複合豬白細胞介素基因抗感染納米分子製劑的製備和應用的製作方法

2023-10-25 16:12:32

專利名稱：複合豬白細胞介素基因抗感染納米分子製劑的製備和應用的製作方法
技術領域：
1.生物技術 2.分子免疫學背景技術養殖業(畜牧業和水產)為大農業的重要組成部份，是我國農業現代化和農村經濟發展、社會穩定的重要根基之一，歐美先進國家養殖業均十分發達，都在大農業中佔50％以上的比重。它為人類提供肉、奶、蛋、皮毛等高檔食品及重要輕紡原料，畜產品是人們優質蛋白質、礦物質、維生素等營養物質的主要來源，其安全性直接關係到人類的身體健康。由於近年來畜產品引起的中毒、疾病傳染等惡性事件不斷發生，如歐洲的狂牛症、口蹄疫、亞洲的禽流感等，對畜牧生產和食品加工業造成了重大影響。動物疫病已成為影響畜產品安全、人類身體健康和社會穩定及廣大農牧民增收致富的重要因素。在我國養殖業中，重要的動物傳染性疾病多達30多種；我國現在不僅舊病未消滅，而且新病不斷湧現，動物傳染病的平均發病率和死亡率高達15-20％和8-10％左右，每年給我國的養殖業造成至少400多億元的直接經濟損失。現代人類正面臨病原微生物感染難於控制的嚴峻挑戰。因此高效防治傳染性疾病和促進動物健康生長是保障我國養殖業提高經濟效益和可持續發展的核心所在，也是保護人民食品衛生和生命健康迫切需要解決的重大科技難題；更是我國畜牧業面對世界範圍的大市場，突破「綠色壁壘」，參與國際市場競爭，樹立新形象的必然選擇。
全新的「第三代免疫增強劑」為解決這一問題帶來了新的希望。免疫增強劑能提高機體特異和非特異的免疫防禦能力，增強機體識別、殺滅和清除病原及異已物質的能力，並且在機體免疫功能低下或處於抑制狀態時，重建免疫功能，提升免疫水平，從而保證機體健康。第三代免疫增強劑是經歷了第一代外源性化學藥物分子和植物源分子的免疫增強劑，以及「細胞因子」類物質的第二代免疫增強劑，發展起來的一類新型免疫增強劑。第三代免疫增強劑利用現代生物工程技術，將免疫調節效應很強的細胞因子基因克隆入高效真核表達載體，構建重組真核質粒，將其有效轉染導入機體細胞，使之持久穩定表達出所需的細胞因子，增強其濃度，從而能夠特異高效而持久地增強機體免疫防禦能力，達到經濟防治目前難以控制的病毒，細菌性傳染病和寄生蟲病的目的；並且預防條件性病原造成難以控制的複雜感染和疾病。近年來，人們對於用細胞因子表達性質粒直接轉染動物方面進行了研究，取得了許多結果。其特點是這些細胞因子可以在動物體內表達，達到免疫刺激增強作用，並且有容易生產，易純化，易保存，作用持久，理化性質穩定等特點。所以，構建高效重組細胞因子表達質粒作為新型抗感染製劑是一個有經濟價值和社會效益的方法。
細胞因子是體內免疫細胞或非免疫細胞產生的一組具有廣泛生物學活性的異質性肽類調節因子，也是目前最有效的免疫調節分子，對各類免疫活性細胞的分化、發育、成熟和活化中均起著十分重要的調節作用；可以定向特異調節抗原疫苗的體液免疫和細胞免疫應答。其中對IL-2、IL-6、IL-4等的研究較為活躍。
