具有木聚糖酶活性的多肽的製作方法

2023-10-09 09:18:29 3

具有木聚糖酶活性的多肽的製作方法
【專利摘要】本發明涉及對具有木聚糖酶活性的多肽進行修飾以提高麩皮溶解性和/或木聚糖酶活性。所述修飾包括在第10位的至少一個胺基酸修飾，並且可能還包含在第11、12、13、34、54、77、81、99、104、113、114、118、122、141、154、159、162、164、166或175位的至少一個或多個胺基酸的修飾，其中所述位置是根據枯草芽孢桿菌木聚糖酶(SEQ ID NO：1)的位置而確定的。所述多肽與SEQ ID NO：1具有至少88％的同一性或者與選自SEQ ID NO：2-22的序列有至少75％的同一性。
【專利說明】具有木聚糖酶活性的多肽
[0001] 本申請是申請日為2009年12月23日、發明名稱為"具有木聚糖酶活性的多肽"的 中國發明專利申請No. 200980155229. X的分案申請。 發明領域
[0002] 本發明涉及具木聚糖酶活性的多肽及其使用。本發明還涉及修飾具木聚糖酶活性 的多肽以影響（優選提高）木聚糖酶活性和/或麩皮溶解性的方法。
[0003] 發明背景
[0004] 多年來，內切-￠-1, 4-木聚糖酶（EC 3. 2. 1.8)(在此稱為木聚糖酶）已被用於來 自植物細胞壁物質的複合碳水化合物的修飾。在本領域內眾所周知不同木聚糖酶（來源於 不同微生物或植物）的功能性有巨大差異。基於結構和遺傳信息，木聚糖酶已被劃歸不同 的糖苷水解酶家族（GH) (Henrissat, 1991 ;Coutinho and Henrissat, 1999)。直至最近，所 有已知並定性的木聚糖酶均屬於家族GHlO或GH11。最近的工作已鑑定了許多其它類型的 屬於家族 GH5，GH7，GH8 和 GH43 的木聚糖酶（Coutinho and Henrissat，1999;Collins et al.，2005)。至今GHll家族仍不同於所有其它的GH，它是唯一的只由木聚糖特異性木聚糖 酶組成的家族。GHll木聚糖酶的結構可描述為果凍卷（P-Jelly roll)結構（見本文 所述圖1)。
[0005] US 6, 682, 923涉及木聚糖酶活性蛋白及核酸。
[0006] 已用定性清楚的純底物進行了表徵木聚糖酶功能性的全面研究（Kormelink et al.，1992)。這些研究顯示不同的木聚糖酶對於阿拉伯糖基木聚糖（AX)之木糖主幹的取代 具有不同的特殊要求。某些木聚糖酶需要三個非取代的木糖殘基以水解木糖主幹；其它的 僅需要一個或兩個。據認為造成特異性方面的這些差異的原因是由於催化結構域內的三維 結構，其繼而又取決於木聚糖酶的一級結構，即胺基酸序列。不過，這些胺基酸序列上的差 異向木聚糖酶功能性上差異的轉化至今尚未在木聚糖酶作用於複雜環境諸如植物材料中 的情況下得到證明。
[0007] 在小麥（小麥麵粉）中發現的木聚糖酶底物傳統上被分成兩部分：水不可提 取的AX (WU-AX)和水可提取的AX (WE-AX)。WU-AX: WE-AX的比例在小麥麵粉中是大約 70:30。關於為何有兩種不同的AX組分存在眾多的解釋。較早的文獻（D'Appolonia and MacArthur (1976)以及 Montgomery and Smith (1955))描述了 WE-AX 和 WU-AX 之間在取代 程度上相當大的差異。在WE-AX中發現最高程度的取代。這被用於解釋為何某些AX是可提 取的。相較於較低取代程度（它會引起聚合物之間的氫鍵形成及隨之而來的沉澱）而言， 高度取代使得聚合物可溶。
[0008] 不同木聚糖酶功能性之間的差異被認為歸因於木聚糖酶特異性上的差異以及它 們由此對WU-AX或WE-AX底物的偏愛。
[0009] 不過，更新近的文獻未發現在WE-AX和WU-AX之間取代程度有同樣巨大的差異。因 此，除了木聚糖酶底物特異性之外的其它參數可能是具有重要意義的。這些參數可能是相 對於WU-AX而言木聚糖酶更偏愛WE-AX，這是由經典的底物特異性之外的其它方式確定的。 此參數在文獻中被描述為底物選擇性。
[0010] 在某些應用中（例如麵包房）希望從WU-AX組分產生高分子量（HMW)可溶性聚 合物。這樣的聚合物與麵包製備中的體積增大相關（Rouau, 1993 ;Rouau et al.，1994and Courtin et al. , 1999).
[0011] 在其它應用中期望修飾WU-AX和WE-AX二者，使WU-AX溶解，降低分子量，減少 它們的水狀膠質效果，產生阿拉伯糖基木聚糖寡糖，從而可以進一步降解其它細胞壁組分 (諸如在餅乾生產、麵粉分離、飼料施用、生物乙醇產生、益生元等等方面）。
[0012] 各種應用中所用木聚糖酶的所有上述特性針對的是木聚糖酶的性能並且對於獲 得所需的功能性而言是非常重要的。不過，選擇具有正確特性的木聚糖酶用於某些應用中 或改造已知的木聚糖酶以達到此目的，經常導致了較低效率的木聚糖酶分子，例如具有低 催化活性的分子（即由分子單位/mg木聚糖酶蛋白表徵的比活性）。由於這些分子是待用 於商業用途的，因此具有儘可能高的催化活性是非常重要的。由於農業副產物諸如穀類麩 皮使用的增加或者在纖維素生物乙醇生產中的使用，此特性的改善對於未來實現這些酶的 商業應用而言將是越來越重要的。
[0013] 發明簡述
[0014] 本發明基於以下令人驚訝的發現，即通過相較於SEQ ID No. 1中所示之枯草芽孢 桿菌木聚糖酶多肽序列而言在第110位修飾具木聚糖酶活性的多肽有可能增加該酶的麩 皮溶解性和/或木聚糖酶活性。
[0015] 由此，本發明的
【發明者】已證明可能產生具有增加的木聚糖酶活性和/或麩皮溶解 性的木聚糖酶多肽。這將例如使得涉及纖維素生物乙醇生產的穀類加工過程中半纖維素組 分的水解成為可能，或者使得諸如動物飼料、澱粉液化，食物烘焙、麵粉分離（溼磨法）、益 生元產生以及紙和紙漿生產等許多應用中所需要的木聚糖酶的量減少。
[0016] 第一方面，本發明涉及具有木聚糖酶活性並且包含與SEQ ID No. 1具至少88%同 一性或與選自SEQ ID No. 2-22之胺基酸序列具至少75 %同一性的胺基酸序列的多肽，並且 該多肽在第110位具有胺基酸修飾，其中所說的第110位通過序列比對確定為相應於SEQ ID No. 1所示之枯草芽孢桿菌木聚糖酶序列第110位的位置。
[0017] 第二方面，本發明涉及具有木聚糖酶活性並且包含與SEQ ID No. 1具至少88%同 一性之胺基酸序列的多肽，並且該多肽在第110位具有胺基酸修飾，其中所說的第110位通 過序列比對確定為相應於SEQ ID No. 1所示之枯草芽孢桿菌木聚糖酶序列第110位的位 置。
[0018] 第三方面，本發明涉及具有木聚糖酶活性並且包含與SEQ ID No. 2具至少75%同 一性之胺基酸序列的多肽，並且該多肽在第110位具有胺基酸修飾，其中所說的第110位通 過序列比對確定為相應於SEQ ID No. 1所示之枯草芽孢桿菌木聚糖酶序列第110位的位 置。
[0019] 在進一步的方面，本發明涉及具有木聚糖酶活性並且包含與SEQ ID No. 3具至少 75%同一性之胺基酸序列的多肽，並且該多肽在第110位具有胺基酸修飾，其中所說的第 110位通過序列比對確定為相應於SEQ ID No. 1所示之枯草芽孢桿菌木聚糖酶序列第110 位的位置。
[0020] 在進一步的方面，本發明涉及鑑定本發明多肽的方法，所說方法包括：
[0021] (i)製備與SEQ ID No. 1具至少88%同一性或與選自SEQ ID No. 2-22之胺基酸 序列具至少75%同一性的多肽，並且該多肽在第110位具有胺基酸修飾，其中所說的第110 位通過序列比對確定為相應於SEQ ID No. 1所示之枯草芽孢桿菌木聚糖酶序列第110位的 位置；
[0022] (ii)將所說多肽的麩皮溶解和/或木聚糖酶活性與選自SEQ ID NOs: 1-22之中的 與其具有最高同一性百分比的胺基酸序列的麩皮溶解和/或木聚糖酶活性進行比較；然後
[0023] (iii)如果相較於SEQ ID NOs: 1-22之中的、與其具有最高同一性百分比的胺基酸 序列而言具有改善的麩皮溶解和/或改善的木聚糖酶活性則選擇該多肽。
[0024] 在進一步的方面，本發明涉及製備本發明多肽的方法，所說方法包括表達編碼所 說多肽的核苷酸序列；並在表達後任選地分離和/或純化該多肽。
[0025] 在某些實施方案中，通過修飾多肽胺基酸序列第110位或在編碼多肽胺基酸序列 之核苷酸序列中編碼第110位胺基酸殘基之密碼子來製備所述多肽，其中第110位參照SEQ ID No. 1所示之枯草芽孢桿菌木聚糖酶序列確定。
[0026] 在進一步的方面，本發明涉及編碼本發明多肽之核苷酸序列。
[0027] 在進一步的方面，本發明涉及包含編碼本發明多肽之核苷酸序列的載體。
[0028] 在進一步的方面，本發明涉及已被編碼本發明多肽之核苷酸序列轉化或已被包含 編碼本發明多肽之核苷酸序列的載體轉化的細胞。
[0029] 在進一步的方面，本發明涉及已被編碼本發明多肽之核苷酸序列轉化或已被包含 編碼本發明多肽之核苷酸序列的載體轉化的宿主生物體。
[0030] 在進一步的方面，本發明涉及包含本發明多肽的組合物。
[0031] 在進一步的方面，本發明涉及包含依照本發明方法鑑定之多肽的組合物。
[0032] 在進一步的方面，本發明涉及包含依照本發明製備之多肽的組合物。
[0033] 在進一步的方面，本發明涉及包含編碼本發明多肽之核苷酸序列的組合物。
[0034] 在進一步的方面，本發明涉及包含含有編碼本發明多肽之核苷酸序列的載體的組 合物。
[0035] 在進一步的方面，本發明涉及包含已被編碼本發明多肽之核苷酸序列轉化之細胞 的組合物。
[0036] 在進一步的方面，本發明涉及包含含有編碼本發明多肽之核苷酸序列的載體的組 合物。
[0037] 在進一步的方面，本發明涉及包含已被編碼本發明多肽之核苷酸序列轉化或已被 含有編碼本發明多肽之核苷酸序列的載體轉化之生物體並混合非毒性組分的組合物。
[0038] 在進一步的方面，本發明涉及包含本發明所述多肽或依照本發明鑑定之多肽或依 照本發明製備之多肽或符合本發明之核苷酸序列或符合本發明之載體或符合本發明之細 胞或符合本發明之生物體混合非毒性組分或符合本發明之組合物的麵團。
[0039] 在進一步的方面，本發明涉及包含本發明所述多肽或依照本發明鑑定之多肽或依 照本發明製備之多肽或符合本發明之核苷酸序列或符合本發明之載體或符合本發明之細 胞或符合本發明之生物體混合非毒性組分或符合本發明之組合物或符合本發明之混合物 的食物烘焙產品。
[0040] 在進一步的方面，本發明涉及包含本發明所述多肽或依照本發明鑑定之多肽或依 照本發明製備之多肽或符合本發明之核苷酸序列或符合本發明之載體或符合本發明之細 胞或符合本發明之生物體混合非毒性組分或符合本發明之組合物的動物飼料。
[0041] 在進一步的方面，本發明涉及包含木聚糖酶的洗滌組合物。在某些實施方案中， 所述的洗滌組合物是衣物洗滌組合物，而在其它的實施方案中所述洗滌組合物是盤碟洗滌 齊U。在某些進一步的實施方案中，所述的盤碟洗滌劑是自動盤碟洗滌劑。在某些另外的實 施方案中，含木聚糖酶的洗滌組合物進一步包含一種或更多種另外的酶。在某些實施方案 中，所述的另外的酶選自半纖維素酶、纖維素酶、過氧化物酶、蛋白酶、木聚糖酶、脂肪酶、磷 脂酶、酯酶、角質酶、果膠酶、果膠酸裂解酶、甘露聚糖酶、角蛋白酶、還原酶、氧化酶、酚氧化 酶、脂氧合酶、木質酶、支鏈澱粉酶、縣酸酶、戊聚糖酶、malanases、0 -葡聚糖酶、阿拉伯糖 苷酶、透明質酸酶、硫酸軟骨素酶、漆酶和澱粉酶或它們的混合物。在某些實施方案中，使用 酶的組合（即"雞尾酒"）。
[0042] 在進一步的方面，本發明涉及降解或修飾植物細胞壁的方法，該方法包括令所說 的植物細胞壁接觸本發明所述多肽或依照本發明鑑定的多肽或依照本發明製備的多肽或 本發明所述核苷酸序列或本發明所述載體或本發明所述細胞或本發明所述生物體混合非 毒性組分或本發明所述組合物。
[0043] 在進一步的方面，本發明涉及加工植物材料的方法，該方法包括使所述的植物材 料接觸本發明之任一項所述多肽或依照本發明鑑定的多肽或依照本發明製備的多肽或本 發明所述核苷酸序列或本發明所述載體或本發明所述細胞或本發明所述生物體混合非毒 性組分或本發明所述組合物。
[0044] 在進一步的方面，本發明涉及在修飾植物材料的方法中使用本發明所述多肽或依 照本發明鑑定的多肽或依照本發明製備的多肽或本發明所述核苷酸序列或本發明所述載 體或本發明所述細胞或本發明所述生物體混合非毒性組分或本發明所述組合物。
[0045] 在進一步的方面，本發明涉及本發明所述多肽或依照本發明鑑定的多肽或依照本 發明製備的多肽或本發明所述核苷酸序列或本發明所述載體或本發明所述細胞或本發明 所述生物體混合非毒性組分或本發明所述組合物在以下任一方面或多方面的用途：食物烘 焙、穀類加工、澱粉液化、從纖維素材料生產生物乙醇、動物飼料、木材加工、提高木漿漂白。
[0046] 在進一步的方面，本發明涉及實質上如上文所述與實施例和附圖有關的多肽或其 片段。
[0047] 在進一步的方面，本發明涉及實質上如上文所述與實施例和附圖有關的方法。 [0048] 在進一步的方面，本發明涉及實質上如上文所述與實施例和附圖有關的組合物。 [0049] 在進一步的方面，本發明涉及實質上如上文所述與實施例和附圖有關的用途。
[0050] 圖例說明
[0051] 在此參看以下附圖。
[0052] 圖1顯示了疊加的枯草芽孢桿菌XynA變體木聚糖酶（TllOA)(黑色）、裡氏木黴 (Trichoderma reesei)Xyn2 變體木聚糖酶（T120A)(深灰）和嗜熱絲抱菌（Thermomyces lanugin〇Sus)XynA變體木聚糖酶（T120A)(淺灰）。突變的殘基TllO和T120分別被突出 顯不。
[0053] 圖2顯示了利用AlignX程序（vectorNTI組的一部分）以適合多重比對的默認值 (缺口開放罰分：IOog缺口延伸罰分0.05)進行的SEQID NO: 1-22的多重序列比對。序列 左邊的數字代表SEQ ID NOs。
[0054] 發明詳述
[0055] 已報導木聚糖酶來自近100種不同的生物體，包括植物、真菌和細菌。這些木聚糖 酶被劃歸到超過40個糖基水解酶家族中的數個內。糖基水解酶包括木聚糖酶，甘露聚糖 酶，澱粉酶，￠-葡聚糖酶，纖維素酶及其它糖酶，基於諸如胺基酸序列、三維結構和催化 位點的幾何學等特性進行分類（Gilkes，et al.，1991，Microbiol. Reviews 55:303-315)。
[0056] -方面，本發明涉及具木聚糖酶活性並且相對於SEQ ID N0:l_22的任一胺基酸序 列而言包含至少三個（諸如5、6、7、8、9或10個）胺基酸取代的多肽，該多肽在第110位具 有胺基酸修飾，其中所說的第110位通過序列比對確定為相應於SEQ ID No. 1所示之枯草 芽孢桿菌木聚糖酶序列第110位的位置。
[0057] -方面，本發明涉及具有木聚糖酶活性並且包含胺基酸序列的多肽，所說胺基酸 序列與SEQ ID No. 1具至少88%同一性或與選自SEQ ID No. 2-22之胺基酸序列具至少 75%同一性，並且該多肽在第110位具有胺基酸修飾，其中所說的第110位通過序列比對確 定為相應於SEQ ID No. 1所示之枯草芽孢桿菌木聚糖酶序列第110位的位置。
[0058] 本發明所述多肽內的特定胺基酸位置是利用標準序列比對工具通過將所說多肽 的胺基酸序列與SEQ ID No. 1進行比對而確定的，譬如用Smith-Waterman運算法則或用 CLUSTALW2運算法則比對兩個序列，其中當比對得分最高時認為所述序列是對準的。比對得 分可依照 Wilbur, W. J. and Lipman, D. J. (1983) Rapid similarity searches of nucleic acid and protein data banks. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 80:726-730 中所述的方法進行 計算。在ClustalW2(l. 82)運算法則中優選使用默認參數：蛋白質缺口開放罰分=10. 0 ; 蛋白質缺口延伸罰分=〇. 2 ;蛋白質矩陣=Gonnet ;蛋白質/DNA端隙=-1 ;蛋白質/DNA GAPDIST = 4.
