一種降低鎘在植物中積累的方法及其應用的製作方法
2023-10-09 12:42:09 2
專利名稱：一種降低鎘在植物中積累的方法及其應用的製作方法
技術領域：
本發明涉及一種降低重金屬在植物中積累的方法及其應用，特別涉及一種降低鎘在植物中積累的方法及其應用。
背景技術：
工業革命以來，全球有毒重金屬的汙染急速加劇，其中重金屬鎘是最嚴重的環境汙染物之一，每年有15000噸鎘被生產出來，用於電池、合金和染料。慢性暴露於鎘汙染的環境能引起腎臟及骨骼的損害，還存在引發癌症的危險。2003年8月Nature-Medicine發表的一項研究提出微量鎘有模擬雌激素的作用，即使相當低的劑量也將對身體造成大範圍的影響，可能誘發子宮癌和乳癌(Johnson MD，Kenney N，Stoica A，Hilakivi-Clarke L，Singh B，Chepko G，Clarke R，Sholler PF，LirioAA，Foss C，Reiter R，Trock B，Paik S Martin MB.Cadmium mimics the in vivoeffects of estrogen in the uterus and mammary gland.Nature Medicine，2003.91081-1084)。據估計，僅在美國，用傳統的方法清除有毒重金屬汙染需要花費至少2000億美元。近年發展的植物修復技術可以利用植物對重金屬的富集作用清除和減低重金屬對環境的汙染，該技術操作方便，費用低廉，而且對於化學方法無力對付的大範圍低濃度的汙染有著很好的治理作用(Prasad，M.N.V and Freitas，H.M.O.Feasible biotechnological and bioremediation strategies for serpentine soilsand mine spoils.EJB Electronic J.Biotechnology，1999.236-50)。但是，目前所知的重金屬超富集植物甚少，而且往往生物量小、富集效率低且對其生長習性不了解，這些都限制了植物修復技術在實際中的應用。在重金屬富集植物的種植過程中如何通過簡便而廉價的方法提高其對重金屬的富集效率還沒有報導。
目前，城市垃圾、汙水、汙泥等用於農業生產的數量愈來愈多，尤其是用於城市郊區農業生產的更多。一方面緩和了肥、水緊缺的矛盾，為農業生產的增產增收做出了貢獻；另一方面則給土壤和農作物帶來了不同程度的重金屬汙染，直接或間接地影響農作物的產量與品質，並通過食物鏈進入人體危害人民的健康。尤其是城市近郊區和工礦企業附近的蔬菜重金屬汙染愈來愈嚴重。菜園土壤隨種菜歷史的延長，熟化程度的增加以及城市工業的汙染，重金屬的含量有明顯增高的趨勢，其中部分蔬菜的重金屬含量已超過了食品衛生標準。
蔬菜是廣大人民日常生活中不可缺少的食物，蔬菜的重金屬含量直接關係到人們的身體健康。土壤汙染對蔬菜影響較大的有鎘汙染、汞汙染、鉻汙染和砷汙染，其中以鎘汙染尤為嚴重。Martin等最新的研究發現在世界衛生組織推薦的一周安全劑量(每周每公斤體重7微克)範圍內，鎘已經能產生雌激素效應(Johnson MD，KenneyN，Stoica A，Hilakivi-Clarke L，Singh B，Chepko G，Clarke R，Sholler PF，LirioAA，Foss C，Reiter R，Trock B，Paik S Martin MB.Cadmium mimics the in vivoeffects of estrogen in the uterus and mammary gland.Nature Medic ine.2003.91081-1084)。
