一種檢測卡那黴素殘留的適配體傳感器的製備方法

2023-10-26 06:54:47

一種檢測卡那黴素殘留的適配體傳感器的製備方法
【專利摘要】本發明涉及一種檢測卡那黴素殘留的適配體傳感器的製備方法，其特徵在於：石墨烯-聚苯胺複合物、硫堇和納米金膠的製備，電極表面依次滴塗硫堇、石墨烯-聚苯胺複合物和納米金膠後，自組裝卡那黴素適配體。由於硫堇、納米金等材料增加電極表面電子傳導能力和穩定性，石墨烯-聚苯胺複合膜提供了更多的氨基和羧基，使電極表面具備更好地定向固定抗生素適配體的能力。具大量氨基的納米複合膜與納米金膠形成金氨體系具有較高穩定性和高度有序性，為卡那黴素適配體的固定提供了良好生物界面，保持了卡那黴素的生物活性且提高了卡那黴素適配體的有效固定量。經上述步驟製備的適配體傳感器，靈敏度、穩定性和特異性較好，再生能力好，回收率符合要求。
【專利說明】一種檢測卡那黴素殘留的適配體傳感器的製備方法
【技術領域】
[0001]本發明提供一種檢測卡那黴素殘留的適配體傳感器的製備方法，屬於生物傳感器【技術領域】。
【背景技術】
[0002]抗生素作為一種治療疾病的藥物，目前已經被廣泛應用在乳牛的疾病治療。無論是通過肌肉注射還是口服，進入奶牛體內的抗生素都是可以以乳牛新陳代謝排出體外，並且奶牛產的牛乳就是乳牛把抗生素類物質排洩出體外的一種比較重要途徑。因此牛奶中的抗生素殘留在來源方面的問題，一般專家調查認為，泌乳期乳牛的用藥不當或者安全時間不注意問題都會成為牛奶中的抗生素殘留的重要的兩個因素，特別是使用乳房灌注法治療乳腺炎時，易造成牛乳中抗生素殘留。目前，在牛飼料中添加化學添加劑已經十分普遍，其中抗生素會佔據一定的比例，它的主要是用來預防奶牛疾病，所以這樣牛奶抗生素殘留的重要原因。此外，一些不法交奶戶在高溫季節為防止乳的酸敗，往往向牛乳中摻雜各種抗生素，這也是乳中抗生素殘留的一個來源。卡那黴素(kanamycin):—種由卡那鏈黴菌(Streptomyces kanamyceticus)產生的氨基糖苷類抗生素,含三個組分:卡那黴素A、B和C，卡那黴素A為主要組分。卡那黴素是一種蛋白質生物合成抑制劑，通過與30S核糖體結合從而致使mRNA密碼誤讀。若細菌中產生一種破壞卡那黴素的酶，則可變為抗性株。卡那黴素抗性的質粒經常被作為選擇基因或標記基因用於分子克隆中。卡那黴素的主要毒副作用體現為對於腦神經、聽覺以及腎臟的損害，因此，針對該類藥物在食品中的殘留，許多國家和機構都規定了明確的最大殘留限量(MRL S)。由於養殖過程中經常存在著違法使用或者不合理使用的現象，牛奶中卡那黴素的過量殘留，已經成為國內外普遍關注的食品安全問題之一。
[0003]抗生素殘留的檢測方法:抗生素殘留的檢測方法多種多樣，每種方法都有各自特點，適應在不同條件下檢測，在選用各種方法是我們應當根據簡便易用、精確可靠的原則。常用的抗生素殘留檢測方法有氣相色譜法(GC)、光譜法、高效液相色譜法(HPLC)、薄層色譜法(TLC)、適配體分析法等。這些分析方法雖然具有高選擇性，但是其操作繁瑣、耗時長、成本高，並且需對樣品進行預濃縮和衍生處理，所以很難得到廣泛應用。因此，人們會更加急切的需要快速、可靠、經濟和適合於現場應用的快速檢測方法。於是，快速、可信、廉價、敏感的適配體生物傳感器應運而生。與傳統的分析方法相比，適配體生物傳感器具有待測的樣品不用經過預先處理、分析速度快、作業系統簡單、準確度高、專一性強、成本低、響應快等優點。