[0059] 優選用AlignX程序（vectorNTI組中的一部分）以適於多重比對的默認參數（缺 口開放罰分：IOog缺口延伸罰分0.05)通過將多肽的胺基酸序列與SEQ ID No. 1進行比對 來確定本發明所述多肽內特定胺基酸的位置。對於本發明所述的某些實施方案而言，可如 本文圖2所述進行序列比對。
[0060] 在進一步的方面，本發明涉及具有木聚糖酶活性並且包含與SEQ ID No. 1具至少 88%同一性之胺基酸序列的多肽，並且該多肽在第110位具有胺基酸修飾，其中所說的第 110位通過序列比對確定為相應於SEQ ID No. 1所示之枯草芽孢桿菌木聚糖酶序列第110 位的位置。
[0061] 在進一步的方面，本發明涉及具有木聚糖酶活性並且與SEQ ID No. 2具至少75% 同一性的多肽，並且該多肽在第110位具有胺基酸修飾，其中所說的第110位通過序列比對 確定為相應於SEQ ID No. 1所示之枯草芽孢桿菌木聚糖酶序列第110位的位置。
[0062] 在進一步的方面，本發明涉及具有木聚糖酶活性並且與SEQ ID No. 3具至少75% 同一性的多肽，並且該多肽在第110位具有胺基酸修飾，其中所說的第110位通過序列比對 確定為相應於SEQ ID No. 1所示之枯草芽孢桿菌木聚糖酶序列第110位的位置。
[0063] 在進一步的方面，本發明涉及具有木聚糖酶活性並且與SEQ ID No. 4具至少75% 同一性的多肽，並且該多肽在第110位具有胺基酸修飾，其中所說的第110位通過序列比對 確定為相應於SEQ ID No. 1所示之枯草芽孢桿菌木聚糖酶序列第110位的位置。
[0064] 在進一步的方面，本發明涉及具有木聚糖酶活性並且包含與SEQ ID No. 1具至少 75%同一性之胺基酸序列的多肽，並且該多肽在第110位具有替換為選自下述的任一種不 同胺基酸殘基的胺基酸取代：穀氨酸、色氨酸、丙氨酸和半胱氨酸，其中所說的第110位通 過序列比對確定為相應於SEQ ID No. 1所示之枯草芽孢桿菌木聚糖酶序列第110位的位 置。
[0065] 除非另外聲明，否則術語關於胺基酸的"序列同一性"用於此處時指按照 (nMf-ndif) ? IOOAw計算的序列同一性，其中ndif是比對時兩個序列中不相同的殘基總 數目，而其中的nMf是其中一個序列的殘基數目。因此，胺基酸序列ASTDYWQNWT與序列 八5丁6￥^^_!'具有80%的序列同一性（11 (1" = 2和1^=10)。
[0066] 在某些實施方案中用常規方法確定序列同一性，例如Smith and Waterman, 1981，Adv. Appl. Math. 2:482,通過 Pearson&Lipman, 1988, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:2444 的搜索相似性方法，用 Thompson et al.，1994, Nucleic Acids Res 22:467380的CLUSTAL W運算法則，通過計算機化運行這些運算法則（Wisconsin Genetics 軟體包中的 GAP, BESTFIT, FASTA,和 TFASTA，Genetics Computer Group)。此外還可 使用其軟體可獲自美國國立生物技術信息中心（National Center for Biotechnology Information www. ncbi. nlm. nih. gov/)的 BLAST 運算法則（Altschul et al.，1990, Mol. Biol. 215:403-10)。在利用任何上述運算法則時，對於"窗口"長度、缺口罰分等使用默認 參數。
[0067] 術語"修飾"用於此處意指對選自SEQ ID NO: 1-22的多肽之任一胺基酸或胺基酸 序列的任何化學修飾，以及編碼所述多肽的DNA的遺傳操作。所述修飾可以是一個或多個 胺基酸的取代、刪除和/或插入以及一個或多個胺基酸側鏈的置換。在某些實施方案中，具 木聚糖酶活性的所述多肽相對於SEQ ID No. 1-22隻具有胺基酸取代。
[0068] 應當理解，在給定多肽中的"修飾"是相對於選自SEQ ID NO: 1-22之中的、與此給 定多肽具最高百分比序列同一性的多肽而言的。
[0069] 此說明書中所用有關胺基酸取代的術語如下。第一個字母代表特定序列某一位置 上天然存在的胺基酸。後面的數字代表相對於SEQ ID No. 1的位置。第二個字母代表取代 該天然胺基酸的不同胺基酸。譬如D11F/R122D/T110A，其中SEQ ID N0:1的第11位天冬氨 酸被苯丙氨酸取代，SEQ ID NO: 1的第122位精氨酸被天冬氨酸取代，第110位蘇氨酸被丙 氨酸取代，全部三個突變均在具木聚糖酶活性的同一多肽內。
[0070] 除了本發明所述具木聚糖酶活性之多肽內的胺基酸修飾之外，所述多肽可能還進 一步具有性質輕微的胺基酸取代，即不顯著影響蛋白質摺疊和/或活性的保守胺基酸取代 或插入；小的刪除，通常1至約30個胺基酸；小的氨基-或羧基-末端延伸，諸如氨基末端 甲硫氨酸殘基；長達約20-25個殘基的小接頭肽；或通過改變淨電荷或另一功能而方便純 化的小的延伸，諸如多聚組氨酸束、抗原性表位或結合結構域。
[0071] 保守取代的例子是鹼性胺基酸（精氨酸、賴氨酸和組氨酸）、酸性胺基酸（穀氨酸 和天冬氨酸）、極性胺基酸（穀氨醯胺和天冬醯胺）、疏水胺基酸（亮氨酸、異亮氨酸和纈氨 酸）、芳香族胺基酸（苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸）以及小胺基酸（甘氨酸、丙氨酸、絲氨酸、 蘇氨酸和甲硫氨酸）組內的取代。通常不改變比活性的胺基酸取代是本領域所已知的並可 參閱例如 H. Neurath and R.L. Hill, 1979, In, The Proteins, Academic Press, New York。 最普遍發生的交換是丙氨酸對絲氨酸、纈氨酸對異亮氨酸、天冬氨酸對穀氨酸、蘇氨酸對絲 氨酸、丙氨酸對甘氨酸、丙氨酸對蘇氨酸、絲氨酸對天冬醯胺、丙氨酸對纈氨酸、絲氨酸對甘 氨酸、酪氨酸對苯丙氨酸、丙氨酸對脯氨酸、賴氨酸對精氨酸、天冬氨酸對天冬醯胺、亮氨酸 對異亮氨酸、亮氨酸對纈氨酸、丙氨酸對穀氨酸以及天冬氨酸對甘氨酸。
[0072] 除了 20種標準胺基酸之外，非標準胺基酸（諸如4-羥脯氨酸、6-/V-甲基賴氨酸、 2_氨基異丁酸、異纈氨酸和a _甲基絲氨酸）可能取代野生型多肽的胺基酸殘基。有限數目 的非保守胺基酸、不是由遺傳密碼編碼的胺基酸以及非天然胺基酸可能取代胺基酸殘基。" 非天然胺基酸"在蛋白質合成後被修飾以及/或者在它們的側鏈具有不同於標準胺基酸側 鏈的化學結構。非天然胺基酸可化學合成，並優選的可商品化獲得，且包括哌啶酸、噻唑烷 羧酸、脫氫脯氨酸、3-和4-甲基脯氨酸和3, 3-二甲基脯氨酸。
[0073] 術語"宿主生物體"用於此處時包括可以接受包含編碼本發明所述多肽之多核苷 酸的核酸構建體或表達載體轉化、轉染、轉導等的任何細胞類型。
[0074] 就本發明目的而言，木聚糖酶意指具木聚糖酶活性的蛋白質或多肽。
[0075] 短語"具木聚糖酶活性的多肽"用於此處指在諸如本文所述之木聚糖酶測定中具 活性的任何蛋白質或多肽。
[0076] 木聚糖酶活性可以任何測定法來檢測，其中使用的底物包括木聚糖內的 1，4-P-D-木糖苷內鍵。測定中所用的pH和溫度是適合所述木聚糖酶的。譬如合適的pH 值是 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 或 11。譬如合適的溫度是 30, 35, 37, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70 或 80°C。 有不同類型的底物可用於測定木聚糖酶活性，例如Xylazyme片劑（交聯的染色木聚糖底 物，Megazyme, Bray, Ireland) 〇 [0077] 優選的，用以下測定法檢測木聚糖酶活性。
[0078] 木聚糖酶測定法（內-3 -1, 4-木聚糖酶活件）
[0079] 在此測定法中將樣品稀釋於檸檬酸（0. 1M)-磷酸氫二鈉（0. 2M)緩衝液pH 5. 0中 以達到大約OD59tl = 0. 7。將三個不同稀釋度的樣品在40°C預保溫5分鐘。在時間達到5分 鍾時，將1片Xylazyme片劑（交聯的染色的木聚糖底物，Megazyme, Bray, Ireland)加入反 應體積為Iml的酶溶液中。在時間達到15分鐘時通過加入IOml的2% TRIS/NaOH, pH 12 終止反應。用1000 緩衝液替代酶溶液製備空白。將反應混合物離心（150〇 X g，10分 鍾，20°C )並在590nm檢測上清液的0D。一個木聚糖酶單位（XU)定義為將OD59tl每分鐘升 高0.025的木聚糖酶活性。
[0080] 以上測定法中所用的底物（提取自小麥的交聯並染色的阿拉伯糖基木聚糖）非常 近似商業應用中的相應底物。
[0081] 可基於來自NC-IUBMB的酶命名法手冊（1992)將酶進一步的分類，也可參閱 ENZYME的網際網路網址：http://www. expasy. ch/enzyme/。ENZYME是與酶命名法有關的信息 庫。它主要基於國際生物化學和分子生物學協會（IUB-MB)命名委員會的推薦，並且描述了 對其已提供EC(Enzyme Commission)編號的每一類型的已定性酶（Bairoch A. The ENZYME database, 2000, Nucleic Acids Res 28:304-305)。此 IUB-MB 酶命名法是是以它們的底物 特異性為基礎的，有時候也以它們的分子機制為基礎；這樣的分類不反應這些酶的結構特 性。
[0082] 在本發明的一方面，木聚糖酶是歸類為EC 3. 2. 1. 8的酶。正式名稱是 內-1，4-0-木聚糖酶.系統名稱是1，4-0-〇-木聚糖酶（17]^]1171311〇117(11'〇1386)。 可能使用其它的名稱，諸如內-(1-4)-0-木聚糖酶；（1-4)-0-木聚糖4-木聚糖水解 酶（xylanohydrolase);內-1，4-木聚糖酶；木聚糖酶；@ -1，4-木聚糖酶；內-1，4-木 聚糖酶；內-3-1，4-木聚糖酶；內_1，4鄰-D-木聚糖酶；1，4-3-木聚糖酶（xylan xylanohydrolase) ; 0 -木聚糖酶；0 _1，4-木聚糖酶（xylan xylanohydrolase); 內-1，4-0-木聚糖酶；3-D-木聚糖酶。催化的反應是木聚糖內1，4-P-D-木糖苷鍵的內 水解。
[0083] 在幾年前已提出在基於胺基酸序列相似性的家族內對某些糖苷水解酶進 行另外的分類，諸如內切葡聚糖酶、木聚糖酶、半乳聚糖酶、甘露聚糖酶、葡聚糖酶 和a-半乳糖苷酶。它們目前屬於90個不同的家族：參閱CAZy(ModO)網際網路址 (Coutinho，P.M. SHenrissat, B. (1999)碳水化合物活性酶伺服器（Carbohydrate-Active Enzymes server)在:http://afmb. cnrs-mrs. fr/-cazy/CAZY/index, html(相應文 獻:Coutinho, P. M. &Henrissat, B. (1999)Carbohydrate-active enzymes: an integrated database approach。 在 ''Recent Advances in Carbohydrate Bioengineering"，HJ. Gilbert,G.Davies, B. Henrissat and B.Svensson 編輯,The Royal Society of Chemistry, Cambridge,pp.3-12 ；Coutinho, P. M.&Henrissat,B. (1999)The modular structure of cellulases and other carbohydrate-active enzymes: an integrated database approach 中。 在 ''Genetics, Biochemistry and Ecology of Cellulose Degradation^. , K. Ohmiya, K. Hayashi, K. Sakka, Y. Kobayashi, S. Karita and T. Kimura eds. , Uni Publishers Co. , Tokyo, pp. 15-23 中）。
[0084] 本發明的一方面，本發明的木聚糖酶是糖苷水解酶（GH)家族11的木聚糖酶。術 語"糖苷水解酶（GH)家族11的"意指所述木聚糖酶是或者可歸類於GH家族11。
[0085] 應當理解蛋白質相似性搜索（類似例如http: //toolkit, tuebingen. mpg.de/ prot_blast上的ProteinBlast)可能不必確定未知序列實際上是否落在GHll木聚糖酶家 族成員的範疇內。用blast搜索找到的蛋白質序列可能具有相對高的同一性/同源性但仍 然不是真實的木聚糖酶，而且更進一步的，不是屬於GHll的木聚糖酶。或者，蛋白質序列可 能具有相對低的一級胺基酸序列同一性但仍是GHll木聚糖酶家族的成員。為了確定未知 蛋白質序列實際上是否是GHll家族內的木聚糖酶蛋白質，要進行評估，不只對序列的相似 性，而且還對3D-結構的相似性評估，因為GH-家族內的分類取決於3D摺疊。可預測未知 蛋白質序列之 3D 摺疊的軟體是 HHpred(http: //toolkit, tuebingen. mpg. de/hhpred)。此 軟體用於蛋白質結構預測的能力依賴於用已知結構作為模板鑑定同源序列。此軟體運行良 好，因為結構趨異比一級序列要慢得多。同一家族的蛋白質可能具有非常相似的結構，即便 是當它們的序列趨異到無法認出的時候。
[0086] 在實踐中，可將未知序列以FASTA格式粘貼到軟體(http://toolkit, tuebingen. mpg.de/hhpred)中。做完此步後，提交搜索。搜索輸出信息將顯示具有已知3D結構的序列 清單。為了證實未知序列真的是GHll木聚糖酶，應在具有大於90的可能性的同源物清單 內找到GHll木聚糖酶。並非所有被鑑定為同源物的蛋白質都會被定性為GHll木聚糖酶， 而是某些會。後者的蛋白質是具有已知結構以及鑑定其為木聚糖酶之生化特性的蛋白質。 前者則沒有在生化上被定性為GHii木聚糖酶。有多篇文獻描述了此流程，諸如Sdding J. (2005)Protein homology detection by HMM-HMM comparison. Bioinformatics 21，951-960(doi:10. 1093/bioinformatics/btil25)和S6dillg J，Biegert A，and Lupas AN. (2005)The HHpred interactive server for protein homology detection and structure prediction. Nucleic Acids Research 33, W244-W248(Web Server issue) (doi:10. 1093/nar/gki40) 〇
[0087] 依照Cazy(ModO)位點，家族11糖苷水解酶可定性如下：
[0088] 已知活性：木聚糖酶（EC 3. 2. 1. 8)
[0089] 機制：保留
[0090] 催化親核物質/鹼基：穀氨酸（實驗性的）
[0091] 催化質子供體：穀氨酸（實驗性的）
[0092] 3D結構狀態：摺疊：3 -果凍卷（3 - jelly roll)
[0093] 家族：GH-C
[0094] 用於此處時，〃家族C〃指享有共同的三維摺疊和相同的催化機制的家族類型（參 閱，例如 Henrissat, B. and Bairoch, A.，（1996) Biochem. J.，316, 695-696)。
[0095] 用於此處時，〃家族 11〃 指 Henrissat and Bairoch(1993)Biochem J.，293, 781-788 所確立的一個酶家族（還可參閱 Henrissat and Davies (1997) Current Opinion in Structural Biol. 1997，&:637_644)。家族11成員的共同特徵包括高度遺傳同 源性，大約20kDa的大小以及雙重取代催化機制（參閱Tenkanen et al.，1992 ;Wakarchuk et al.，1994)。家族11木聚糖酶的結構包括由￠-鏈組成的兩個大的￠-片層和a-螺 旋。
[0096] 家族11木聚糖酶包括但不局限於以下：黑麴黴（Aspergillus niger) XynA> 白麴黴(Aspergillus kawachiir)XynC> Aspergillus tubigensis XynA,環 狀芽抱桿菌（Bacillus circulans)XynA、Bacilluspunzilus XynA,枯草芽抱桿菌 XynA, Neocalliniastix patriciarum XynA,變鉛青鏈黴菌（Streptomyces Iividans) XynB,變鉛青鏈黴菌（Streptomyces lividans) XynC, Streptomyces therinovioIaceus XynII,赫色嗜熱單抱菌（Thermomonospora fusca)XynA,哈茨木黴（Trichoderma harzianum)Xyn, Tyichoderma reesei XynI,裡氏木黴（Trichoderma reesei)XynII,綠色 木黴（Trichodermaviride)Xyn0
[0097] 用於此處時，"野生型"指天然的或自然存在的序列或蛋白質。
[0098] 在另一具體實施方案中，本發明的木聚糖酶來源於細菌木聚糖酶，例如來自 ⑴厚壁菌門；（ii)芽孢桿菌綱；（iii)芽孢桿菌目；（iv)類芽孢桿菌科；或（V)類芽孢 桿菌屬的細菌；例如來自（vi)類芽孢桿菌（Paenibacillus pabuli),多粘類芽孢桿菌 (Paenibacillus polymyxa)或類芽抱桿菌種（Paenibacillus sp.)的細菌；例如來自 (vii)類芽孢桿菌或多粘類芽孢桿菌（Paenibacillus polymyxa)的菌株。
[0099] 表述〃衍生自細菌木聚糖酶的木聚糖酶〃用於此處時包括分離自所述細菌的任何 野生型木聚糖酶，及其保持木聚糖酶活性的變體或片段。
[0100] 在進一步的具體實施方案中，本發明的木聚糖酶衍生自真菌木聚糖酶。
[0101] 上述〃衍生自〃的定義（在細菌木聚糖酶的上下文中）也可類推適用於真菌木聚 糖酶.
