一對部分同序引物減少其二聚體的方法

2023-10-09 10:50:34

專利名稱：一對部分同序引物減少其二聚體的方法
技術領域：
本發明屬於分子生物學技術及核酸擴增PCR技術領域，具體涉及一種減少引物二 聚體形成的引物設計方法。
背景技術：
核酸研究從確立遺傳物質基礎為核糖核酸DNA起，歷經半個多世紀的探索，到 1953年Watson和Crick建立了 DNA雙螺旋結構模型及闡明了其中心法則，從而開啟了核 酸研究的分子生物學時代。由於各種核酸DNA都是由四種鹼基排列組成的僅編碼遺傳信 息不同的線性結構，其物理化學性能基本一樣，難以通過一般理化技術分離純化微量目的 基因或特異性檢測微量靶基因。二十世紀70、80年代美國冷泉港(Cold Spring Harber) 實驗室開發出了完整系統的基於細菌單克隆篩選基因文庫及轉化基因的分子克隆技術，然 而要得到目的基因仍是費時、繁瑣的工作。檢測靶基因只能通過合成探針經印跡雜交(Dot Blotting)才能檢測納克(ng)級的分子，且定量不準確，操作繁瑣。早在1971年，Korana就提出了核酸體外擴增的設想「經過DNA變性，與合適的 引物雜交，用DNA聚合酶延伸引物，並不斷重複該過程便可克隆tRNA基因」。1983年美國 PF-Cetus公司人類遺傳研究室的Kary Mullis偶然的產生了核酸擴增的靈感於試管中模 擬天然的DNA體內複製過程。提供一種合適的條件一模板DNA，寡核苷酸引物，DNA聚合 酶，合適的緩衝體系，DNA變性、復性及延伸的溫度與時間，就可成幾何級數地擴增已知兩端 序列的一段DNA分子。核酸擴增PCR反應由變性一退火一延伸三個基本反應步驟構成①模板DNA的 變性擬擴增的模板DNA經加熱至94°C左右一定時間後，使模板DNA雙鏈或經PCR擴增形 成的雙鏈DNA解離，使之成為單鏈，以便它與引物結合，為下輪反應作準備；②模板DNA與引 物的退火(復性)模板DNA經加熱變性成單鏈後，溫度降至左右，引物與模板DNA單 鏈的互補序列配對結合；③引物的延伸升溫至72°C左右，DNA模板一引物結合物在耐熱 DNA聚合酶的作用下，以dNTP為反應原料，靶序列為模板，按鹼基配對與半保留複製原理， 合成一條新的與模板DNA鏈互補的半保留複製鏈，不斷重複循環變性一退火一延伸三過 程，就可獲得更多的「半保留複製鏈」，而且這種新鏈又可成為下次循環的模板。每完成一 個循環需2 3分鐘，2 3小時就能將待擴目的基因呈指數擴增放大百萬倍以上。反應 最終的DNA擴增量可用Y= (1+X)n計算。Y代表DNA片段擴增後的拷貝數，X表示平⑴ 均每次的擴增效率，η代表循環次數。平均擴增效率的理論值為100%，但在實際反應中 平均效率達不到理論值。反應初期，靶序列DNA片段的增加呈指數形式，隨著PCR產物的 逐漸積累，被擴增的DNA片段不再呈指數增加，而進入線性增長期或靜止期，即出現「停滯 效應」 一平臺期。Mullis經過一系列研究證實了這一技術，申請了首個PCR發明專利(US Patent 4,683,202)。隨著ABI-PE等公司開發出各種熱循環PCR儀，包括最初的水浴鍋式，以及壓縮 機製冷式和目前廣泛應用的半導體製冷式PCR儀。1988年Saiki等從溫泉中分離的一株水生嗜熱桿菌(thermus aquaticus)中提取到Taq耐熱DNA聚合酶以及pfu、Vent、 Tth等其它耐熱聚合酶的發現應用，PCR技術逐漸成熟、實用，並因其高靈敏度、操作簡便 而快速傳播全世界，因而1989年稱為「PCR爆炸年」。在以後的二十年裡，多達數十種 PCR新改進，新方法不斷湧現，被發明，包括反轉錄PCR(RT-PCR)，原位PCR，連接酶鏈反應 (Ligase chain reaction, LCR),標記 PCR(Labeled primers, LP-PCR), Jx.