利用四環素調控的dcf1基因誘導表達系統及其構建方法

2023-10-25 19:23:57

利用四環素調控的dcf1基因誘導表達系統及其構建方法
【專利摘要】本發明利用四環素調控的dcf1基因誘導表達載體及其構建方法。本發明利用四環素來調控DCF1在哺乳動物細胞中表達，構建了Tet-on四環素調控載體pTRE-EGFP-DCF1，與ptTS-Neo一起完成調控作用。共轉染後，載體pTRE-EGFP-DCF1表達被抑制，加入強力黴素（Dox）後，載體pTRE-EGFP-DCF1被誘導表達。該系統可以在特定空間和時間誘導表達DCF1基因，有助於更好地研究DCF1基因的功能，具有調節效率高、無副作用、反應迅速等特點。
【專利說明】利用四環素調控的dcfl基因誘導表達系統及其構建方法
【技術領域】
[0001]本發明涉及一種利用四環素調控的dcfl基因誘導表達載體及其構建方法。
【背景技術】
[0002]樹突狀細胞因子(Dendritic Cell Factor, DCFl)又被稱為跨膜蛋白59(Transmembrane Protein59, Tmem59)。最早是在樹突狀細胞中發現而因此得名的，其被認為是一種在DC分化和遷移的過程中起作用的信號分子。根據本實驗室前期的工作，在未分化的神經幹細胞與分化的神經細胞內發現了 12個存在高度差異表達的序列表達標籤(Express Sequences Tag，EST)，其中編號 SHDll 的序列與小鼠 EST BG172336 有 91% 的同源性，其包含117個胺基酸的開放閱讀框，蛋白序列分析表明其與DFCl有98%的同源性。接下來的研究又發現，在小鼠神經幹細胞系C17.2中過表達DCF1，可維持神經幹細胞狀態，而RNAi沉默DCFl表達，可引起C17.2神經幹細胞進入分化狀態，主要向膠質細胞分化(10%星形膠質細胞，1%神經元)。通過小分子MicroRNA-351下調DCFl表達時，C17.2神經幹細胞也向膠質細胞分化。而且通過之前構建的螢光載體PEGFP-DCF1，發現在U251膠質瘤細胞系中過量表達而/1基因，可顯著抑制U251細胞增殖、遷移、侵襲能力。
[0003]Gossen和Bujard最先描述了一種適用於哺乳動物細胞的四環素(Tetracycline,Tc)調控基因表達系統，可根據需求控制外源基因在細胞中的表達量和表達時間。四環素調控系統根據實驗需求可分為Tet-off和Tet-on兩種，其中Tet_off調控系統通過加入四環素或者強力黴素(Doxycycline, Dox)來停止基因的表達，而相反地，Tet-on系統則是在加入了四環素或強力黴素後基因才開始表達。我們根據實驗需求，選擇了構建Tet-on系統來調控而/1的表達。該系統包含兩部分:四環素控制的轉錄抑制子(tetracyline-controlled transcriptional suppressor, tTS)與含有四環素反應原件的人巨細胞病毒啟動子0°?^/。》)。tTS是一個很強的轉錄抑制子，是四環素抑制子蛋白(tetrepressor protein, TetR)與 Kid-1 蛋白的 KRAB-AB 沉默區域(SDKid-1)的融合蛋白。Amiod/w主要部分為四環素反應原件(Tet response element, TREmod),由7段重複的36bp鹼基構成，每段36bp鹼基中包含一段19bp的四環素操縱子序列(tet operator sequence,tetO、。

【發明內容】

[0004]本發明的目的之一在於克服現有技術中存在的問題，提供一種利用四環素調控的dcfl基因誘導表達載體。
[0005]本發明的目的之二在於提供該載體的構建方法。
[0006]為達到上述目的，本發明採用如下技術方案:
一種利用四環素調控的dcfl基因誘導表達載體，其特徵在於該載體為SEQ ID N0.1所不的喊基序列。
[0007]—種構建上述的利用四環素調控的dcfl基因誘導表達載體的方法，其特徵在於該方法的具體步驟為:
a.以pSIREN-RetroQ-TetP為模板，用PCR酶擴增出長為330bp的TREmod;所述的酶擴增所用引物序列如下，下劃線部分為AseI酶切位點:
上遊引物:5 』 -TTATCCATTAATCACTCCTTCTCTAG-3，；