[0102] 舉例而言，家族11糖苷水解酶的真菌木聚糖酶是可衍生自以下真菌屬的那些類 型：麴黴屬（Aspergillus),短梗黴屬（Aureobasidium),裸胞殼屬（Emericella),鐮孢菌 (Fusarium),頂囊殼屬（Gaeumannomyces),腐殖黴屬（Humicola),香燕屬（Lentinula), 稻癌菌屬（Magnaporthe) ,Neocallimastix,擬諾卡氏菌屬（Nocardiopsis) ,Orpinomyces, 擬青黴屬（Paecilomyces),青黴屬（Penicillium),畢赤酵母屬（Pichia),裂裙菌屬 (Schizophyllum),踩節菌屬（Talaromyces),嗜熱真菌屬（Thermomyces),木黴菌屬 (Trichoderma)〇
[0103] 真菌木聚糖酶包括酵母和絲狀真菌木聚糖酶。在某些實施方案中，木聚糖酶是衍 生自⑴子囊菌門；（ii)盤菌綱；（iii)散囊菌目；（iv)散囊菌亞目；(V)發菌科的真菌，例 如絲抱發菌（mitosporic Trichocomaceae);或來自（vi)麴黴屬（Aspergillus)的真菌； 例如來自（vii)黑麴黴（Aspergillus niger)的菌株。應當理解前述物種的定義包括完美 的和不完美的狀態，以及其它的分類學對等物例如變形物，不管它們已知的物種名稱為何。 本領域技術人員應容易認知合適的對等物的身份。
[0104] 上述細菌和真菌菌株是公眾在許多培養物收藏中心可方便獲得的，諸如美國典型 培養物保藏中心（American Type Culture Collection, ATCC),德國微生物菌種保藏中 心（Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH, DSMZ),荷蘭微 生物菌種保藏中心（Centraalbureau Voor Schi_elcultures，CBS)和農業研究服務專 利培養物保藏中心北方區研究中心（Agricultural Research Service Patent Culture Collection, Northern Regional Research Center, NRRL)〇
[0105] 涉及分類學的問題可查閱分類學資料庫諸如可從以下網址獲得的NCBI分類學瀏 覽器：http://www. ncbi. nlm. nih. gov/分類學/分類學home, html/。不過，優選參考以 下手冊！Dictionary of the Fungi, 9th edition, edited by Kirk, P. M. , P. F. Cannon, J. C.David&J. A. Stalpers，CAB Publishing, 2001;和 Bergey，s Manual of Systematic Bacteriology, Second edition(2005)〇
[0106] 本發明涉及在某些胺基酸位置的修飾。這些位置是參考SEQ ID No. I所示的枯草 芽孢桿菌胺基酸序列而列出的。在本發明中，具木聚糖酶活性的多肽至少在相較於SEQ ID No. 1所示之枯草芽孢桿菌序列的第110位具有修飾。可能通過將其它家族11木聚糖酶與 SEQ ID No. 1進行比對並確定哪一個胺基酸對準SEQ ID No. 1的特定胺基酸來找到在其它 家族11木聚糖酶中的同等位置（例如，參閱實施例5)。以某一序列作為第一參照的所述比 對和用法對於本領域普通技術人員而言僅僅是例行公事而已。
[0107] 一方面，本發明所述的木聚糖酶變體具有提高的麩皮溶解活性，該活性在"麩皮溶 解測定法"中高於使用相應野生型木聚糖酶或包含選自SEQ ID No. 2-22中之胺基酸序列的 任一木聚糖酶所獲得的活性。
[0108] 一方面，本發明所述木聚糖酶具有由於第110位的修飾而造成的提高的麩皮溶解 活性。
[0109] 適當的，可用本文所提供的麩皮溶解測定法檢測木聚糖酶麩皮溶解活性。由此，可 提供具增加的木聚糖酶活性和/或增加的麩皮溶解活性的多肽。對WU-AX特異性的需求越 來越重要，因為許多應用是使用濃度提高的穀類麩皮。由於健康和營養的問題，麵包製造 業在許多產品中提高了麩皮濃度，由於在例如生物乙醇生產中使用穀類，飼料工業摻入了 數量越來越多的麩皮物質（纖維，具有可溶物的幹酒糟（Distilers Dried Grains with Solubles，DDGS))。因此提供特異性增加且由此溶解此麩皮物質的效率增高的新木聚糖酶 是有利的。
[0110] 麩皮溶解測定法
[0111] 優選的，用以下測定法檢測麩皮溶解度。
[0112] 在（0. IM)-磷酸氫二鈉（0. 2M)緩衝液，pH 5. 0中製備小麥麩皮懸浮液至濃度 1. 33%麩皮（w/w)。從此懸浮液中，邊攪拌邊將750 ii 1的等分試樣轉移入Eppendorph管 中。將每個底物管在40°C預熱5分鐘。至此，加入250 ill酶溶液，使底物終濃度達到1 %。 從每一種木聚糖酶製備三個稀釋度的稀釋液（一式兩份），對於每個測定時間點（〇, 30, 60 和240分鐘）具有逐步增加的酶濃度（0. 33、I. 0和3. 0 ii g木聚糖酶/克麩皮）。使用木聚 糖酶熱變性溶液作為空白。在給定的時間通過將管子轉移至設置為95°C的孵育器上終止反 應。熱變性樣品保存於4°C直至所有的酶反應終止。當所有的酶反應終止時，將Eppendorph 管離心以獲取清澈的上清液。酶溶解麩皮的能力表現為用PAHBAH測定的還原端基的增加 (Lever, 1972)〇
[0113] 由於附帶的活性例如澱粉酶活性可能干擾以上測定法，所以麩皮溶解測定法應只 用純化後的木聚糖酶樣品進行（見實施例2)。
[0114] 一方面,本發明所述木聚糖酶與任一野生型木聚糖酶或含有選自SEQ ID No. 2-22 之胺基酸序列的任一木聚糖酶相比對木聚糖酶抑制劑的敏感性降低。
[0115] 在進一步的方面，由於在第110位的修飾聯合以下任一個或多個胺基酸位置處的 一個或多個修飾，所述本發明木聚糖酶活性的多肽對木聚糖酶抑制劑的敏感性下降：11，12 ，13, 34, 54, 77, 81，99, 104, 113, 114, 118, 122, 141，154, 159, 162, 164, 166 和 175。
[0116] 所述抑制劑可以是在植物組織中自然發現的抑制劑。
[0117] 用於此處時，術語"木聚糖酶抑制劑"指其作用為控制植物細胞壁中所存在的複雜 碳水化合物例如阿拉伯糖基木聚糖解聚的化合物，通常是蛋白質。這些木聚糖酶抑制劑能 降低自然存在的木聚糖酶以及真菌或細菌來源木聚糖酶的活性。已報導在穀類種子中有木 聚糖酶抑制劑的存在（參閱例如 McLauchlan et al 1999a ;Rouau and Suget 1998)。
[0118] McLauchlan等（1999a)公開了來自小麥且結合併抑制兩種家族-11木聚糖酶 的蛋白質的分離和定性。同樣地，WO 98/49278證實了小麥麵粉提取物對均歸類於家族 11木聚糖酶的一組微生物木聚糖酶活性的影響。Debyser等（1999)也公開了來自黑曲 黴（Aspergillus niger)和枯草芽孢桿菌的內木聚糖酶，它們都是被小麥木聚糖酶抑制劑 TAXI所抑制的家族11木聚糖酶成員。McLauchlan等（1999b)講述了來自商品化麵粉諸如 小麥、大麥、黑麥和玉米的提取物能抑制家族10和11木聚糖酶。
[0119] 所述木聚糖酶抑制劑可以是任何合適的木聚糖酶抑制劑。舉例而言，所述木 聚糖酶抑制劑可能是W0-A-98/49278中所述的抑制劑和/ *Rouau，X.andSurget，A. (1998)，McLauchlan, R.，et al. (1999)所述的木聚糖酶抑制劑和/或英國專利申請號 9828599. 2(於1998年12月23日遞交）、英國專利申請號9907805. 7(於1999年4月6日 遞交）和英國專利申請號9908645.6(於1999年4月15日遞交）中所述的木聚糖酶抑制 劑。
[0120] 在現有技術中所描述的抑制劑也可用於測定法中以確定本發明變體多肽對木聚 糖酶抑制劑的敏感性。它們也可如下文所述用於調節木聚糖酶的功能性。
[0121] 木聚糖酶抑制劑測定法
[0122] 優選的，用以下測定法檢測木聚糖酶抑制活性。
[0123] 將100 抑制劑製品（包含多個濃度的木聚糖酶抑制劑（對於定量，參閱下文的 木聚糖酶抑制劑定量））、250 ill木聚糖酶溶液（含12XU木聚糖酶/ml)和650 ill緩衝液 (〇? IM 檸檬酸-0? 2M 磷酸氫二鈉緩衝液，1% BSA(Sigma-Aldrich，USA), pH 5. 0)混合。混合 物在40. (TC恆溫5分鐘。在時間為5分鐘時加入一片Xylazyme片劑。在時間為15分鐘 時通過加入IOml 2%TRIS/Na0H，pH 12終止反應。將反應混合物離心（1500x g，10分鐘， 20°C)並在590nm檢測上清液。木聚糖酶抑制計算為與空白相比較而言的殘留活性百分數。
[0124] 所用的內源內_ P -1，4-木聚糖酶抑制劑可獲自小麥麵粉。該抑制劑是二肽，分子 量約為40kDa(根據SDS-PAGE或質譜檢測）且等電點約為8至9. 5。迄今為止的序列分析 顯示所述抑制劑具有SEQ ID No. 24所示序列或與其高度同源。
[0125] 對給定抑制劑製品中的抑制劑濃度進行定量的方法可參閱實施例3。
[0126] 以同樣方式製備空白，但以水替代抑制劑溶液。
[0127] 本發明還涉及編碼本發明所述多肽的核苷酸序列，其包含與一個或多個控制序列 可操作性連接的核苷酸序列，所述控制序列在與該控制序列相容的條件下指導編碼序列在 合適的宿主細胞內的表達。可以多種方式處理編碼本發明多肽的多核苷酸以提供所述多肽 的表達。在其插入載體之前處理多核苷酸的序列可能是值得做的或必需的，這取決於表達 載體。利用重組DNA方法修飾多核苷酸序列的技術是本領域眾所周知的。
[0128] 控制序列可能是適當的啟動子序列，被宿主細胞識別用於表達編碼本發明多肽之 多核苷酸的核苷酸序列。啟動子序列包含介導多肽表達的轉錄調控序列。啟動子可以是在 選定宿主細胞內顯示轉錄活性的任何核苷酸序列，包括突變的、截短的和雜合的啟動子，並 且可能獲自與宿主細胞同源或異源之編碼細胞外或細胞內多肽的基因。
[0129] 指導本發明核酸構建體轉錄，尤其是在細菌宿主細胞內轉錄的合適啟動 子是獲自以下來源的啟動子：大腸桿菌Iac操縱子、天藍色鏈黴菌（Streptomyces coelicolor)瓊脂糖酶基因（dagA),枯草芽孢桿菌果聚糖鹿糖酶基因（sacB),地衣 芽孢桿菌（Bacillus licheniformis) a -澱粉酶基因（amyL)，脂肪嗜熱芽孢桿菌 (Bacillus stearothermophilus)麥芽澱粉酶基因{amyM),解澱粉芽抱桿菌（Bacillus amyloliquefaciens) a-澱粉酶基因{amyQ),地衣芽抱桿菌（Bacillus licheniformis) 青黴素酶基因（penP)，枯草芽孢桿菌xylA和xylB基因，和原核￠-內醯胺酶基因 (Villa-Kamaroff et al. , 1978, Proceedings of the National Academy of Sciences USA 75:3727-3731)，以及 tac 啟動子（DeBoer et al., 1983, Proceedings of the National Academy of Sciences USA 80:21-25)。更多的啟動子參閱"Useful proteins from recombinant bacteria〃in Scientific American, 1980, 242:74-94 ；以及 Sambrook et al. , 1989,見上文。
[0130] 指導本發明核酸構建體在絲狀真菌宿主細胞內轉錄的合適啟動子的例子是獲 自以下來源基因的啟動子：米麴黴（Aspergi I Ius oryzae) TAKA澱粉酶，米黑根毛黴 (Rhizomucor miehei)天冬氨酸蛋白酶，黑麴黴（Aspergillus niger)中性a-澱粉酶， 黑麴黴（Aspergillus niger)酸穩定a-澱粉酶，黑麴黴（Aspergillus niger)或泡盛曲 黴（Aspergillus awamori)葡糖澱粉酶{glaA),米黑根毛黴（Rhizomucor miehei)脂肪 酶，米麴黴（Aspergillus oryzae)喊性蛋白酶，米麴黴（Aspergillus oryzae)憐酸丙 糖異構酶，構巢麴黴（Aspergillus nidulans)乙醜胺酶，鎌抱黴（Fusarium venenatum) 澱粉葡糖苷酶（W000/56900),鎌抱黴（Fusarium venenatum) Daria (W0 00/56900)，鎌抱 黴（Fusarium venenatum) Quinn (W0 00/56900)，尖抱鎌刀菌（Fusarium oxysporum)膜蛋 白酶樣蛋白酶（W0 96/00787)，瑞氏木黴（Thchoderma reesei)0-葡萄糖苷酶，裡氏木 黴（Trichoderma reesei)纖維二糖水解酶 I，裡氏木黴（Trichoderma reesei)纖維二 糖水解酶II，裡氏木黴（Trichoderma reesei)內切葡聚糖酶I，裡氏木黴（Trichoderma reesei)內切葡聚糖酶II，裡氏木黴（Trichoderma reesei)內切葡聚糖酶III，裡氏木黴 (Trichoderma reesei)內切葡聚糖酶IV，裡氏木黴（Trichoderma reesei)內切葡聚糖酶 V，裡氏木黴（Trichoderma reesei)木聚糖酶I，裡氏木黴（Trichoderma reesei)木聚糖 酶II，裡氏木黴（Trichoderma reesei) ￠-木糖苷酶，以及NA2-tpi啟動子（來自黑麴黴 (Aspergillus niger)中性a-澱粉酶和米麴黴（Aspergillus oryzae)磷酸丙糖異構酶基 因的啟動子的雜合體）；以及它們的突變的、截短的和混合的啟動子。
[0131] 在酵母宿主中，有用的啟動子獲自以下酶的基因：釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae)烯醇化酶（EN0-1),釀酒酵母半乳糖激酶（GAL1),釀酒酵母乙醇脫氫 酶/甘油醛-3-磷酸脫氫酶（ADHl, ADH2/GAP),釀酒酵母磷酸丙糖異構酶（triose phosphate isomerase, TPI),釀酒酵母金屬硫蛋白（CUPl),和釀酒酵母3-磷酸甘油酸激 酶（Phosphoglycerate kinase)。其它適於酵母宿主細胞的有用啟動子參閱Romanos et al.， 1992,Yeast 8:423-488。
[0132] 調控序列也可以是合適的轉錄終止子序列，被宿主細胞識別來終止轉錄的序列。 終止子序列與編碼所述多肽之核苷酸序列的3'末端可操作性的連接。在選定宿主細胞內 起作用的任何終止子均可用於本發明中。
[0133] 適於絲狀真菌宿主細胞的終止子可獲自以下酶的有關基因：米麴黴（Aspergillus oryzae)TAKA澱粉酶，黑麴黴（Aspergillus niger)葡糖澱粉酶，構巢麴黴（Aspergillus nidulans)鄰氨基苯甲酸合酶（anthranilate synthase),黑麴黴（Aspergillus niger) a-葡萄糖苷酶，和尖孢鐮刀菌（Fusarium oxysporum)胰蛋白酶樣蛋白酶。適合酵母 宿主細胞的終止子可獲自釀酒酵母烯醇化酶，釀酒酵母細胞色素C(CYCl)，和釀酒酵母 甘油醛-3-磷酸脫氫酶的基因。其它適於酵母宿主細胞的有用終止子參閱Romanos et al.，1992,見上文。
[0134] 調控序列也可能是合適的前導序列，即對於宿主細胞的翻譯而言非常重要的mRNA 非翻譯區。前導序列與編碼所述多肽之核苷酸序列的5'末端可操作性連接。在選定宿主 細胞內起作用的任何前導序列均可用於本發明中。
[0135] 適於絲狀真菌宿主細胞的前導序列可獲自米麴黴（Aspergillus oryzae)TAKA澱 粉酶和構巢麴黴（Aspergillus nidulans)磷酸丙糖異構酶的基因。
[0136] 適於酵母宿主細胞的前導序列可獲自釀酒酵母烯醇化酶（EN0-1)，釀酒酵母3-磷 酸甘油酸激酶（Phosphoglycerate kinase),釀酒酵母a-因子和釀酒酵母乙醇脫氫酶/ 甘油醛-3-磷酸脫氫酶（ADH2/GAP)的基因。
