用於治療真菌感染特別是麴黴病的藥物的製作方法

2023-10-25 14:32:32

專利名稱：用於治療真菌感染特別是麴黴病的藥物的製作方法
技術領域：
本發明涉及用於麴黴病治療的由五亞基環蛋白(pentraxin)PTX3和抗真菌劑的組合組成的藥物。
背景技術：
侵入性麴黴病(IA)是醫院性肺炎和同種異體骨髓(BM)移植中死亡的主要原因，據估計感染率為8％-15％且相關死亡率為約90％(3，16，30，36，47)。儘管早期診斷和使用新的抗真菌劑治療已經取得進展(6，31)，但是絕大多數AI病例仍然沒有被診斷出來且沒有得到治療(16)。AI最重要的危險因素在過去是嗜中性白細胞減少症。然而，對於經歷化療和移植的患者的準備中取得的進展已使得嗜中性白細胞減少期顯著縮短。許多研究已經證明了，麴黴病在骨髓移植之後伴隨移植物抗宿主(GvH)疾病的發作而表現出來(30)。IA也可在非-嗜中性白細胞減少症患者中發生(17)證實了在先天性和適應性免疫效應物機理中的特異性缺陷在疾病發病中的重要性(13，20，22，32，39，43，44)。具體而言，近來已經評價了Th淋巴細胞在提供針對真菌的基本繼發性防禦中的作用(8-10，12，14，23，26)。由於IA在免疫活性個體中非常罕見，因此目標在於增強宿主免疫應答的療法在這種感染的治療方面提供了一種新的且有希望的途徑。
先天免疫系統以複雜、多面的方式進化以保護肺組織免受感染。據信對肺組織的保護不僅包括對微生物增殖的預防性控制，而且還包括足以控制感染而不會誘導危險程度的肺泡滲出和浸潤的平衡炎性反應的實現。肺泡內襯的分子成分作為感染中主要的免疫調節物近來已成為重要的注意焦點(28，29)。
五亞基環蛋白(PTX)是在由美洲鱟到人的進化過程中保守的蛋白超家族，其總體特徵在於五聚結構(21)。PTX3是長五亞基環蛋白的原型，在於N-末端部分與五亞基環蛋白C-末端結構域偶聯，後者是短PTX的同源物(7)。PTX3由多種類型的細胞分泌，特別是單核吞噬細胞、內皮細胞和樹突細胞(DC)，在體外和體內應答初級炎性細胞因子(11，38，18)。該蛋白循環水平的增加已在各種不同的感染和炎症中檢測到(37，19，34，41)。PTX3可結合多種選定的微生物因子(例如，煙麴黴分生孢子和銅綠假單胞菌)並激活免疫系統的多種效應物途徑，從而對抗病原體的感染性(20)。對PTX3-缺陷型小鼠的分析證實了PTX3是一種模式識別受體(PRR)，其在對選定的病原體的抗性中發揮非-多餘作用(20)。PTX3-缺陷型小鼠對煙麴黴的敏感性與I型適應性免疫反應的不成功組構相關，但由重組PTX3的外源施用所恢復(20)。
儘管近來抗真菌醫藥物質已經擴充(45)，但在抗麴黴病方面仍需要治療性進展。
研究人員正在開始探究使用抗真菌劑和細胞因子的單一組合的新策略(46)。使用兩性黴素B(一種首選藥物)進行治療受到與劑量有關的腎毒性的限制，其阻礙了接受BM移植的患者中的全劑量治療(24)。已經開發了多種基於脂質的兩性黴素B製劑，以降低與常規D-AmB(25)以及與L-AmB(2)有關的毒性。L-AmB毒性的藥動學性能較之D-AmB更為有利，由此使全劑量治療成為可能。雖然如此，失敗率仍然是值得關注的問題(1)。公開的IA鼠模型，其中已經評價了抗真菌劑的功效，依賴由使用或未使用皮質類固醇的化療誘導的嗜中性白細胞減少症，從而使小鼠不易感染。近來，對用於治療IA的新抗真菌劑的開發有所增加，藥物類別由新的治療靶表徵(45)，其引起對IA治療的新的預期且增加了可能的新聯合療法的數目(45)。基於對其它感染性疾病的治療(4)，聯合療法似乎是重要的治療選擇。