下遊引物:5』 -TCAAGTTACATTAATCATATGACCT-3』 ；
b.將步驟a所得TREmod片段割膠回收，酶切出粘性末端後，用鹼性磷酸酶脫磷處理，再連接到載體pEGFP-DCFl的CMV啟動子前的AseI位點中，即得到利用四環素調控的dcf\基因誘導表達載體。
[0008]本發明利用四環素調控系統的原理，結合DCFl表達載體pEGFP-DCFl，構建了一個全新的DCFl調控系統，該系統可以在特定空間和時間誘導表達DCFl基因，有助於更好地研究DCFl基因的功能，具有調節效率高、無副作用、反應訊速等特點。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0009]圖1載體pTRE-EGFP-DCFl構建示意圖
圖2 pTRE-EGFP-DCFl的PCR鑑定與酶切鑑定。A圖中1_7為所挑克隆，以其為模板用上遊引物與下遊引物進行鑑定，若連入了 TREmod片段，便能擴增出條帶。8為pEGFP-DCFl，陰性對照。B)2-4為沒有酶切過的克隆，作為對照。6-7為酶切後的克隆，若連入了 TREmod片段，酶切後釋放出條帶。I和5為pEGFP-DCFl，陰性對照。 [0010]圖3 Hek293T細胞中轉染調控質粒，轉然後用螢光顯微鏡檢測載體表達情況，可以看到當tTS與TREmod同時存在時，載體表達受到抑制。A圖為轉然後用螢光顯微鏡檢測載體表達情況，可以看到當tTS與TREmod同時存在時,載體表達受到抑制。圖中標尺，100 μ m。
[0011]圖4 Hek293T細胞中轉染調控質粒，使用Image-Pro Plus 6分析圖3中轉染圖片(每組3張)，發現與其他情況相比tTS針對TREmod的抑制效果顯著。(*p ^ 0.05，**p < 0.01)
圖5加入Dox載體表達。通過螢光顯微鏡觀察載體表達水平，Hek293T細胞中共轉染ptTS-neo與pTRE-EGFP-DCFl後加入不同濃度的Doxycycline,載體的表達量隨著Doxycycline的升高而升高。圖中標尺，100μπι。
【具體實施方式】
[0012]實施例一:利用四環素調控的而/1基因誘導表達載體的構建方法，參見圖1和圖2。
[0013]載體PEGFP-N2的多克隆位點中插入DCFl基因，得到載體pEGFP-DCFl，具體方法參見文獻(Xie Y, et al.(2014) Overexpression of DCFl inhibits glioma throughdestruction of mitochondria and activation of apoptosis pathway.Scientific reports4:3702.)。
[0014]a.以pSIREN-RetroQ-TetP為模板,用高保真PCR酶擴增出長為330bp的TREmod，所述的酶擴增所用引物序列如下，下劃線部分為AseI酶切位點:
上遊引物(Up primer):5』 -TTATCCATTAATCACTCCTTCTCTAG-3，；
下遊引物(Low primer):5』 -TCAAGTTACATTAATCATATGACCT-3，；對TREmod進行PCR擴增的反應體系如下(20 μ I):
ddH20 12.5μ I
10XPCR buffer 2μ I
2.5mM dNTPs 2 μ I
Up primer I μ I
Low primer I μ I
Template I μ I
Pfu Taq0.5 μ I
PCR反應程序:
Stepl104 °C Wait
Step298 °C 8 min
Step398 °C 30 s
Step455 °C 30 s
Step572 °C 60 s
Step6Go to 2 Rep 32
Step772 °C 10 min
Step84 °C Hold ；
b.將步驟a所得TREmod片段割膠回收，酶切出粘性末端後，用鹼性磷酸酶脫磷處理，再連接到載體pEGFP-DCFl的CMV啟動子前的AseI位點，得到利用四環素調控的dcf\基因誘導表達載體。載體的PCR鑑定與AseI酶切鑑定如圖2所示。酶切鑑定和基因測序表明成功構建重組載體pTRE-EGFP-DCFl。
[0015]片段與質粒載體酶切:
1)PCR產物經割膠回收後，進行AseI酶切。