[0004]發明的目的在於提供一種能克服上述缺陷以及操作簡單、靈敏度高、選擇性好的檢測卡那黴素殘留的適配體傳感器的製備方法。
[0005]其技術方案為:一種檢測卡那黴素殘留的適配體傳感器的製備方法，其特徵在於:適配體傳感器的敏感界面組成包括由硫堇、石墨烯-聚苯胺複合膜和納米金膠(AuNPs)，進而固定卡那黴素適配體。[0006]所述的一種檢測卡那黴素殘留的適配體傳感器的製備方法，其特徵在於:金電極(d=3mm)的清洗,適配體傳感器敏感界面的構建及過程表徵(製備石墨烯-聚苯胺納米複合物，利用硫堇、石墨烯-聚苯胺和納米金膠的協同作用共同修飾電極)，適配體傳感器工作曲線的建立，適配體傳感器性能的檢測，適配體傳感器對實際樣品的檢測。
[0007]所述的一種檢測卡那黴素殘留的適配體傳感器的製備方法，其特徵在於:實驗條件的優化，主要包括適配體濃度、測試底液的pH以及測試時間和溫度；所製備的適配體傳感器的工作曲線為:y = 0.0327x + 0.2585 (R2 = 0.9954);適配體傳感器性能檢測包括重現性、穩定性、再生性、特異性以及適配體傳感器對牛奶樣品回收率的測定。
[0008]其製備原理為:適配體檢測抗原是近年來發展起來的新技術，將一個適配體末端交聯到固相載體上作為捕獲分子，去捕獲待測標本中的靶物質，另一個適配體的5'端標有相應的指示劑，如螢光素、生物素、放射性同位素或膠體金等標記轉化為檢測分子，當檢測分子與相應的待測標本結合後就會產生信號，以達到檢測的目的。本發明採用以硫堇、石墨烯-聚苯胺複合物和納米金膠對金電極進行修飾。由於硫堇、納米金等材料增加電極表面電子傳導能力和穩定性，石墨烯-聚苯胺複合膜提供了更多的氨基和羧基，使電極表面具備更好地定向固定抗生素適配體的能力。具大量氨基的納米複合膜與納米金膠形成的金氨體系具有較高的穩定性和高度有序性，為卡那黴素適配體在電極表面的固定提供了良好的生物界面，保持了卡那黴素的生物活性且提高了傳感器表面卡那黴素適配體的有效固定量，進而增大了檢測精度。經上述步驟製備的適配體傳感器，比較簡單，且靈敏度、穩定性和特異性較好，再生能力好，回收率符合要求。
[0009]為達到以上目的，採取以下技術方案實現:一種檢測卡那黴素殘留的適配體傳感器的製備方法，其特徵在於:(I)適配體傳感器製備前裸金電極的清洗、活化和性能測試，如果測試循環伏安曲線中的峰電位差在120mV以下，氧化峰和還原峰對稱，則所述金電極可使用，否則要重新返回清洗步驟中，直到符合要求。(2)清洗好的裸金電極表面滴塗分散均勻的硫堇，繼而修飾石墨烯-聚苯胺，在修飾上納米金膠，然後固定卡那黴素適配體，最後用牛血清白蛋白(BSA)封閉非特異性結合位點。適配體傳感器製備結束後，放入冰箱裡
4°C保存備用。
[0010]為達到以上目的，採取以下技術方案實現:一種檢測卡那黴素殘留的適配體傳感器的製備方法，其特徵在於:(I)將上述製備好的適配體傳感器在工作底液中以不同的掃速做循環伏安方法掃描，可以得到峰值和掃速的關係，得到是受擴散控制的。(2)配置一系列的卡那黴素標準液，進行循環伏安掃描，得到抑制率，進一步得出上述製備的適配體傳感器的工作曲線、檢測範圍和檢測限；(3)配置一系列經常混合使用的抗生素溶液，以檢測所製備適配體傳感器的選擇性；W通過循環伏安掃描多段驗證上述適配體傳感器的穩定性，通過解離和再次特異性結合few其再生性能；(5)對實際牛奶樣品進行分析得出該適配體傳感器的回收率。