發明概述現在已經發現當與其它抗真菌劑組合時，五亞基環蛋白PTX3可發揮令人吃驚的協同作用，因而可製備特徵在於亞適劑量抗真菌劑的藥物。該特徵顯示在藥物更大的易控性方面有益，因為它能夠大大限制其各活性成分特徵性的副作用。
因此，本發明其中一個目的是五亞基環蛋白PTX3和抗真菌劑的組合，以及含有該組合的藥物組合物和所述組合製備用於真菌感染特別是麴黴病的預防性或治療性治療的藥物的用途。
發明詳述五亞基環蛋白PTX 3及其多種治療用途在以本申請人的名義提交的多項專利申請中描述。
國際專利申請WO 99/32516描述了該蛋白的序列及其在感染性、炎性或腫瘤性疾病中的用途。長五亞基環蛋白PTX3的其它用途在WO02/38169、WO 02/36151、WO 03/011326和WO 03/084561中描述。
在本發明的優選實施方案中，抗真菌劑是兩性黴素B，更優選是已知以商標Fungizone(Bristol-Myers Squibb)出售的脫氧膽酸鹽形式或已知以商標AmBisome(GILEAD)出售的脂質體製劑。
關於本發明工業實用性方面，長五亞基環蛋白PTX3和抗真菌劑將為藥物組合物的形式，其中活性成分溶於和/或載於藥學可接受的賦形劑和/或稀釋劑中。
可用於長五亞基環蛋白PTX3的藥物組合物的例子還有在WO99/32516中描述的那些。
本發明的組合可通過腸道或非腸道途徑給藥。
根據初級護理醫師的判斷，每日劑量取決於患者的體重、年齡和一般健康狀況。
應指出，所述藥物組合物包括緩釋製劑的製備可使用藥劑師和製藥技術專家熟知的常規技術和設備來完成。
在本發明的特定實施方案中，真菌感染為侵入性麴黴病(IA)。
已在鼠骨髓移植模型中評價本發明的組合，該模型複製了在人相同狀況中觀察到的免疫缺陷。使小鼠經受不同的治療方案並評價對IA的抗性及先天性和適應性免疫參數。結果顯示PTX3誘導了對感染和再感染的總體抗性，它激活了I型保護反應並且當聯合給藥時顯著增加了抗真菌劑的治療功效。
現在通過實施例和附圖詳細例示本發明，其中
圖1舉例說明在患有侵入性麴黴病的小鼠中給予PTX3、AmBisome(L-AmB)或Fungizone(D-AmB)的作用。鼻內感染2×107個麴黴分生孢子之前一周，給經致死性輻射的C3H/HeJ小鼠輸注BALB/c小鼠的耗盡T-細胞的BM細胞(2×106)。感染之前5天(之前)或之後(之後)或與感染同時(同時)，以所示劑量並經由所示途徑，使用PTX3或聚烯治療小鼠，在各情況下接下來5天重複給藥。以存活百分率的形式評價對感染的抗性。通過將各器官灌洗液在沙氏葡萄糖培養基上連續平板接種而定量感染小鼠的肺、腦和腎中的真菌負荷，結果以從所示器官採集的樣品中的菌落形成單位(CFU)(平均值±SE)表示，採樣在於感染之前死亡的小鼠死亡時進行或在感染後6天進行。每組由6隻動物組成。
*表示P＜0.05(經治療的與未經治療的小鼠相比)。
圖2舉例說明PTX3給藥對於對麴黴菌再感染的抗性的作用。在BM移植後1周用2×107個麴黴分生孢子鼻內感染BM-移植小鼠，該小鼠按照圖1說明中詳細描述的而產生，並且在感染當天開始並接下來再持續5天，同時用PTX3以所示的劑量並經由所示的給藥途徑進行治療。感染後2周，靜脈內注射5×105個麴黴分生孢子，使存活的小鼠再感染。再感染後3天，評價腎中的真菌生長(CFU)。*表示P＜0.05(經治療的與未經治療的小鼠相比)。
圖3顯示PTX3可減輕患有侵入性麴黴病小鼠的肺病。從感染了麴黴分生孢子，且未治療(A)或從感染當天開始並再持續5天用1mg/kgPTX3腹膜內治療(B)的BM-移植小鼠的肺製備高碘酸席夫鹼切片。眾多麴黴菌絲(箭頭)浸潤肺實質，伴有廣泛的實質破壞和支氣管壁損害的強烈徵象，並在沒有治療過的小鼠肺中觀察到壞死和差的細胞募集(感染後3天)。PTX3-治療過的小鼠呈現特徵在於炎性細胞治癒性浸潤的肺組織，且沒有實質破壞或真菌生長的跡象(感染後6天)。A和B圖放大100倍；插圖放大400倍。