[0137] 調控序列還可以是聚腺苷酸化序列，即是與核苷酸序列的3'末端可操作性連接 並且在轉錄時被宿主細胞識別為添加聚腺苷酸殘基至被轉錄mRNA的信號的序列。在選定 宿主細胞內起作用的任何聚腺苷酸化序列均可用於本發明中。
[0138] 適於絲狀真菌宿主細胞的聚腺苷酸化序列可獲自米麴黴（Aspergillus oryzae) TAKA澱粉酶，黑麴黴（Aspergillus niger)葡糖澱粉酶，構巢麴黴（Aspergillus nidulans)鄰氨基苯甲酸合酶（anthranilate synthase),尖抱鎌刀菌（Fusarium oxysporum)胰蛋白酶樣蛋白酶，和黑麴黴屬（Aspergillus niger) a-葡萄糖苷酶的有關 基因。
[0139] 用於酵母宿主細胞的聚腺苷酸化序列參閱Guo and Sherman, 1995，Molecular Cellular Biology 15:5983-5990。
[0140] 調控序列也可以是編碼與多肽的氨基末端連接之胺基酸序列並指導所編碼多肽 進入細胞分泌途徑的信號肽編碼區。核苷酸序列的編碼序列的5'末端可能固有的包含在 翻譯讀碼框架內與編碼所述分泌多肽之編碼區部分天然連接的信號肽編碼區。或者，編碼 序列的5'末端可能包含對於編碼序列而言是外來的信號肽編碼區。在編碼序列天然不包 含信號肽編碼區的情況下可能需要外源的信號肽編碼區。或者，外源的信號肽編碼區可能 簡單地替代天然信號肽編碼區以便促進所述多肽的分泌。無論如何，指導被表達多肽進入 選定宿主細胞之分泌途徑即分泌入培養基中的任何信號肽編碼區均可能用於本發明中。
[0141] 適於細菌宿主細胞的有效信號肽編碼區是獲自以下有關基因的信號肽編碼 區：芽孢桿菌（Bacillus)NCIB 11837麥芽糖源澱粉酶，脂肪嗜熱芽孢桿菌（Bacillus stearothermophilus) a-澱粉酶，地衣芽抱桿菌（Bacillus licheniformis)枯草桿菌 蛋白酶（subtilisin),地衣芽孢桿菌（Bacillus licheniformis) 內醯胺酶，脂肪嗜 熱芽抱桿菌（Bacillus stearothermophilus)中性蛋白酶（nprT，nprS，nprM),和枯草芽 抱桿菌 prsA。更多的信號膚參閱 Simonen and Palva, 1993, Microbiological Reviews 57:109-137。
[0142] 適於絲狀真菌宿主細胞的有效信號肽編碼區是獲自以下有關基因的信號肽編碼 區：米麴黴（Aspergillus oryzae)TAKA 澱粉酶，黑麴黴（Aspergillus niger)中性澱粉 酶，黑麴黴（Aspergillus niger)葡糖澱粉酶，米黑根毛黴（Rhizomucor miehei)天冬氨 酸蛋白酶，特異腐質黴（Humicola insolens)纖維素酶，特異腐質黴（Humicola insolens) 內切葡聚糖酶V，和腐柔毛腐質黴（Humicola lanuginosa)脂肪酶.
[0143] 適於酵母宿主細胞的有用信號肽獲自釀酒酵母a-因子和釀酒酵母轉化酶的基 因。其它有效的信號肽編碼區參閱Romanos et a/.，1992,見上文。
[0144] 調控序列還可以是編碼定位於多肽氨基末端的胺基酸序列的前肽編碼區。所產 生的多肽被認為是前酶或多肽原（或在某些情況下是酶原）。多肽原通常是無活性的，但 可通過從多肽原催化性或自身催化性切割前肽而轉變為成熟的活性多肽。前肽編碼區可 能獲自以下編碼下述的基因：枯草芽孢桿菌鹼性蛋白酶（aprE)，枯草芽孢桿菌中性蛋白酶 (nprf),釀酒酵母a-因子，米黑根毛黴（Rhizomucor miehei)天冬氨酸蛋白酶，和嗜熱 毀絲黴（Myceliophthora thermophila)漆酶（W095/33836)。
[0145] 當信號肽和前肽區均存在於多肽的氨基末端時，前肽區定位在緊鄰多肽的氨基末 端，而信號肽區則定位於緊鄰前肽區的氨基末端。
[0146] 還可適當的添加允許所述多肽表達相對於宿主細胞的生長進行調節的調節序列。 調節系統有例如使得基因表達響應化學或物理刺激物（包括調節化合物的存在）而開啟或 關閉的調節系統。在原核體系內的調節系統包括lac，tec，和tip操縱子系統。在酵母內， 可用ADH2系統或GALl系統。在絲狀真菌內，TAKA a-澱粉酶啟動子，黑麴黴（Aspergillus niger)葡糖澱粉酶啟動子和米麴黴（Aspergillus oryzae)葡糖澱粉酶啟動子可用作調控 序列。其它的調控序列的例子有允許進行基因擴增的那些調控序列。在真核體系內，這些 包括在氨甲喋呤存在下被擴增的二氫葉酸還原酶基因，由於重金屬而被擴增的金屬硫蛋白 基因。在這些案例中，編碼多肽的核苷酸序列將可操作性的與所述調控序列連接。
[0147] 本發明還涉及包含編碼本發明多肽之多核苷酸、啟動子以及轉錄和翻譯終止信號 的重組表達載體。本文所述的各種核酸和調控序列可結合在一起以產生重組表達載體，它 可能包含一個或更多個方便的限制性位點以便在所述位點對編碼所述多肽的核苷酸序列 進行插入或取代。或者，編碼本發明所述多肽的核苷酸序列可通過將核苷酸序列或包含該 序列的核酸構建體插入適於表達的合適載體進行表達。在構建表達載體時，編碼序列位於 所述載體內以便編碼序列與用於表達的適當調控序列可操作性的連接。
[0148] 重組表達載體可能是可方便進行重組DNA操作並可使核苷酸序列表達的任何載 體（例如，質粒或病毒）。載體的選擇通常取決於載體與該載體待引入之宿主細胞的相容 性。所述載體可能是線性的或閉環的質粒。
[0149] 載體可能是自主複製載體，即作為染色體外實體存在的載體，它的複製不依賴於 染色體的複製，例如質粒、染色體外元件、微型染色體或人工染色體。該載體可能包含保證 自我複製的任何工具。或者，所述載體可能是當引入宿主細胞時被整合入基因組中並與其 所整合入的染色體一起複製的載體。此外，可使用單個載體或質粒或者一起包含待引入宿 主細胞基因組之總DNA的兩個或更多個載體或質粒，或者轉座子。
[0150] 本發明的載體優選包含一個或更多個可選擇標記，它們可允許方便地選擇被轉 化、被轉染、被轉導等等的細胞。可選擇標記是其產物提供了殺菌劑或病毒抗性、抵抗重金 屬、給營養缺陷型提供原養型等等的基因。
[0151] 細菌可選擇標記的例子有來自枯草芽孢桿菌或地衣芽孢桿菌（Bacillus licheniformis)的dal基因，或賦予抗生素抗性諸如氨節青黴素、卡那黴素、氯黴素或四 環素抗性的標記。適於酵母宿主細胞的標記物有ADE2, HIS3, LEU2, LYS2, MET3, TRPl和 URA3。適用於絲狀真菌宿主細胞的可選擇標記包括但不局限於amdS (乙醯胺酶），argB (鳥 氨酸氨基甲醯轉移酶），bar (草胺膦乙醯轉移酶），hph(潮黴素磷酸轉移酶），niaD(硝 酸還原酶），PyrG (乳清酸核苷-5' -磷酸脫羧酶），sC (硫酸腺苷轉移酶（sulfate adenyltransferase))和 trpC(鄰氨基苯甲酸合酶（anthranilate synthase))及其它們的 對等物。在某些實施方案中，構巢麴黴（Aspergillus nidulans)或米麴黴（Aspergillus oryzae)的 amdS 和 pyrG 基因以及吸水鏈黴菌（Streptomyces hygroscopicus)的 bar 基因 被用於麴黴（Aspergillus)細胞中。
[0152] 本發明的載體優選包含允許載體整合入宿主細胞基因組或在細胞內不依賴於基 因組而自主複製的元件。對於整合進入宿主細胞基因組的方面，所述載體可依靠編碼多肽 的多核苷酸序列或適於通過同源或非同源重組整合入基因組的載體的任何其它元件。或 者，載體可包含用於指導在染色體的準確位置通過同源重組整合入宿主細胞基因組的附加 的核苷酸序列。為了提高在準確位置處整合的可能性，整合元件應優選包含足夠數目的核 酸，譬如100至10, OOO個鹼基對，優選400至10, OOO個鹼基對，更優選800至10, OOO個鹼 基對，它們與相應的靶序列具有高度的同一性以提高同源重組的概率。整合元件可能是與 宿主細胞基因組內靶序列同源的任何序列。此外，整合元件可能是非編碼的或編碼的核苷 酸序列。另一方面，載體可能通過非同源重組整合入宿主細胞的基因組內。對於自主複製 而言，載體可能進一步包含能使載體在所述宿主細胞內自主複製的複製起點。複製起點可 能是在細胞內發揮作用的介導自主複製的任何質粒複製子。術語"複製起點"或"質粒復 制子"在此定義為能使質粒或載體在體內進行複製的核苷酸序列。
[0153] 細菌複製起點的例子有允許在大腸桿菌中複製的質粒pBR322, pUC19, pACYC177， 和PACYC184的複製起點，以及允許在芽孢桿菌（Bacillus)中進行複製的 pUB110，pE194，pTA1060,和 pAMP i 的複製起點。
[0154] 適於用在酵母宿主細胞內的複製起點有例如2 ii複製起點、ARS1、ARS4、ARSl和 CEN3的組合以及ARS4和CEN6的組合。
[0155] 可用於絲狀真菌細胞內的複製起點有例如AMAl和ANSI (Gems et a/.，1991，Gene 98:61-67 ;Cullen et al.， 1987,Nucleic Acids Research 15:9163-9175 ;W0 00/24883)。 AMl基因的分離和包含該基因的質粒或載體的構建可依照WO 00/24883中所公開的方法 完成。
[0156] 可將一拷貝以上的本發明之多核苷酸插入宿主細胞中以提高基因產物的產量。可 通過將至少一個額外拷貝的序列整合入宿主細胞基因組中或者通過將可擴增的可選擇標 記基因與所述多核苷酸包含在一起來達到多核苷酸拷貝數目的增加，在後一情形下，包含 擴增拷貝的選擇標記基因以及由此而來的附加拷貝的多核苷酸的細胞可通過在適當的可 選擇製劑存在的條件下人工培養所述細胞進行選擇。
[0157] 用於連接上述元件以構建本發明之重組表達載體的程序是本領域技術人員眾所 周知的（參閱，例如Sambrook et al.，1989，見上文）。
[0158] 本發明還涉及重組宿主細胞，其中包含編碼本發明多肽的多核苷酸，它被方便的 用於所述多肽的重組生產中。將包含編碼本發明多肽之多核苷酸的載體引入宿主細胞中使 得載體作為染色體整合體的一部分存在或如早先所述作為自我複製的染色體外載體存在。 術語"宿主細胞"涵蓋由於複製期間發生的突變而與親本細胞不完全相同的任何親本細胞 後代。宿主細胞的選擇很大程度上取決於編碼所述多肽的基因及其來源。
[0159] 宿主細胞可以是單細胞微生物，例如原核生物，或者非單細胞微生物，例如 真核生物。有用的單細胞微生物是細菌細胞，諸如革蘭氏陽性細菌，包括但不局限 於芽孢桿菌細胞，例如嗜鹼性芽孢桿菌（BaciIlus alkalophiIus)，解澱粉芽孢杆 菌（Bacillus amyloliquefaciens),短芽抱桿菌（Bacillus brevis),環狀芽抱桿菌 (Bacillus circulans),克勞氏芽抱桿菌（Bacillus clausii),凝結芽抱桿菌（Bacillus coagulans),燦爛芽抱桿菌（Bacillus lautus),遲緩芽抱桿菌（Bacillus lentus), 地衣芽抱桿菌（Bacillus licheniformis),巨大芽抱桿菌（Bacillus megaterium), 脂肪嗜熱芽孢桿菌（Bacillus stearothermophilus),枯草芽孢桿菌，和蘇雲金杆 菌（Bacillus thuringiensis);或鏈黴菌細胞，例如變鉛青鏈黴菌（Streptomyces Iividans)和鼠灰鏈黴菌（Streptomyces murinus)，或革蘭氏陰性細菌諸如大腸桿菌和 假單胞菌（Pseudomonas sp)。在一個方面中，細菌宿主細胞是遲緩芽孢桿菌（Bacillus lentus)，地衣芽抱桿菌（Bacillus licheniformis)，脂肪嗜熱芽抱桿菌（Bacillus stearothermophilus)或枯草芽孢桿菌細胞。在另一方面中，芽孢桿菌細胞是嗜鹼性的芽 孢桿菌。將載體引入細菌宿主細胞可能通過例如原生質體轉化（參閱，例如Chang and Cohen，1979，Molecular General Genetics 168:111-115)，使用感受態細胞（參閱，例 如 Young and Spizizen, 1961, Journal of Bacteriology 81:823-829，或 Dubnau and Davidoff-Abelson，1971，Journal of Molecular Biology56:209_221)電穿孔（參閱，例 如 Shigekawa and Dower，1988，Biotechniques 6:742-751)，或接合（參閱，例如 Koehler and Thome，1987, Journal of Bacteriology 169:5771-5278)來實現。
[0160] 宿主細胞還可以是真核生物，諸如哺乳動物、昆蟲、植物或真菌細胞。
[0161] 在一方面中，宿主細胞是真菌細胞。〃真菌〃用於此處時包括子囊菌門 (Ascomycota)，擔子菌門（Basidiomycota)，壺菌門（Chytridiomycota)和接合菌門 (Zygomycota)(如文獻所述：Hawksworth et al.，In，Ainsworth and Bisby's Dictionary of The Fungi, 8th edition，1995,CAB International, University Press, Cambridge, UK) 以及卵菌門（Oomycota)(如文獻中所印證的：Hawksworth et al.，1995，見上文，第171 頁）和所有的有絲分裂抱子真菌（mitosporic fungi) (Hawksworth et al.，1995，見上 文）。在另一方面中，真菌宿主細胞是酵母細胞。"酵母"用於此處時包括產子囊孢子酵母 (內抱黴目（Endomycetales))，產擔抱子酵母（basidiosporogenous yeast)和屬於半知菌 (Fungi Imperfecti)(芽孢綱（Blastomycetes))的酵母。由於酵母的分類在未來可能有變 化，所以針對本發明的目的而言，酵母應如以下文獻中所述定義：Biology and Activities of Yeast (Skinner, F. A. , Passmore, S. M. , and Davenport, R. R. , eds, Soc. App. Bacteriol. Symposium Series No. 9, 1980)〇
[0162] 在更進一步的方面，酵母宿主細胞是假絲酵母（Candida)，漢遜酵母屬 (Hansenula)，克魯維酵母菌屬（Kluyveromyces)，畢赤酵母屬（Pichia)，酵母屬 (Saccharomyces)，裂殖酵母屬（Schizosaccharomyces)或耶氏酵母屬（Yarrowia)細胞。
[0163] 在某一特定方面，酵母宿主細胞是卡氏酵母（Saccharomyces carlsbergensis)，釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae)，糖化酵母（Saccharomyces diastaticus)，Saccharomyces douglasii，克魯弗酵母（Saccharomyces kluyveri),諾地 酵母（Saccharomyces norbensis)或卵形酵母（Saccharomyces oviformis)細胞。在另一 方面，酵母宿主細胞是乳酸克魯維酵母（Kluyveromyces Iactis)細胞。在另一方面，酵母 宿主細胞是解脂耶氏酵母（Yarrowia Iipolytica)細胞。
[0164] 在另一方面，真菌宿主細胞是絲狀真菌細胞。〃絲狀真菌〃包括分支真菌門 (Eumycota)和卵菌門（Oomycota)的所有絲狀形式（參閱Hawksworth et al.，1995，見 上文）。絲狀真菌通常特徵為由幾丁質，纖維素（cellulose)，葡聚糖（glucan)，殼聚 糖（chitosan)，甘露聚糖（mannan)和其它複雜多糖組成的菌絲體壁。無性繁殖的生長 是通過菌絲延長，而碳分解代謝專性好氧的。相反，酵母諸如釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae)的無性繁殖生長是通過單細胞菌體的出芽，而碳分解代謝可能是發酵性的。