[0011]本發明採用簡單的原位聚合法合成聚苯胺均勻包裹石墨烯的納米複合材料和納米金膠來促進電化學反應中電子的傳遞，提高電極上的響應電流，改善電極表面的微環境，因而可以作為載體材料，用以製備響應信號強和靈敏度高的適配體傳感器；具有大量氨基的納米複合膜與納米金膠形成的金氨體系具有較高的穩定性和高度有序性，增大了適配體傳感器的電流響應並提高了傳感器表面適配體的有效固定，從而增大了檢測精度。[0012]所述適配體傳感器的製備工藝如下:在金電極(GE)上滴加6 μ L的硫堇(TH)，在室溫條件下放置兩個小時，得ΤΗ/GE。接著在THAu電極上滴加6 μ L 2 mg/mL的石墨烯-聚苯胺複合物(Gr-PANI)，於室溫下放置2h。接著電極自然晾乾後，再滴加6 μ L納米金(AuNPs)溶液，在室溫條件下放置兩個小時自然晾乾。然後在前述電極上滴加6 uL的5 μ M的適配體，在室溫條件下放置兩個小時自然晾乾。接著在適配體晾乾的基礎上滴加6μ L 0.5% BSA溶液，室溫下靜置2h，以封閉非特異性結合位點，取出置於室溫下晾乾，適配體傳感器製作完成，保存在4° C條件下備用。
[0013]【專利附圖】

【附圖說明】
圖1納米金複合物的SHM表徵圖 圖2適配體傳感器組裝過程的電流特性表徵 圖3適配體傳感器特異性分析 圖4適配體傳感器的標準曲線。
【具體實施方式】
[0014]實施例:(I)硫堇溶液的製備:用分析天平秤取硫堇粉末250mg，然後置於燒杯中，加入超純水攪拌溶解。將溶解好的溶液轉移至50mL容量瓶中，定容，得到5mg/mL的硫堇溶液。(2)石墨烯-聚苯胺複合膜的製備:首先，氧化石墨烯(GR)的製備由改性Hummers方法。簡言之，氧化石墨烯粉末使用含有硝酸鈉和高錳酸鉀的硫酸溶液，然後過氧化氫被緩慢加入到混合物中。當沒有氣體產生時，在該混合物中加入過量的超純水。將反應混合物過濾，並用鹽酸水溶液和超純水洗滌。將濾液溶解在超純水中，並通過透析去除雜質。最後將濾液離心30分鐘，以除去殘留的石墨，然後得到氧化石墨烯。石墨烯-聚苯胺複合物材料的製備程序類似如下:0.3mol/L的聚苯胺溶解在lmol/L的鹽酸溶液中，通過超聲波處理I小時。然後，IOml 0.075mol/L的過硫酸銨和Imol的鹽酸溶液在劇烈攪拌下加入到混合物中。苯胺的聚合反應發生在此約5分鐘後，同時該混合物顏色變為綠色。在室溫下(RT)下攪拌過夜後，將所得混合物用IOOml超純水稀釋，並通過過濾收集。(2)納米金膠的製備採用檸檬酸三鈉熱還原氯金酸(HAuCl4)的方法。所有的玻璃器皿均用王水浸泡過夜，再用12mol/L的氫氧化鈉水溶液浸泡2h,洗漆乾淨備用。將98mL去離子水和2mL 50mM氯金酸溶液混合，快速攪拌下加熱至亞沸狀態(即產生回流)時，迅速加入IOmL 38.8mM的檸檬酸三鈉溶液，混合物加熱至沸騰後，繼續攪拌20min (此間溶液由淡黃色轉為無色，然後變灰黑色，最後成酒紅色)，除去熱源後繼續攪拌至室溫下慢慢冷卻。