一種肉雞腸道微生物的定量檢測方法與流程

2023-10-26 06:36:37 2

本發明屬于于家禽腸道微生物檢測
技術領域：
，具體地說，涉及一種肉雞腸道微生物的定量檢測方法。
背景技術：
：動物消化道存在著數目龐大、相對穩定的微生物群落。菌群的多樣性能夠保證腸道微生物區系平衡。微生物群落能夠維持胃腸道環境相對穩定，促進營養物質消化吸收。家禽的大腸很短，食糜會很快進入盲腸，所以盲腸是微生物生存和活動的重要場所。家禽腸道微生物分布，種類和數量的檢測方法目前採用兩種方法，一種是平板計數法，該法誤差大，易汙染，檢測結果為活菌數，檢測效果不好，並且耗時耗勞力。另一種是實時螢光定量pcr法，該方法靈敏度高，汙染小，但依賴於標準品，檢測菌種選擇少，特異性不強。絕對定量pcr(absolutequantificationpcr，aq-pcr)技術是利用已知起始拷貝數的標準樣品作出標準曲線，通過測定未知樣品的ct值，從標準曲線上計算出該樣品的起始濃度，實現了對測定樣本基因的分子拷貝數的絕對定量。目前廣泛應用的相對螢光定量pcr技術只是測定樣本中的靶序列相對於參照樣本量的變化，而不能測出初始模板起始拷貝數的絕對量。標準曲線的製備是絕對螢光定量pcr實驗的關鍵步驟，目前家禽腸道微生物絕對定量pcr法多選擇已知菌株為標準品，提取基因組製備標準曲線，測定樣品時，標準品與未知樣品同時進行pcr循環，根據未知樣品的ct值，結合標準曲線來求得未知樣品cdna的起始拷貝數。該方法會受到標準品的限制，檢測菌種選擇少，特異性不強，並且標準品菌株是利用平板計數法確定活菌數，存在較大誤差。技術實現要素：有鑑於此，本發明針對家禽腸道微生物檢測方法目前存在誤差大，耗時，檢測效果不好，檢測菌種限制，特異性不強的問題，提供了一種肉雞腸道微生物的定量檢測方法。為了解決上述技術問題，本發明公開了一種肉雞腸道微生物的定量檢測方法，包括以下步驟：步驟1、dna提取：採用糞便基因組提取試劑盒，將肉雞盲腸內容物總dna提取於1.5mlep管中，測其核酸濃度，滅菌超純水稀釋到20ng/μl，與原液一起保存於-20℃冰箱，待用；步驟2、合成肉雞腸道微生物pcr引物；步驟3、構建肉雞腸道微生物質粒；步驟4、製作標準品；步驟5、進行樣品檢測。進一步地，所述步驟3中構建肉雞腸道微生物質粒具體為：1)以肉雞腸道內容物總dna為模板，用步驟1中的引物進行pcr擴增，按照pcr反應體系擴增產物，瓊脂糖凝膠電泳，用瓊脂糖凝膠dna小量回收試劑盒回收純化目的片段，測od值，-20℃保存；2)用試劑盒將1)中純化的目的片段連結在載體上並轉化，按照說明書製備10μl連接混合液，16℃，30min；1μl混合液加入10μldh5α冰上30min，做一個重複組；42℃熱激90s，冰上3min；500μl的lb培養基，37℃，復甦45-60min，220rpm/min；4000rpm/min離心，2min，棄400μl，重懸，la平板上塗板，37℃過夜培養，不超過16h；3)挑取單菌落白斑，於10ul液體la培養基中，取1ul進行菌落pcr，剩下的加500ul的液體la培養基；pcr結果陽性的菌液測序；4)測序結果在blast上比對，陽性結果菌液發酵後試劑盒提取質粒；5)質粒測序，ncbi上blast比對結果，挑選與目的菌株匹配的質粒，檢測dna濃度，保存於-20℃冰箱，備用。進一步地，所述步驟4中製備標準品具體為：將質粒按十倍稀釋法，用滅菌超純水稀釋成10-1-10-9的濃度梯度，取9個無菌的1.5mlep管，根據濃度由大到小依次編號1-9，並各加入90μl滅菌的超純水，取肉雞腸道微生物標準質粒原液10μl於試管中，快速輕柔吹打20-30次，重複該步驟至9號ep管，得到包括原液的10個梯度的標準品。進一步地，所述步驟5中樣品檢測具體為：選取3-7號標準品與樣品稀釋液一起進行螢光定量pcr反應；試驗所用設備為bio-rad96孔螢光定量pcr儀。進一步地，pcr反應的反應體系為上遊引物和下遊引物各0.8μl；rnase-freeddh2o7.4μl；sybrgreensupermix10μl；dna模板1μl。