白細胞介素-2(IL-2)主要由激活的T細胞產生，在免疫系統中具有十分重要的免疫生理調節效應，能激活、提高免疫細胞的多種功能，如提高它們殺傷癌細胞、病毒或細菌感染細胞、促進抗體生成和分泌的能力。自Taniguchi等1983年從人細胞中首次克隆出IL-2全長cDNA，並報導其全序列以來，目前已從30多種動物中克隆出此基因，重組IL-2也在人類醫學提高免疫抗病機能、抗感染和治療癌症等方面獲得了廣泛的應用。
白細胞介素4(IL-4)具有多種生物學功能，可以作用於T細胞、B細胞、胸腺細胞、肥大細胞、巨噬細胞等多種靶細胞，激活的B細胞產生的抗體主要是IgG和IgE，是機體體液免疫的重要調節因子，也在黏膜免疫中也發揮著重要作用。IL-4可以刺激肥大細胞和B細胞的增殖，促進嗜酸性的富集和浸潤。IL-4還是CD4+Th幼稚前體細胞(Thp細胞)分化發育成Th2細胞的重要信號。IL-4主要由輔助T細胞(Th細胞)產生，大多數能誘導T細胞活化的因素都能誘導T細胞產生IL-4。
白細胞介素-6(Interleukin-6，IL-6)是迄今發現的功能最為廣泛的細胞因子之一，能夠刺激B細胞的分化和IgG的產生，亦能刺激外周T細胞和胸腺T細胞成熟分化為細胞毒型T細胞(CTL)，誘導特異性幹擾素—激活基因，刺激由SPA-Cowan-I型激活的正常B細胞分泌IgM和IgG，誘導EB病毒轉化的B細胞分泌IgM和IgG，刺激肝細胞，誘導急性期蛋白的表達，在機體免疫應答、骨髓造血、自身免疫和機體防禦等方面均起到重要作用。IL—6可由各種淋巴細胞和非淋巴細胞受各種刺激所分泌。成纖維細胞、單核細胞、某些T細胞系等都可以產生IL-6。值得人們注意的是，這些不同種類的組織細胞均產生白細胞介素-6，但最終都對免疫系統起各種調節作用，可以認為白細胞介素-6是聯繫免疫和非免疫細胞之間雙向傳遞信息的一個重要的途徑。
IL-4、IL-6均是由CD4+T Th2細胞分泌的細胞因子，可刺激B細胞激活和抗體的分泌，對增加B細胞在體液免疫方面的功能有重要作用。IL-4在許多細胞類型中是IL-6表達的潛在誘導物。IL-4和IL-6相互調節在很多文獻中已有報導，在成骨細胞中IL-4可誘導IL-6的分泌，其作用是IL-13的10倍。IL-6可抑制Th2細胞炎症因子的分泌，而這種調節作用需IL-4的參與。
應用免疫基因體細胞轉基因表達持續提高動物抗病防禦和免疫應答能力，有選擇性地增強與免疫保護密切相關的特定免疫細胞活性，使免疫動物建立起堅強而持久的特異性免疫保護力，並提高機體的整體免疫水平，達到免疫防病和治病、防制病原感染的根本目的。這種經濟簡便的防治傳染性疾病的策略尤為適合我國的國情。
目前限於細胞因子基因在動物體內的表達活性較低，免疫增強效果不夠理想，實際應用中需用大劑量的基因質粒，從而了阻礙免疫增強劑的應用和推廣。如何提高基因表達產物的活性及其表達效率是廣泛使用免疫增強劑的關鍵所在。傳統的提高真核基因表達效率的方法對增加細胞因子的活性作用十分有限，遠不能滿足實際生產對免疫增強劑高效廉價和效應持久的要求。採用新的基因工程技術顯著提高細胞因子基因表達的生物活性以及組合應用細胞因子提高免疫調節活性為解決這一難題提供了嶄新的途徑。