( PCR(reverse PCR,擴增兩引物外側未知序列)，不對稱PCR(asymmetric PCR)，降落PCR(touchdown PCR)，重組 PCR(recombinant PCR)，巢式 PCR(nest PCR)，多重 PCR(multiplex PCR)，免 疫-PCR(immuno-PCR)，mRNA 差異 PCR，鏈替換擴增(Strand displacement amplification, SDA)，依賴核酸序列的擴增(Nucleic acidsequence-based amplif ication，NASBA)，轉錄 依賴的擴增系統(Transcript-based amplificationsystem, TAS)，Q^ 複製酶 ^hbeta r印licase)催化 RNA 擴增，滾環擴增(Rolling circleamplification, RCA)，環介導的等 溫擴增(Loop mediated isothermal amplification, LAMP)等，尤其是近年來各種實時 螢光PCR(Real-time PCR)技術的發展實現了從定性測定到精確定量的飛躍，如螢光染料 SYBR Green I 實時螢光 PCR和各種螢光探針 jTaqman(Hydrolysisprobe) ,FRETHybridition probes, and Molecular Beacons PCR,詳見綜述(Maisa L.Wong and Juan F. Medrano, BioTechniques 39 :75-85, July 2005)。實時螢光PCR定量分析是通過實時檢測擴增產物 量(螢光強度)與起始靶基因量直接相關而定量。擴增產物螢光信號達到對數期的循環數 Ct值(Cycle threshold)與靶模板起始拷貝數的對數存在負相關線性關係。即起始模板稀 釋一倍達到同樣對數期螢光強度所需的擴增循環就要增加一個循環數(Ct)。核酸擴增技術極大提高了基因克隆效率及核酸檢測靈敏度、效率，PCR應用已拓 展到生物學的許多領域。PCR技術已不是單一技術方法，而是包括一系列理論、方法學及應 用的新學科。詳細綜述於PCR書籍(黃留玉等「PCR最新技術原理、方法及應用」化學工業 出版社2005年)，PCR廣泛應用於分子克隆、測序、基因重組、蛋白質工程等生命科學研究， 及醫療、農林、畜牧、環保、食品等眾多檢測應用領域，成為現代分子生物學最核心的基礎技 術。截至目前全世界與PCR相關的專利已多達數千個以上。所有這些核酸擴增PCR技術的質量控制及實驗條件優化的核心、關鍵主要在於 其擴增引物的質控及設計。引物對的特異性(尤其3』端)長度、GC含量、退火及融解溫 度、穩定性、同源互補性及二級結構等等就決定了 PCR產物擴增的特異性、產物的有無、本 底背景大小、檢測靈敏度、是否可定量以及可重複性等等。關於引物的設計工作，現有許多 商業引物設計軟體如 PRIDE、PRIME+、D0PRIMER、PRIM0、MEDUSA 和 Primer Master 等，也有 更多的在線引物設計網址可供應用選擇，如I^rimerf……等等，詳見綜述(F.John Burpo, Biochemistry218 :1-11, Aug 2001 禾口 Vinay K. Singh&Anil Kumar, Molecular Biology Today2(2) :27_32，2001)。然而這些生物信息軟體只解決了以上這些一般性優化條件，採用 這些原則應用軟體設計的沒有連續互補序列的引物對，在特異性、長度、GC含量、退火溫度 Tm值及二級結構上最優化的合成引物對在實際工作中總或多或少存在引物二聚體問題，且 沒有規律性，試驗結果重複性差，優化後引物對仍形成二聚體的根本問題尚未見公開報導 的解決方法。引物二聚體的形成不僅產生高噪音本底，尤其嚴重幹擾採用螢光染料STOR Green I的實時螢光PCR低拷貝(copy)樣本的定量準確性或弱陽性的判斷；也競爭性幹擾 模板的特異性擴增效率，使大多數實時螢光定量PCR技術定量不精準。