進一步地，所述螢光定量pcr反應的反應條件：預變性階段，1次循環，溫度95℃，預變性30s，不採集螢光信號；pcr反應階段，40次循環，溫度95℃，變性5s，退火溫度50-60℃，時間30s，溫度72℃，延伸20s，採集螢光信號；溶解曲線，72℃到95℃，每2s上升0.5℃。進一步地，所述肉雞腸道微生物為總菌、乳桿菌或大腸桿菌中的一種。與現有技術相比，本發明可以獲得包括以下技術效果：1)本發明提供的肉雞腸道微生物檢測的方法採用的是螢光定量pcr方法，具有特異性高，重複性好，靈敏度高等特點；2)本發明通過利用腸道菌群的特異性保守基因片段插入載體構建質粒的方法，提高了菌種檢測的準確性，解決了標準菌株做標準曲線的局限性；3)本發明通過對肉雞腸道微生物的絕對定量，可以確定某種菌的絕對拷貝數，對腸道菌群多樣性和豐度的分析提供了參考依據。本發明可以用於其他動物腸道微生物水平的檢測。當然，實施本發明的任一產品並不一定需要同時達到以上所述的所有技術效果。附圖說明此處所說明的附圖用來提供對本發明的進一步理解，構成本發明的一部分，本發明的示意性實施例及其說明用於解釋本發明，並不構成對本發明的不當限定。在附圖中：圖1是本發明實施例1中的肉雞腸道乳桿菌絕對定量pcr標準曲線；圖2是本發明實施例1中的乳桿菌質粒標準品實時定量pcr溶解曲線；圖3是本發明實施例1中的擴增曲線；圖4是本發明實施例2中的肉雞腸道總菌數絕對定量pcr標準曲線；圖5是本發明實施例2中的總菌質粒標準品實時定量pcr溶解曲線；圖6是本發明實施例2中的擴增曲線；圖7是本發明實施例3中的肉雞腸道腸球菌絕對定量pcr標準曲線；圖8是本發明實施例3中的腸球菌質粒標準品實時定量pcr溶解曲線；圖9是本發明實施例3中的擴增曲線。具體實施方式以下將配合實施例來詳細說明本發明的實施方式，藉此對本發明如何應用技術手段來解決技術問題並達成技術功效的實現過程能充分理解並據以實施。實施例1肉雞腸道乳桿菌的定量檢測方法該方法包括以下步驟：步驟1、dna提取：採用糞便基因組提取試劑盒，將肉雞盲腸內容物總dna提取於1.5mlep管中，測其核酸濃度，滅菌超純水稀釋到20ng/μl，與原液一起保存於-20℃冰箱，待用；步驟2、引物合成：合成肉雞腸道乳桿菌pcr引物，其上遊引物為cgatgagtgctaggtgttgga，核苷酸序列如seqidno.1所示；下遊引物為caagatgtcaagacctggtaag，序列如seqidno.2所示；步驟3、構建質粒：1)以肉雞腸道內容物總dna為模板，用步驟2中的引物進行pcr擴增，按照表1的pcr反應體系擴增產物，瓊脂糖凝膠電泳，用瓊脂糖凝膠dna小量回收試劑盒(magen,d2111-02)回收純化目的片段，測od值，-20℃保存。2)用試劑盒pmdtm19-tvectorcloningkit(takara，6013)將1)中純化的目的片段連結在載體上並轉化，按照說明書製備10μl連接混合液，16℃，30min；1μl混合液加入10μldh5α冰上30min，可做一個重複組；42℃熱激90s，冰上3min；500μl的lb培養基，37℃，復甦45-60min，220rpm/min；4000rpm/min離心，2min，棄400μl，重懸，la平板上塗板，37℃過夜培養，不超過16h。3)挑取單菌落白斑，於10ul液體la培養基中，取1ul進行菌落pcr，剩下的加500ul的液體la培養基。pcr結果陽性的菌液測序。4)測序結果在blast上比對，陽性結果菌液發酵後試劑盒提取質粒(20ml體積菌液回收一管)。5)質粒測序，ncbi上blast比對結果，挑選與目的菌株匹配的質粒，檢測dna濃度，保存於-20℃冰箱，備用，肉雞腸道乳桿菌質粒如基因序列seqidno.3所示。步驟4、標準品的製作：將質粒按十倍稀釋法，用滅菌超純水稀釋成10-1-10-9的濃度梯度，取9個無菌的1.5mlep管，根據濃度由大到小依次編號1-9，並各加入90μl滅菌的超純水，取乳桿菌標準質粒原液10μl於試管中，快速輕柔吹打20-30次，重複該步驟至9號ep管，得到包括原液的10個梯度的標準品；步驟5、樣品檢測：選取3-7號標準品與樣品稀釋液一起按照表1的反應體系以及表2的反應條件進行螢光定量pcr反應。