多用途型接頭化合物和配位體及它們的製造方法

2023-10-06 03:43:14 2

專利名稱：多用途型接頭化合物和配位體及它們的製造方法
技術領域：
本發明涉及多用途型接頭化合物以及把糖分子引入該多用途型接頭化合物形成的配位體、配位體載體及它們的製造方法。所述多用途型接頭化合物在晶片技術或色譜技術、生物探頭等方面使用糖分子的時候，特別方便地且高效地適用於糖分子的導入。
背景技術：
存在於生物體內的各種糖與特定的蛋白質相互作用，在生物活動或生命維持的機理方面起著非常重要的作用。為此，研究糖和蛋白質之間的相互作用在研究糖的生物活性方面更為重要。
與糖進行相互作用的蛋白質，例如，通過以下手段可以得到檢測。即根據表面等離子體振子共振法(以下，稱作SPR)，使用表面固定糖的傳感片，可以研究該糖和蛋白質之間的生物化學的結合。若把糖固定在親和色譜的載體上，可以分離純化特異地作用於糖的蛋白質。若進一步用糖作為基因工程學的生物探頭，則可以檢測出與糖相互作用的蛋白質。
迄今為止，本發明人發現，正如公開於「日本化學會第79次春季年會演講文稿集II、社團法人日本化學會、2001年3月15日，p.1042」，在上述SPR的傳感片或親和色譜的載體等蛋白質分析用的支持物上，在某一步驟引入各種寡糖可固定的接頭化合物以及在該接頭化合物導入寡糖形成了配位體。
上述接頭化合物包含芳香族氨基部位和生物素部位。其中，所述芳香族氨基部位用於導入寡糖。此外，所述生物素部位利用生物素-鏈黴親和素(或親和素)鍵，用於固定到蛋白質分析用的支持物表面上。因此，通過該接頭化合物可以把寡糖固定在蛋白質分析用的支持物上。
然而，僅用1個寡糖分子其分子活性不高，所以當評價寡糖的生物活性時，通常，必需將3單元個以上的寡糖一起引入到所述蛋白質分析用的支持物上。因此，通過把糖引入到上述的接頭化合物形成的配位體集中在上述支持物表面上，則必需集合3個單元以上的寡糖才能通過所述接頭化合物把寡糖固定到上述支持物上。
另外，關於糖鏈的集合化及其接頭的合成法，已經公開在日本國特許公開公報2002-08048號(2002年3月19日公開)。而關於糖鏈的固定方法及其接頭以及糖鏈配位體的合成法已經公開在日本國特許公開公報2003-83969號(2003年3月19日公開)。而關於固定於晶片上的糖鏈和蛋白質之間的相互作用利用表面等離子體振子共振分析法已經公開在「H.Mach，D.B.Volkin，C.J.Burke，C.R.Middaugh，R.J.Linhardt，J.R.Fromm，D.Loganathan，Biochemisty，32，5480-5489(1993)」。而關於集合糖鏈的分子效果則公開在「Eric K.Wollker and Marry J.Cloninger，Org.Lett.，4，7-10(2000)」。而關於糖鏈的集合方法公開在「K.Matuura，H.Kitakouji，A.Tsuchida，N.Sawada，H.Ishida，M.Kiso and K.Kobayashi，J.Am.Chem.Soc.，122，7406-7407(2000)」和「S.Koshida，Y.Suda，Y.Fukui，J.Ormsby，M.Sobel，S.Kusumoto，Tetrahedron Lett.，40 5725-5728(1999)」。而關於多用途型接頭分子的合成方法公開在「D.H.Tomalia，H.Barker and J.Roeck，Polymer.Jornal.，17，117-132(1985)」和「Christof Worner and Rolf Mulhaupt，Angew.Chem.Int.Ed.Engl.，32，1306-1311(1993)」。
然而，當使用上述現有的含有接頭化合物的配位體時，可以2次元地集中把寡糖的糖鏈排列於傳感片表面上，但控制該集合狀態以及很好地再現排列是非常困難的，迄今為止還存在著這樣的技術問題。
也就是說，使用固定在蛋白質分析用支持物表面上的寡糖，為精確地檢測該寡糖的生物活性，統一寡糖糖鏈的集合狀態，希望能夠很好地檢測再現寡糖和蛋白質之間的相互作用。然而，使用上述現有的配位體時，3個單元以上的寡糖糖鏈的集合狀態依賴於配位體的集合狀態，有時無法把3個單元以上的寡糖糖鏈的集合狀態統一起來。若寡糖糖鏈的集合狀態不同，檢測的寡糖和蛋白質之間的相互作用也不同，很難較好地評價寡糖的生物活性。