[0165] 另一方面，絲狀真菌宿主細胞是支頂孢屬（Acremonium)，麴黴屬（Aspergillus)， 短梗黴屬（Aureobasidium)，煙管菌屬（Bjerkandera)，擬錯菌屬（Ceriporiopsis)，鬼傘 屬（Coprinus)，雲芝屬（Coriolus)，隱球菌屬（Cryptococcus)，Filibasidium，嫌抱菌屬 (Fusarium)，腐殖黴屬（Humicola)，稻痕菌屬（Magnaporthe)，毛黴屬（Mucor)，毀絲黴屬 (Myceliophthora)，Neocallimastix，脈抱菌屬（Neurospora)，擬青黴屬（Paecilomyces)， 青黴屬（PeniciIlium)，平革菌屬（Phanerochaete)，射脈菌屬（Phlebia)，Piromyces， 側鸞（Pleurotus)，裂糟菌屬（Schizophyllum)，踝節菌屬（Talaromyces)，嗜熱子囊 菌屬（Thermoascus)，梭抱殼黴屬（Thielavia)，彎頸黴屬（Tolypocladium)，栓菌屬 (Trametes)或木黴菌屬（Trichoderma)細胞。
[0166] 另一方面，絲狀真菌宿主細胞是泡盛麴黴（Aspergillus awamori)，煙麴黴 (Aspergillus fumigatus)，臭麴黴（Aspergillus foetidus)，日本麴黴（Aspergillus japonicus)，構巢麴黴（Aspergillus nidulans)，黑麴黴（Aspergillus niger)或米麴黴 (Aspergillus oryzae)細胞。另一方面，絲狀真菌宿主細胞是 Fusarium bactridioides， 禾穀嫌刀菌（Fusarium cerealis)，克地嫌刀菌（Fusarium crookwellense)，大刀嫌刀菌 (Fusarium cuImorum),禾穀嫌刀菌（Fusarium graminearum)，Fusarium graminum，異抱 嫌抱（Fusarium heterosporum)，Fusarium negundi，尖抱嫌刀菌（Fusarium oxysporum)， 多枝鐮孢（Fusarium reticulatum)，粉紅鐮刀菌（Fusarium roseum)，接骨木鐮刀菌 (Fusarium sambucinum)，膚色嫌抱（Fusarium sarcochroum)，擬枝抱嫌刀菌（Fusarium sporotrichioides)，硫色嫌刀菌(Fusarium sulphureum)，Fusarium torulosum,類 (擬）絲抱嫌刀菌（Fusarium trichothecioides)或 Fusarium venenatum 細胞。另一 方面，絲狀真菌宿主細胞是黑管菌（Bjerkandera adusta)，幹擬錯菌（Ceriporiopsis aneirina)，幹擬錯菌（Ceriporiopsis aneirina)，Ceriporiopsis caregiea，淺黃擬 錯孔菌(Ceriporiopsis gilvescens), Ceriporiopsis pannocinta，Ceriporiopsis rivulosa, Ceriporiopsis subrufa，蟲擬錯菌（Ceriporiopsis subvermispora),灰蓋 鬼傘（Coprinus cinereus)，毛雲芝菌（Coriolus hirsutus)，特異腐質黴（Humicola insolens)，腐柔毛腐質黴（Humicola lanuginosa)，米黑毛黴（Mucor miehei)，嗜熱 毀絲黴（Myceliophthora thermophila)，粗糖脈抱菌（Neurospora crassa)，產紫青黴 (Penicillium purpurogenum)，黃抱原毛平革菌（Phanerochaete chrysosporium),身寸脈 側菌（Phlebia radiata)，杏鮑燕（Pleurotus eryngii)，太瑞斯梭抱殼黴（Thielavia terrestris)，長絨毛栓菌（Trametes villosa)，雲芝（Trametes versicolor)，哈茨木黴 (Trichoderma harzianum)，康氏木黴（Trichoderma koningii)，長梗木黴（Trichoderma Iongibrachiatum)，裡氏木黴（Trichoderma reesei)或綠色木黴（Trichoderma viride) 細胞。真菌細胞可以通過本身已知的方式通過包括原生質體形成、原生質體轉化和細胞 壁再生的過程被轉化。適合麴黴屬（Aspergillus)和木黴菌屬（Trichoderma)宿主細 胞的轉化步驟參閱 EP 238023 和 Yelton et al.，1984, Proceedings of the National Academy of Sciences USA81:1470-1474。適合轉化嫌抱菌（Fusarium)的方法參閱 Malardier et al.，1989, Gene 78:147-156 和 WO 96/00787。酵母的轉化可用以下文獻 所述步驟進行：Becker and Guarente，In Abelson, J. N. and Simon, M. I. , editors, Guide to Yeast Genetics and Molecular Biology, Methods in Enzymology, Volume 194,pp 182-187,Academic Press,Inc. , New York ；lto et al.，1983,Journal of Bacteriology 153:163 ；and Hinnen et a/.，1978,Proceedings of the National Academy of Sciences USA 75 ；1920〇
[0167] 本發明還涉及產生本發明多肽的方法，包括：(a)在有益於所述多肽生產的條件 下培養細胞，該細胞在其野生型形式下能產生所述多肽；然後（b)回收所述多肽。優選的， 所述細胞屬於麴黴屬（Aspergillus),更優選是煙麴黴（Aspergillus fumigatus)。
[0168] 本發明還涉及生產本發明多肽的方法，包括：(a)在有助於所述多肽生產的條件 下培養宿主細胞；和（b)回收所述多肽。
[0169] 在本發明的生產方法中，用本領域眾所周知的方法將所述細胞培養於適於所述多 肽產生的營養培養基上。例如，在實驗室或工業發酵罐中以合適的培養基並且在允許所述 多肽表達和/或分離的條件下通過搖瓶培養和小規模或大規模發酵（包括連續的、分批的、 分批投料或固態發酵）培養細胞。用本領域已知的步驟在包含碳和氮源以及無機鹽的合適 營養培養基上進行培養。合適的培養基可購自供應商或依照已發表的組成配製（例如，在 美國典型培養物保藏（American Type Culture Collection)的目錄上）。若所述多肽被分 泌入營養培養基中，則可直接從培養基中回收該多肽。若所述多肽不分泌到培養基中，則可 從細胞裂解物中回收它。
[0170] 可用本領域已知特異於所述多肽的方法檢測該多肽。這些檢測方法可包括使用特 異抗體、形成酶產物或酶底物的消失。
[0171] 例如，可如本文所述用酶檢測法測定所述多肽的活性。
[0172] 產生的多肽可用本領域已知的方法回收。例如，可通過常規方法從營養培養基中 回收所述多肽，這些方法包括但不局限於離心、過濾、提取、噴霧乾燥、揮發或沉澱。本發明 的多肽可通過本領域已知的多種方法進行純化，包括但不局限於層析（例如離子交換、親 和、疏水、層析聚焦和分子排阻）、電泳流程（例如製備型等電聚焦）、差異溶解度（例如硫 酸銨沉澱）、SDS-PAGE 或提取（參閱，例如 Protein Purification, J. -C. Janson and Lars Ryden, editors, VCH Publishers, New York, 1989)來獲得充分純的多膚。
[0173] 一方面，在第110位的胺基酸修飾是胺基酸取代。
[0174] 一方面，在第110位的胺基酸修飾是胺基酸刪除。
[0175] 一方面，在第110位的胺基酸修飾是胺基酸插入。
[0176] 在某些實施方案中，測定相對於SEQ ID No. 1的序列同一性，其中SEQ ID No. 1所 述胺基酸序列進一步包含信號肽序列，諸如其天然信號肽序列。
[0177] 在某些實施方案中，本發明所述多肽與SEQ ID No. 1具有至少90、92或95%的同 一性。
[0178] 在某些實施方案中，本發明多肽與選自SEQ ID No. 2-22之中的具有最高同一性百 分比的序列具有至少76, 78, 80, 85, 90, 95, 98或95%的同一性。
[0179] 在某些實施方案中，本發明所述多肽與SEQ ID No. 2具有至少 76, 78, 8〇, 85, 9〇, ％，98 或 的同一性。
[0180] 在某些實施方案中，本發明所述多肽與SEQ ID No. 3具有至少 76, 78, 8〇, 85, 9〇, 95, 98 或 95% 的同一性。
[0181] 在某些實施方案中，本發明所述多肽具有￠-果凍卷摺疊。
[0182] 在本發明所述的某些實施方案中，第110位的胺基酸修飾是胺基酸取代。
[0183] 在本發明所述的某些實施方案中，第110位的胺基酸修飾是取代為選自以下的任 一不同胺基酸殘基：丙氨酸，精氨酸，天冬醯胺，天冬氨酸，半胱氨酸，穀氨酸，穀氨醯 胺，甘氨酸，組氨酸，異亮氨酸，亮氨酸，賴氨酸，甲硫氨酸，苯丙氨酸，脯氨酸，絲氨 酸，色氨酸，酪氨酸和纈氨酸。
[0184] 在本發明所述的某些實施方案中，第110位的胺基酸修飾是取代為選自以下的任 一不同胺基酸殘基：丙氨酸，精氨酸，天冬醯胺，半胱氨酸，穀氨酸，穀氨醯胺，甘氨酸， 組氨酸，異亮氨酸，亮氨酸，賴氨酸，甲硫氨酸，苯丙氨酸，脯氨酸，絲氨酸，色氨酸， 酪氨酸和纈氨酸。
[0185] 在本發明所述的某些實施方案中，第110位的胺基酸修飾是取代為選自以下的任 一不同胺基酸殘基：穀氨酸，色氨酸，丙氨酸和半胱氨酸。
[0186] 在本發明所述的某些實施方案中，第110位的胺基酸修飾是取代為丙氨酸。
[0187] 在某些實施方案中，本發明所述多肽具有總數少於250個胺基酸，諸如少於240， 諸如少於230,諸如少於220,諸如少於210,諸如少於200個胺基酸，諸如在160至240個 範圍內，諸如在160至220個胺基酸範圍內。
[0188] 在某些實施方案中，本發明所述多肽包含在以下任何一個或多個位置處的一個或 多個修飾：11，12, 13, 34, 54, 77, 81，99, 104, 113, 114, 118, 122, 141，154, 159, 162, 164, 166 和175,所述位置被確定為SEQ ID No. 1所示之枯草芽孢桿菌胺基酸序列的相應位置。
[0189] 在某些實施方案中，本發明所述多肽包含選自以下的一個或更多個胺基酸取代： HF, 12F, 54Q, 54W, 122D, 113A, 13Y, 113D, 175L, 122F, 34K, 99Y, 104W, 141Q, 154R, 159D, 175K ，811, 166F, 162E, 162D, 164F, 114D, 114Y, 114F, 118V, 175K, 77L, 77M, 77S, 77V,和 77Y,所述 位置被確定為SEQ ID No. 1所示之枯草芽孢桿菌胺基酸序列的相應位置。
[0190] 在某些實施方案中，本發明所述多肽包含選自以下的一個或更多個胺基酸取 代：D11F，G12F，N54Q，R122D，Y113A，G13Y，Y113D，N141Q，Q175L，R122F，G34K，K99Y，T104 ff, K154R, N159D, Q175K, V81I, Y166F, S162E, S162D, W164F, N114D, N114Y, N114F, I118V, I77L，I77M，I77S，I77V和I77Y，所述位置被確定為SEQ ID No. 1所示之枯草芽孢桿菌氨基 酸序列的相應位置。
[0191] 在某些實施方案中，本發明所述多肽包含在以下任何一個或多個胺基酸位置處的 一個或多個修飾：13, 99, 104, 113, 122, 154, 159和175,所述位置被確定為SEQ ID No. 1所 示之枯草芽孢桿菌胺基酸序列的相應位置。
[0192] 在某些實施方案中，本發明所述多肽包含在以下胺基酸位置處的取代： 13, 99, 104, 113, 122, 154, 159和175,所述位置被確定為SEQ ID No. 1所示之枯草芽孢桿菌 胺基酸序列的相應位置。
[0193] 在某些實施方案中，本發明所述多肽進一步包含在以下任何一個或多個胺基酸位 置處的一個或多個修飾：114和166,所述位置被確定為SEQ ID No. 1所示之枯草芽孢桿菌 胺基酸序列的相應位置。
[0194] 在某些實施方案中，本發明所述多肽進一步包含在以下任何一個或多個胺基酸位 置處的一個或多個取代：114和166,所述位置被確定為SEQ ID No. 1所示之枯草芽孢桿菌 胺基酸序列的相應位置。
[0195] 在某些實施方案中，本發明所述多肽包含在以下胺基酸位置中至少4個位置處的 取代：13, 99, 104, 113, 114, 122, 154, 159, 166 和 175,所述位置被確定為 SEQ ID No. 1 所示 之枯草芽孢桿菌胺基酸序列的相應位置。
[0196] 在某些實施方案中，本發明所述多肽包含在以下胺基酸位置處的取代： 13, 99, 104, 113, 114, 122, 154, 159和175,所述位置被確定為SEQ ID No. 1所示之枯草芽孢 桿菌胺基酸序列的相應位置。
[0197] 在某些實施方案中，本發明所述多肽包含在以下胺基酸位置處的取代： 13, 99, 104, 113, 122, 154, 159, 166和175,所述位置被確定為SEQ ID No. 1所示之枯草芽孢 桿菌胺基酸序列的相應位置。
[0198] 在某些實施方案中，本發明所述多肽包含在以下胺基酸位置處的取代： 13, 99, 104, 113, 122, 154, 159和175,所述位置被確定為SEQ ID No. 1所示之枯草芽孢桿菌 胺基酸序列的相應位置。
[0199] 在某些實施方案中，本發明所述多肽包含選自以下的一個或更多個胺基酸取代： 13Y, 99Y, 104W, 110A, 113D, 114D, 114F, 122F, 154R, 159D, 166F, 175K 和 175L,所述位置被確 定為SEQ ID No. 1所示之枯草芽孢桿菌胺基酸序列的相應位置。
[0200] 在某些實施方案中，本發明所述多肽相比於選自SEQ ID No. 1-22之中的與其具有 最高同一性的序列而言具有至少5、6、7、8、9或10個胺基酸取代。
[0201] 在某些實施方案中，本發明所述多肽具有至少9或10個胺基酸取代。
[0202] 在某些實施方案中，本發明所述多肽包含選自以下的一個或更多個胺基酸取代：
[0203] a. DlIF, R122D 和 Tl 10A ;
[0204] b. Dl IF, R122D, Tl 10A 和 Yl 13A ;
[0205] c. G13Y, Tl 10A, Yl 13D, R122D 和 Q175L ;
[0206] d. G13Y, Tl 10A, Yl 13D, R122F 和 Q175L ;
[0207] e. G13Y, G34K, Tl 10A, Yl 13D, R122D 和 Q175L ;
[0208] f. G13Y, K99Y, T104W, Tl 10A, Yl 13D, NI 14D, R122F, K154R, N159D 和 Q175K ;
[0209] g. G13Y, K99Y, T104W, T110A, Y113D, R122F, K154R, N159D, Q175 和 V81I ;
[0210] h. G13Y, K99Y, T104W, T110A, Y113D, R122F, K154R, N159D, Y166F 和 Q175L ;