融合蛋白是利用基因工程技術構建的人工蛋白，可以優化蛋白性能，甚至產生新功能。融合蛋白可以有多種融合方式，分別在免疫反應的各個階段發揮作用。兩種細胞因子融合成一種新的蛋白，兩者可以取長補短，也可兼兩者之長，發揮其雙因子抗癌和增強免疫的綜合效應，或使其某些活性顯著提高，出現雙因子簡單合用所不具備的生物學效應。自1986年日本的Masahara等人在大腸桿菌中表達了幹擾素γ(IFN-γ)/白介素2(IL-2)融合蛋白以來，迄今國內外已陸續報導了PIXY321，IFN-γ/腫瘤壞死因子(TFN)，IL-2/IL-6，IL-3/紅細胞生成素和CH925等幾種有價值的細胞因子融合蛋白。
DNA Shuffling(DNA改組)是1994年由美國Affymax研究所Stemmer等發明的一種基於PCR的DNA突變、重組技術，是DNA分子的體外重組，是基因在分子水平上進行有性重組的新技術。它通過基因的有性重組，改變基因或基因家族原有核苷酸序列，不僅可以加速積累有益突變，而且可以使蛋白質兩個或多個的優化性質合為一體，賦予表達產物以更好的生物學功能。同時突變後的基因在序列、結構、功能上均顯著區別於原來基因，可以獲得自主智慧財產權，故在生物工程的各個領域均已顯示出具有巨大的應用潛力。
本發明運用基因融合技術，進行了豬白細胞介素4、6融合基因的構建；利用DNA改組技術，將來源於人、藏豬、犛牛和小鼠的白細胞介素-2基因家族進行了改組，構建了豬白細胞介素4、6融合基因真核表達質粒VRIL46、改組豬白細胞介素2基因真核表達質粒VRIL2S。利用離子交聯法製備殼聚糖納米顆粒，包裝豬白細胞介素4、6融合基因真核表達質粒VRIL46和改組豬白細胞介素2基因真核表達質粒VRIL2S組合免疫豬，並開展對疫苗免疫調節作用研究，為研製新型的高效分子免疫佐劑，提高豬的免疫應答能力，增強其抗病性奠定堅實的基礎。

發明內容
本發明所要解決的技術問題具體包括豬白細胞介素-4、6基因的融合、融合豬白細胞介素-4、6基因真核表達質粒的構建，白細胞介素-2的改組、改組豬白細胞介素2基因真核表達質粒VRIL2S的構建，殼聚糖納米顆粒對VRIL46、VRIL2S重組真核質粒的分子包裝及其增強動物免疫應答和免疫保護力的應用。該方法包括下列步驟1、豬白細胞介素-4、6基因的克隆、融合設計IL4、IL6基因的連接接頭與融合PCR引物，分別擴增豬IL4和IL6基因，連接入相應的pMD18-T載體，雙酶切後，先將PIL6連接到同樣雙酶切的pGEX4T-1質粒上，再將從載體雙酶切獲得的PIL4片段與重組的pGPIL6連接，轉化感受態細胞，篩選陽性轉化子，酶切鑑定獲得融合的pGPIL46重組質粒。
2、融合豬白細胞介素-4、6基因的真核表達質粒的構建豬白細胞介素-46融合基因和真核表達載體VR1020雙酶切，連接轉化，篩選和酶切鑑定重組子VRIL46。
3、IL-2基因的DNA改組DNA酶切豬、犛牛、小鼠和人IL2基因，分離回收50-100bp的核苷酸片斷；經無引物和有引物兩步PCR重新擴增IL2基因，分離純化獲得改組的IL2基因；構建重組基因庫，篩選高活性的IL2改組基因陽性克隆，改組IL2基因(shuffled IL2，SIL2)連接入PGEX4T-1原核表達載體，轉化感受態細菌，構建重組基因庫；免疫印跡法篩選表達IL2的陽性轉化子，PCR擴增和酶切鑑定陽性克隆基因。
4、改組豬白細胞介素2基因真核表達質粒的構建將改組IL2基因亞克隆入VR1020真核表達載體，轉化、篩選陽性表達克隆，將構建的改組豬白細胞介素2基因真核表達質粒命名為VRIL2S。