本發明就是為了解決上述技術問題而提出的，其目的在於提供一種新的多用途型接頭化合物、以及、把糖分子引入到該多用途型接頭化合物而形成的新配位體、配位體載體及它們的製造方法，進一步用它們來測定糖分子和其他物質之間的相互作用的方法。其中，所述多用途型接頭化合物很好地把糖排列在蛋白質分析用支持物上。

發明內容
本發明人為了解決上述技術問題進行悉心研究的結果發現，可導入作為4個單元以上糖分子的部位具有4個芳香族氨基，且，特異地與糖分子相互作用的蛋白質進行檢測或分離時所使用的結合在蛋白質分析用支持物的部位作為可結合的部位具有生物素部位或亞氨基生物素部位(以下，稱作生物素部位)的新的多用途型接頭化合物，由此，可以2次元地很好地把4個單元以上的糖分子排列在上述支持物上，以至完成本發明。
即，為了解決上述的技術問題，本發明多用途型接頭化合物(以下，記作接頭化合物)，以下述為特徵包括用通式(1)表示的結構，
(其中，Y具有O或NH表示的結構)，上述X包括由4個鏈形成的多個部位的結構，所述4個鏈在鏈末端不僅具有芳香族氨基，同時還在主鏈上含有碳-氮鍵的烴衍生鏈。
所說烴衍生鏈是指，由碳和氫組成的烴鏈，其中，部分的碳或氫可以被其他原子或取代基所取代的鏈。即，所說烴衍生鏈是指，在鏈末端具有芳香族氨基，烴鏈為主要鏈結構的碳-碳鍵(C-C)的一部分也可以被碳-氮鍵(C-N)、碳-氧鍵(C-O)或醯胺鍵(CO-NH)所取代。
根據上述結構，所述接頭化合物在上述蛋白質分析用支持物上可固定的部位包括生物素部位。該生物素部位具有高親和性為鏈黴親和素或親和素(以下，總稱為親和素)。為此，在固定有親和素的支持物表面上形成生物素-親和素鍵，可以把上述接頭化合物簡單地固定在支持物表面上。
此外，上述接頭化合物，作為可簡單地導入各種糖分子的部位，還具有芳香族氨基。所述芳香族氨基包含在各個烴衍生鏈中，所以在接頭化合物中可以引入4個單元以上的糖分子。還有，被引入的糖分子被引入到一個接頭化合物中可以把被引入的4個單元以上的糖分子按照一定間隔排列。由此，通過上述接頭化合物可以得到再現性非常好的被引入到蛋白質分析用支持物上的糖分子的排列。
進一步通過使用上述接頭化合物，把4個單元以上的糖分子集中在上述支持物表面上，可以使糖分子再現地很好地排列，由此，可以獲得糖分子具有充分生物活性，因此，也可以檢測糖分子和蛋白質之間的相互作用，可以再現地很好地評價糖分子的生物活性。
在用上述通式(1)表示的接頭化合物中，優選上述X具有下述通式(2)表示的結構
(式中，m1，m2，n1，n2，p1，p2，p3，p4各自獨立地為1-6的整數)。
上述接頭化合物中的X具有上述4個烴衍生鏈，所以，介於該接頭化合物可以在上述支持物上導入4個單元以上的糖分子。為此，通過使用上述接頭化合物可以控制引入到上述支持物表面上的糖分子間的距離，獲得再現性良好的糖分子排列。
因此，通過使用上述接頭化合物可以獲得再現性良好的糖分子的生物活性。由此，用SPR或親和層析、生物探頭等技術，它們利用糖分子的生物活性可以非常好地檢測各種糖分子和蛋白質之間的特異性相互作用。
此外，為了解決上述技術問題，本發明的配位體是以上述任意一種接頭化合物的芳香族氨基上引入糖分子而形成的配位體為特徵。
具體地，上述配位體優選具有下述通式(3)表示的結構
(式中，Y具有O或NH表示的結構，R1，R2，R3，R4各自獨立用H-或 表示的結構，R6，R7，R8，R9，R10是選自HO-或 或者 表示的結構)，(式中，m1，m2，n1，n2，p1，p2，p3，p4各自獨立地為1-6的整數)。
上述配位體優選具有下述通式(4)表示的結構
(式中，Y具有O或NH表示的結構，m1，m2，n1，n2，p1，p2，p3，p4各自獨立地為1-6的整數)。
在上述蛋白質分析用的支持物表面上，通過使用任意一種上述配位體可以使4個單元(配位體具有用通式(4)表示的結構的情形)或者4個單元以上(配位體具有用通式(3)表示的結構的情形)的糖分子固定。此外，一個配位體具有4個單元以上的糖分子，所以不僅在上述支持物表面上可以2次元地集合4個單元以上的糖分子，同時還可以使之再現性良好地排列糖分子。由此，用SPR或親和層析、生物探頭等技術，它們利用上述配位體可以有效地檢測各種糖分子和蛋白質之間的特異性相互作用。