[0016]TREmod片段酶切體系如下(50 μ I): ddH2024 μ I
IOXBuffer tango 10 μ I
TREmod回收產物 15 μ I (量可調整)
Ase II μ I
2)載體pEGFP-DCFl 酶切體系(50 μ I): ddH20 37 μ I
IOXBuffer tango 10 μ I
pEGFP-DCFl 2 μ I
Ase II μ I
將配製好的上述體系放入37°C孵育器中，反應時間為3小時左右。
[0017]鹼性磷酸酶脫磷處理:
將上述酶切產物，經割膠回收，稍濃縮後，配製脫磷體系。
[0018]ddH202μ I FastAP I μ I IOXBuffer 2μ IpEGFP-DCFl 15 μ I
將配製好的上述體系放入37°C孵育器中，反應時間為10-15分鐘左右，然後75°C 5-10分鐘將鹼性磷酸酶失活。
[0019]片段與質粒載體連接:
將上述酶切產物，經割膠回收，稍濃縮後。配製連接體系(8 μ I)。
[0020]pEGFP-DCFl 1.5μ I
TREmod 4.5 μ I
T4 Buffer 0.8 μ I
T4 ligase 1.2 μ I
16°C反應12-16小時。
[0021]實施例二:系統的調控效果，參見圖3、圖4和圖5
2.1將調控載體pTRE-EGFP-DCFl與ptTS-neo共轉染到HEK293T細胞中，可以看到在共轉兩種質粒的細胞中融合蛋白EGFP-DCF1表達量顯著偏低，說明tTS對啟動子PTREmod/cmv起到了抑制效果，如圖4所示。
[0022]細胞轉染具體步驟:
I)轉染前準備好無內毒素質粒，測定濃度，用於轉染。長期保存應置於_80°C。 [0023]2)本實驗中的所有細胞轉染均採用陽離子脂質體Lipofectamine ? 2000Transfection Reagent (Invitrogen, 11668-019)。
[0024]3)轉染前一天，在不含抗生素的培養基中接種細胞。24小時後，待細胞密度為80%-90%時進行轉染。
[0025]4)以24孔板一個孔為例,取I μ g無內毒素質粒與50 μ I無血清DMEM混勻，I μ ILipofectamine ? 2000與50 μ I無血清DMEM混勻，兩者室溫放置5分鐘。質粒與Lipo2000用量要根據細胞系及細胞狀態進行適時調整。
[0026]5) 5分鐘後，將質粒混合物與Lipofectamine ? 2000混合物混合，用槍吹打混勻，
注意輕柔。室溫放置20分鐘。
[0027]6)將24孔板中培養基換成400 μ I無血清DMEM。
[0028]7)將轉染混合溶液加入24孔板中，輕柔搖晃孔板，使溶液混勻，置於C02培養箱(37°C，5%C02)中培養。
[0029]8) 6小時後，將無血清DMEM培養基換成含10% FBS-DMEM,繼續培養。RNA抽提一般於轉染後24小時,蛋白抽提及免疫螢光於轉染後48小時。
[0030]2.2當加入不同濃度的Doxycycline後,載體開始表達,表達量與加入的Dox濃度呈正相關，且Dox大於0.75 μ g/ml時，載體的表達量達到最高，如圖5所示。
【權利要求】
1.一種利用四環素調控的而/I基因誘導表達載體，其特徵在於該載體為SEQ ID N0.1所不的喊基序列。
2.—種構建根據權利要求1所述的利用四環素調控的而/1基因誘導表達載體的方法，其特徵在於該方法的具體步驟為: a.以pSIREN-RetroQ-TetP為模板，用PCR酶擴增出長為330bp的TREmod;所述的酶擴增所用引物序列如下，下劃線部分為AseI酶切位點: 上遊引物:5 』 -TTATCCATTAATCACTCCTTCTCTAG-3，； 下遊引物:5』 -TCAAGTTACATTAATCATATGACCT-3』 ； b.將步驟a所得TREmod片段割膠回收，酶切出粘性末端後，用鹼性磷酸酶脫磷處理，再連接到載體pEGFP-DCFl的CMV啟動子前的AseI位點中，即得到利用四環素調控的dcf\基因誘導 表達載體。
【文檔編號】C12N15/63GK103993029SQ201410210708
【公開日】2014年8月20日 申請日期:2014年5月19日 優先權日:2014年5月19日
【發明者】文鐵橋, 嚴煌, 黃晨, 楊眉, 吳喨 申請人:上海大學