試驗所用設備為bio-rad96孔螢光定量pcr儀。表1pcr反應體系試劑體積上遊引物0.8μl下遊引物0.8μlrnase-freeddh2o7.4μlsybrgreensupermix10μldna模板1μltotal20μl表2pcr反應條件本實施例1成功建立肉雞腸道乳桿菌絕對定量pcr標準曲線，見圖1。本實施例1通過對肉雞腸道乳桿菌的絕對定量，可以確定該菌的絕對拷貝數，對其微生物水平分析提供參考依據。以初始模板量的對數為橫坐標，ct值為縱坐標，繪製出乳桿菌的螢光定量pcr標準曲線，初始模板濃度與ct值之間呈較好的線性關係，相關係數為1.000，斜率為-3.553，擴增效率為91.2％。通過乳桿菌質粒標準品實時定量pcr溶解曲線(見圖2)的檢測，可見為單峰，因此本發明擴增產物特異性好。擴增曲線(見圖3)顯示，檢測樣品ct值在標準品ct值範圍內，得出的拷貝數準確性高。實施例2肉雞腸道總菌數的定量檢測方法該方法所用到的pcr引物包括上遊引物和下遊引物，其中，上遊引物為cggcaacgacgcaaccc，核苷酸序列如seqidno.4所示；下遊引物為ccattgtagcacgtgtgtagcc，核苷酸序列如seqidno.5所示；螢光定量pcr反應的退火溫度為60℃；製備得到的肉雞腸道總菌質粒序列如seqidno.6所示，其餘步驟同實施例1。本實施例2成功建立肉雞腸道總菌絕對定量pcr標準曲線，見圖4。本實施例2通過對肉雞腸道總菌的絕對定量，可以確定總菌的絕對拷貝數，對其微生物水平分析提供參考依據。以初始模板量的對數為橫坐標，ct值為縱坐標，繪製出總菌的螢光定量pcr標準曲線，初始模板濃度與ct值之間呈較好的線性關係，相關係數為0.996，斜率為-3.456，擴增效率為94.7％。通過總菌質粒標準品實時定量pcr溶解曲線(見圖5)的檢測，可見為單峰，因此本發明擴增產物特異性好。擴增曲線(見圖6)顯示，檢測樣品ct值在標準品ct值範圍內，得出的拷貝數準確性高。實施例3肉雞腸道大腸桿菌數的定量檢測方法該方法所用到的pcr引物包括上遊引物和下遊引物，其中，上遊引物為gttaatacctttgctcattga，核苷酸序列如seqidno.7所示；下遊引物為accagggtatctaatcctgtt，核苷酸序列如seqidno.8所示；螢光定量pcr反應的退火溫度為50℃；製備得到的肉雞腸道大腸桿菌質粒序列如seqidno.9所示，其餘步驟同實施例1。本實施例3成功建立肉雞腸道大腸桿菌絕對定量pcr標準曲線，見圖7。本實施例3通過對肉雞腸道大腸桿菌的絕對定量，可以確定大腸桿菌的絕對拷貝數，對其微生物水平分析提供參考依據。以初始模板量的對數為橫坐標，ct值為縱坐標，繪製出大腸桿菌的螢光定量pcr標準曲線，初始模板濃度與ct值之間呈較好的線性關係，相關係數為0.999，斜率為-3.907，擴增效率為80.3％。通過大腸桿菌質粒標準品實時定量pcr溶解曲線(見圖8)的檢測，可見為單峰，因此本發明擴增產物特異性好。擴增曲線(見圖9)顯示，檢測樣品ct值在標準品ct值範圍內，得出的拷貝數準確性高。本發明可用於其他動物腸道微生物的檢測。上述說明示出並描述了發明的若干優選實施例，但如前所述，應當理解發明並非局限於本文所披露的形式，不應看作是對其他實施例的排除，而可用於各種其他組合、修改和環境，並能夠在本文所述發明構想範圍內，通過上述教導或相關領域的技術或知識進行改動。而本領域人員所進行的改動和變化不脫離發明的精神和範圍，則都應在發明所附權利要求的保護範圍內。