此外，為了解決上述技術問題，本發明接頭化合物製造方法的特徵是，包括以下步驟使生物素類化合物，與具有在芳香族氨基末端被保護基保護的4個分支鏈的胺化合物進行縮合反應的步驟和，除去芳香族氨基末端的保護基的去保護步驟。
所述生物素類化合物是指，正如能夠與胺化合物的仲氨基反應，在生物素結構或亞氨基生物素結構上引入取代基使之活化的化合物。
根據上述方法，可以獲得本發明接頭化合物，該化合物包括固定有親和素的可同定在蛋白質分析用的支持物上的生物素部位和，能簡便地引入糖分子的芳香族氨基。
此外，本發明配位體的製造方法是以使用上述任意一種接頭化合物和糖分子進行還原氨基化反應為特徵。
根據上述方法，因還原氨基化反應而在接頭化合物上簡便地導入糖分子可以得到本發明的配位體。
此外，本發明引入糖分子的方法是以將含有上述配位體的溶液和，表面上固定了鏈黴親和素或親和素的支持物接觸為特徵。
根據上述方法，上述配位體(配位體所含有的接頭化合物)的生物素部位或亞氨基生物素部位和，上述支持物表面的鏈黴親和素或親和素結合，根據這種結合可以把上述配位體固定在支持物表面上。因此，使含有配位體溶液和支持物接觸的簡便方法可以使與接頭化合物結合的糖分子排列在支持物表面之上。
此外，本發明配位體載體是以，把配位體，通過生物素部位或亞氨基生物素部位和，鏈黴親和素或親和素之間的鍵即生物素-親和素鍵固定在表面上而形成的為特徵。
根據上述的組成，通過生物素部位或亞氨基生物素部位和，鏈黴親和素或親和素之間的鍵即生物素-親和素鍵可以把配位體強烈地固定在支持物表面上，則，可以2次元地提供再現性良好且把多個糖分子排列在支持物表面上的配位體載體。因此，若使用上述配位體載體，可以再現良好地觀測到配位體中的糖分子和，與該糖分子相互作用的蛋白質等物質之間的相互作用，則可以定量地評價糖分子的生物活性。
此外，本發明表面等離子體振子共振的測定方法，其特徵在於，導入末端結構不同的糖分子至少使用2個傳感片，上述至少2個傳感片包括，在第1糖分子固定在支持物上的第1傳感片和，與上述第1糖分子末端結構不同的第2糖分子固定在支持物上的第2傳感片，用第1傳感片得到的檢測結果和，用第2傳感片得到的檢測結果，測定這兩者之差，並測定糖分子的相互作用。
此外，本發明表面等離子體振子共振的測定方法，其特徵在於，用與上述結構相同的接頭化合物將糖分子固定在上述傳感片上。
根據上述方法，使用具有除糖分子外的其他結構相同的配位體的至少2個傳感片，可以測定表面等離子體振子共振(SPR)，至少2個傳感片相互作用之差可以作為因糖分子的不同而被觀測到。因此，若利用上述測定方法，可以降低除糖分子外的其他部分與其他物質之間的非特異性相互作用，可以測定糖分子與其他物質之間的非特異性相互作用。
再有，本發明的其他目的、特徵、以及優點通過以下所述充分理解。還有，本發明的利益參照


會更加清楚。

圖1表示為導入本發明配位體而固定親和素並製作表面等離子體振子共振(SPR)傳感片的工藝剖面圖。
圖2表示本發明導入配位體的晶片的剖面圖，(a)表示與蛋白質沒有相互作用的情形，(b)表示與蛋白質有相互作用的情形。
圖3表示採用本發明配位體SPR測定的「2-通道分析法」模式圖。
圖4表示在獲得本發明配位體載體工藝中測得SPR的結果圖。
圖5表示本發明配位體(Mal-Bio)和比較例配位體(Ace-Mal)之間的相互作用測得SPR的結果圖。
圖6表示本發明配位體5.3Mal及8-Glc與伴刀豆球蛋白A之間的相互作用測得SPR的結果圖。
圖7表示製作本發明配位體載體親和柱的工藝圖。
圖8表示親和層析的步驟。
圖9表示4-Mal和蛋白質之間的結合鍵SDS-PAGE結果圖。
具體實施例方式
以下，詳細地說明本發明，但本發明並不受這些說明的限制。
本發明多用途型接頭化合物(以下，稱作接頭化合物)，是利用寡糖等的糖(以下，記為糖分子)生物活性如SPR測定或親和層析、基因工程學的生物探頭等，在檢測或分離與糖分子特異地相互作用的蛋白質時，非常適合把糖分子導入蛋白質分析用的支持物上而使用的一種化合物。此外，上述接頭化合物與蛋白質之間沒有非特異的相互作用，所以，可以優選適用於如上所述的蛋白質檢測或分離。