圖4顯示PTX3加速患有侵入性麴黴病小鼠中的細胞恢復。使按照圖1說明中詳細描述產生的BM-移植小鼠鼻內感染2×107個麴黴分生孢子，從感染當天起並再持續5天使用1mg/kg PTX3腹膜內給藥而治療(+)或不進行治療(-)。數字表示感染後3或6天肺(A)和脾(B)中陽性細胞的百分比，其通過FACS分析而報告。
圖5顯示PTX3誘導Th1細胞的功能性恢復。使按照圖1說明中詳細描述產生的BM-移植小鼠鼻內感染2×107個麴黴分生孢子，並在感染之前(斜線柱條)和從感染當天開始並再持續3天(帶點的柱條)，使用1mg/kg PTX3腹膜內給藥治療。在感染後3天，通過對支氣管肺泡灌洗液進行特異性ELISA分析而測定IL-12 p70和IL-10水平(A)，產生細胞因子的CD4+T脾細胞數是通過ELISPOT分析計數的(B)且CD4+脾細胞上細胞因子的基因表達通過實時-PCR測定。線條表示標準誤差。*P＜0.05，感染與沒有感染的小鼠相比；**P＜0.05，PTX3-治療過的與沒有治療過的小鼠相比。未感染的小鼠(白色柱條)；感染過的小鼠(黑色柱條)。
圖6顯示PTX3增加AmBisome(L-AmB)和Fungizone(D-AmB)的治療功效。使按照圖1說明中詳細描述產生的BM-移植小鼠鼻內感染2×107個麴黴分生孢子，並在感染之前(之前)或之後(之後)，單獨或聯合使用各單一藥物進行腹膜內治療。劑量為感染之前或之後分別為0.04和0.2mg/kg PTX3；1mg/kg AmBisome和2mg/kg Fungizone。對感染的抗性以存活百分率和來自肺的CFU評價，後者在感染前死亡的小鼠死亡時進行或在感染後6天進行。*P＜0.05，治療過的與沒有治療過的小鼠相比；**P＜0.001，PTX3+L-AmB的聯合治療與單獨的各單一治療相比；***P＜0.05，PTX3+D-AmB的聯合治療與單獨的D-AmB相比。
圖7顯示在用聚烯治療的小鼠中，PTX3降低TNF-α產生並增加Th1∶Th2細胞因子比。使按照圖1說明中詳細描述產生的BM-移植小鼠鼻內感染2×107個麴黴分生孢子，並在感染之後，單獨或聯合使用各單一藥物進行腹膜內治療。劑量是如圖6說明中詳細描述的。測定感染後3天支氣管肺泡灌洗液中的TNF-γ水平(pg/ml)(A)和抗原-激活的脾細胞的培養上清液中的IFN-γ和IL-4水平(pg/ml)(B)，後者在於感染前死亡的小鼠死亡時進行，或在感染後6天時進行。線條表示標準誤差。(-，沒有治療過的小鼠)。*P＜0.05治療過的與沒有治療過的小鼠相比；**P＜0.05，PTX3+Fungizone(D-AmB)的聯合治療與單獨的D-AmB相比；***P＜0.05，PTX3+AmBisome(L-AmB)的聯合治療與單獨的各單一治療相比。
材料和方法動物.雌性BALB/c和C3H/HeJ小鼠，8-10周齡，由Charles RiverBreeding Laboratories(Calco，Italy)提供。該小鼠在特定的無汙染的條件下餵養。將BM-移植小鼠圈養在小的無菌籠子中(每個籠子5隻動物)並餵以無菌飼料和水。與動物和它們的護理有關的所有過程均按照國家和國際法規和標準進行。所有體內研究均按照國家準則和Committee for the Care and Use of Animals of the University ofPerugia的那些指南進行。