[0211] i. G13Y, T110A, Y113D, R122D, K154R, N159D 和 Q175L ;
[0212] j. G13Y, K99Y, T104W, T110A, Y113D, R122F, K154R, N159D 和 Q175L ;
[0213] L G13Y, T110A, Y113D, R122D, S162E 和 Q175L ;
[0214] I. G13Y, T110A, Y113D, R122D, S162D 和 Q175L ;
[0215] m. G13Y, Tl 10A, Yl 13D, R122D, W164F 和 Q175L ;
[0216] n. G13Y, K99Y, T104W, Tl 10A, Yl 13D, NI 14D, R122F, K154R, N159D 和 Q175L ;
[0217] 〇? G13Y, K99Y, T104W, Tl 10A, Yl 13D, NI 14Y, R122F, K154R, N159D 和 Q175L ;
[0218] p. G13Y, K99Y, T104W, Tl 10A, Yl 13D, NI 14F, R122F, K154R, N159D 和 Q175L ;
[0219] q. G13Y, K99Y, T104W, Tl 10A, Yl 13D, I118V, R122F, K154R, N159D 和 Q175L ;
[0220] r. G13Y, K99Y, T104W, Tl 10A, Yl 13D, NI 14Y, R122F, K154R, N159D 和 Q175K ;
[0221] s. G13Y, K99Y, T104W, Tl 10A, Yl 13D, NI 14D, R122F, K154R, N159D 和 Q175K ;
[0222] t. G13Y, I77L, K99Y, T104W, Tl 10A, Yl 13D, R122F, K154R, N159D 和 Q175L ;
[0223] u. G13Y, I77M, K99Y, T104W, Tl 10A, Yl 13D, R122F, K154R, N159D 和 Q175L ;
[0224] V. G13Y, I77S, K99Y, T104W, Tl 10A, Yl 13D, R122F, K154R, N159D 和 Q175L ;
[0225] w. G13Y, I77V, K99Y, T104W, Tl 10A, Yl 13D, R122F, K154R, N159D 和 Q175L ;
[0226] x. G13Y，I77Y，K99Y，T104W，Tl 10A，Yl 13D，R122F，K154R，N159D 和 Q175L
[0227] y. G13Y, K99Y, T104W, T110A, Y113D, R122F, N141Q, K154R, N159D, Q175L ；
[0228] z. G13Y, N54Q, K99Y, T104W, T110A, Y113D, R122F, N141Q, K154R, N159D, Q175 ；
[0229] aa. G13Y, N54W, K99Y, T104W, T110A, Y113D, R122F, 141Q, K154R, N159D, 175L ；
[0230] bb. G13Y, N54Q, K99Y, T104W, T110A, Y113D, N114F, R122F, K154R, N159D, Q175L ；
[0231] cc. G13Y, K99Y, T104W, Tl 10A, Yl 13D, NI 14F, R122F, 141Q, K154R, N159D, Q175L ;和
[0232] dd. G13Y, 54Q, K99Y, T104W, T110A, Y113D, N114F, R122F, 141Q, K154R, N159D, Q175 L ；
[0233] 所述位置被確定為SEQ ID No. I所示之枯草芽孢桿菌胺基酸序列的相應位置。
[0234] 在某些實施方案中，本發明所述多肽包含選自以下的一個或更多個胺基酸取代：
[0235] a. G13Y，K99Y，T104W，Tl 10A，Yl 13D，NI 14D，R122F，K154R，N159D 和 Q175K ;
[0236] b. G13Y, K99Y, T104W, Tl10A, Yl13D, R122F, K154R, N159D, Y166F 和 Q175L ;
[0237] c. G13Y, K99Y, T104W, Tl 10A, Yl 13D, R122F, K154R, N159D 和 Q175L ;
[0238] d. G13Y, K99Y, T104W, Tl 10A, Yl 13D, NI 14D, R122F, K154R, N159D 和 Q175L ;
[0239] e. G13Y, K99Y, T104W, Tl 10A, Yl 13D, NI 14F, R122F, K154R, N159D 和 Q175L ;
[0240] 所述位置被確定為SEQ ID No. 1所示之枯草芽孢桿菌胺基酸序列的相應位置。
[0241] 在某些實施方案中，本發明所述多肽具有麩皮溶解活性。
[0242] 在某些實施方案中，本發明所述多肽是分離的形式。
[0243] 術語"分離的"用於此處意指所述多肽至少大體上沒有至少一種在自然界與所述 序列天然相伴的其它組分。
[0244] 在本發明所述的某些實施方案中，第110位的胺基酸修飾不是T110D。
[0245] 在某些實施方案中，具有木聚糖酶活性的多肽在第110位沒有天冬氨酸。
[0246] 在某些實施方案中，本發明所述多肽在木聚糖酶活性檢測中相較於SEQ ID No. 1 所示之枯草芽孢桿菌胺基酸序列而言具有改善的木聚糖酶活性。
[0247] 在某些實施方案中，本發明所述多肽由於第110位的修飾而具有改善的木聚糖酶 活性。
[0248] 在某些實施方案中，本發明所述多肽在麩皮溶解活性檢測中相較於SEQ ID No. 1 所示之枯草芽孢桿菌胺基酸序列而言具有改善的麩皮溶解活性。
[0249] 在某些實施方案中，本發明所述多肽由於第110位的修飾而具有改善的麩皮溶解 活性。
[0250] 在某些實施方案中，本發明所述多肽對木聚糖酶抑制劑的敏感性降低。
[0251] 在某些實施方案中，本發明所述多肽具有包含在選自以下列表位置處之修飾的氨 基酸序列：
[0252] a) 13/110/113/122/154/159/175 ；
[0253] b)13/99/104/110/113/122/154/159/166/175 ；
[0254] c)13/99/104/110/113/114/122/154/159/175 ；
[0255] d)13/110/113/122/175 ；
[0256] e)13/99/104/110/113/122/154/159/175 ；
[0257] f)13/99/104/110/113/122/154/159/175 ；
[0258] g)13/99/104/110/113/114/122/154/159/175 ；
[0259] h)13/99/104/110/113/114/122/154/159/175 ；
[0260] i)13/99/104/110/113/114/122/154/159/175 ；
[0261] j)13/99/104/110/113/114/122/154/159/175 ；
[0262] k)13/77/99/104/110/113/122/154/159/175 ；
[0263] I)13/81/99/104/110/113/122/154/159/175 ；
[0264] m) 13/110/113/122/164/175 ；
[0265] n)13/110/113/122/162/175 ；
[0266] o)13/110/113/122/175 ；
[0267] p)11/122/110/113 ；
[0268] q)13/77/99/104/110/113/122/154/159/175 ；
[0269] r) 11/122/110 ；
[0270] s) 13/34/110/113/122/175 ；
[0271] t) 13/77/99/104/110/113/122/154/159/175 ；
[0272] u)13/77/99/104/110/113/122/154/159/175 ；
[0273] v)13/99/104/110/113/118/122/154/159/175 ；
[0274] w)13/110/113/122/162/175 ；
[0275] x)13/77/99/104/110/113/122/154/159/175 ；
[0276] y)13/99/104/110/113/122/141/154/159/175 ；
[0277] z)13/54/99/104/110/113/122/141/154/159/175 ；
[0278] aa)13/54/99/104/110/113/122/141/154/159/175 ；
[0279] bb)13/54/99/104/110/113/114/122/154/159/175 ；
[0280] cc) 13/99/104/110/113/114/122/141/154/159/175 ;和
[0281] dd)13/54/99/104/110/113/114/122/141/154/159/175 ；
[0282] 所述位置被確定為SEQ ID No. I所示之枯草芽孢桿菌胺基酸序列的相應位置。
[0283] 在某些實施方案中，本發明所述多肽具有包含選自以下列表之胺基酸取代的氨基 酸序列：
[0284] a)13Y/110A/113D/122D/154R/159D/175L ；
[0285] b)13Y/99Y/104W/110A/113D/122F/154R/159D/166F/175L ；
[0286] c)13Y/99Y/104W/110A/113D/114F/122F/154R/159D/175L ；
[0287] d)13Y/110A/113D/122F/175L ；
[0288] e)13Y/99Y/104W/110A/113D/122F/154R/159D/175L ；
[0289] f)13Y/99Y/104W/110A/113D/122F/154R/159D/175K ；
[0290] g)13Y/99Y/104W/110A/113D/114D/122F/154R/159D/175K ；
[0291] h)13Y/99Y/104W/110A/113D/114Y/122F/154R/159D/175L ；
[0292] i)13Y/99Y/104W/110A/113D/114D/122F/154R/159D/175L ；
[0293] j)13Y/99Y/104W/110A/113D/114Y/122F/154R/159D/175K ；
[0294] k)13Y/77L/99Y/104W/110A/113D/122F/154R/159D/175L ；
[0295] I)13Y/81I/99Y/104W/110A/113D/122F/154R/159D/175L ；
[0296] m)13Y/110A/113D/122D/164F/175L ；
[0297] n)13Y/110A/113D/122D/162D/175L ；
[0298] o)13Y/110A/113D/122D/175L ;
[0299] p)11F/122D/110A/113A ;
[0300] q)13Y/77Y/99Y/104W/110A/113D/122F/154R/159D/175L ；
[0301] r)11F/122D/110A ；
[0302] s)13Y/34K/110A/113D/122D/175L ;
[0303] t)13Y/77V/99Y/104W/110A/113D/122F/154R/159D/175L ；
[0304] u)13Y/77M/99Y/104W/110A/113D/122F/154R/159D/175L ；
[0305] v)13Y/99Y/104W/110A/113D/118V/122F/154R/159D/175L ；
[0306] w)13Y/110A/113D/122D/162E/175L ;
[0307] x)13Y/77S/99Y/104W/110A/113D/122F/154R/159D/175L ；
[0308] y)13Y/99Y/104W/110A/113D/122F/141Q/154R/159D/175L ；
[0309] z)13Y/54Q/99Y/104W/110A/113D/122F/141Q/154R/159D/175L ；
[0310] aa)13Y/54W/99Y/104W/110A/113D/122F/141Q/154R/159D/175L ；
[0311] bb)13Y/54Q/99Y/104W/110A/113D/114F/122F/154R/159D/175L ；
[0312] cc)13Y/99Y/104W/110A/113D/114F/122F/141Q/154R/159D/175L ;和
[0313] dd)13Y/54Q/99Y/104W/110A/113D/114F/122F/141Q/154R/159D/175L ；
[0314] 所述位置被確定為SEQ ID No. I所示之枯草芽孢桿菌胺基酸序列的相應位置。
[0315] 在某些實施方案中，本發明所述多肽具有包含選自以下列表之胺基酸取代的SEQ ID No. 1之胺基酸序列：
[0316] a)G13Y/T110A/Y113D/R122D/K154R/N159D/Q175L ；
[0317] b)G13Y/K99Y/T104W/T110A/Y113D/R122F/K154R/N159D/Y166F/Q175L ；
[0318] c)G13Y/K99Y/T104W/T110A/Y113D/N114F/R122F/K154R/N159D/Q175L ；
[0319] d)G13Y/T110A/Y113D/R122F/Q175L ;
[0320] e)G13Y/K99Y/T104W/T110A/Y113D/R122F/K154R/N159D/Q175L ；
[0321] f)G13Y/K99Y/T104W/T110A/Y113D/R122F/K154R/N159D/Q175K ；
[0322] g)G13Y/K99Y/T104W/T110A/Y113D/N114D/R122F/K154R/N159D/Q175K ；
[0323] h)G13Y/K99Y/T104W/T110A/Y113D/N114Y/R122F/K154R/N159D/Q175L ；
[0324] i)G13Y/K99Y/T104W/T110A/Y113D/N114D/R122F/K154R/N159D/Q175L ；
[0325] j)G13Y/K99Y/T104W/T110A/Y113D/N114Y/R122F/K154R/N159D/Q175K ；
[0326] k)G13Y/I77L/K99Y/T104W/T110A/Y113D/R122F/K154R/N159D/Q175L ；
[0327] l)G13Y/V81I/K99Y/T104ff/T110A/Y113D/R122F/K154R/N159D/Q175L ；
[0328] m)G13Y/T110A/Y113D/R122D/W164F/Q175L ；
[0329] n)G13Y/T110A/Y113D/R122D/S162D/Q175L ；
[0330] o)G13Y/T110A/Y113D/R122D/Q175L ;
[0331] p)Dl1F/R122D/T110A/Y113A ;
[0332] q)G13Y/I77Y/K99Y/T104W/T110A/Y113D/R122F/K154R/N159D/Q175L ；
[0333] r)Dl1F/R122D/T110A ;
[0334] s)G13Y/G34K/T110A/Y113D/R122D/Q175L ；
[0335] t)G13Y/I77V/K99Y/T104W/T110A/Y113D/R122F/K154R/N159D/Q175L ；
[0336] u)G13Y/I77M/K99Y/T104W/T110A/Y113D/R122F/K154R/N159D/Q175L ；