sequencelisting廣東省農業科學院動物科學研究所一種肉雞腸道微生物的定量檢測方法20173patentinversion3.3121dna人工序列1cgatgagtgctaggtgttgga21222dna人工序列2caagatgtcaagacctggtaag2231091dna肉雞腸道乳桿菌質粒3aaagttccatggcctcattcggtggtaagttcttagcatcgggcggatgtaggagcaaac60cattaggacatggtcacgacgacggtcacgctattcagcccaaatggcccacctgagttc120tgctatcaatggcctattccgcgtcgccagcccgacttgccccccaagcacgtgtgtcgg180gtcgaacctcgcttgctggatgtggcttgactctatggatgtcgcactcgatactctttc240gcggtgcgaagggcttccctctttccgcctgtccataggccattcgccgtcccagccttg300tcctctcgcgtgctccctcgaaggtccccctttgcggaccatagaaatatcaggacagcc360caaagcggtggagactgaactcgcagctaaaaacactacgagcagtccccccgcctcgga420tacctttttgcggtcgttgcgccggaaaaatgccaaggaccggaaaacgaccggaaaacg480agtgtacaagaaaggacgcaataggggactaagacacctattggcataatggcggaaact540cactcgactatggcgagcggcgtcggcttgctggctcgcgtcgctcagtcactcgctcct600tcgccttctcgcgggttatgcgtttggcggagaggggcgcgcaaccggctaagtaattac660gtcgaccgtgctgtccaaagggctgacctttcgcccgtcactcgcgttgcgttaattaca720ctcaatcgagtgagtaatccgtggggtccgaaatgtgaaatacgaaggccgagcatacaa780cacaccttaacactcgcctattgttaaagtgtgtcctttgtcgatactggtactaatgcg840gttcgaacgtacggacgtccagctgctaagttctacagttctggaccattccaagaagcg900caacgaagcttaatttggtgtatgaggtgacgaacacgcccgggggcagttaaggaaact960caaagttggaacgccagcatgaggggtccacctaatgaataacacaattgacgccgtgac1020ttccccagttaggaggttgtggatcgtgagtagcttagagatctcctaggggcccatggc1080tcgagcttaag1091417dna人工序列4cggcaacgacgcaaccc17522dna人工序列5ccattgtagcacgtgtgtagcc2261094dna肉雞腸道總菌質粒6ccaagtgtctccggtctaggtttatgcaaaaaaatccatcggcatcatccggtggtaagt60tctgaagcatcgtggcggatgtatggagcgaaaccattaggacaatggtcaccgacgacg120gtcaccgctattcagcacagaatggcccaacctgagttctgctatcaatggcctattccg180cgtcgccagcccgacttgccccccaagcacgtgtgtcgggtcgaacctcgcttgctggat240gtggcttgactctatggatgtcgcactcgatactctttcgcggtgcgaagggcttccctc300tttccgcctgtccataggccattcgccgtcccagccttgtcctctcgcgtgctccctcga360aggtccccctttgcggaccatagaaatatcaggacagcccaaagcggtggagactgaact420cgcagctaaaaacactacgagcagtccccccgcctcggatacctttttgcggtcgttgcg480ccggaaaaatgccaaggaccggaaaacgaccggaaaacgagtgtacaagaaaggacgcaa540taggggactaagacacctattggcataatggcggaaactcactcgactatggcgagcggc600gtcggcttgctggctcgcgtcgctcagtcactcgctccttcgccttctcgcgggttatgc660gtttggcggagaggggcgcgcaaccggctaagtaattacgtcgaccgtgctgtccaaagg720gctgacctttcgcccgtcactcgcgttgcgttaattacactcaatcgagtgagtaatccg780tggggtccgaaatgtgaaatacgaaggccgagcatacaacacaccttaacactcgcctat840tgttaaagtgtgtcctttgtcgatactggtactaatgcggttcgaacgtacggacgtcca900gctgctaaggtaacatcgtgcacacatcgggttctgtattccccgtactactaaactgca960gtaggggtggaaggaggcacaataggtgccgtcagagaggtctcacgggttgatttacta1020ccgatgacttctattcccaacgcagcaacggcttagagatctcctaggggcccatggctc1080gagcttagtgatgg1094721dna人工序列7gttaatacctttgctcattga21821dna人工序列8accagggtatctaatcctgtt2191094dna大腸桿菌質粒9ccccaagcagtggttggggtcgaacctcccttgctgaagggggctttaccctagggaggt60cgcactcgaaaccctttcgcggtgcgaagggcttccctctttccgcctgtccaaaggcca120ttcgccgtcccagccttgtcctctcgcgtgctccctcgaaggtccccctttgcggaccat180agaaatatcaggacagcccaaagcggtggagactgaactcgcagctaaaaacactacgag240cagtccccccgcctcggatacctttttgcggtcgttgcgccggaaaaatgccaaggaccg300gaaaacgaccggaaaacgagtgtacaagaaaggacgcaataggggactaagacacctatt360ggcataatggcggaaactcactcgactatggcgagcggcgtcggcttgctggctcgcgtc420gctcagtcactcgctccttcgccttctcgcgggttatgcgtttggcggagaggggcgcgc480aaccggctaagtaattacgtcgaccgtgctgtccaaagggctgacctttcgcccgtcact540cgcgttgcgttaattacactcaatcgagtgagtaatccgtggggtccgaaatgtgaaata600cgaaggccgagcatacaacacaccttaacactcgcctattgttaaagtgtgtcctttgtc660gatactggtactaatgcggttcgaacgtacggacgtccagctgctaacaattatggaaac720gagtaactgcaatgggcgtcttcttcgtggccgattgaggcacggtcgtcggcgccatta780tgcctcccacgttcgcaattagccttaatgacccgcatttcgcgtgcgtccgccaaacaa840ttcagtctacactttaggggcccgagttggacccttgacgtagactatgaccgttcgaac900tcagagcatctccccccatcttaaggtccacatcgccactttacgcatctctagacctcc960ttatggccaccgcttccgccgggggacctgcttctgactgcgagtccacgctttcgcgcc1020cctcgtttgtcctaatctatgggaccattagagatctcctaaggggcccatggctcgagc1080ttagtgaccggagc1094當前第1頁12