稀土元素鑭可提高植物對不良環境的適應能力或增加對逆境的抗性，如低溫、高溫、乾旱和鹽漬等。另有研究表明，稀土元素能減輕重金屬鉛對植物的傷害作用(龐欣，王東紅，彭安，鑭對鉛脅迫下小麥幼苗抗氧化酶活性的影響.環境化學，2002，21(4)318-323)。面對目前土壤重金屬汙染在相當長的一段時間尚不能完全清除的現實，當務之急便是研究如何降低蔬菜中重金屬積累的技術。蔬菜對重金屬吸收、積累和解毒的機制較為複雜，有人通過植物生理學研究推測外加鑭可緩解重金屬對植物的毒性(龐欣，王東紅，彭安，鑭對鉛脅迫下小麥幼苗抗氧化酶活性的影響.環境化學，2002，21(4)318-323；張家榮，顧月華，趙貴文，稀土浸種對油菜種子萌發及種苗生長的生物效應.稀土，1999，30(3)55-57；周青，黃曉華，黃鋼業等，La對Pb傷害大豆幼苗的影響，應用與環境生物學報，1999，5(1)22--25)。最近的研究表明，植物絡合素及植物絡合素合酶基因在蔬菜對重金屬的耐受機制中起著極其重要的作用。但有關鑭與該基因的表達及植物重金屬積累的關係國內外尚無報導。
發明創造內容本發明的目的是提供一種降低鎘在植物中積累的方法及其應用。
本發明所提供的降低鎘在植物中積累的方法是在含鎘的植物生長介質中施加三價鑭離子。
所述植物可為農作物，蔬菜，觀賞植物，樹木等，優選為蔬菜，尤其為葉菜類蔬菜，特別是十字花科的葉菜，最優選為生菜。三價鑭離子可以來自La(NO3)3、La(Ac)3、LaCl3或以上述成份為主的稀土微肥，優選為La(NO3)3。三價鑭離子的濃度為0.02-0.06mg/L或0.02-0.06mg/kg生長介質，優選為0.04mg/L或0.04mg/kg植物生長介質。植物生長介質可為土壤，沙子，銍石等任何可適合植物生長的物質。
本發明的方法有效地降低了植物對鎘的積累。生菜幼苗在鎘脅迫下施加0.04mg/L硝酸鑭後，三價鑭離子可以抑制生菜對有害重金屬鎘的積累，特別是在蔬菜莖葉中的積累。已有的研究表明鑭在施用臨界值30mg/kg耕作土時，對環境和動物都是安全無害的，而本發明中施加的鎘濃度遠低於該臨界值。本發明的方法可廣泛用於生產低鎘農作物。
圖1A為不同處理條件下生菜種子的萌發照片圖1B為不同處理生菜芽的鮮重、根長及莖長統計直方2為鑭對鎘脅迫下生長20天的生菜鮮重、根長及莖長的影響直方3A為經不同處理後生菜根中鎘的含量直方3B為經不同處理後生菜莖葉中鎘的含量直方4為LsPCS1片段核苷酸序列及編碼胺基酸序列圖5A生菜莖葉RT-PCR電泳5B生菜根RT-PCR電泳6A為鑭對鎘脅迫下的生菜葉中植物絡合素合酶基因表達的影響直方6B為鑭對鎘脅迫下的生菜根中植物絡合素合酶基因表達的影響直方圖具體實施方式
材料1、植物材料和質粒所用的植物材料為美國結球生菜(Lactuca sativa)；主要試劑均為進口或國產分析純試劑。克隆載體pGEM-TEasy購自Promega公司。
2、主要生化試劑及酶類限制性核酸內切酶、DNA分子量參照物購自華美生物工程公司；DNA回收試劑盒購至上海申友生物技術公司；Taq酶、dNTPs和RT-PCR kit購自Takara公司；X-Gal、IPTG購自Promega公司；SuperScript II反轉錄酶購自Invitrogenn公司。
實施例1、鑭對鎘脅迫下的生菜種子萌發的影響將生菜種子用70％乙醇浸泡30秒，0.1％HgCl2水溶液浸泡10分鐘，然後用無菌水衝洗5次，將種子點種於墊有濾紙的平皿中，滴加不同處理的溶液(處理及代碼見表1)28℃暗處萌發。5天後，採收幼苗、衝洗後吸乾水分，稱其鮮重，測量其根及莖的長度。
表1、各種處理及處理濃度代碼 處理 處理濃度CK 對照 ——La 鑭處理 0.04mg/L La(NO3)3