5、納米顆粒的製備利用離子交聯法，以分子量150000，脫乙醯度95％以上的殼聚糖製備納米包裝顆粒，將殼聚糖溶液(pH5.5)和VRIL46+VRIL2S質粒組合、VR1020質粒(含適當濃度三聚磷酸鹽)溶液50℃水浴分別恆溫20min，然後均勻混合質粒溶液和殼聚糖溶液5min，即得質粒殼聚糖納米顆粒樣品液。
6、免疫用質粒DNA的大量製備接種含有重組真核表達質粒VRIL46、VRIL2S、VR1020單菌落於含相應抗生素的LB培養基，37℃振搖過夜；離心後收集菌體；加入溶液I懸浮菌體，加入溶液II，翻轉混合後，冰浴加入溶液III，翻轉混合，冰浴；離心後轉移上清至新的離心管，加入異丙醇，-20℃放置，離心去上清，Tris.Cl溶解DNA，加入亞精胺、異丙醇、70％乙醇純化質粒，溶解於滅菌生理鹽水，調節濃度為3pmol/μl。
7、質粒組合殼聚糖納米顆粒抗感染製劑的應用選擇3周齡小豬20隻，隨機分為2組，每組10隻。採用肌肉注射法，每頭質粒劑量0.5mg/頭。所有豬按該養豬場常規免疫程序接種疫苗1周齡免疫接種藍耳病疫苗；2周齡免疫接種偽狂犬疫苗。3周齡在免疫注射基因製劑時同時免疫接種豬瘟疫苗。
豬自免疫後第0，1，2，4，6，8周前腔靜脈採血，分離血清，用以檢測體液免疫反應。酶聯免疫檢測技術按照常規ELSA方法。
檢測了各組豬的體液免疫(IgG、IgA及IgM的含量、特異性抗體的測定)和細胞免疫水平(細胞因子和外周血免疫細胞數量)的影響情況，並對不同形式的質粒作用下細胞免疫和體液免疫應答的變化，進行了較為系統地分析。
結果發現以殼聚糖納米顆粒包裝豬白細胞介素4、6融合基因真核表達質粒(CNP-VRIL46)和改組豬白細胞介素2基因真核表達質粒(CNP-VRIL2S)組合作為免疫增強劑時，與豬常規疫苗聯合使用，豬的IgG、IgA、IgM含量和血清IL-2、IL-4、IL-6等細胞因子水平比對照組顯著升高；同時，白細胞、淋巴細胞、單核細胞、中性粒細胞等免疫細胞數量也明顯增加；對疫苗的特異性免疫應答也顯著加強。
這些結果表明CNP-VRIL46和CNP-VRIL2S組合能顯著提高豬的免疫應答水平，增強體液免疫和細胞免疫反應。提示殼聚糖納米顆粒包裹豬白細胞介素4、6融合基因真核表達質粒VRIL46和改組豬白細胞介素2基因真核表達質粒VRIL2S組合可提高機體細胞免疫和體液免疫水平，增強免疫應答及免疫保護力，作為高效新型抗感染免疫調節劑，具有廣泛應用前景。


圖1 豬白細胞介素4、6基因cDNA的PCR擴增電泳圖譜1，4posotive control2PIL-4 cDNA3PIL- 6cDNA圖2 pUFPIL4重組子酶切鑑定電泳圖1pUFPIL4質粒MDL 20002pUFPIL4/PmaCI3pUFPIL4/SalI+XhoI圖3 pUFPIL6重組子酶切鑑定電泳圖1pUFPIL6質粒MDL2000 marker2pUFPIL6/PstI3pUFPIL6/BamHI+SalI圖4 FPIL-6 cDNA，FPIL-4 cDNA片段酶切回收檢測電泳圖譜1FPIL-4 cDNA片段酶切回收MDL20002FPIL-6 cDNA片段酶切回收圖5 IL-6插入PGEX4T-1的酶切電泳圖譜1pGFPIL-6/BamHI+SalIMDL20002pGFPIL-6/BamHI3pGFPIL-6/SalI4pGFPIL-6/XhoI5pGFPIL-6質粒圖6 IL-4插入pGFPIL-6的酶切電泳圖譜1pGFPIL-6/IL4/PstIMDL2000Marker2pGFPIL-6/IL4/BamHI+Xhol
