C變性 30s，55°C退火 30s，72°C延伸 30s， 30個循環；循環後72°C延伸lOmin ;
[0102] PCR反應體系為25 μ L，成分如下：
[0103] 成分
[0104] 30......M')ng/uLDN..\ 模板 Ιμ? 10pmol~L引物（U6-1的上遊和U6-3的下遊引物） 2μ[ 10 X PCR buffer ( 10 X PCR bufFer ( -- Mg2' (25mmol/L) 1 Kj! i. lpL、dATP、dGTP、dTTP、dCTP 各 2mmol/L ) TaqDNA 聚浦 0.5μ? 尤菌水 4.5 μ?;
[0105] 三、用限制性內切酶asel和mlul雙酶切PEGFP-C1載體，切除質粒上的CMV啟動 子、egfp表達區域和sv40終止子後，獲得3100bp的框架結構；並用限制性內切酶asel和 mlul雙酶切上一步得到的5 '端asel酶切位點，3'端bamhl和mlul酶切位點的斑馬魚U6 啟動子片段；獲得帶有asel和mlul粘性末端的啟動子片段；通過T4DNA連接酶連接，得連 接產物；其中，限制性內切酶asel和mlul雙酶切的酶切反應條件為：37°C水浴酶切2小時， 4 °C保存備用；
[0106] 酶切體系為10 μ L，成分如下：
[0107] 成分 用W: 56ng/uL PEGFP-C1 栽休 3.6μΙ asel O.SjtL mlul Ι.ΟμΙ 10 X Buffer Ι.Ομ? dd H2O 4A\ihi
[0108] 連接條件為：16°C循環水浴連接16h ;
[0109] 連接體系為10 μ L，成分如下：
[0110] 成分 丨 PEGFP-C1 鈸體 1.0μΙ_ 斑.*§儀U6 )ι!動段 3.0μ? Τ4 DNA 酶 1,0 μ? 2xT4 Ligasc Buffer 5.0μ?；
[0111] 四、將上一步的連接產物轉化進toplO感受態細胞中，鋪板；挑取4個克隆菌液 PCR鑑定（圖3)，片段大小正確，為400bp ;然後提取質粒，分別用asel和mlul雙酶切，asel 和bamhl雙酶切鑑定，經鑑定酶切片段大小正確；酶切條件和體系同上；
[0112] 其中，PCR驗證的PCR反應程序為：94°C預變性10min，94°C變性30s，55°C退火 30s，72°C延伸30s，30個循環；循環後72°C延伸lOmin ;
[0113] PCR反應體系為25 μ L，成分如下：
[0114] 成分 用量 30?50ng/uL DNA 模扳 l|iL 10pmol/pL弓丨物（U6-1的上遊和1)6-3的下遊引物） 2μΙ 10 X PCR buffer ( 10 X PCR buffer (含 Mg:i (25mmol/L) 18μ? lpL, dATP, dGTP, dTTP, dCTP ^ 2 mmoi/L ) TaqDNA 聚屬 0J|iL 11 丨W 水 4.5pL:
[0115] (2) pzu6p_siMSTN重組載體的構建
[0116] 五、siRNA是作用在基因的⑶S區從而抑制基因的轉錄後翻譯過程，因此設計 siRNA幹涉片段需要從基因的⑶S區上尋找幹涉片段，因此在鯉魚mstn基因的⑶S區 (GenBank:GQ214770. 1)上通過金斯瑞公司的設計軟體設計了一條含有頸環結構的MSTN幹 涉片段長度為70bp，MSTN幹涉片段的核苷酸序列如序列表Seq ID N〇:2所示；其含有bamhl 和mlul酶切位點；公司合成的MSTN幹涉片段是構建在puc57載體上，命名為puc57-siRNA 重組載體；
[0117] 六、用限制性內切酶bamhl和mlul雙酶切步驟五已經構建好pzu6p_siRNA重組 載體，將pzu6p-siRNA重組載體中切出了 bamhl和mlul的粘性末端，同樣通過限制性內切 酶bamhl和mlul雙酶切puc57-siRNA重組載體，得到MSTN幹涉片段；將MSTN幹涉片段與 pzu6p-siRNA用T4連接酶連接；其中，限制性內切酶asel和mlul雙酶切的酶切體系和酶 切條件同上；連接體系和條件同上；
[0118] 七、將上一步T4連接酶連接的產物轉化進toplO感受態細胞中，挑取克隆菌落，以 siMSTN幹涉片段引物，進行菌液PCR，PCR鑑定為400bp，即為siMSTN幹涉片段；表明已成 功將siMSTN幹涉片段連接到pzu6p載體上；對PCR驗證陽性的菌液提取質粒，進行酶切鑑 定，鑑定結果正確，表明構建成功，命名為pzu6p-siMSTN重組載體；
[0119] 其中，PCR驗證的PCR反應程序為：94°C預變性10min，94°C變性30s，55°C退火 30s，72°C延伸30s，38個循環；循環後72°C延伸lOmin ;
[0120] PCR反應體系為25 μ L，成分如下：
[0121] 成分 川 30 ?50ng/uL DNA 棋板 1 μ?