Cd 鎘處理 0.05mM CdCl2Cd+La 鎘鑭處理 0.05mM CdCl2+0.04mg/L La(NO3)3生菜種子於0.05mM CdCl2脅迫下萌發5天後，與正常條件下的種子相比，幼芽鮮重減少、根長和莖長降低，其中最明顯的變化是對根生長的抑制。結果如圖1A和圖1B所示，表明同時外加0.04mg/L La(NO3)3，生菜的根明顯比僅以鎘處理的根長，說明三價鑭離子在一定程度上對鎘的毒性有拮抗作用；在鮮重、莖長方面，鑭離子也在一定程度上減緩了鎘的毒性。
實施例2、鑭對鎘脅迫下的生菜植株生長的影響生菜(Lactuca sativa)種子按照步驟1中的殺菌方法處理後在洗淨的石英砂中發芽出苗，10天後取生長一致的幼苗，清洗乾淨，移於塑料缽中，每缽盛4/5體積洗淨的沙子，營養物質1/2MS(CaCl2free)培養基以溶液的方式加入到沙子中，在溫室內進行培養，光周期16/8h，培養溫度25℃。植株生長20天後開始處理。試驗設6個處理，各處理中鎘離子和鑭離子的濃度見表2。每個處理分別於1h，2h，6h，12h，24h，48h和96h分7次取樣，分別採集根和莖葉，每個樣品備四份。其中一份用於測定鎘含量。
表2、各種處理及處理濃度代碼 處理 處理濃度CK 對照 ——La 鑭處理 0.04mg/L La(NO3)3Cd 鎘處理 0.5mM CdCl2Cd+La 鎘鑭處理 0.5mM CdCl2+0.04mg/L La(NO3)3在鎘脅迫下，生菜植株最明顯的中毒症狀是葉片萎蔫失綠，生長緩慢甚至停滯。但同時加入鑭在很大程度上可以緩解鎘的毒性，植株未見明顯的萎蔫。結果如圖2所示，表明在鎘脅迫下，鎘處理的植株與對照植株相比鮮重、根長及莖長均顯著下降，而鎘鑭處理的植株鮮重、根長及莖長只有很小幅度的降低。說明外加三價鑭離子可提高生菜對重金屬鎘的耐受性。
實施例3、施加鑭對鎘脅迫下生菜中鎘累積的效應將實施例2中用於測定鎘含量的生菜根和莖葉用去離子水洗淨後，105℃下殺青，65℃下烘乾。樣品粉碎後，稱取適量，加3ml硝酸於微波消解儀中消解15min，消解後定容至25ml容量瓶中，用石墨爐原子吸收分光光度計測定鎘含量(鎘波長228.8nm)。
結果如圖3A和圖3B所示，表明對照和僅外加鑭的生菜植株中鎘含量幾乎為零。在營養液中加鎘，生菜植株中鎘含量便顯著增加，且根中鎘含量明顯比莖葉中高；並且隨著時間的延長，生菜根和莖葉中的鎘的含量增加。但是Cd+La處理的生菜中鎘的含量明顯低於Cd處理。其中當鎘脅迫12h時，根和莖葉中鎘含量分別為205.8μg/gDW和165.8μg/g DW；在鎘脅迫的同時加入三價鑭離子，生菜根和莖葉中鎘含量為185.1μg/g DW和73.8μg/g DW，分別降低至89.9％和44.5％。鎘脅迫96h時，生菜根和莖葉中鎘含量分別為709.7μg/g DW和416.8μg/g DW；在鎘脅迫的同時加入三價鑭離子，生菜根和莖葉中鎘含量為556.6μg/g DW和255.6μg/g DW，分別降低至78.4％和53.7％。說明施加三價鑭離子在提高了生菜對重金屬鎘耐受性的同時降低了其對鎘的吸收和積累。
實施例4、鑭作用的分子機理1、LsPCS1片段的克隆及測序(1)生菜總DNA的製備提取緩衝液5ml Tris(1M，pH 8.0)，5ml EDTA(0.5M，pH 8.0)，6.25mlNaCl(4M)，3.3ml 20％SDS，1.180 β-Mecapto ethanol，定容至50ml。
取0.2g生菜全株於液氮中研成粉狀，加入800μl提取緩衝液(65℃)劇烈震蕩混勻，65℃水浴20分鐘，每5分鐘混勻一次。加250μl 5 M KAc(預冷)，迅速顛倒混勻置於冰上5分鐘。4℃，12000rpm，離心5min，上清液轉入新管，4℃，12000rpm，離心5min，徹底去沉澱。上清轉入含600μl異丙醇的離心管，顛倒混勻至少10次(RNA沉澱)。4℃，12000rpm離心15min後，去上清。加入500μl去離子水溶解沉澱，用等體積的酚∶氯仿∶異戊醇(25∶24∶1)抽提，4℃，12000rpm離心5min，上清用2倍體積乙醇沉澱。加入1ml 4℃預冷的75％乙醇，洗滌沉澱及離心管壁。4℃，12000rpm離心5min，棄上清，用吸水紙吸乾。加入適量Milli-Q水，溫和振蕩至完全溶解，進行紫外分析測定。