3pGFPIL-6/IL4/SalI+XhoI4pGFPIL-6/IL4/BamHI+SalI圖7 pGFPIL-6/IL4質粒PCR電泳圖譜1pGEX-4T-1質粒PCR/P1+P4MDL2000Marker2pGFPIL-6/IL4質粒PCR/P3+P43pGFPIL-6/IL4質粒PCR/P1+P24pGFPIL-6/IL4質粒PCR/P1+P4圖8 白細胞介素4、6融合基因真核表達質粒VRIL46的RT-PCR和酶切電泳分析1VRIL46RT-PCR結果MDL20002VRIL46酶切結果圖9 IL2基因家族改組結果1Marker2無引物PCR3有引物PCR圖10 改組的TPIL-2酶切電泳圖1DL20002pGTPIL-2/BamHI+EcoRI雙酶切3pGTPIL-2圖11 VRIL2S質粒PCR電泳圖1DL2,0002VRIL2S質粒PCR圖12 免疫豬血清中IgG含量圖13 免疫豬血清中IgA含量圖14 免疫豬血清中IgM含量圖15 免疫豬血清中豬瘟特異性抗體含量圖16 免疫組豬血清中豬藍耳病特異性抗體含量圖17 免疫豬血清中IL-2含量圖18 免疫豬血清中IL-4含量圖19 免疫豬血清中IL-6含量圖20 免疫豬白細胞數量變化圖21 免疫豬單核細胞數量變化圖22 免疫豬淋巴細胞數量變化圖23 免疫豬中性粒細胞數量變化具體實施方式
1、豬白細胞介素-4、6基因的克隆、融合設計IL4、IL6基因的連接接頭與融合PCR引物，分別擴增豬IL4和IL6基因，連接入相應的pMD18-T載體，雙酶切後，先將PIL6連接到同樣雙酶切的pGEX4T-1質粒上，再將從載體雙酶切獲得的PIL4片段與重組的pGPIL6連接，轉化感受態細胞，篩選陽性轉化子，酶切鑑定獲得融合的pGPIL46重組質粒。
結果見說明書附圖1、2、3、4、5、6、7。圖1顯示使用連接引物分別以IL-6和IL-4為為模板擴增，並以pUC18空載為對照，通過PCR反應獲得的擴增產物經瓊脂糖凝膠電泳.分別在700bp和420bp處呈現一條與預期產物相對分子質量大小相符的DNA條帶，它們分別是0.7kb的豬白細胞介素-6和0.42kb的豬白細胞介素-4DNA片段。與編碼IL-6模板序列相比，在其C端去除了終止密碼子，引入SalI的酶切位點，與編碼IL-4模板序列相比，引入SalI後，增加了Val和Asp兩個胺基酸，再加引入的柔性肽序列，在其N端共增添了6個接頭胺基酸。
圖2、3顯示回收產物與pMD18-T載體連接，16℃連接過夜，連接產物轉化DH5α感受態細胞，將Amp平板的轉化子點種X-gal平板，過夜培養以後，將白色菌落接種於LA，提取質粒DNA，對較空載大的質粒進行酶切分析，連IL-6的轉化子用BamHI和SalI酶切，連IL-4的轉化子用SalI和XhoI酶切，1.0％瓊脂糖凝膠電泳觀察，篩選有目的片段插入的重組質粒，再分別用IL-6和IL-4特有的酶進行酶切分析，確證為正確的重組子。重組質粒分別命名為pUFPIL6和pUFPIL4。