發明內容
為了克服引物對二聚體造成的PCR高背景不易進行螢光染料STOR Green I實時 螢光PCR對低濃度樣本檢測分析的局限。本發明「一對部分同序引物減少其二聚體的方法」 根據任意對引物在STOR Green I實時螢光PCR檢測中總是或多或少存在引物二聚體，而任 意單一引物相互間只要沒有連續三個鹼基以上的互補，就總是沒有任何二聚體形成的實驗 前提，提供一種設計中間區部分序列相同的引物對，近似單一引物，從而大大減少二聚體形 成的設計合成方法。「一對部分同序引物減少其二聚體的方法」其特徵在於，沒有任何連續互補鹼基的 一對引物中間區域預先設置一段4-lOkis同樣序列，類似於單一引物自身的同樣序列，不 形成二聚體的機理，從而減少引物二聚體形成的程度，優化PCR質量。其特徵還在於中間部 分同序引物對3』末端為l-5kiSe靶特異性序列鹼基。其一 3』最末端鹼與另一 3』末端最 後兩鹼基絕對避免互補也要避免間隔互補鹼基，其特徵還在於中間部分同序引物對5』端區 域沿5』 -3』方向平行比對，不要有3個以上間隔鹼基互補。所述的「一對部分同序引物減少其二聚體的方法」的引物設計，其策略原則是首 先遵守一般引物設計所有原則，選擇一對16 Mkise長的優化引物對，在其中間位置，都 從5』 -3』方向設置一段4 lOkise完全相同的序列，優選設置6 Sbase完全相同序列； 引物對3』末端(即相同序列下遊尾端)為1 5個base靶特異性序列，優選2 4base 絕不連續互補的靶特異性序列，也儘量避免不連續的單個互補鹼基，最多允許一對互補，還 不能在最末端兩鹼基；引物對5』端區(即相同序列上遊首端區)為4 10個kise靶特異 性序列，優選6 Sl3ase絕對沒有連續互補的靶特異性序列，儘量選擇較少的不連續的單個 互補，最多只允許間隔的3對不連續互補鹼基。所述的「一對部分同序引物減少其二聚體的方法」優化PCR，其特徵是中間部分同 序的引物對(下面將簡稱「同序引物對」)，進行STOR Green I實時螢光PCR。同序引物對 的濃度(1_5μΜ)也很重要，濃度不僅影響靶模板擴增效率(Ct讀值)，過濃引物也將本底 的Ct值前移(數字減少)，幹擾低濃度靶模板檢測時的正確判斷。為了更進一步增加擴增 特異性和減少循環前低溫非特異性反應，聯合採用各種熱啟動DNA聚合酶，化學修飾耐熱 聚合酶或加熱緩釋Mg2+緩衝液等各種PCR優化方法，將更加極大地完善採用同序引物對的 SYBR Green I實時螢光PCR質量。所述的「一對部分同序引物減少其二聚體的方法」增加PCR靈敏度，其特徵是使用 新型STOR Green ER螢光染料，提高靈敏度10倍以上；也可聯合採用巢式nest-PCR，先利 用靶外側較長特異性引物(加低濃度)預先小量循環擴增靶基因，再採用靶內側短的同序 引物對常規進行實時螢光定量PCR擴增分析等。所述的「一對部分同序引物減少其二聚體的方法」用於創新PCR，其特徵是採用單 一引物，並與靶特異性引物聯用，這樣就絕對沒有引物二聚體的困擾。單管兩步法擴增，先 用稀有基因靶特異嵌合引物進行長時高溫退火少量熱循環擴增特異性靶基因，產生兩端均 帶少量稀有基因的二次靶模板，再採用單一稀有基因序列引物，常規退火溫度退火結合二 次模板兩側定量PCR擴增分析。所述的「一對部分同序引物減少其二聚體的方法」用於軟體，基因檢測盒，盒成份包括核酸提取試劑，IOmM dNTPs, Taq聚合酶及其緩衝液，螢光染料、螢光探針，引物F/R。本發明「一對部分同序引物減少其二聚體的方法」，其理論依據是基於長期的實時 染料螢光PCR試驗經驗總結。