(2)LsPCS1片段的克隆根據已經克隆的擬南芥、大豆、油菜等的植物絡合素合酶基因的cDNA序列比較結果，在保守區設計簡併引物，上遊引物和下遊引物分別為5』-TGGAAGGG(AGCT)CC(CT)TGGAG(AGCT)TGG-3』，5』-TGCCGTCGCAG(A/G)TGCA(G/A)(T/A)ACCT-3』用生菜的總DNA作為模板，進行PCR擴增，在20μL的反應體系中依次加入模板DNA約10ng，10×PCR緩衝液2μl，2.5mmol/L dNTP2μl，20mmol/L上下遊引物各1μl，Taq DNA聚合酶1U，在MJ Research公司生產的PTC200型擴增儀上進行PCR擴增。反應條件為95℃預變性5min，每次循環94℃變性30sec，60℃退火30min，72℃延伸1min，共30次循環，最後72℃再延伸10min。總DNA擴增產物在1％瓊脂糖凝膠上電泳檢測，並用GDS 8000凝膠圖像分析系統照像記錄。
(3)特異擴增片段的回收和克隆測序特異擴增片段經低熔點瓊脂糖凝膠電泳，回收、純化，按常規方法克隆到pGEM-TEasy載體上，並轉化E.coli DH5α，藍白斑篩選後，進行EcoR I酶切鑑定，PCR鑑定，菌株送到上海申友生物技術公司測序。結果如圖4所示，表明從生菜基因組DNA中擴增出一個片斷，測序結果表明，大小為421bp，編碼115個胺基酸，在GenBank中進行同源性比較結果表明，該片段與其他植物絡合素合酶基因同源性達85％，其中包含一個76bp的內含子。將該片段命名為LsPCS1，並在GenBank註冊(Accession No.AF506283，核苷酸序列及推測的蛋白序列見圖4)。
2、鑭對鎘脅迫下的生菜植物絡合素合酶基因表達的影響(1)生菜幼苗葉、根總RNA的抽提採用TRIZOL總RNA抽提試劑盒(GIBCOBRL公司產品)抽提生菜幼苗葉、根的總RNA。設置CK、La、Cd、Cd+La(CdCl20.5mM、La(NO3)30.04mg/L)4個處理，分別於1h、2h、6h、12h、24h、48h後採收樣品，提取莖葉和根中的RNA進行半定量RT-PCR檢測。稱取組織0.1mg放入用液氮預冷過的碾缽中，在液氮中研磨至粉末狀，轉至勻漿管加入RNA extraction buffer 1ml。將勻漿管插於冰上，靜止冰浴20分鐘。加入等體積酚氯仿溶液，用力震蕩1分鐘，冰浴20分鐘。4℃，12000rpm，離心20min。從每管中吸取上清至另一離心管。分別加入1/10體積3mol/l NaAc(pH4.5)，加入等體積酸性酚氯仿溶液，用力震蕩離心管1分鐘，冰浴20分鐘。4℃，12000rpm，離心20min。從每管中吸取上清至另一離心管，加入等體積-20℃預冷的異丙醇，混勻後沉澱。4C，12000rpm離心20min後，去上清。加入1ml 4℃預冷的75％乙醇，洗滌沉澱及離心管壁。4℃，12000rpm離心5min，棄上清，用吸水紙吸乾。加入25μl Milli-Q水，溫和振蕩至完全溶解，進行紫外分析測定。將RNA置於-20℃保存備用。
(2)RT-PCR檢測LsPCS1的表達量①不同處理cDNA的合成按下列成份合成反轉錄2×mRNA Selective PCR Buffer 25μl，MgCl210μl，