[0337] v)G13Y/K99Y/T104W/T110A/Y113D/1118V/R122F/K154R/N159D/Q175L ；
[0338] w)G13Y/T110A/Y113D/R122D/S162E/Q175L ；and
[0339] x)G13Y/I77S/K99Y/T104W/T110A/Y113D/R122F/K154R/N159D/Q175L
[0340] y)G13Y/K99Y/T104W/T110A/Y113D/R122F/N141Q/K154R/N159D/Q175L ；
[0341] z)G13Y/N54Q/K99Y/T104W/T110A/Y113D/R122F/N141Q/K154R/N159D/Q175L ；
[0342] aa)G13Y/N54W/K99Y/T104W/T11OA/Y113D/R122F/141Q/K154R/N159D/175L ；
[0343] bb)G13Y/N54Q/K99Y/T104W/T110A/Y113D/N114F/R122F/K154R/N159D/Q175L ；
[0344] cc)G13Y/K99Y/T104W/T110A/Y113D/N114F/R122F/141Q/K154R/N159D/Q175L ;和
[0345] dd)G13Y/54Q/K99Y/T104ff/T110A/Y113D/N114F/R122F/141Q/K154R/N159D/ Q175L。
[0346] 在某些實施方案中，本發明所述多肽具有包含選自以下列表之胺基酸取代的氨基 酸序列：
[0347] a)13Y/110A/113D/122D/154R/159D/175L ；
[0348] b)13Y/99Y/104W/110A/113D/122F/154R/159D/166F/175L ；
[0349] c)13Y/99Y/104W/110A/113D/114F/122F/154R/159D/175L ；
[0350] d)13Y/110A/113D/122F/175L ；
[0351] e)13Y/99Y/104W/110A/113D/122F/154R/159D/175L ；
[0352] f)13Y/99Y/104W/110A/113D/122F/154R/159D/175K ；
[0353] g)13Y/99Y/104W/110A/113D/114D/122F/154R/159D/175K ；
[0354] h)13Y/99Y/104W/110A/113D/114Y/122F/154R/159D/175L ；
[0355] i)13Y/99Y/104W/110A/113D/114D/122F/154R/159D/175L ；
[0356] j)13Y/99Y/104W/110A/113D/114Y/122F/154R/159D/175K ；
[0357] k)13Y/77L/99Y/104W/110A/113D/122F/154R/159D/175L ；
[0358] I)13Y/81I/99Y/104W/110A/113D/122F/154R/159D/175L ；
[0359] m)13Y/110A/113D/122D/164F/175L ；
[0360] n)13Y/110A/113D/122D/162D/175L ;
[0361] o)13Y/110A/113D/122D/175L ；
[0362] p)11F/122D/110A/113A ;
[0363] q)13Y/77Y/99Y/104W/110A/113D/122F/154R/159D/175L ；
[0364] r)11F/122D/110A ；
[0365] s)13Y/34K/110A/113D/122D/175L ;
[0366] t)13Y/77V/99Y/104W/110A/113D/122F/154R/159D/175L ;
[0367] u)13Y/77M/99Y/104W/110A/113D/122F/154R/159D/175L ；
[0368] v)13Y/99Y/104W/110A/113D/118V/122F/154R/159D/175L ；
[0369] w)13Y/110A/113D/122D/162E/175L ;
[0370] x)13Y/77S/99Y/104W/110A/113D/122F/154R/159D/175L ;
[0371] y)13Y/99Y/104W/110A/113D/122F/141Q/154R/159D/175L ；
[0372] z)13Y/54Q/99Y/104W/110A/113D/122F/141Q/154R/159D/175L ；
[0373] aa)13Y/54W/99Y/104W/110A/113D/122F/141Q/154R/159D/175L ；
[0374] bb)13Y/54Q/99Y/104W/110A/113D/114F/122F/154R/159D/175L ；
[0375] cc)13Y/99Y/104W/110A/113D/114F/122F/141Q/154R/159D/175L ;和
[0376] dd)13Y/54Q/99Y/104W/110A/113D/114F/122F/141Q/154R/159D/175L,
[0377] 所述位置被確定為SEQ ID No. I所示之枯草芽孢桿菌胺基酸序列的相應位置。
[0378] 在某些實施方案中，本發明所述多肽具有SEQ ID No. 1的胺基酸序列，其中具有選 自以下列表的胺基酸取代：
[0379] a)G13Y/T110A/Y113D/R122D/K154R/N159D/Q175L ；
[0380] b)G13Y/K99Y/T104W/T110A/Y113D/R122F/K154R/N159D/Y166F/Q175L ；
[0381] c)G13Y/K99Y/T104W/T110A/Y113D/N114F/R122F/K154R/N159D/Q175L ；
[0382] d)G13Y/T110A/Y113D/R122F/Q175L ;
[0383] e)G13Y/K99Y/T104W/T110A/Y113D/R122F/K154R/N159D/Q175L ；
[0384] f)G13Y/K99Y/T104W/T110A/Y113D/R122F/K154R/N159D/Q175K ；
[0385] g)G13Y/K99Y/T104W/T110A/Y113D/N114D/R122F/K154R/N159D/Q175K ；
[0386] h)G13Y/K99Y/T104W/T110A/Y113D/N114Y/R122F/K154R/N159D/Q175L ；
[0387] i)G13Y/K99Y/T104W/T110A/Y113D/N114D/R122F/K154R/N159D/Q175L ；
[0388] j)G13Y/K99Y/T104W/T110A/Y113D/N114Y/R122F/K154R/N159D/Q175K ；
[0389] k)G13Y/I77L/K99Y/T104W/T110A/Y113D/R122F/K154R/N159D/Q175L ；
[0390] l)G13Y/V81I/K99Y/T104ff/T110A/Y113D/R122F/K154R/N159D/Q175L ；
[0391] m)G13Y/T110A/Y113D/R122D/W164F/Q175L ；
[0392] n)G13Y/T110A/Y113D/R122D/S162D/Q175L ；
[0393] o)G13Y/T110A/Y113D/R122D/Q175L ;
[0394] p)Dl1F/R122D/T110A/Y113A ;
[0395] q)G13Y/I77Y/K99Y/T104W/T110A/Y113D/R122F/K154R/N159D/Q175L ；
[0396] r)Dl1F/R122D/T110A ;
[0397] s)G13Y/G34K/T110A/Y113D/R122D/Q175L ；
[0398] t)G13Y/I77V/K99Y/T104W/T110A/Y113D/R122F/K154R/N159D/Q175L ；
[0399] u)G13Y/I77M/K99Y/T104W/T110A/Y113D/R122F/K154R/N159D/Q175L ；
[0400] v)G13Y/K99Y/T104W/T110A/Y113D/1118V/R122F/K154R/N159D/Q175L ；
[0401] w)G13Y/T110A/Y113D/R122D/S162E/Q175L ;和
[0402] x)G13Y/I77S/K99Y/T104W/T110A/Y113D/R122F/K154R/N159D/Q175L
[0403] y)G13Y/K99Y/T104W/T110A/Y113D/R122F/N141Q/K154R/N159D/Q175L ；
[0404] z)G13Y/N54Q/K99Y/T104W/T110A/Y113D/R122F/N141Q/K154R/N159D/Q175L ；
[0405] aa)G13Y/N54W/K99Y/T104W/T11OA/Y113D/R122F/141Q/K154R/N159D/175L ；
[0406] bb)G13Y/N54Q/K99Y/T104W/T110A/Y113D/N114F/R122F/K154R/N159D/Q175L ；
[0407] cc)G13Y/K99Y/T104W/T110A/Y113D/N114F/R122F/141Q/K154R/N159D/Q175L ;和
[0408] dd)G13Y/54Q/K99Y/T104ff/T110A/Y113D/N114F/R122F/141Q/K154R/N159D/ Q175L。
[0409] 在某些實施方案中，本發明所述多肽不是SEQ ID No. 25。
[0410] 在某些實施方案中，本發明所述多肽不具有選自以下列表的序列：
[0411] 國際專利申請 W00238746 的 SEQ ID No. 57 ;
[0412] 國際專利申請 TO0238746 的 SEQ ID No. 62 ;
[0413] 國際專利申請 TO0238746 的 SEQ ID No. 59 ;
[0414] 國際專利申請 TO0238746 的 SEQ ID No. 53 ;
[0415] 國際專利申請 TO0238746 的 SEQ ID No. 65 ;
[0416] 國際專利申請 TO0238746 的 SEQ ID No. 56 ;
[0417] 國際專利申請 TO0238746 的 SEQ ID No. 64:
[0418] 國際專利申請 TO0238746 的 SEQ ID No. 52 ;
[0419] 國際專利申請 W00238746 的 SEQ ID No. 63 ;
[0420] 國際專利申請 TO0238746 的 SEQ ID No. 61 ;
[0421] 國際專利申請 W00238746 的 SEQ ID No. 60 ;
[0422] 國際專利申請 TO0238746 的 SEQ ID No. 58 ;
[0423] 國際專利申請 TO0238746 的 SEQ ID No. 55 ;
[0424] 國際專利申請 TO0238746 的 SEQ ID No. 12 ;
[0425] 國際專利申請 TO0238746 的 SEQ ID No. 11 ;
[0426] 國際專利申請 TO0068396 的 SEQ ID No. 21 ;和
[0427] 國際專利申請 W00068396SEQ ID No. 22。
[0428] 在本發明的某些實施方案中，所述胺基酸序列被用於大規模的應用中。
[0429] 優選所述胺基酸序列在宿主生物體培養後以每升總細胞培養物體積中含Ig至約 l〇〇g的量產生。
[0430] 本發明還涉及包含如本文所述之胺基酸序列和/或編碼木聚糖酶之核苷酸序列 的組合物。
[0431] 本發明的組合物可改善供消費含所述組合物的產品的氣味，滋味、溫和性，一致 性，質地、形狀、口感，硬度，粘度，膠裂，結構和/或感官特性以及營養。此外，本發明 的組合物還可與供消費之產品的其它組分聯合使用以達到所說的改善。
[0432] 儘管優選本發明組合物用於改進含所述組合物供消費的產品的氣味，滋味、溫和 性，一致性，質地、形狀、口感，硬度，粘度，膠裂，結構，表面光滑性和/或感官特性以 及營養，本發明還覆蓋了將本發明組合物用作含其它組分之藥用組合物的組分以向消費者 提供醫學或生理學益處。
[0433] 因此，本發明的組合物可與其它組分聯合使用。
[0434] 其它組分的例子包括以下一種或多種：增稠劑，膠凝劑，乳化劑，粘合劑，結晶 改良劑，甜味劑（包括人造增甜劑），流變改性劑，穩定劑，抗氧化劑，染料，酶，載體， 媒介物，賦形劑，稀釋劑，潤滑劑，增香劑，著色劑，懸浮劑，崩解劑，造粒粘合劑等。 這些其它組分可以是天然的。這些其它組分可以通過使用化學的和/或酶促的技術製備。
[0435] 術語"增稠劑或膠凝劑"用於此處時指通過減慢或阻礙顆粒移動來防止分開的產 品，所述顆粒是不混溶液體小滴、氣體或不溶固體。增稠發生在當單獨的水合分子引起粘性 增加，減慢分離的情況下。膠凝發生在當水合分子連接形成三維網絡而捕獲顆粒，從而使它 們固定。
[0436] 術語"穩定劑"用於此處時定義為保持產品（例如食品）不隨時間改變的一種成 分或幾種成分的聯合。
[0437] 術語"乳化劑"用於此處時指防止乳劑分離的成分（例如一種食品成分）。乳劑 是兩種不混溶的物質，一種以小滴形式存在，包含於另一種內。乳劑可以是水包油組成，其 中小滴或被分散相是油而連續相是水；或者是油包水組成，其中水變成了被分散相而連續 相是油。泡沫（液體包氣體）以及懸浮液（液體包固體）也可通過使用乳化劑來穩定。氣 化可發生在三相系統中，其中空氣被液態油包圍然後經由用乳化劑穩定的凝聚油脂結晶來 加以穩定。乳化劑具有對水有親和力的極性基團（親水的）和被油類所吸引的非極性基團 (親脂的）。它們被吸收在兩種物質的接觸面，形成了兩表面間的薄膜，起到穩定乳劑的作 用。乳化劑的親水/親脂特性受分子結構的影響。這些特性通過親水的/親脂的平衡（HLB) 值進行鑑定。低HLB值指示較大的親脂傾向，可用於穩定油包水的乳劑。高HLB值指向親 水的乳化劑，通常用於水包油的乳劑。這些數值來自簡單的體系。因為食物常常包含影響 乳化特性的其它成分，所以HLB值可能不總是乳化劑選擇的可靠指南。
[0438] 用於此處時"粘合劑"指通過物理或化學反應將產物粘合在一起的成分（例如食 物成分）。例如在"elation"過程中，水被吸收，達到了粘合的效果。不過，粘合劑可吸收其 它液體，諸如油，將它們保持在產品內。在本發明的上下文中粘合劑通常用於固體或低溼度 產品中，例如烘焙產品：糕餅、甜圈、麵包及其它。
[0439] 術語"結晶改良劑"用於此處指影響油脂或水結晶的成分（例如食物成分）。由 於兩個原因，冰晶的穩定是很重要的。第一個原因從分離的立場看直接涉及產物的穩定性。 產品經受越多的凍/融循環，產生的冰晶就越大。這些巨大的晶體可以破壞產品的結構，它 或者是天然存在的，如同在細胞壁的情形中，或者是由於"elation"而造成的。因為水不再 保持在原位，所以產品在融化後可能展現出脫水收縮或滴水。
[0440] 其次，在產品以冷凍狀態消費的情況下，這些巨大的晶體導致了令人不快的有砂 石樂的口感。
[0441] 〃載體〃或〃媒介物〃意指適於化合物施用的材料，包括本領域已知的任何所述材 料，例如任何液體、凝膠、溶齊IJ、液體稀釋齊IJ、增溶劑等等，它是非毒性的並且不以有害形式 與組合物的任何組分相互作用。
[0442] 在營養上可接受的載體的例子包括例如水、鹽溶液、醇、矽氧烷，蠟，凡士林油， 植物油、聚乙二醇，丙二醇，脂質體，糖，明膠，乳糖，直鏈澱粉，硬脂酸鎂，滑石，表 面活性劑，娃酸，粘性石錯，芳香油，脂肪酸單甘油酯和二甘油酯，petroethral脂肪酸 酯，羥甲基-纖維素，聚乙烯吡咯烷酮等等。
[0443] 賦形劑的例子包括以下一種或多種：微晶纖維素和其它纖維素、乳糖，檸檬酸鈉， 碳酸鈣，磷酸氫鈣，甘氨酸，澱粉，乳糖和高分子量聚乙二醇。
[0444] 崩解劑的例子包括以下一種或多種：澱粉（優選玉米、馬鈴薯或木薯澱粉），澱粉 羥乙酸鈉，交聯羧甲基纖維素鈉和某些複合矽酸鹽。
[0445] 造粒粘合劑的例子包括以下一種或多種：聚乙烯吡咯烷酮，羥丙基甲基纖維素 (HPMC)，羥丙基纖維素（HPC)，蔗糖，麥芽糖，明膠和阿拉伯樹膠。
[0446] 潤滑劑的例子包括以下一種或多種：硬脂酸鎂，硬脂酸，甘油二十二烷酸酯和滑 石.