在沒有加陽性靶基因的核酸擴增系統中，最佳設計的任意引 物對總是存在一定的Ct值，約在25至35循環數之間，而僅加雙倍量任意單一引物的螢光 值(引物延伸時讀取螢光值)總是一條直線，沒有高出基線的Ct讀值。也就是說優化的任 意引物對(序列特異)總會形成一些二聚體，其解鏈溫度多在75°C-77°C;而單一引物在相 同條件下絕對不會形成引物二聚體。見圖1。這就提出了一條創新途徑，如果一對引物近似 單一引物就不會產生二聚體，那麼引物對怎樣相似或相同多少就可以像單一引物而不會形 成二聚體？為什麼沒有互補序列及內部互補髮夾二級結構的單一引物不會形成引物二聚 體？分子機理是什麼？沿著這條思路，從二聚體形成理論機制和檢測引物二聚體最靈敏的 SYBR Green I實時螢光PCR實驗兩個方面來破解引物二聚體形成真正原因，找出減少引物 二聚體程度的正確方向。首先採用螢光染料STOR Green I實時螢光PCR，試驗系列引物對近似度與二聚體 程度的關係。螢光染料STOR Green I是一種雙鏈DNA結合染料，游離時不發出螢光，隨著 雙鏈模板擴增，相對應結合的染料就越多，發出的螢光強度Ct值與最初靶基因濃度存在負 對數關係。但是引物二聚體雙鏈亦同樣有效結合染料而發出螢光。試驗選擇一條特異性序 列引物A，不加靶模板，僅加雙倍濃度單一引物A的螢光PCR系統擴增，螢光值僅為一條直 線；再人工合成另一條有四個鹼基(base)以下連續不同的同一序列寡核苷酸引物B，與引 物A作為引物對，A-B不加模板擴增，螢光值大多為一條直線，部分僅在Ct38才高出基線一 點點，而且連續四個不同鹼基在引物中的位置沒有影響，說明高度近似的引物對基本沒有 二聚體；再人工合成另一條C有7個以上連續不同，但與A沒有連續互補的同一引物，與最 初A引物作為引物對，A-C不加模板擴增，其Ct值大多為30 35，甚至連續7個kise以上 不同位於引物5』端也會使螢光值升高，Ct值為30 35。說明不連續的鹼基互補，只要足 夠多G 6個以上)就能使引物對相互靠近結合，使其3』端找到互補點結合延伸形成二 聚體。換句話說A-C引物對3』端6 Sbase以上連續相同，均為同樣序列末端的引物，只 要引物對哪怕是5』端有3個kise以上連續互補，或4 6個kise以上不連續互補就可以 增加引物二聚體形成程度；再人工合成另一條D引物，5』端與A有4個kise不同，同時3』 端有3kiSe不同，組成A-D引物對，螢光值仍在Ct值35以後才高出基線，也不容易形成二 聚體；這就說明不連續的鹼基互補，距離越近就越類似連續鹼基互補，容易結合形成引物二 聚體。距離越遠，結合力就會越分散，不易形成引物二聚體。最後合成一與A序列完全相同 但5』 一3』方向相反的E引物，A-E引物對不加模板擴增，Ct值仍約30左右，與普通引物對 形成二聚體無異。這就更進一步說明，一對引物高度近似性且必須都是5』 -3』方向相比較 高度近似性才是避免引物二聚體的唯一正確方向。結果見圖2。再由此推導出引物二聚體形成機理的理論假設一般的高度互補引物對二聚體形 成機理是以其3』末端大段連續的互補鹼基對頭(一條5』 -3』方向，另一條3』 -5』方向) 方式配對結合，末端在聚合酶和底物dNTP作用下延伸，形成二聚體雙鏈。而優化的引物對 沒有連續互補鹼基形成的合力，其3』末端極少幾個不連續互補鹼基形成氫鍵的能力太弱， 不足以抵抗引物鏈因大量磷酸基團負電荷所形成水化分子顆粒之間的斥力及分子熱運動 的阻力，即使降低引物溶液溫度也不足以配對結合，還需要除3』末端外的更多個不連續互補鹼基的合力才能促使3』末端極少的互補鹼基氫鍵形成。因此，一般優化引物對形成二聚 體過程是優化引物對首先是均以5』 -3』方向平行配對，以多個不連續互補鹼基的合力形 成多處氫鍵，促使引物對3』末端靠近並使末端扭曲，以局部對頭配對，將末端極少的不連 續互補鹼基配對形成氫鍵，再互為「引物」延伸形成引物二聚體。