將克隆到pMD18-T載體上的FPIL-6，FPIL-4 cDNA片段酶切回收，結果見說明書附4。將pGEX4T-1進行BamHI，SalI酶切，同經BamHI，SalI酶切的pUFPIL-6 cDNA片段在T4DNA連接酶作用下進行連接反應。連接產物轉化DH5α感受態細胞，抽提轉化子質粒，進行酶切和PCR鑑定，得到含FPIL-6cDNA片段的重組質粒pGFPIL6，結果見說明書附5。
圖6、7顯示進一步將pGEX4T-1-IL6進行SalI、XhoI酶切，去磷酸化處理後同SalI，XhoI酶切的pUFPIL-4 cDNA片段進行連接反應，連接產物轉化DH5α感受態細胞，抽提轉化子質粒，方向插入正確的pUFPIL-4cDNA片段可以用SalI、XhoI酶切出420bp的片段，方向錯誤的片段因酶切位點改變無法酶切出小帶。進一步用PCR鑑定，得到含FPIL-6 cDNA和FPIL-4cDNA片段的重組質粒，命名為pGFPIL-6/IL-4。
3、融合豬白細胞介素-4、6基因的真核表達質粒的構建豬白細胞介素-46融合基因和真核表達載體VR1020雙酶切，連接轉化，篩選和酶切鑑定重組子。結果見附圖8。重組子質粒PCR和酶切結果顯示，所構建的重組子已成功插入了融合IL-4、6基因，將融合IL-4、6基因的重組真核表達質粒命名為VRIL46。
4、IL-2基因的DNA改組將克隆得到的豬、犛牛、小鼠和人IL2基因進行DNA酶切，分離回收50-100bp的核苷酸片斷；經無引物和有引物兩步PCR重新擴增IL2基因，分離純化獲得改組的IL2基因；改組PCR後的片段進行2.0％瓊脂糖凝膠電泳，瓊脂糖凝膠小分子DNA抽提試劑盒回收500bp的改組片段。然後將此DNA片段用BamHI/EcoRI進行酶切，與脫脫磷酸化、BamHI/EcoRI雙酶切的pGEX 4T-1載體在T4DNA連接酶作用下16℃水浴過夜。連接產物轉化E.coli DH5α感受態細胞，構建重組質粒，酶切鑑定陽性克隆基因。
結果見說明書附圖9、10。圖9顯示DNaseI消化後獲得的50-100bp左右的隨機片段，經55個循環的無引物PCR後，這些小片段拼接為許多大小不一的改組分子，經電泳檢測為主要集中在100-250bp左右的模糊條帶(第二泳道)，是PCR重組配對的結果。無引物PCR的產物再經過30個循環的有引物PCR，與原模板大小相同的IL-2改組分子(約500bp)被富集(第三泳道)，電泳結果顯示在500bp處出現一特異條帶。圖10顯示將初步篩選的陽性菌落，接種於3ml含Amp的LB培養液中，37℃震蕩過夜，用鹼裂解法提取出所有菌落的質粒，然後用BamHI/EcoRI進行酶切，發現大部分切出小片段，大小約500bp左右。
5、改組豬白細胞介素2基因真核表達質粒的構建改組的IL-2基因亞克隆到VR1020載體，PCR反應和酶切反應鑑定重組子，構建改組豬白細胞介素2基因真核表達質粒，命名為VRIL2S。結果見附圖11。重組子VRIL2S的質粒PCR的結果顯示，所構建的重組子已成功插入了改組的IL-2基因。