[0447] 稀釋劑的例子包括以下一種或多種：水、乙醇、丙二醇和丙三醇以及它們的組合。
[0448] 其它組分可同時（例如，當它們混合在一起或甚至當它們經由不同途徑遞送時） 或順序（例如，它們可通過不同途徑遞送）使用。
[0449] 用於此處時術語"適於動物或人消耗的組分"意指作為補充物被加入或者可以加 入本發明組合物中的化合物，它可能是營養上有益的、纖維替代品或者通常對消費者具有 有益的影響。所述成分可用於需要凝膠化，質地化（texturising),穩定，懸浮，形成薄 膜和結構化，保持溼潤，而不添加不必要的粘性的各種產品中。優選的，所述成分能改善活 培養物的保質期和穩定性。
[0450] 舉例說來，所述組分可以是益生元諸如藻酸鹽，黃原膠，果膠，槐樹豆 膠（LBG),菊粉，瓜爾膠，低聚半乳糖（galacto_oligosaccharide，GOS)，左旋寡糖 類（fruct〇-〇ligosaccharide,FOS),低聚乳果糖（Iactosucrose),大豆寡糖，帕 拉金糖（palatinose),低聚異麥芽糖（isomalto-oligosaccharides),低聚葡糖 (gluco-oligosaccharide)和低聚木糖（xylo-oligosaccharides) 〇
[0451] 本發明的組合物還可用作食物，或用於食物製備中。在此，術語"食物"是在廣義 上使用的，涵蓋了人的食物以及動物的食物（即飼料）。在一個優選的方面，所述食物是供 人消費的。
[0452] 所述食物可以是溶液形式或作為固體-取決於用途和/或應用方式和/或施用方 式。
[0453] 當用作或用於食物諸如功能性食物製備中時-本發明的組合物可與以下一種或 多種成分聯合使用：營養上可接受的載體、營養上可接受的稀釋劑、營養上可接受的賦形 齊U、營養上可接受的佐劑、營養活性成分。
[0454] 本發明的組合物可用作食物成分。
[0455] 用於此處時術語"食物成分"包括作為或能夠作為營養補充物和/或纖維補充物 加入功能性食物或食品中的配方。術語食物成分用於此處時還指可低水平用於需要凝膠 化，纖維捲曲化，穩定，懸浮，形成薄膜和結構化，保持溼潤和改善口感而不增加粘性的 多種產品中的配方。
[0456] 所述食物可以是溶液形式或作為固體-取決於用途和/或應用方式和/或施用方 式。
[0457] 本發明的組合物可以是-或者可以被加入_食物補充物。
[0458] 本發明的組合物可以是-或者可以被加入_功能性食物。
[0459] 用於此處時"功能性食物"意指不僅能提供營養效果和/或味覺的滿足，還能給消 費者傳遞更多有益效果的食物。
[0460] 因此，功能性食物是具有摻入其中賦予食物以特殊功能性的組分或成分（諸如本 文所述的那些）的普通食物-所述功能性是除了純粹的營養作用之外的例如醫學或生理學 益處。
[0461] 儘管功能性食物沒有法律定義，對此領域有興趣的大部分人員都同意它們是由於 具有特殊健康作用而上市的食物。
[0462] 某些功能性食物是保健食品。在此，術語"保健食品"意指不僅能提供營養效果和 /或味覺的滿足，還能給消費者傳遞治療（或其它有益）效果的食物。保健食品跨越了食物 和藥品之間的傳統分界線。
[0463] 調查顯示消費者最著重於涉及心臟疾病的功能性食物要求。預防癌症是營養品令 大量消費者感興趣的另一方面，但有趣的是在此領域消費者感到他們可發揮的控制作用最 小。事實上，根據世界衛生組織（World Health Organization)的報告，至少35%的癌症病 例是飲食相關的。此外涉及骨質疏鬆症，腸道健康和肥胖現象的需求也是關鍵的因素，它 們可能刺激功能性食物的購買並驅使市場發展。
[0464] 本發明的組合物可用於製備食品，諸如以下一種或多種：果醬、橘子醬、果凍、乳制 品（諸如牛奶或奶酪）、肉製品、家禽製品、魚產品和烘焙產品。
[0465] 舉例而言，本發明的組合物可用作以下製品的成分：軟飲料、水果汁或包含乳清蛋 白的飲料、健康茶飲、可可飲料、牛奶飲料和乳酸菌飲料、酸奶和酸奶飲品、奶酪、冰激凌、水 冰和甜品、糖果、餅乾蛋糕和蛋糕混合料、小吃、早餐穀物、速食麵和杯麵、速食湯和杯湯、平 衡食物和飲料、增甜劑、質地改善的快餐棒、纖維棒、烘焙穩定的水果餡、喜歡的糖汁（care glaze)、巧克力烘焙餡料、奶酪蛋糕味餡料、水果味蛋糕餡料、蛋糕和甜甜圈糖衣、熱穩定烘 焙餡料、方便烘焙餡料奶油、餅乾餡料、現成的烘焙餡料、減少熱量型餡料、成人營養飲料、 酸化豆漿/果汁飲料、無菌的/蒸餾的巧克力飲料、酒吧混合飲料、飲料粉、鈣加強型豆漿/ 純淨水和巧克力奶、鈣加強型咖啡飲料。
[0466] 本發明所述組合物可進一步用作食品中的成分，例如美國乾酪沙司、適於搓碎和 切碎奶酪的抗結劑、碎屑澆汁、奶油乾酪、幹混和攪拌澆頭脫脂酸奶油，冷凍的/融化的 牛奶鮮奶油、冷凍的/融化的穩定鮮鑲邊、低脂和清淡的天然切達乾酪、低脂的瑞士風味酸 奶、充氣冷凍甜品和新奇棒、硬填料冰激凌、標籤友好的、改良的經濟和特許的硬填料冰激 凌、低脂冰激凌：冷凍奶油狀、烤肉調味醬、乾酪澆頭調味料、村舍奶酪汁、幹混和Alfredo 沙司、混和奶酪沙司、幹混和番茄沙司及其它。
[0467] 對於某些方面，優選所述食品是飲料。
[0468] 對於某些方面，優選所述食品是烘焙產品-諸如麵包、丹麥酥皮餅、餅乾或曲奇 餅。
[0469] 本發明還提供了製備食物或食物成分的方法，所述方法包含根據本發明方法生產 的木聚糖酶或攜帶另外的食物成分的本發明所述組合物。用於製備食物或食物成分的方法 也是本發明的又一方面。
[0470] 在廣義上，本發明之具木聚糖酶活性的多肽可用於溶解和/或降解包含阿拉伯糖 基木聚糖的不溶植物細胞壁物質，改變例如降低含植物細胞壁物質之溶液或體系中由於半 纖維素或阿拉伯糖基木聚糖存在造成的粘性。通常所說的植物細胞壁物質會包含一種或多 種木聚糖酶抑制劑。
[0471] 明確的說，本發明之具木聚糖酶活性的多肽可用於加工植物材料來用作食品，諸 如動物飼料、用於澱粉生產、用於食物烘焙、用於以纖維素材料生產生物乙醇以及用於加工 木楽以造紙。
[0472] 本發明之具木聚糖酶活性的多肽可用於加工植物材料諸如用於包括動物飼料在 內的食品中的穀類。用於此處時，術語"穀類"意指用於食品的任何種類穀物和/或產生此 穀物的任何草，諸如但不局限於以下任一種：小麥、去殼小麥、大麥、玉米、高粱、黑麥、燕麥、 黑小麥和稻或它們的組合。在某一優選的實施方案中，所述穀類是小麥。
[0473] 通過使木聚糖接觸本發明之具木聚糖酶活性的多肽來改良食物和/或飼料補充 物中的木聚糖。
[0474] 用於此處時，術語"接觸"包括但不局限於用本發明之具木聚糖酶活性的多肽噴 灑、塗覆、灌注或分層覆蓋所述食物和/或飼料補充物。
[0475] 在某一實施方案中，可通過將具木聚糖酶活性的多肽直接與食物和/或飼料補充 物混合來製備本發明之食物和/或飼料補充物。舉例而言，可用具木聚糖酶活性的多肽接 觸（例如通過噴灑）到以穀類為基礎的食物和/或飼料補充物諸如去殼小麥、玉米或豆粉 上。
[0476] 還可能將具木聚糖酶活性的多肽摻入第二種（以及不同的）食物和/或飼料或飲 用水中，然後將其加入本發明的食物和/或飼料補充物中。因此，不是必須將本發明所述之 具木聚糖酶活性的多肽摻入以穀類為基礎的食物和/或飼料補充物本身中，儘管這樣的摻 入形成了本發明一個特別優選的方面。
[0477] 在本發明的某一實施方案中，可將食物和/或飼料補充物與其它的食物和/或飼 料組分聯合生產以穀類為基礎的食物和/或飼料。所述的其它食物和/或飼料組分可包括 一種或多種其它（優選熱穩定的）酶補充物、維生素食物和/或飼料補充物、礦物食物和/ 或飼料補充物和胺基酸食物和/或飼料補充物。然後可將由此產生的可能包含數種不同類 型化合物的（組合）食物和/或飼料補充物以適當的量與其它食物和/或飼料組分諸如谷 類和蛋白質補充物混和從而構成人的食物和/或動物的飼料。
[0478] 在某一優選的實施方案中，可通過將具適當活性的不同酶混和產生酶混合物來制 備本發明的食物和/或飼料補充物。舉例而言，可使由例如去殼小麥或玉米形成的以穀類 為基礎的食物和/或飼料補充物同時或順序接觸（例如通過噴灑）木聚糖酶和具適當活 性的其它酶。這些酶可包括但不局限於以下任何一種或多種：澱粉酶、葡糖澱粉酶、甘露聚 糖酶、半乳糖苷酶、植酸酶、脂肪酶、磷脂酶、半乳糖脂酶、葡聚糖酶、阿拉伯糖呋喃糖苷酶、 ferulyol酯酶、果膠酶、蛋白酶、葡萄糖氧化酶、己糖氧化酶和木聚糖酶。例如具所需活性的 酶可與本發明之木聚糖酶混和，混和或者在這些酶接觸以穀類為基礎的食物和/或飼料補 充物之前進行，或者所述的酶可同時或順序接觸這種以穀類為基礎的補充物。然後將食物 和/或飼料補充物與以穀類為基礎的食物和/或飼料混和來製備最終的食物和/或飼料。 還可能將食物和/或飼料補充物配製成各個酶活性的溶液，然後在將食物和/或飼料補充 物加工成丸粒或糊狀物之前將此溶液與食物和/或飼料物質混和。
[0479] 本發明提供了本發明之具木聚糖酶活性的多肽在食品製備工藝中的用途。本發明 所述之典型的烘焙產品包括麵包-諸如烤過的食物、卷狀食物、小圓麵包、比薩餅底等-椒 鹽卷餅、玉米粉圓餅、蛋糕、餅乾、曲奇餅、薄脆餅乾等。食品諸如烘焙產品的製備是本領域 眾所周知的。例如生麵團製造參閱實施例4。利用本發明之具木聚糖酶活性的多肽來改變 烘焙食物的性能參閱實施例4。
[0480] 本發明之具木聚糖酶活性的多肽還可用於從來自穀類和塊莖諸如馬鈴薯的植物 材料生產澱粉中。
[0481] 本發明之具木聚糖酶活性的多肽還可例如在造紙中用於加工木質紙漿。
[0482] 加工纖維素材料用於生物乙醇生產
[0483] 本發明之具木聚糖酶活性的多肽還可用於水解纖維素植物材料用於生產可發酵 成生物乙醇的糖。
[0484] 在某些具體的實施方案中，本發明所述具木聚糖酶活性的多肽在生麵團加工溫度 諸如大約20至大約40°C的範圍內具有最佳木聚糖酶活性。在某些實施方案中，本發明所述 具木聚糖酶活性的多肽在食物烘焙過程中被滅活。
[0485] 在某些替代的實施方案中，本發明所述具木聚糖酶活性的多肽與相應的野生型酶 相比具有提高的熱穩定性和/或溫度最適值，以便在熱處理之後保持活性。這兩種特性均 是本領域技術人員所已知的。 實施例
[0486] 實施例1-木聚糖酶的定位誘變和表達
[0487] 利用構建體獲得枯草芽孢桿菌木聚糖酶的特異突變體，所述構建體包含來自 pET24a 的核糖體結合位點（ctagaaataattttgtttaactttaagaaggagatatacat)，並且與不 帶信號序列（atggctagcacagactactggcaa--------tggtaa)之野生型木聚糖酶基因融合， 將其轉移至載體pCRBlunt (InVitrogen, Carlsbad, CA, USA)。這導致了在用構建好的載體 轉化後木聚糖酶在T0P10細胞（InVitrogen)中組成型表達，條件是所述基因的方向是〃 順時針〃方向。然後依照製造商的流程使用〃QuickChange〃誘變試劑盒（Stratagene, La Jolla，CA, USA)獲得該基因內的定位突變。突變體通過測序來驗證。通過將已轉化的T0P10 細胞以1升的規模進行培養來獲得足夠產量的已驗證的突變體。
[0488] 實施例2-木聚糖酶突變體的麩皮溶解研究
[0489] 由於小麥麩皮用於商業應用中，所以我們利用小麥麩皮作為底物來評估木聚糖酶 變體的比活性。
[0490] 麩皮底物：
[0491] 舉例而言，麩皮可以是通過實驗室規模的Chopin⑶Auto Mill (Chopin Technologies, France)利用供應商所提供的的設置和條件將小麥碾磨成小麥麵粉和麩皮 而獲自幹磨小麥的小麥麩皮。所獲得的麩皮組分可在麩皮溶解試驗中用作底物。在此實施 例中將小麥用作穀物來源。
[0492] 麩皮溶解試驗：
[0493] 將（0. IM)-磷酸氫二鈉（0. 2M)緩衝液，pH 5. 0中的小麥麩皮懸浮液配製成濃度 1，33%麩皮（w/w)。從此懸浮液中，將750ii 1等分試樣邊攪拌邊轉移入eppendorph管中。 將每個底物管在40°C預熱5分鐘。向其中加入250 ill酶溶液，使底物終濃度為1 %。從每 一種木聚糖酶製備三個稀釋液（一式兩份），對每個測定時間（〇, 30, 60和240分鐘）採用 逐步升高的酶濃度（〇, 33 ;1，0和3, 0 ii g木聚糖酶/克麩皮）。使用木聚糖酶熱變性溶液 作為空白。在給定的時間通過將管子轉移至設置為95°C的孵育器上終止反應。熱變性樣品 保存於4°C直至所有的酶反應終止。當所有的酶反應終止時，將Eppendorph管離心以獲取 清澈的上清液。酶溶解麩皮的能力以OD 41tl的增加表示，這是通過用PAHBAH試劑測定還原 性端基的增加而確定的（Lever, 1972)。
[0494] 簡而言之，還原性端基與PAHBAH反應，形成有色反應產物，它可在OD41tl進行定量。
[0495] 以上麩皮溶解試驗對於對麩皮底物中殘餘澱粉有活性的酶的附帶活性敏感。
[0496] 枯草芽孢桿菌木聚糖酶純化流程：
[0497] 通過離心（20分鐘，3500x g，20°C )收穫已表達木聚糖酶的大腸桿菌T0P10細胞 並重懸於 50mM Tris, 2mM EDTA, pH 7. 4 中。加入 lmg/ml 溶菌酶（ICN Biomedicals, Costa Mesa，CA, US，cat. No. 100831)打開細胞，在環境溫度將漿狀液體攪拌2小時，凍融後超聲處 理。用IM HCl將pH調到4. 0,隨後進行離心（20分鐘，3500x g，20°C )。用以50mM乙酸鈉 pH 4. 5平衡和洗脫的一次性F1D-IO脫鹽柱（Amersham Bioscience, Sweden)將包含木聚糖 酶的上清液進行脫鹽。將脫鹽後的樣品加到用50mM乙酸鈉（pH 4. 5)預平衡的IOml SOURCE 15S柱（Amersham Bioscience, Sweden)上。然後用平衡緩衝液清洗柱子並用線性NaCl梯 度（50mM乙酸鈉，0-0. 35M NaCl，pH 4. 5)進行洗脫。合併含木聚糖酶活性的組分並用於進 一步的分析。
[0498] 可調整相似的流程使其適於具有顯著不同於枯草芽孢桿菌XynA之pi的非枯草芽 孢桿菌XynA來源木聚糖酶變體。
[0499] 表1.木聚糖酶麩皮溶解活性，表示為最大光密度、木聚糖酶突變體的斜率、與木 聚糖酶BSl (如SEQ ID No. 1所示之枯草芽孢桿菌酶）和木聚糖酶BS3 (如SEQ ID No. 23 所示之枯草芽孢桿菌變體）相比的相對光密度和斜率
[0500]
【權利要求】
1. 具有木聚糖酶活性並包含以下特性之胺基酸序列的多肽，所述胺基酸序列與SEQ ID No. 1具有至少88%的同一性或者與選自SEQ ID No. 2-22的胺基酸序列具有至少75%的同 一性，並且該多肽在第110位具有胺基酸修飾，其中所述第110位通過序列比對確定為相應 於SEQ ID No. 1所示之枯草芽孢桿菌木聚糖酶序列第110位的位置。
2. 權利要求1所述的多肽，其具有木聚糖酶活性並且包含與SEQ ID No. 1具至少88% 同一性的胺基酸序列，並且該多肽在第110位具有胺基酸修飾，其中所述第110位通過序列 比對確定為相應於SEQ ID No. 1所示之枯草芽孢桿菌木聚糖酶序列第110位的位置。
3. 權利要求2所述的多肽，其中所述多肽與SEQ ID No. 1具有至少95%的同一性。
4. 權利要求1所述的多肽，其中所述多肽與選自SEQ ID No. 2-22之中的、與其具有最 高同一性百分比的序列具有至少76, 78, 80, 85, 90, 95, 98或95%的同一性。
5. 權利要求1-4中任一項所述的多肽，其具有β -果凍卷摺疊。
6. 權利要求1-5中任一項所述的多肽，其中第110位的胺基酸修飾是胺基酸取代。
7. 權利要求1-6中任一項所述的多肽，其中第110位的胺基酸修飾是替代成選自以下 的任一不同的胺基酸殘基：丙氨酸，精氨酸，天冬醯胺，天冬氨酸，半胱氨酸，穀氨酸，谷 氨醯胺，甘氨酸，組氨酸，異亮氨酸，亮氨酸，賴氨酸，甲硫氨酸，苯丙氨酸，脯氨酸， 絲氨酸，色氨酸，酪氨酸和纈氨酸。
8. 權利要求1-7中任一項所述的多肽，其中第110位的胺基酸修飾是替代成選自以下 的任一個不同的胺基酸殘基：穀氨酸，色氨酸，丙氨酸和半胱氨酸。
9. 權利要求8所述的多肽，其中第110位的胺基酸修飾是替代成丙氨酸。
10. 權利要求1-9中任一項所述的多肽，包含以下任何一個或多個胺基酸位置處的一 個或多個修飾：11，12, 13, 34, 54, 77, 81，99, 104, 113, 114, 118, 122, 141，154, 159, 162, 164， 166和175,所述位置被確定為SEQ ID No. 1所示之枯草芽孢桿菌胺基酸序列的相應位置。
11. 權利要求1-10中任一項所述的多肽，包含選自以下的一個或多個胺基酸取代：11F ,12F, 122D, 113A, 13Y, 54Q, 54W, 113D, 141Q, 175L, 122F, 34K, 99Y, 104W, 154R, 159D, 175K, 81 I，166F, 162E, 162D, 164F, 114D, 114Y, 114F, 118V, 175K, 77L, 77M, 77S, 77V 和 77Y,所述位置 被確定為SEQ ID No. 1所示之枯草芽孢桿菌胺基酸序列的相應位置。
12. 製備權利要求1-11中任一項所述多肽的方法，所述方法包括表達編碼所述多肽的 核苷酸序列；以及任選地在表達後分離和/或純化該多肽。
13. 編碼權利要求1 一 11中任一項所述多肽的核苷酸序列。
14. 一種組合物，其中包含權利要求1 一 11中任一項所述的多肽或依照權利要求12的 方法所製備的多肽或權利要求13所述的核苷酸序列混合非毒性組分。
15. 權利要求1 一 11中任一項所述的多肽或依照權利要求12的方法所製備的多肽或 權利要求13所述的核苷酸序列混合非毒性組分或者權利要求14所述組合物在修飾植物材 料的方法中的用途。
【文檔編號】C12N15/56GK104293747SQ201410515266
【公開日】2015年1月21日 申請日期:2009年12月23日 優先權日:2008年12月23日
【發明者】O·斯本森, J·F·索任森 申請人:杜邦營養生物科學有限公司