[0122] lOpmol/.uL *J|物（siMSTN Γ-涉片段…物.） 2μΙ 10 X PCR buffer ( 10 X PCR buffer ( ',t Mg2* (25mmol/L) Ιμ?、dATP、dGTP、dTTP、dCTP 各 2mmol/L ) TaqDNA 聚介_ 0.5μ? iilW水 4.5μΙ_:
[0123] 其中，siMSTN幹涉片段引物的序列為：
[0124] 上遊引物：5 ' -CTGCGATTAATTCTTTAGCCTCCGAGAG-3 '
[0125] 下遊引物：5 ' -GCAAAGGCGGTGCGGGAT-3 '。
[0126] 本實施例的siMSTN幹涉片段是將siRNA幹涉片段與U6啟動子片段連接後形成 的。
[0127] 本實施例通過鯉魚myostatin基因序列，構建了 RNA幹擾質粒載體，為了確定鯉魚 的myostatin雙鏈RNA是否能夠刺激鯉魚的生長，將用人工合成的轉蛋白抑素（Myostatin) RNAi質粒（pZU6p-siMSTN重組載體）通過顯微注射技術導入鯉魚受精卵核區附近，獲得當 年轉基因鯉魚。
[0128] 結果顯示，共導入野鯉受精卵1208粒。受精卵於23°C孵化培育，72h後孵化出膜， 獲得實驗魚548尾，出苗率為45. 36% ;
[0129] 對獲得的實驗魚經PCR和分子雜交檢測，結果表明，PCR檢測後，通過凝膠電泳檢 測結果顯示片段大小在400bp，表明外源基因進入了部分受體魚的基因組內；其中，PCR檢 測的引物為siMSTN幹涉片段引物；在所測定的40尾實驗魚中，有13?16尾顯示出明確的 雜交帶，陽性率為32. 5?40%，表明均有良好的擴增結果；
[0130] 將上步凝膠檢測後的片段回收（Biospin膠回收試劑盒），進行測序，通過測序結 果，進一步確定了供體基因在受體魚中的正確性；
[0131] 經一齡魚的生長實驗表明，轉基因鯉比普通鯉平均體重重49. 6 %，其體高和體厚 分別平均增長18 %和20%。
[0132] 本
【發明內容】
不僅限於上述各實施方式的內容，其中一個或幾個【具體實施方式】的組 合同樣也可以實現發明的目的。
【權利要求】
1. 一種採用魚類轉基因方法構建的基於鯉魚MSTN幹涉載體，其特徵在於它包括骨架 載體和siMSTN幹涉片段，所述的siMSTN幹涉片段的核苷酸序列如序列表Seq ID No :1所 /Jn 〇
2. 根據權利要求1所述的一種採用魚類轉基因方法構建的基於鯉魚MSTN幹涉載體，其 特徵在於所述的siMSTN幹涉片段是由MSTN幹涉片段通過其兩端的bamh-1和mlul酶切位 點分別與斑馬魚U6啟動子和骨架載體連接而成的；其中，斑馬魚U6啟動子的核苷酸序列如 序列表Seq ID No :2所不；MSTN幹涉片段的核昔酸序列如序列表Seq ID No :3所不。
3. 根據權利要求1所述的一種採用魚類轉基因方法構建的基於鯉魚MSTN幹涉載體， 其特徵在於所述的MSTN幹涉片段為中間連有5'-TTCAAGAGA-3'鹼基的發卡DNA序列，並在 MSTN幹涉片段序列兩端加入bamh-1和mlul酶切位點。
4. 根據權利要求1所述的一種採用魚類轉基因方法構建的基於鯉魚MSTN幹涉載體，其 特徵在於所述的骨架載體為pzu6p載體。
5. -種採用魚類轉基因方法構建基於鯉魚MSTN幹涉載體的方法，其特徵在於它是按 照以下步驟進行的： 一、 pzu6p-siRNA重組載體的構建 (1) 提取斑馬魚尾鰭中的DNA ; (2) 根據斑馬魚U6啟動子區域設計引物U6-1、U6-2和U6-3,然後以U6-1的上遊引物 和U6-2下遊引物為引物，以步驟一提取的DNA為模板，通過PCR，得到兩端分別為asel與 bamhl酶切位點的U6啟動子片段；其中，U6-1含有asel酶切位點，U6-2含有含有bamh-1 酶切位點，U6-3含有含有mlul酶切位點； 其中，U6-1的序列： 上遊引物 5' GTCACAGAACTCATCCAATCACA3' 下遊引物 5' AACCTCTTCAGGGCAAACC3'， U6-2的序列： 上遊引物 5' CACAGAACTCATCCAATCACACT3' 