單一引物自身不能形成二 聚體的機理也就清楚了 首先自身引物對以5』 -3』方向平行完全不能配對，僅靠3』末端極 少的不連續互補鹼基不足以形成氫鍵，絕對形成不了二聚體。當然，單一引物其一 3』末端 也可以對頭方式與另一引物5』區偶爾配對，其極少的互補鹼基藉助3』末端以外的多處不 連續互補鹼基合力而形成氫鍵，產生極少量的短二聚體，其解鏈溫度低於65°C，基本不影響 本底。而同一反向引物對，序列完全相同，僅其中一條顛倒順序的引物對，對頭時雖完全相同，不形成二聚體；但均以5』 -3』平行配對時總會形成一些多個不連續間隔的氫鍵，助其 3』末端配對結合，延伸形成二聚體，與普通引物對無異。引物對設計的核心關鍵首先如絕大多數已發表的引物設計策略，引物對正反兩 個方向相比較都不能有連續的互補鹼基。但是，引物對平行之間(均5』-3』方向平行對比， 逐一或許平移比對)有多個相近的不連續間隔的互補鹼基亦是影響引物二聚體形成的關 鍵因素。關於這方面的實驗、理論和引物設計還尚未見報導。引物設計時選擇沒有(排除) 任何連續的互補鹼基的引物較容易，但對於多數長約20個kise的引物，由於僅4種鹼基的 排列組合很容易產生多處不連續的、間斷的互補鹼基，足以影響二聚體的形成。怎樣將這些 不連續的互補鹼基數降低到數量最少和合力最小。策略是在引物對序列中間設置一段序列 完全相同的部分以提高引物對的相同性，並將相同序列置於不連續的互補鹼基序列中間以 分散它們的合力，分散越遠合力就越小。由此得出一創新引物設計原則首先遵守一般引物 設計所有原則，選擇一對16 Mbase長的優化引物對，在其中間位置，都從5』_3』方向設置 一段4 lOkise完全相同的序列，優選設置6 Skise完全相同序列；引物對3』末端(即 相同序列下遊尾端)為1 5個lDase靶特異性序列，優選2 4base絕不連續互補的靶特 異性序列，也儘量避免不連續的單個互補鹼基，最多允許一對互補，還不能留在最末端；引 物對5』端區(即相同序列上遊首端區)為4 10個kise靶特異性序列，優選6 Sbase 絕對沒有連續互補的靶特異性序列，儘量選擇較少的不連續的單個互補，最多只允許間隔 的3對不連續互補鹼基。接下來是怎樣找到引物對中間預選的6 8個kise完全相同序 列？首先選擇一段靶基因，將其有意義鏈與反意義鏈都從5』 -3』端方向排序(Alignment) 分析，有4 5kiSe相同序列的較多，6 Sbase以上完全連續相同的情況少見一些，大部 分基因總會有一段這樣中間隔100-300bp的迴文序列。再按上面的原則選優。如果機遇不 佳，只能找到4 ^ase的相同序列，也可選擇引物對的其中一條在相同序列的上遊相鄰處 (即引物中間)突變一個鹼基與另一條相同，增加一個相同鹼基，達到5-6個kise完全相同 序列，並在這一條引物5』端和3』端，各再加1 2個base原靶序列的相應鹼基以彌補中 間鹼基突變所造成的退火溫度損失。最高相似度引物設計策略就是PCR上下遊擴增引物乾脆採用單一引物，這樣就絕 對沒有引物二聚體的困擾。也就是人造單一引物與靶基因特異性引物相結合的方法。首先 在一對長達25kiSe的靶特異性上下遊引物5』端前面都加上同一個12 13kiSe長的稀 有基因序列，併合成一對長約35 40kiSe的雜合引物對。單管兩步法擴增，先加常規量1/20-1/50濃度的這對雜合引物(二聚體量少)，利用其3』端的靶特異性進行長時高溫退 火結合靶模板，預先少量熱循環擴增特異性靶基因，產生兩端均帶少量稀有基因的二次靶 模板，再合成同一稀有基因序列3』端後面加上34base的靶特異性引物對5』首端序列而 合成的高達90%相同的引物對，常規退火溫度退火結合二次模板兩側，最後定量PCR擴增 分析。採用中間部分同序的引物對(下面將簡稱「同序引物對」)，進行STOR Green I實 時螢光PCR。