即，具體地說，本發明接頭化合物如通式(1)所示，包括生物素部位或亞氨基生物素部位(以下，總稱為生物素部位)作為可固定在上述蛋白質分析用支持物的部位，還包括芳香族氨基作為可導入糖分子的部位。
眾所周知，生物素或亞氨基生物素(以下，總稱為生物素)與鹼性糖蛋白質的鏈黴親和素或親和素(以下，把它們總稱為親和素)具有特異的相互作用。為此，在親和素被固定的支持物表面上，與具有生物素部位的上述接頭化合物接觸，形成生物素-親和素鍵，可以很容易地把上述接頭化合物固定在上述支持物表面上。
此外，上述接頭化合物包括所述通式(1)以X表示的結構，在末端具有芳香族氨基同時在主鏈上還可以具有碳-氮鍵的4個烴衍生鏈形成的多分支部位。該多分支部位含有的芳香族氨基的氨基(-NH2基)與糖分子中因平衡而產生的醛基(-CHO基)或酮基(-CR′O基，其中R′為烴基)反應。然後，通過連接該反應形成的希夫鹼進行還原，則糖分子被導入到芳香族氨基上。上述X具有4個芳香族氨基末端，如後面所述，4個單元以上的糖分子可以被導入到上述接頭化合物中。
具體地說，如前面通式(2)所示，上述X具有2個分支結構，該結構是由2條烴衍生鏈在與芳香族氨基相對的末端結合了1個氮(N)而成。而且，該2個2分支結構的上述氮通過-CO-(CH2)m-(其中，m為1-6整數。)通過結合了1個氮(N)形成多分支結構。還有，在上述通式(2)中，m1，m2隻要為1-6整數，不受任何限制，既可以是彼此互相不同的整數，也可以是彼此相同的整數。其中，從製造難易程度上考慮，優選m1，m2為彼此相同的整數，特別優選為2。此外，n1，n2隻要為1-6整數，不受任何限制，既可以是彼此互相不同的整數，也可以是彼此相同的整數。其中，從製造難易程度上考慮，優選n1，n2為彼此相同的整數，特別優選為2。此外，p1～p4隻要為1-6整數，不受任何限制，既可以是彼此互相不同的整數，也可以是部分或全部都相同的整數。其中，從製造上述多分支部位的化合物時難易程度上考慮，優選p1～p4為彼此相同的整數，特別優選為2。
如此地，上述X包括以碳或氮等原子，將多個上述烴衍生鏈結合形成分支結構的多分支部位的結構。還有，優選上述X中包括的多個烴衍生鏈都是相同的鏈，但在末端若含有芳香族氨基也可以彼此不同。
如上所述，包括通式(1)所表示的結構的接頭化合物具有生物素部位和芳香族氨基末端。由此，介於上述接頭化合物，可以把糖分子堅固地且簡單地結合在上述蛋白質分析用支持物上。
此外，上述接頭化合物具有多分支部位，在該多分支部位的末端具有芳香族氨基。為此，通過使用把糖分子導入到上述接頭化合物而形成的配位體(見後述)，可以有效地把4個單元以上的糖分子集合在上述支持物表面上。還可以在1個接頭化合物中導入4個單元以上的糖分子，當把上述配位體結合在支持物表面時，可以再現地良好地排列多個糖分子。
進一步，上述接頭化合物可以幾乎忽略它與蛋白質之間的非特異的相互作用的影響。為此，通過使用本發明的接頭化合物可以再現地良好地評價糖分子的生物活性。
根據以下所示的方法製造上述接頭化合物。即，上述接頭化合物，通過生物素類化合物和，芳香族氨基末端被保護基保護的具有4條分支鏈的胺化合物，使這2種化合物進行縮合反應，然後，去保護基去掉上述芳香族氨基末端的保護基來進行製造。
作為上述生物素類化合物，可以例舉以下述通式(5)所表示的結構 (式中，Y具有O或NH表示的結構，R5具有 基(Pfp)或 基(Su)表示的結構)。上述生物素類化合物是五氟苯基(Pfp)或琥珀醯亞胺基(Su)的酯化合物。為此，上述生物素類化合物被這些取代基所活化，可以與胺化合物的仲氨基(-NH基)反應。
此外，只要上述胺化合物包含被仲氨基和保護基保護並具有芳香族氨基末端的分支鏈即可，不受任何限制，也可以具有相當於上述接頭化合物的多個分支部位(通式(1)的X)。
因此，上述分支鏈除了具有由保護基保護的芳香族氨基末端來代替上述烴衍生鏈所含有的芳香族氨基之外，也可以具有上述烴衍生鏈所含有的結構。也就是說，上述分支鏈也可以用碳及氫所組成的烴鏈，一部分碳或氫被其他原子或取代基取代。更具體地說，上述分支鏈也可以具有由保護基保護的芳香族氨基末端同時也可以由烴鏈的主鏈結構即碳-碳鍵(C-C)的一部分被碳-氮鍵(C-N)取代。