將冷卻後的金膠溶液置於乾淨的棕色玻璃瓶中於4° C冰箱中避光保存備用，數月有效。(3)金電極的清洗:金電極修飾前，首先浸入熱的「piranha」溶液(H2SO4:30% H2O2 = 3:1)中浸泡15min,用水清洗乾淨,接下來用0.3 μ m、30nm的Al2O3漿在麂皮上拋光至鏡面，拋光後用去離子水洗去除表面汙物，再移入超聲水浴中清洗,每次5min，重複二次，然後依次用6mol/L的HNO3、無水乙醇和去離子水超聲清洗，氮氣環境下乾燥。⑷金電極的活化:徹底清洗後，電極在0.5mol/L &504溶液中用循環伏安法活化，掃描範圍1.0V?-1.0V,反覆掃描直至達到穩定的循環伏安圖為止。(5)預處理好的金電極的測試:在含有1X10-3 mol/L K3Fe (CN)6的0.20 mol/L KNO3溶液中跑循環伏安曲線，以測試所述金電極的性能，掃描速度50mV/S，掃描範圍為-0.1V?
0.6V;當所述循環伏安曲線中的峰電位差在SOmV以下，並儘可能接近64mV，所述金電極可使用，否則要重新返回步驟(3)中，處理所述金電極，直到符合要求。(6)取6yL分散均勻的硫堇(TH)滴塗在電極表面，常溫下2h，然後用pH7.5的磷酸鹽緩衝液衝洗表面，氮氣吹乾。在金電極(GE)上滴加6 UL的硫堇(TH)，在室溫條件下放置兩個小時，得TH/GE。(7)接著在ΤΗ/GE電極上滴加6 μ L 2 mg/mL的石墨烯-聚苯胺複合物(Gr-PANI)，於室溫下放置2h。(8)接著電極自然晾乾後，再滴加6 μ L納米金(AuNPs)溶液，在室溫條件下放置兩個小時自然晾乾。(9)然後在前述電極上滴加6 uL的5μ M的適配體，在室溫條件下放置兩個小時自然晾乾。(10)接著在適配體晾乾的基礎上滴加6 UL 0.5% BSA溶液，室溫下靜置2h，以封閉非特異性結合位點，取出置於室溫下晾乾，適配體傳感器製作完成，保存在4° C條件下備用。(11)從適配體濃度、測試底液pH、測試時間和溫度四方面對所製備的適配體傳感器的實驗條件進行優化，抗體濃度的範圍為0-20 μ g/mL，pH的範圍為6.0-8.5，測試時間時間的範圍為0-120min。測試溫度的範圍為0_60°C。(11)配置0.01_200ng/mL的卡那黴素標準溶液，將上述製備好的適配體傳感器分別浸入不同濃度的卡那黴素標準溶液，在常溫下孵育60min，檢測反應前後電流變化得到其工作曲線。(12)將適配體在土黴素(QT)、妥布黴素(TOB)、慶大黴素(CN)、四環素(TE)和鏈黴素(SM)等幹擾物10ng/ml存在的情況下對10 ng/mL的卡那黴素(KM)標準液進行測試，以檢測其選擇性；選5根於相同條件下製備好的適配體傳感器檢測其重現性；連續7天依次檢測相同濃度的適配體溶液以檢測其穩定性；將適配體與卡那黴素結合後的傳感器用甘氨酸-HCl緩衝液(pH2.8)解離卡那黴素5min後再次免疫，檢測其再生能力。(13)將牛奶稀釋到合適倍數，加入不同濃度的卡那黴素後測試。對卡那黴素的添加後檢測率在97.2 - 104.9%之間。
[0015]此種適配體傳感器檢測卡那黴素殘留的檢測方法操作工藝簡單，檢測時間較短，檢測卡那黴素濃度範圍廣，靈敏度高，穩定性好，再生能力高以及對實際樣品分析有較好的回收率和重現性，符合我國抗生素殘留快速檢測技術發展和國際化要求。