同序引物對的濃度也很重要，濃度不僅影響靶模板擴增效率(Ct讀值)，過濃 引物也將本底的Ct值前移(數字減少)，幹擾低濃度靶模板檢測時的正確判斷。為了更進 一步增加擴增特異性和減少循環前低溫非特異性反應，聯合採用各種熱啟動DNA聚合酶， 化學修飾耐熱聚合酶或加熱緩釋Mg2+緩衝液等各種PCR優化方法，將更加極大地完善採用 同序引物對的STOR Green I實時螢光PCR質量。常規STOR Green I定量實時螢光PCR最 小檢出靈敏度可達50拷貝(copy) /次反應，如果需要進一步增加檢測靈敏度，既可使用新 型STOR GreenER螢光染料，提高靈敏度10倍以上；也可聯合採用巢式nest-PCR，先利用靶 外側較長特異性引物(加低濃度)預先小量循環擴增靶基因，再採用靶內側短的同序引物 對常規進行實時螢光定量PCR擴增分析等。一、引物對相似度與二聚體形成的實時PCR實驗採用STOR Green I螢光染料的實時PCR，在開始的1_15個循環中，靶基因擴增量 還不是增加很多，STOR Green I染料結合雙鏈DNA發出螢光的值很低，到15個循環後DNA 增加進入對數期，每個循環產量增加一倍；很快DNA合成的底物和聚合酶急劇消耗，對數後 期每一個循環產量不到理論的一倍；最後產量不再增加，進入平臺期。所以對數早期定量是 最精準的，因此，以最初的1-15個循環平均螢光值作為基線，人為設置高於基線10倍螢光 值的循環數作為循環閾值Ct (Cycle threshold)值。初始靶分子稀一倍，擴增達到同樣量 (同樣螢光值)的循環數Ct值就要多一個，反之靶分子濃一倍，Ct值就少一個，為負對數關 系。染料實時螢光PCR定量靶分子Ct值一般在15-30之間定量較準確。問題是一對 引物不加靶模板擴增時Ct值往往在30-35之間，甚至在30左右，幹擾低濃度靶分子的測 定。而雙倍量的單一引物不將模板擴增螢光值為一直線，不升高進入對數期，沒有Ct讀值， 也就說單一引物沒有二聚體雙鏈形成。因此選擇B型肝炎病毒HBV靶基因的一條引物HBVR2作為實驗，以HBVR2基準引 物為人為設計合成系列逐步變異(變異部位以下劃線表示)不同的引物作為引物對不加模 板擴增，來測試引物對相似程度與二聚體形成之間的關係。HBVR2 :5，_c atg gtg ctg gtg aac_3，Bia3F3 :5， _c atg gtg ctg gtg tct_3，Bia5F4 :5，~r get gtg ctg gtg aac_3，BiamF 5' -c atg gtc gag gtg aac_3，Bia53F:5，~g_gac gtg ctg gtg tct_3，Bia5F7 :5，~r Rct tea ctg gtg aac_3，和一條完全倒置反向的HBVR2 DHBVF 5' —caa gtg gtc gtg gta c_3，
設置6組變異引物對PCR反應
變異引物作為上遊引物F(5 μ Μ)0. 5μ 1
下遊HBVR2反向引物(5 μ Μ)0. 5μ 1
IOmM dNTP0. 5μ 1
IOXTaq buffer2. 5μ 1
Taq0. 5μ 1
SYBR Green I1. 5μ 1
dH2019 μ 1
25 μ 1
和單一引物HBVR2對照
下遊HBVR2反向引物(5 μ Μ)1 μ 1
IOmM dNTP0. 5μ 1
IOXTaq buffer2. 5μ 1
Taq0. 5μ 1
SYBR Green I1. 5μ 1
dH2019 μ 1