此外，所說保護基是芳香族氨基中的氨基根據上述縮合反應而被導入不參加反應的取代基。這種保護基只要是在去掉仲氨基的保護基時不受影響即可。上述保護基可以例舉出，例如，t-丁氧基羰基(-COOC(CH3)3基，稱為Boc基)、苄基、丙烯基氨基甲酸酯基(-COOCH2CH＝CH2，稱為Alloc基)。
作為上述胺化合物，例如，可以舉例為用下述通式(6)表示的化合物結構 再有，關於該胺化合物的合成方法將在以後的實施例中詳細闡述。
通過上述生物素類化合物和胺化合物之間的縮合反應，生物素類化合物的Pfp或Su等的取代基和，胺化合物的仲氨基縮合，形成亞氨基鍵。然後，把芳香族氨基末端的保護基去保護，去掉保護基，成為芳香族氨基，由此可以得到上述接頭化合物。
接著，闡述在上述接頭化合物的芳香族氨基上導入糖分子形成配位體。本發明的配位體是，通過接頭化合物的氨基與糖分子中的平衡產生的醛基或酮基反應，連接因該反應形成的希夫鹼進行還原從而將糖分子導入到芳香族氨基上。
本發明配位體中所含有的糖分子，只要是還原糖即可。作為糖分子，可以舉例為，例如，葡糖糖、半乳糖、甘露糖等的單糖類、結合糖的數量為雙糖-10個糖的麥芽糖、乳糖、下面提到的硫酸化寡糖等的寡糖類、單糖類或寡糖類組合而成的糖數量為11以上的肝素、硫酸軟骨素、硫酸乙醯肝素等多糖類。
此外，作為上述寡糖類，可以舉例硫酸化寡糖或寡糖，所述硫酸化寡糖，包括用具有周知的抗血液凝固活性硫酸化多糖肝素中的下述通式(7)表示的特定的部分二糖結構(GlcNS6S-IdoA2S)，所述寡糖具有用下述通式(8)表示的構造，通式(8)是把該硫酸化寡糖的還原末端結合葡萄糖而成的， 再有，上述寡糖類或多糖類即可以是同一單糖分子組成的單一寡糖或單一多糖，也可以是多種單糖分子或其衍生物組成的複合糖或，多種單糖分子或其衍生物、含有寡糖類的複合多糖類。此外，上述糖分子均可以從自然界中分離純化而獲得的各種天然糖，還可以是人工合成的糖。
具體地說，本發明的配位體包括所述通式(3)表示的結構。該通式(3)表示的配位體結構是，用所述通式(1)表示，X具有用所述通式(2)表示的結構的接頭化合物中導入葡萄糖或麥芽糖或乳糖作為糖分子而形成的。通式(2)表示的X具有含4條烴衍生鏈的結構。在該每個烴衍生鏈的芳香族氨基上可以引入1個單元或2個單元的糖分子。由此，用通式(3)表示的配位體結構則在上述接頭化合物結合有4個單元以上8個單元以下的糖分子。另外，在上述通式(3)中，m1，m2與上述通式(2)中的m1，m2一樣，只要為1-6整數，不受任何限制，既可以是彼此互相不同的整數，也可以是彼此相同的整數。此外，n1，n2與上述通式(2)中的n1，n2一樣，n1，n2隻要為1-6整數，不受任何限制，既可以是彼此互相不同的整數，也可以是彼此相同的整數。此外，p1～p4與上述通式(2)中的p1～p4一樣，p1～p4隻要為1-6整數，不受任何限制，既可以是彼此不同的整數，也可以是部分或全部都相同的整數。
作為引入到上述接頭化合物烴衍生鏈的芳香族氨基的糖分子可以舉例為，選自葡萄糖、麥芽糖、乳糖中的1種以上的糖分子。因此，用通式(3)表示的配位體結構對應於通式(3)表示的R7-R10結構，在上述接頭化合物中導入4個單元以上8個單元以下的糖分子，該糖分子選自葡萄糖、麥芽糖、乳糖所組成的組群。
另外，在上述接頭化合物的芳香族氨基上引入的糖分子，即可以彼此不同，也可以部分地或全部地相同，但從容易導入糖分子方面來考慮，還是優選全部相同的。例如，在通式(3)中，m1，m2，n1，n2，p1，p2，p3，p4均為2，當4個單元的糖分子被導入到接頭化合物時，糖分子為葡萄糖時，優選下述通式(16)表示的配位體，同樣地，當4個單元的糖分子被導入時，若糖分子為麥芽糖時，優選下述通式(17)表示的配位體，若糖分子為乳糖時，優選下述通式(18)表示的配位體，在通式(16)-(18)中，Y具有O或NH表示的結構