BM-移植模型.來自BALB/c供體小鼠的骨髓(BM)細胞是使用大豆凝集素通過差別凝集製備的。將耗盡T-淋巴細胞的細胞(通過FACS分析測量，汙染T細胞少於1％)以≥4×106個/mL的濃度靜脈內(i.v.)注射在暴露於9Gy致死劑量的受體C3H/HeJ小鼠中(33)。不進行BM移植的情況下，小鼠在14天內死亡。根據先前研究(33)，超過95％的小鼠存活下來，如通過脾細胞中供體類型的I類MHC的表達所檢測到的，所述存活小鼠顯示穩定供體的造血嵌合狀態。
微生物，培養條件和感染.煙麴黴菌株由在Institute forInfectious Diseases of the University of Perugia的一例肺麴黴病致死病例提供(13)。對於感染，通過吸入乙醚使小鼠輕度麻醉，然後滴注2×107個分生孢子/20μL鹽水溶液的混懸液，使用具有無菌一次性管尖的微量吸管經由鼻孔緩慢釋放。該過程重複連續3天。對於再感染，對經首次鼻內(i.n.)感染仍存活的小鼠i.v.接種5×105個麴黴分生孢子。感染小鼠的肺、腦和腎中的真菌負荷通過在沙氏葡萄糖培養基上連續平板接種而定量，且結果(平均值±SE)以從所示器官採集的樣品中的菌落形成單位(CFU)表示。對於選定的實驗，真菌生長還可通過殼多糖分析而評價(10)。對於組織學分析，摘除肺並立即固定在福馬林中。將包埋在石蠟中的組織切片(3-4μm)使用高碘酸席夫鹼操作染色(13，20)。
治療PTX3(SIGMA-Tau，Pomezia，Rome，Italy)是通過免疫親和色譜從轉染PTX3的CHO細胞的培養上清液純化的，並監測是否缺乏內毒素(20)。將PTX3、兩性黴素B脫氧膽酸鹽(D-AmB，Fungizone，Bristol-Myers Squibb，Sermoneta，Italy)和脂質體兩性黴素B(L-AmB，AmBisome，GILEAD，Milan，Italy)在無菌鹽水溶液(PTX3)或5％葡萄糖-水溶液中稀釋至所需濃度。治療是按照下列方案進行的腹膜內(i.p.)或鼻內(i.n.)(僅PTX3)給予不同劑量的PTX3、兩性黴素B或AmBisome，單獨或聯合，在麴黴菌感染之前進行5天(預防性治療)，與感染同時進行和感染後進行5天，或在最後一次注射分生孢子後進行5天(治療性治療)。在i.n.給藥的情況下，分開給予PTX3和分生孢子。對照動物僅接受稀釋劑或無菌鹽水溶液。
流式細胞計量術.各種細胞類型的表型使用針對所示抗原的鼠抗體和來源於PharMingen(San Diego，Ca)的與FITC綴合的大鼠抗小鼠抗體來評價。在進行免疫化學鑑定之前，通過將細胞與5％正常血清溫育而使FcR飽和。組織型抗體用作對照。分析通過FACScan(BectonDickinson，Mountain View，Ca)進行。所得數據以陽性細胞百分比的形式評價。直方圖代表4個獨立實驗中的1個。
通過實時RT-PCR定量細胞因子的轉錄物.按照製造商的說明，用Sensiscript逆轉錄酶(QIAGEN)逆轉錄總RNA(5μg，使用RNeasy MiniKit(QIAGEN S.p.A.，Milan，Italy)從CD4+T脾細胞提取)。進行PCR的引物從Applied Biosystems(FosterCity，Ca)獲得。使樣品經過95℃15秒，然後60℃ 1分鐘的40次擴增循環，其使用ABI PRISM 7000Sequence Detection System(Applied Biosystems)進行。按照製造商(Applied Biosystems)的說明，進行真核18S rRNA管家基因的PCR擴增，以便使樣品標準化。包括使用水進行的對照是為了確保特異性。通過對擴增圖的分析，檢驗了所有數據的完整性。將使用RNA 18S標準化的數據以所檢驗細胞因子的相對mRNA(ΔΔCt)表示，並與首次用於實驗的小鼠的數據(10)進行比較。