【權利要求】
1.一種檢測卡那黴素殘留的適配體傳感器的製備方法，其特徵在於:運用共價鍵和、自組裝等技術構建適配體傳感器用於檢測卡那黴素抗生素，並且引入硫堇、石墨烯-聚苯胺、納米金等材料，可以增強適配體傳感器的電化學方面性能，利用卡那黴素適配體可以和卡那黴素特異性結合來定向固定卡那黴素，以更有效的完成目標成分卡那黴素的快速檢測，石墨烯-聚苯胺納米複合膜的製備步驟為: (I)氧化石墨烯(GR)的製備:氧化石墨粉末被緩慢地加入到含有硝酸鈉和高錳酸鉀的硫酸溶液以及過氧化氫的混合物中，當沒有氣體產生時，在該混合物中加入過量的超純水，將反應混合物過濾，並用HCl水溶液和超純水洗滌，將濾液溶解在超純水中，並通過過濾除去雜質，最後，將濾液離心30分鐘，以除去殘留的石墨，然後得到氧化石墨烯；(2)石墨烯-聚苯胺納米複合材料製備如下:0.3 mol/L的苯胺溶解在I mol/L鹽酸溶液中，氧化石墨烯被添加到上述混合液中超聲處理I小時，然後，10 ml包含0.075 mol/L的過硫酸銨和I mol/L的HCl溶液在劇烈攪拌下迅速加入到混合物中，苯胺的聚合反應開始後約5分鐘，同時該混合物的顏色變為綠色，在室溫(RT)下攪拌過夜後，將所得混合物用IOOml超純水稀釋，並通過過濾收集，將所得的石墨烯-聚苯胺複合材料添加到含有0.1毫升肼的50ml超純水中加熱I小時(95°C)，然後對複合材料進行過濾，重複用超純水洗滌，以除去過量的肼，最後，所得到的複合材料被分散在10毫升的含有過硫酸銨(0.06克)的I mol/L鹽酸中，室溫下攪拌過夜，通過過濾收集析出的聚合物，並用超純水、乙醇和己烷重複洗滌，通過過濾收集所得的石墨烯-聚苯胺納米複合材料。
2.如權利要求1所述的一種檢測卡那黴素抗生素殘留的適配體傳感器的製備方法，其特徵在於:聚苯胺的氨基端通過金氨鍵連接納米金膠，利用硫堇、石墨烯-聚苯胺和納米金膠三種納米材料的協同作用共同修飾電極，顯著的增強了電流響應，顯著的增強了電流響應，且形成的金氨體系具有較高的穩定性和高度有序性，為適配體在電極表面的固定提供了一個良好的生物界面，擴大了電極的有效固定面積，提高了傳感器表面適配體的有效固定量，且保持了適配體的生物活性，進而增大了檢測精度和靈敏度，適配體傳感器的製備步驟為: 在金電極(GE)上滴加6 μ L的硫堇(TH)，在室溫條件下放置兩個小時，得TH/GE，接著在THAu電極上滴加6 μ L 2 mg/mL的石墨烯-聚苯胺複合物(Gr-PANI)，於室溫下放置2h，接著電極自然晾乾後，再滴加6 μ L納米金(AuNPs)溶液，在室溫條件下放置兩個小時自然晾乾，然後在前述電極上滴加6 uL的5μ M的適配體，在室溫條件下放置兩個小時自然晾乾，接著在適配體晾乾的基礎上滴加6 μ L 0.5% BSA溶液，室溫下靜置2h，以封閉非特異性結合位點，取出置於室溫下晾乾，適配體傳感器製作完成，保存在4° C條件下備用。
【文檔編號】B82Y30/00GK103499627SQ201310489050
【公開日】2014年1月8日 申請日期:2013年10月18日 優先權日:2013年10月18日
【發明者】郭業民, 孫霞, 王相友, 劉君峰, 李發蘭 申請人:山東理工大學