另設一有HBV模板陽性對照pUCHBV+P上遊HBVF2正向引物(5 μ M)下遊HBVR2反向引物(5 μ Μ)IOmM dNTPIOXTaq bufferTaqSYBR Green IClH2O_25 μ 1上實時螢光PCR儀(西安天隆公司TL988型和MJ Inc. DNA Engine 0ption 2)。 首先變性94°C 4分鐘，然後40個循環，95°C 30秒，52°C 30秒，74°C 30秒。於74°C讀取熒 光值，並設置52°C _95°C融解曲線分析。實驗結果見圖2 除Bia5F7和DHBVF的Ct值明顯提前外，其它組Ct值較雙倍單 一引物實驗組對照變化不是很大。二、引物設計公式和STOR Green I實時螢光PCR定量實時螢光PCR中間部分同序引物對F/R的設計公式為首先排除任何連續互補鹼
基序列。L(LeftTerminal 5，區)+M(Middle 中間同序區)+R(Right End 3，端)=長度
25 μ 1
0. 5μ 1 0. 5μ 1 0. 5μ 1 0. 5μ 1 2. 5μ 1
0.5μ 1
1.5μ 1 18. 5μ 116-24base。L :F/R比對至少不能有3個以上間隔互補鹼基的靶特異序列，或F/R為完全同樣 鹼基序列。M :F/R都為4-lOlDase同樣鹼基序列並為靶特異序列。R :F/R為l-5kiSe靶特異序列，其一 3』最末端不與另一 3』末端最後兩鹼基互補， 亦不能有間隔互補鹼基。SYBR Green I實時螢光PCR定量單個反應模板(Template)10 μ 1上遊正向引物F (5 μ Μ)0. 5μ 1下遊反向引物R(5 μ Μ)0. 5μ 110mM dNTP0. 5μ 110XTaq buffer2. 5μ 1Taq0. 5μ 1SYBR Green I1. 5μ 1dH209μ 1 _25 μ 1實際操作時，每個樣本取40 μ 1，加入30 μ 1 A液(包括上遊正向引物F 2μ 1, IOmM dNTP 2 μ 1，SYBR Green I 6 μ 1, dH20 20 μ 1)和 30 μ 1 B 液(含下遊反向引物 R 2μ 1，IOXTaq buffer 10 μ l，Taq 2μ l,dH20 16 μ 1)。然後每個樣本分取 3 份X 25 μ 1 平 行檢測，分析統計結果。上實時螢光PCR儀(西安天隆公司TL988型和MJ Inc. DNA Engine 0ption 2)。 首先變性94°C 4分鐘，然後40-45個循環，95 °C 20-30秒，52 °C 20-30秒，74°C 20-30秒。於 74°C讀取螢光值，並設置52°C _95°C融解曲線分析。


圖1.為三對典型引物對二聚體和三個單一引物實時螢光PCR螢光值圖，單一引物
螢光值為一直線。圖2.為引物對相似度與二聚體形成的實時螢光PCR循環數Ct值分析，Bian5F7/ HBVR2的循環數CU8. 3，DHBF/HBVR2的循環數CU6，其餘都約Ct37_38。圖3.為HBV實時螢光PCR定量雙份間的平行性和圖4的線性分析。圖5.為HBV實時螢光PCR精確定量和圖6的線性分析。具體實施例B型肝炎病毒載量實時螢光PCR檢測以下實施例進一步說明本發明的內容，但不應理解為對本發明的限制。在不背離 本發明精神和實質的情況下，對本發明方法、條件、步驟及應用所作的修改或替換，均屬於 本發明的範圍。乙型病毒性肝炎(簡稱B肝)由B型肝炎病毒Ofepatitis B virus, HBV)引起 的一種世界性的傳染性疾病。在我國人群中B肝感染率非常高，極大的危害了人們的身體 健康。目前B肝的檢測方法主要有酶免疫法、放免法、化學發光法、免疫螢光法、核酸擴增(PCR)螢光定量法等。酶免疫法應用較廣，但是實時螢光PCR定量法可以精確測定B型肝炎 病人的病毒載量，對感染者病毒複製水平的判斷，病情傳染性及抗病毒藥物療效監測具有 無法替代的重要作用。選取B型肝炎病毒Ofepatitis B virus，HBV)X區(1545-1887)序列如下加粗部 分為保守區，劃線部分為實時螢光PCR擴增引物。將全長該序列克隆到PUC19
權利要求