此外，本發明其他的配位體具有所述通式(4)表示的結構。該通式(4)表示的配位體結構用通式(1)表示，在X具有所述通式(2)表示的接頭化合物上導入用所述通式(8)表示的糖分子。通式(2)表示的X有4個烴衍生鏈結構，具有所述通式(4)表示的配位體結構則在上述接頭化合物上結合4個單元的糖分子。另外，在上述通式(4)中，m1，m2與上述通式(2)中的m1，m2一樣，只要為1-6整數，不受任何限制，既可以是彼此互相不同的整數，也可以是彼此互相相同的整數。此外，n1，n2與上述通式(2)中的n1，n2一樣，n1，n2隻要為1-6整數，不受任何限制，既可以是彼此互相不同的整數，也可以是彼此相同的整數。此外，p1～p4與上述通式(2)中的p1～p4一樣，p1～p4隻要為1-6整數，不受任何限制，既可以是彼此互相不同的整數，也可以是部分或全部都相同的整數。
上述配位體均包含接頭化合物和糖分子，所以，在接頭化合物內的生物素部位可以通過具有親和素的蛋白質分析用支持物和，生物素-親和素鍵結合。進而，介於該生物素-親和素鍵可以在上述支持物表面上提供集合併固定4個單元的糖分子形成的配位體載體。因此，通過使用上述配位體，例如，2次元地將多個糖分子再現地良好地排列在蛋白質分析用支持物表面上得到配位體載體，通過使用該配位體載體可以再現地良好地評價糖分子的生物活性。因此，本發明的配位體非常適用於將各種糖分子簡便地導入到SPR或親和層析、生物探頭等技術中。
這樣介於該生物素-親和素鍵將本發明配位體固定於支持物表面上形成的配位體載體也包含在本發明中。該配位體載體未必限定蛋白質分析的用途上，為了研究它與糖分子之間的相互作用也可以用於蛋白質以外的分析用途。
在含有該配位體的配位體溶液中，上述配位體可以提供配位體載體，通過把固定親和素的蛋白質分析用支持物浸漬一定時間，或者把配位體溶液注入到上述支持物，可以引入到上述支持物表面，在上述支持物表面上集合4個單元以上的糖分子並固定形成配位體載體。
例如，當得到將上述配位體導入SPR傳感片形成的配位體載體時，首先，製作固定有親和素的傳感片。即，如圖1(a)所示，使用表面塗布金(Au)的玻璃基板1。接著，如圖1(b)所示，利用金-硫鍵(Au-S)把具有下述通式(9)表示的結構4-硫代丁酸固定在玻璃基板1上。
HOOCCH2CH2CH2SH…(9)另外，也可以用塗布包含羧基的聚合物基板來代替固定該4-硫代丁酸玻璃基板1。
其次，如圖1(c)所示，在碳化二亞胺試劑的存在下，使固定在玻璃基板1的4-硫代丁酸與N-羥基琥珀酸亞胺反應。然後，使N-羥基琥珀酸亞胺部位和含有親和素2的末端氨基縮合，如圖1(d)所示，把親和素2固定在玻璃基板1上。進而，得到把親和素2固定在玻璃基板1上的傳感片。
再其次，把該傳感片與本發明的含有配位體的配位體溶液接觸。具體地，就是把上述傳感片浸漬於配位體溶液或者傳感片表面衝洗配位體溶液。進而，通過作為特異性相互作用而眾所周知的生物素-親和素鍵，如圖2(a)所示，可以在上述傳感片上得到固定配位體3的配位體載體4。
另外，作為用於配位體溶液的溶劑沒有特別的限定，但可以舉例為，例如PBS(磷酸緩衝液)等緩衝液。浸漬於配位體溶液時的浸漬時間可以為0.5-1.5個小時左右。此外，注入配位體溶液時的注入量可以為0.006mg-0.06mg。
如上所述，使用固定有配位體3形成的配位體載體4，使該配位體載體與蛋白質5接觸(圖2(b))，按照常規方法，使用表面等離子體振子共振裝置測定共振角度，可以觀測到該配位體載體4和蛋白質5之間的鍵活動。再有，作為測定SPR所使用的傳感片，例如可以使用玻璃、塑料等，特別優選使用玻璃。此外，配位體載體和蛋白質接觸例如，可以把蛋白質溶解於電泳緩衝液的溶液流入到該配位體載體的表面上，或者，在溶解蛋白質的電泳緩衝液的溶液中，通過浸漬上述配位體載體而實施。作為該電泳緩衝液例如可以舉例為PBS等緩衝液。
此外，例如，作為親和層析中所使用的親和柱，當得到上述引入配位體的配位體載體時，首先，製作固定親和素的層析柱。該製作方法可以按照常規方法(例如，參照文獻，即アマシヤムフアルマシアバイオテク株式會社編，「最初的配位體偶聯劑手冊」(2002年)等)製作。例如，適合固定帶氨基的化合物的載體填充到柱中(例如，N-羥基琥珀酸亞胺固定的凝膠載體充填柱)，通過衝洗含親和素溶液，可以在上述載體上固定親和素。把含有本發明配位體的配位體溶液注入到固定有該親和素的載體(以下，為親和素附加物)。由此，通過生物素-親和素鍵(作為特異地相互作用而眾所周知)，可以得到把配位體固定在親和素附加物上而形成的配位體載體。