下遊引物 5' CTTATTCAACTCATTTACCTCAAACA3'， U6-3的序列： 上遊引物 5' CGAGAGTCTGTGAATGTTTCG3' 下遊引物 5' CCAGCAGITTTGTGGAGGT3' ； (3) 以步驟（2)得到的U6啟動子片段為模板，採用U6-1的上遊引物和U6-3的下遊引 物為引物，進行PCR，得到5 '端含有asel酶切位點、3'端含有bamhl和mlul酶切位點的斑 馬魚U6啟動子片段； ⑷用限制性內切酶asel和mlul雙酶切PEGFP-Cl載體，並用限制性內切酶asel和 mlul雙酶切步驟（3)獲得的斑馬魚U6啟動子片段，同過T4連接酶，將酶切後的PEGFP-Cl 載體與酶切後的斑馬魚U6啟動子片段進行連接，得連接產物； (5)將步驟（4)得到的連接產物轉化至toplO感受態細胞中，培養，挑取陽性克隆菌落， 進行PCR驗證，篩選出驗證為陽性的菌落，提取質粒，採用asel和mlul酶進行雙酶切驗證， 將驗證為陽性的片段，進行測序，測序成功後的載體，即為pzu6p-siRNA重組載體； 二、 pzu6p_siMSTN重組載體的構建 (6) 依據鯉魚mstn基因的⑶S區，設計出MSTN幹涉片段，MSTN幹涉片段兩端帶有bamhl 和mlul酶切位點，將MSTN幹涉片段連接到puc57載體上，構建得到puc57-siRNA重組載體； 其中，含有頸環結構的MSTN幹涉片段的核苷酸序列如序列表Seq ID No :2所示； (7) 用限制性內切酶bamhl和mlul雙酶切分別酶切步驟一構建的pzu6p-siRNA重組 載體以及puc57-siRNA重組載體，然後將酶切後回收得到的MSTN幹涉片段與pzu6p-siRNA 重組載體採用T4連接酶連接； (8) 將上一步採用T4連接酶連接後的重組載體轉化至toplO感受態細胞中，挑取陽性 克隆，進行菌液PCR鑑定，提取陽性克隆菌的質粒，進行bamh 1和mlu 1雙酶切鑑定，將鑑定 結果均為陽性的載體，命名為pzu6p-siMSTN重組載體，即完成基於鯉魚MSTN幹涉載體載體 的構建。
6. 根據權利要求5所述的一種採用魚類轉基因方法構建基於鯉魚MSTN幹涉載體的方 法，其特徵在於步驟（2)和（3)中所述的PCR反應程序為：94°C預變性10min，94°C變性30s， 55°C退火30s，72°C延伸30s，30個循環；循環後72°C延伸IOmin ; PCR反應體系為25 μ L，成分如下：
7. 根據權利要求5所述的一種採用魚類轉基因方法構建基於鯉魚MSTN幹涉載體的方 法，其特徵在於步驟（4)中限制性內切酶asel和mlul雙酶切的酶切反應條件為：37°C水浴 酶切2小時，4°C保存備用； 酶切體系為10 μ L，成分如下：
8. 根據權利要求5所述的一種採用魚類轉基因方法構建基於鯉魚MSTN幹涉載體的方 法，其特徵在於步驟（4)中的連接條件為：16°C循環水浴連接16h ; 連接體系為lOuL,成分如下：
9. 根據權利要求5所述的一種採用魚類轉基因方法構建基於鯉魚MSTN幹涉載體的方 法，其特徵在於步驟（7)中的限制性內切酶bamhl和mlul雙酶切的酶切反應條件為：37°C 水浴酶切2小時，4°C保存備用； 酶切體系為10 μ L，成分如下：
10. 根據權利要求5所述的一種採用魚類轉基因方法構建基於鯉魚MSTN幹涉載體的方 法，其特徵在於步驟（8)的PCR鑑定的PCR反應程序為：94°C預變性10min，94°C變性30s， 55°C退火30s，72°C延伸30s，38個循環；循環後72°C延伸IOmin ; PCR反應體系為25 μ L，成分如下：
其中，PCR所用的引物為siMSTN幹涉片段引物，其序列為： 上遊引物：5 ' -CTGCGATTAATTCTTTAGCCTCCGAGAG-3 ' 下遊引物：5' -GCAAAGGCGGTGCGGGAT-3'。
【文檔編號】C12N15/63GK104232670SQ201410421731
【公開日】2014年12月24日 申請日期:2014年8月25日 優先權日:2014年8月25日
【發明者】閆學春, 曹頂臣, 何立川 申請人:中國水產科學研究院黑龍江水產研究所