細胞因子的分析和″斑點酶聯免疫吸附″(ELISPOT)分析.支氣管肺泡灌洗液和用熱激活的麴黴菌(9，10)刺激的脾細胞培養物上清液中的細胞因子水平是用ELISA Kit(RD Systems，Inc.SpaceImport-Export srl，Milan Italy)測定的。分析的檢測限(pg/ml)為對IL-12 p70＜16，對TNF-α＜32，對IFN-γ＜10且對IL-4和IL-10＜3。對產生細胞因子的CD4+T細胞計數時，對純化的CD4+T脾細胞使用ELISPOT分析(9，10)。結果以每105個細胞中產生細胞因子的細胞平均數(±SE)表示，其中使用連續細胞稀釋物的平行測定計算。
統計學分析.對數-秩檢驗用於分析Kaplan-Meier存活曲線的成對數據。Student′s t-檢驗或方差分析(ANOVA)和Bonferroni檢驗用於確定器官清除率和體外分析中差異的統計學顯著性，正如


中所示。顯著性被定義為P＜0.05。體內組由4-6隻動物組成。除非另有說明，所報告的數據從3-5次實驗匯總。
結果正如先前所證實的，PTX3的外源給藥恢復了患有IA的PTX3-缺陷型小鼠的抗真菌抗性(20)。為了評價PTX3是否可能在以其它方式易感的小鼠中具有益作用，我們使用了BM-移植小鼠，它對IA的顯著敏感性已得到很好證明(15)。在感染之前、同時或之後，鼻內或腹膜內給予不同劑量的PTX3而使小鼠經受治療。劑量是基於初步實驗而選擇的，該初步實驗表明PTX3水平(0.5mg/kg/i.n.劑量)在支氣管肺泡灌洗液中較高，持續至少24小時(從2-24小時為70-25ng/ml)且它們高於在IA小鼠中感染後1天觀察到的水平(2-15ng/ml)(20和未公開的數據)。然後記錄存活參數及肺和腦中的真菌負荷並通過與在使用不同劑量AmBisome或Fungizone治療的小鼠中獲得的那些數據相比較而進行分析。結果表明預防性給予PTX3(圖1A)在任何測定劑量下誘導對IA的總體抗性，如絕大多數(85-95％)治療過的小鼠存活增加(≥60天)及肺和腦中真菌負荷顯著降低而揭示的，特別是在接受最高劑量(1mg/kg)的小鼠中。在感染同時接受PTX3的小鼠中獲得了相似的結果(圖1B)。在該給藥期間檢測到了劑量-依賴性作用，其中在0.04mg/kg劑量下，PTX3的保護性功效喪失。感染後給予PTX3僅在較高劑量下增加小鼠存活，雖然在兩種劑量下，它均顯著降低肺中的真菌負荷，且在更高劑量下顯著降低腦中的真菌負荷(圖1C)。在兩種給藥途徑之間沒有觀察到差異。在使用5mg/kg AmBisome治療的小鼠中觀察到類似的結果，其中當在感染之前或之後治療時，所有小鼠經感染均存活下來(圖1D)。Fungizone沒有提供相同水平的保護，僅在感染後給予最高耐受劑量(4mg/kg)時，觀察到存活增加以及真菌負荷降低(圖1E)。此外，我們評價了使用PTX3治療之後，治癒小鼠對麴黴菌再感染的敏感性，並發現使用PTX3治療還顯著增加對再感染的抗性，這是通過再感染小鼠腎中的真菌生長減少而揭示的(圖2)。PTX3還改善了肺病理學。感染小鼠的肺切片顯示存在許多浸潤了肺實質的麴黴菌菌絲，並有嚴重損害支氣管壁的徵象及壞死和差的炎性細胞募集(圖3A)。在使用PTX3治療的小鼠中沒有觀察到這些特徵，其肺特徵在於多核及單核的炎性細胞的癒合性浸潤，沒有真菌生長或支氣管壁破壞的跡象(圖3B)。這些數據為PTX3在BM移植狀況中的治療性功效提供了證據，在所述狀況中抗真菌劑通常顯示活性降低(16，31)。