dNTP/相似物混合物 5μl，RNase抑制劑 1μl，AMV反轉錄酶 1μl，下遊特異引物 1μl，樣品RNA 1μg，ddH2O6μl。
按以下條件進行反轉錄反應30℃ 10min，45℃ 30min，5℃ 5min。
②生菜actin基因片段的克隆根據擬南芥等雙子葉植物actin基因的保守區設計一對簡併引物上遊，5』-TTTGCTGGAGATGATGCTCC-3』，下遊，5』-GTGGTACGACCACTGGCATA-3』，以生菜對照cDNA為模板，進行PCR擴增，得到一條400bp左右大小的條帶，經過回收、連接、測序、比較，證明同雙子葉植物的actin基因具有極高的同源性，是生菜的actin基因片段。actin基因的表達比較穩定，不因外界環境刺激或組織不同而變化，在RT-PCR中作為內參。
③PCR反應根據LsPCS的序列，設計一對特異引物上遊，5』-GCTTGACTGTTGCGAGCCTTTG-3』下遊5』-ATCAATGCCATGTCCCTTCCAGCA-3』以不同處理的cDNA為模板，按以下程序進行95℃ 30sec，60℃ 30sec，72℃ 50秒，23個循環。PCR均設置了相應的正負對照，即以總DNA為模板作為PCR正對照，以不加模板作為負對照。結果如圖5A和圖5B所示，表明以合成的第一鏈cDNA作為模板，特異引物擴增出一條300bp左右的條帶。
取等量的PCR產物進行電泳，經Alphaimager掃描並利用BiolD對各個泳道的條帶進行積分。同法測定對應的actin基因表達量，並將兩者進行比較，對生菜莖葉和根中LsPCS1的表達情況進行了分析。結果如圖6A和圖6B所示，表明對照植株莖葉和根中LsPCS1的轉錄水平均較低；在重金屬鎘脅迫下，LsPCS1的轉錄水平明顯升高，而且根中LsPCS1 mRNA積累的速度和量均較莖葉中高。這與植株中鎘積累的趨勢相似。在鎘脅迫的同時加入三價鑭離子後，LsPCS1的表達量更高；特別是在處理24小時的根中，LsPCS1的表達量為對照的6.4倍，鎘脅迫的1.7倍；但相應的鎘的積累卻下降為鎘脅迫的57％。這表明三價鑭離子可能是通過促進在重金屬解毒中起重要作用的植物絡合素合酶基因的表達來降低重金屬對植物的毒害的，其結果表現為植物對重金屬的抗性提高而積累降低。
權利要求
1.一種降低鎘在植物中積累的方法，是在含鎘的植物生長介質中施加三價鑭離子。
2.根據權利要求1所述的方法，其特徵在於所述植物為農作物，蔬菜，觀賞植物，樹木。
3.根據權利要求2所述的方法，其特徵在於所述植物為蔬菜。
4.根據權利要求3所述的方法，其特徵在於所述植物為生菜。
5.根據權利要求1、2、3或4所述的方法，其特徵在於所述三價鑭離子來自La(NO3)3，La(Ac)3或LaCl3或以上述成份為主的稀土微肥。
6.根據權利要求5所述的方法，其特徵在於所述三價鑭離子為La(NO3)3。
7.根據權利要求1、2、3或4所述的方法，其特徵在於所述三價鑭離子的濃度為0.02-0.06mg/L或0.02-0.06mg/kg生長介質。
8.根據權利要求7所述的方法，其特徵在於所述三價鑭離子的濃度為0.04mg/L或0.04mg/kg植物生長介質。
9.根據權利要求1所述的方法，其特徵在於所述植物生長介質為土壤，沙子或銍石。
10.權利要求1所述的方法在生產低鎘植物中的應用。
全文摘要
本發明公開了一種降低鎘在植物中積累的方法及其應用。其目的是提高植物對鎘的耐受性並降低鎘在植物中的積累。本發明所提供的降低鎘在植物中積累的方法是在含鎘的植物生長介質中施加三價鑭離子。本發明的方法可廣泛用於生產低鎘農作物。
文檔編號A01N59/16GK1596657SQ0315719
公開日2005年3月23日 申請日期2003年9月18日 優先權日2003年9月18日
發明者麻密, 何振豔, 李江川, 張海燕 申請人:中國科學院植物研究所