此外，作為在上述含有親和素溶液中所使用的溶劑，例如可以舉例為，含氯化鈉的醋酸鈉水溶液等。此外，作為上述配位體溶液所使用的溶劑，可以舉例為，PBS等緩衝液。
如上所述，因為本發明配位體具有生物素部位，所以正如上述一樣，例如，在蛋白質分析用支持物表面上通過一個步驟容易地將糖分子導入固定從而可以獲得本發明的配位體載體。
如上所述，利用含有配位體載體固定化配位體的親和柱，為實施親和層析，如下所述。即，在填充有親和素固定化的載體(親和素附加物)親和柱上，注入蛋白質溶液，按照常規方法，進行親和層析，可以分離與配位體載體結合的蛋白質和未結合的蛋白質。另外，作為上述蛋白質溶液中所使用的溶劑，例如可以舉例為，PBS等緩衝液。此外，未與配位體載體結合的蛋白質從親和柱上析出時所使用的析出液，例如，也可以舉例為，PBS等緩衝液。
另外，如上所述，在SPR法使用的傳感片，或者，在親和層析中所使用的填充親和柱的親和素附加物等的支持物上導入糖分子的方法也包含在本發明中。
如上所述，因為本發明配位體載體具有配位體，可以2次元地將多個糖分子再現地良好地排列在支持物表面上。故，可以再現地良好地評價糖分子的生物活性，就糖分子結構的闡明或，糖分子的生物活性可以定量地進行評價。
此外，SPR測定方法也包含在本發明中，也就是說，利用糖分子固定在支持物表面的傳感片，來檢測糖分子的特異性相互作用。它使用導入末端結構不同的糖分子而形成的至少2個傳感片，來觀測糖分子和蛋白質等物質之間的相互作用。而所述糖分子的末端，是指，未固定在傳感片的那側。此外，觀測與糖分子相互作用的物質未必限定為蛋白質。
利用上述方法，為測定SPR而使用糖分子種類不同的2個傳感片，例如，可根據如下所述方法實施。製備第1糖分子固定在支持物表面上形成的第1傳感片和，與上述第1糖分子末端結構不同的第2糖分子固定在支持物表面上形成的第2傳感片。如上所述，這同樣能夠得到製作固定在傳感片上的配位體載體(傳感片)。這些傳感片可以用於被固定不同的糖分子配位體。例如，在對比的糖分子中可以舉例為，乳糖-葡萄糖、麥芽糖-葡萄糖、麴酸生物活素類-葡萄糖等。固定在傳感片上的不同糖分子的配位體例如，舉例為上述通式(16)-(18)所示的配位體。另外，配位體也可以使用不限於本發明，其他配位體也可以。
而且，例如，用與第1糖分子具有特異性作用的蛋白質等，設一定的測定條件，作用於上述2個傳感片，觀測兩者的共振角度。通過檢測該2兩者共振角度之差，可以測定糖分子與蛋白質等之間的特異性作用。
在上述中，並不限定2個不同種類的傳感片同時測定，也可以2種以上的傳感片進行測定，也可以不在同時測定。此外，也可以使用至少1個傳感片上沒有被糖分子引入的傳感片。例如，也可以使用僅固定接頭化合物的傳感片。
如上所述，本發明SPR測定方法降低非特異性相互作用，可以測定糖分子和其他物質之間的特異性相互作用。
以下，根據實施例和比較例進一步詳細地說明本發明，但本發明並不限定於這些。
另外，在下面的實施例中，各種色譜、旋光度的測定、電泳均使用下面的儀器。
*)核磁共振(NMR)色譜JEOL EX 270，JNM-LA 500 NMR spectrometer(商品名)*)質譜分析Mariner(註冊商標)Boispectromety(註冊商標)Workstation(商品名，ESI-TOF，MS，PE Biosystems，CA，USA)VOYAGER-DERP(商品名，MALDI-TOF MS，PE Biosystems，CA，USA)*)旋光度Perkin Elmer model 241 polarimeter(商品名)*)紫外分光光度計JASCO V-530 UV/Vis spectrometer(商品名)*)表面等離子體振子共振生物傳感器SPR670(商品名，Nippon Laser Electronics LAB)*)電泳裝置ATTO CompactPAGE AE-7300(商品名)*)電泳用現成凝膠ATTO PAGEL-Compact AE-6000(12.5％)Lot244S024(商品名)此外，色譜法中還使用二氧化矽凝膠。