在患有I A的小鼠中，對感染的抗性與產生IFN-γ的Th1細胞的激活有關(12，13)。為了評價在患有IA的BM-移植小鼠中PTX3是否激活Th1細胞反應性，我們通過FACS分析評價了細胞恢復、局部細胞因子產生和效應物吞噬細胞的抗真菌活性。對血液白細胞的定量評價表明在使用PTX3治療之後，循環嗜中性白細胞的絕對數量顯著增加(沒有顯示數據)。然而，由於血液中嗜中性白細胞的水平不能使我們預測對麴黴病的敏感性(5)，因此對肺和脾細胞進行了細胞螢光分析。在使用PTX3治療的小鼠肺中，CD4+細胞、CD8+細胞和Gr-1+嗜中性白細胞的數量顯著增加(圖4A)。在脾中還觀察到嗜中性白細胞和CD4+T細胞(部分地)的恢復。使用或沒有使用PTX3治療的肺或脾F4-80+細胞的數量沒有發現差異(圖4B)。恢復的細胞和淋巴細胞證實是有功能活性的，這是通過肺勻漿中促炎(IL-12)和抗炎(IL-10)細胞因子的產生和CD4+Th1(IFN-γ)及Th2(IL-4)的頻率所表明的。圖5A顯示使用PTX3治療大大增加IL-12產生(約4倍)；然而，IL-10的產生僅為一半(與沒有治療過的對照相比)，這一結果表明PTX3對感染部位的炎性過程發揮精細的控制作用。此外，PTX3治療增加脾中CD4+Th1細胞的頻率，並減少產生IL-4的細胞的頻率(圖5B)，這一發現是利用定量PCR通過評價細胞因子的mRNA表達水平加以證實的。圖5C顯示使用PTX3進行的預防性和治療性治療均顯著增加IFN-γ表達並減少IL-4表達。在評價效應物吞噬細胞的抗真菌活性水平時，發現PTX3-治療過的小鼠中的效應物吞噬細胞殺死分生孢子的活性高於沒有治療過的小鼠(沒有顯示數據)。因為體外研究已經排除了PTX3對真菌的任何直接殺死活性(沒有顯示數據)，因此這些數據證明了PTX3作為一種新的藥物，對先天性和適應性抗真菌免疫具有顯著的免疫調節活性。
所有上述發現促使我們評價PTX3的免疫調節活性是否可用於增加AmBisome或Fungizone的治療功效，因為已知這些藥物可與抗真菌的效應物吞噬細胞協同起作用(40)。為了該目的，BM移植小鼠接受亞適劑量的單獨或與聚烯一起的PTX3，在所述亞適劑量下兩種藥物均未達到最大治療作用。在感染之前或之後給予聯合或單一的治療。監測小鼠的存活、真菌生長和細胞因子的產生。發現單獨給予各單一藥物顯著降低肺中真菌生長，但它不能顯著改變小鼠的存活，除了在感染之前單獨給予PTX3外。然而，使用PTX3和AmBisome的聯合療法，無論在感染之前還是之後，均治癒小鼠感染，這是通過存活增加(＞60天)和真菌生長減少而判斷的。當在感染之後給藥時，與單獨的Fungizone給藥相比，PTX3和Fungizone的聯合給藥顯著增加對真菌感染的抗性(圖6)。對肺勻漿和培養的抗原-刺激的脾細胞上清液中的細胞因子的分析證實，與在使用單獨的藥物進行治療的小鼠中觀察到的水平相比，PTX3大大降低接受Fungizone的小鼠肺中TNF-α的產生；作為對AmBisome的反應的TNF-α產生的水平低於使用Fungizone治療所誘導的水平，且不能通過與PTX3聯合治療而改變(圖7A)。各單一治療之後，與沒有治療過的小鼠相比，脾細胞產生IFN-γ顯著增加，且在使用PTX3和AmBisome治療的小鼠中進一步增加；相反，使用PTX3和/或AmBisome治療，和使用PTX3與Fungizone聯合治療時，兩者均大大減少IL-4的產生，儘管程度較低(圖7B)。因此，在減輕肺炎性反應和促進Th1抗真菌反應性方面，PTX3似乎與AmBisome協同發揮作用，並超過與Fungizone的協同作用。
本發明的PTX3在患病最輕的IA小鼠中誘導治癒性反應。鑑於當預防性給藥時PTX3是有效的且它不顯示對真菌細胞的直接活性，似乎該有益作用取決於它激活Th1-依賴性保護抗性的能力。