6、納米顆粒的製備以分子量150000，脫乙醯度95％以上的殼聚糖分散在1％醋酸溶液中(A液)；分別將VR1020、VRIL2S+VRIL46質粒溶解於三聚磷酸鹽溶液(B液)。將A液、B液置於50℃水浴分別恆溫20min，將DNA溶液按一定比例(氨基摩爾數與DNA的磷酸酯基摩爾數比)加入殼聚糖溶液，磁力攪拌使其充分混合，靜置過濾得到粒徑40-60nm的複合物微粒。即是各質粒殼聚糖納米顆粒樣品液。
7、實驗動物的免疫選擇3周齡小豬20隻，隨機分為2組，每組10隻。採用肌肉注射法，每頭質粒劑量0.5mg/頭。所有豬按該養豬場常規免疫程序接種疫苗1周齡免疫接種藍耳病疫苗；2周齡免疫接種偽狂犬疫苗。3周齡在免疫注射基因製劑時同時免疫接種豬瘟疫苗。
動物免疫分組見表1。
表1 免疫豬分組

注CNP殼聚糖納米顆粒8、殼聚糖納米顆粒包裝VR1C+VR6C質粒組合對豬特異性免疫應答的影響豬自免疫後第0，1，2，4，6，8周前腔靜脈採血，分離血清，用以檢測各項免疫指標。
(1)IgG、IgA及IgM的測定含量實驗豬血清分別作105(IgG)和104(IgM、IgA)稀釋包被Costar酶標板，用特異性的兔抗豬IgG、IgM和IgA重鏈抗體(美國Bethyl公司生產)作一抗，酶標羊抗兔IgG為二抗(華美生物工程公司)，TMB(四甲基聯苯胺)為底物，測定豬血清中IgG、IgM和IgA含量。
結果見說明書附圖12、13、14。由圖可見，豬在肌注殼聚糖納米顆粒包裝豬白細胞介素4、6融合基因真核表達質粒VRIL46和改組豬白細胞介素2基因真核表達質粒VRIL2S組合後，其血清中IgG、IgA、IgM含量比對照組有顯著增高；與對照組差異顯著(P＜0.05)。
(2)特異性抗體的測定間接ELISA法。用豬瘟抗原、豬藍耳病抗原包被Costar酶標板，實驗豬血清100倍稀釋為一抗，TMB(四甲基聯苯胺)為底物，測定豬血清中豬瘟、豬藍耳病特異性抗體含量。
結果見說明書附圖15、16。圖15、16顯示了豬瘟疫苗、豬藍耳病疫苗與VRIL46+VRIL2S質粒組合聯合免疫動物後豬只特異性抗體變化情況。結果顯示動物在免疫一周後，就檢測到豬瘟、豬藍耳病特異性抗體的產生；在同時免疫VRIL46+VRIL2S質粒組合後，實驗豬只的上述特異性抗體比對照組顯著提高(P＜0.05)。
(3)細胞因子的檢測實驗豬血清100倍稀釋包被Costar酶標板，兔抗豬IL2、IL4、IL6 IgG抗體(武漢博士德生物工程公司提供)為一抗，TMB(四甲基聯苯胺)為底物，SABC法檢測血清中IL2、IL4及IL6含量，觀測豬細胞免疫應答情況。
結果見說明書附圖17、18、19。圖結果顯示殼聚糖納米顆粒包裝豬白細胞介素4、6融合基因真核表達質粒VRIL46和改組豬白細胞介素2基因真核表達質粒VRIL2S組合與豬瘟疫苗、豬藍耳病疫苗聯合免疫豬後，豬只血清中IL-2、IL-4和IL-6的含量較對照組高，對免疫豬血清中IL-2、IL-4和IL-6的含量的提升作用差異顯著(P＞0.05)。
(4)免疫豬外周血免疫細胞數量的動態變化常規法血球自動計數儀分類計數中性粒細胞、單核細胞核、淋巴細胞。
結果見說明書附圖20、21、22、23。用豬瘟疫苗、豬藍耳病疫苗聯合殼聚糖納米顆粒包裹VRIL46+VRIL2S質粒組合免疫豬，豬外周血免疫細胞數量的變化結果發現肌肉注射殼聚糖納米顆粒包裝VRIL46+VRIL2S質粒組合對豬只外周血免疫細胞有較好的提升能力，免疫組的白細胞、中性粒細胞、單核細胞、淋巴細胞比對照組顯著增高。