1.「一對部分同序引物減少其二聚體的方法」，其特徵是設計PCR的一對擴增引物最基 本原則是盡最大比例的近似單一引物。所述PCR引物對中間區域沿5』 -3』方向設置一段 4-10BASE同樣序列以分散引物鏈多處間隔互補鹼基所形成氫鍵的合力；所述引物3』末端 預留Hbase，其一 3』最末端與另一條3』末端最後兩個鹼基絕對避免互補，也要避免有間 隔的鹼基互補。所述中間部分同序引物對5』端區域沿5』-3』方向平行比對，不要有3個以 上間隔鹼基互補，從而優化PCR質量。
2.根據權利要求1所述的「一對部分同序引物減少其二聚體的方法」，其設計原則是 首先遵守一般引物設計所有原則，選擇一對16 Mbase長的優化引物對，在其中間位置， 都從5』-3』方向設置一段4 lOkise完全相同的序列，優選設置6 Sbase完全相同序列； 引物對3』末端(即相同序列下遊尾端)為1 5個base靶特異性序列，優選2 4kiSe 絕不連續互補的靶特異性序列，也儘量避免不連續的單個互補鹼基，最多允許一對互補，還 不能留在最末端；引物對5』端區(即相同序列上遊首端區)為4 10個kise靶特異性 序列，優選6 Sbase絕對沒有連續互補的靶特異性序列，儘量選擇較少的不連續的單個互 補，最多只允許間隔的3對不連續互補鹼基。
3.根據權利要求1所述的「一對部分同序引物減少其二聚體的方法」，其特徵是中間部 分同序的引物對(下面將簡稱「同序引物對」)，進行STOR Green I實時螢光PCR。同序引 物對的濃度也很重要，濃度不僅影響靶模板擴增效率(Ct讀值)，過濃引物也將本底的Ct值 前移(數字減少)，幹擾低濃度靶模板檢測時的正確判斷。為了更進一步增加擴增特異性 和減少循環前低溫非特異性反應，聯合採用各種熱啟動DNA聚合酶，化學修飾耐熱聚合酶 或加熱緩釋Mg2+緩衝液等各種PCR優化方法，將更加極大地完善採用同序引物對的STOR Green I實時螢光PCR質量。
4.根據權利要求1所述的「一對部分同序引物減少其二聚體的方法」，其特徵是使用新 型STOR Green ER螢光染料，提高靈敏度10倍以上；也可聯合採用巢式nest-PCR，先利用 靶外側較長特異性引物(加低濃度)預先小量循環擴增靶基因，再採用靶內側短的同序引 物對常規進行實時螢光定量PCR擴增分析等。
5.根據權利要求1所述的「一對部分同序引物減少其二聚體的方法」，其特徵採用單一 引物，這樣就絕對沒有引物二聚體的困擾。單管兩步法擴增，先進行長時高溫退火少量熱循 環擴增特異性靶基因，產生兩端均帶少量稀有基因的二次靶模板，再採用單一稀有基因序 列引物，常規退火溫度退火結合二次模板兩側定量PCR擴增分析。
6.根據權利要求1所述的「一對部分同序引物減少其二聚體的方法」，其特徵是所述的 「一對部分同序引物減少其二聚體的方法」基因擴增試劑盒，成份包括樣本核酸提取試劑， IOmM dNTPs, Taq聚合酶及其緩衝液，螢光染料、螢光探針，引物F/R。
全文摘要
本發明「一對部分同序引物減少其二聚體的方法」，根據發明人的發現-沒有連續互補鹼基的引物對沿5』-3』方向平行配對形成多處間隔氫鍵的合力促使它們3』末端個別互補鹼基形成氫鍵使末端結合延伸成二聚體；和單一引物自身不形成二聚體的現象。盡最大比例設計PCR引物對近似單一引物。其特徵在於PCR引物對中間沿5』-3』方向預設一段4-10bsae同樣序列，所述引物對3』末端1-5base避免間隔互補鹼基，所述5』端區避免3個以上的間隔互補鹼基，最好5』端完全同序。可極大減少引物二聚體形成，優化PCR質量，尤其是螢光染料實時PCR。
文檔編號G01N21/64GK102146432SQ20101010537
公開日2011年8月10日 申請日期2010年2月4日 優先權日2010年2月4日
發明者劉濤, 張寶林, 張輝, 江必勝, 江洪 申請人:北京泰格瑞分子檢驗有限公司