PTX3可激活針對致病感染性的至少兩個效應物途徑，即，經典補體激活途徑，在Clq結合中(35)，和通過與一種或多種尚未鑑定的細胞受體相互作用而促進吞噬作用(20)。駐留單核細胞對分生孢子的內化可能有助於限制真菌的感染性並使肺中的髓樣細胞和淋巴樣細胞恢復。然而，PTX3還可通過應答麴黴分生孢子時IL-12的產生和共同刺激分子的表達而激活DC(20)。因此，通過Toll-樣受體(TLR)家族成員(18)，在DC中PTX3產生的迅速開始暗示了PTX3在先天抗性的擴增和定向適應性免疫中的直接作用。
在使用PTX3治療的感染小鼠的肺中，IL-12的產生增加且IL-10的產生減少，這一結果表示炎性反應。然而，使用PTX3治療沒有增加TNF-α的產生，表明PTX3象許多膠原凝集素一樣可對促炎和抗炎刺激之間的平衡發揮精細調節劑的作用(42，48)。
根據本發明，在BM移植感染模型中評價了AmBisome和Fungizone的治療功效，該模型與BM移植受體中見到的深度免疫病理相似，其中對侵入性真菌感染的敏感性在原因上與保護性Th反應的發生與否有關(15，33)。我們發現在BM移植後的IA小鼠中，AmBisome顯示出與Fungizone相比更優的活性。使用5mg/kg AmBisome進行每日預防性和治療性治療均治癒小鼠的感染並減少肺中真菌負荷。使用D-AmB，我們僅在感染後給予最高耐受劑量(例如，4mg/kg)時，觀察到對感染的抗性稍稍增加。
已經假定D-AmB的毒性(包括發熱和戰慄)是由先天免疫細胞通過TLR-依賴性機理產生促炎細胞因子所致(43)。表達TKR2、CD14和MyD88銜接蛋白的鼠巨噬細胞和人細胞系應答D-AmB，釋放促炎細胞因子，包括TNF-α。這裡，我們發現與使用L-AmB治療的小鼠相比，在使用D-AmB治療的小鼠中，TNF-α產生更高。然而，與PTX3聯合治療大大降低使用Fungizone治療所誘導的TNF-α的產生，而它同時增加該藥物的治療功效，正如在感染後使用PTX3和D-AmB組合治療的小鼠存活增加和真菌負荷降低所示的那樣。與使用各單一治療所觀察到的相比，與PTX3聯合治療還在不影響TNF-α產生水平的情況下，增加亞適劑量AmBisome的功效。因此，PTX3與抗真菌劑共同給藥的活性可能取決於超出降低TNF-α產生的一種作用。在這一點上，已知抗真菌化療的功效取決於宿主的免疫反應性(32)且不同的兩性黴素B製劑與效應物吞噬細胞聯合針對煙麴黴發揮附加的抗真菌活性(40)。還報告了PTX3可增加效應物吞噬細胞針對麴黴分生孢子的吞噬作用和殺傷活性(20)。
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權利要求
1.五亞基環蛋白PTX3與抗真菌劑的組合。
2.根據權利要求1所述的組合，其中所述抗真菌劑為兩性黴素B。
3.根據權利要求2所述的組合，其中所述兩性黴素B為脫氧膽酸鹽形式或脂質體製劑。
4.由權利要求1-3任何一項所述的組合組成的藥物組合物。
5.根據權利要求4所述的組合物，含有亞適劑量抗真菌劑。
6.權利要求1-3任何一項所述的組合在製備用於真菌感染的預防性或治療性治療的藥物中的用途。
7.根據權利要求6所述的用途，其中所述藥物含有亞適劑量的抗真菌劑。
8.根據權利要求6和7所述的用途，其中所述真菌感染為肺麴黴病。
全文摘要
本發明描述了用於治療真菌感染且特別是由煙麴黴引起的感染的五亞基環蛋白PTX3與抗真菌劑的組合。
文檔編號A61P31/10GK1950104SQ200580014654
公開日2007年4月18日 申請日期2005年4月28日 優先權日2004年5月7日
發明者G·薩爾瓦託利, P·卡爾米納蒂, L·羅曼尼 申請人:希格馬託製藥工業公司