8、數據分析上述各種數據均用方差分析進行差異顯著性比較，以P＜0.05為差異顯著性標準。
權利要求
1.複合豬白細胞介素基因抗感染納米分子製劑的製備和應用，其特點包括豬白細胞介素-4、6基因的融合、融合豬白細胞介素-4、6基因真核表達質粒VRIL46的構建，白細胞介素-2基因的改組、改組豬白細胞介素2基因真核表達質粒VRIL2-S的構建，殼聚糖納米顆粒對VRIL46+VRIL2-S質粒組合進行分子包裝製備納米分子製劑，並將此納米分子製劑應用於增強豬機體免疫應答及抗感染免疫力的應用技術。
2.根據權利要求1所述的複合豬白細胞介素基因抗感染納米分子製劑的製備，其特徵在於所述的納米分子製劑的基質是構建的融合豬白細胞介素-4、6基因真核表達質粒VRIL46和改組豬白細胞介素2基因真核表達質粒VRIL2-S質粒組合。
3.根據權利要求1所述的複合豬白細胞介素基因抗感染納米分子製劑的製備，其特徵在於所述的納米分子製劑的包裹材料是分子量為150000，脫乙醯度95％以上的殼聚糖，用離子交聯法製備殼聚糖納米顆粒分子。
4.使用權利要求1要求的殼聚糖納米顆粒包裝融合豬白細胞介素-4、6基因真核表達質粒VRIL46和改組豬白細胞介素2基因真核表達質粒VRIL2S質粒組合作為豬新型抗感染納米分子製劑的應用，其特徵在於以製備的殼聚糖納米顆粒包裝融合豬白細胞介素-4、6基因與改組豬白細胞介素2基因抗感染納米分子製劑聯合疫苗(豬瘟疫苗、豬藍耳病疫苗)免疫豬，以殼聚糖納米顆粒包裝VR1020空質粒為對照，檢測了殼聚糖包裝VRIL46+VRIL2S質粒組合對豬的體液免疫(IgG、IgA及IgM的含量、特異性抗體的測定)和細胞免疫水平(細胞因子和外周血免疫細胞數量)的影響情況，結果表明殼聚糖酸納米顆粒包裹融合豬白細胞介素-4、6基因真核表達質粒VRIL46和改組豬白細胞介素2基因真核表達質粒VRIL2S質粒組合可顯著提升豬對疫苗的細胞免疫和體液免疫應答反應，增強免疫保護力。
全文摘要
本發明融合豬白細胞介素－4、6基因，構建了融合豬白細胞介素－4、6基因真核表達質粒VRIL46，改組白細胞介素－2基因，構建了改組豬白細胞介素2基因真核表達質粒VRIL2－S，以分子量為150000、脫乙醯度95％以上的殼聚糖製備了殼聚糖納米顆粒，提供了利用殼聚糖納米顆粒對VRIL46+VRIL2－S質粒組合進行分子包裝製備納米分子製劑的方法，公開了該納米分子製劑作為新型抗感染分子免疫增強劑的應用技術。該方法包括殼聚糖納米顆粒包裝VRIL46+VRIL2－S質粒組合，將此製備納米分子製劑以肌肉注射方式協同疫苗免疫豬，增強豬特異細胞和體液免疫機能，提供了殼聚糖納米顆粒包裝VRIL46+VRIL2－S質粒組合作為新型複合豬白細胞介素基因抗感染納米分子製劑的應用技術。
文檔編號A61P37/00GK1954885SQ20051002195
公開日2007年5月2日 申請日期2005年10月28日 優先權日2005年10月28日
發明者高榮, 武梅, 呂學斌, 李江凌, 王澤州, 李惠, 王穎玉, 謝曌, 趙鍾鍾 申請人:四川大學