*)薄層色譜法Merck Silica gel 60 F524(No.5715)(商品名)*)調製的薄層色譜法Merck Silica gel 60 F524(No.5744)(商品名)*)中壓柱色譜法Merck Silica gel 60(No.9385，0.040-0.063mm，230-400mesh)(商品名)[實施例1·接頭化合物的合成]本發明接頭化合物按照下列步驟合成。
如下述通式(10)所示，室溫條件下，在甲醇(式中，MeOH)中，苄胺(化合物1，式中，Bn表示苄基)和，6當量的丙烯酸甲酯反應，給上述苄胺作標記附加2個單元的丙烯酸甲酯，以收率為93％獲得化合物2。然後，在室溫條件下，在含有該化合物2的甲醇中，加入過量(50當量)的乙二胺，使該乙二胺與化合物2縮合，得到化合物3。另外，加入過量(50當量)的乙二胺是為了防止乙二胺的2個氨基同時與化合物2縮合。
具體地，為獲得化合物2，在苄胺(4.7mL，44.6mmol)的甲醇溶液(143mL)裡加入內烯酸甲酯(8.52mL，104mmol)，室溫下，在氮氛圍中攪拌8個小時，追加丙烯酸甲酯(3.87mL，47mmol)，室溫下，攪拌12個小時。在攪拌過的溶液中，再加入丙烯酸甲酯(7.47mL，94mmol)徹夜攪拌，得到甲醇/丙烯酸甲酯反應溶液。減壓濃縮甲醇/丙烯酸甲酯反應溶液，把殘渣用中壓二氧化矽凝膠色譜法(300g，甲苯∶乙酸乙酯＝5∶1-3∶1)進行純化，得到化合物2呈無色油狀溶液。
所得化合物2收量為11.7g(收率為95％)。此外，把得到的化合物2進行1H NMR(400MHz，CD3OD)測定，為δ7.28-7.20(5H，m，aromatic)，δ4.79(6H，s，OMe*×2)，δ3.57(2H，d，J＝4.6Hz，NCH2*Ph)，δ2.76(4H，td，Jgem＝4.6，Jvic＝6.8Hz，CH2*NBn)，δ2.46(4H，td，Jgem＝4.6，Jvic＝6.8Hz，COCH2*CH2NBn)。另外，每個化學希夫鹼δ表示在H為複數時記為*質子，即表示針對H*、的測定值，以下描述相同。此外，實施ESI-MS(positive)測定(飛行時間型質譜分析儀測定)的時候，為m/z(質量/電荷比)302.1[(M+Na)+]。
接著，如下述通式(11)所示，室溫條件下，在含有化合物3的甲醇中，加入11當量的丙烯酸甲酯，給化合物3附加4個單元的丙烯酸甲酯，以收率為81％獲得化合物4。然後，在甲醇中添加2M的氫氧化鈉水溶液的鹼條件下，水解化合物4的甲酯，獲得在末端含有4個單元羧基(-COOH基)的化合物5以收率為96％。
為了獲得化合物4，具體地實施操作如下。即，把化合物2(9.97g，35.7mmol)溶解在甲醇(120mL)，在氮氛圍氣氛下，0℃攪拌5分鐘，加入無水乙二胺(60mL，1.11mol)，0℃攪拌5分鐘後，室溫下徹夜攪拌，再加入無水乙二胺(50mL，0.93mol)，室溫下徹夜攪拌，得到化合物2/無水乙二胺反應溶液。將該化合物2/無水乙二胺反應溶液濃縮，得到黃色油狀殘渣。在該黃色油狀殘渣中加入甲醇(120mL)溶解，加入丙烯酸甲酯(19.3mL，234mmol)室溫下徹夜攪拌，再加入丙烯酸甲酯(19.3mL，234mmol)室溫下徹夜攪拌，得到黃色油狀殘渣/丙烯酸甲酯反應溶液。將該黃色油狀殘渣/丙烯酸甲酯反應溶液減壓濃縮，把殘渣用中壓二氧化矽凝膠色譜法(700g，三氯甲烷∶甲醇＝20∶1-7∶1)進行純化，得到化合物4呈黃色油狀溶液。
所得到的化合物4收量為24.5g(收率為81％)。此外，把得到的化合物4進行1H NMR(400MHz，CD3OD)測定，為δ7.29-7.28(5H，m，aromatic H)，δ3.66(12H，s，OMe*×4)，3.27(4H，q，J＝6.1Hz，CH2*NHCO)2.81(4H，t，J＝6.8Hz，CH2NBn)，δ2.75(8H，t，CH2×4，J＝6.8Hz，CH2*NCH2)，δ2.52(4H，t，CH2×2，J＝5.9，6.1Hz，CH2*NHCO)，δ2.41(12H，t，CH2×(2×4)，J＝6.8，6.6Hz，NCOCH2*CH2NHCO，MeOCOCH2*)。此外，ESI-MS(positive)m/z 680.4[(M+H)+]。
為了獲得化合物5，具體操作如下。即，把化合物4(1.0mg，1.47mmol)溶解在甲醇(7.4mL)，將4M氫氧化鈉水溶液(7.4mL)加入其中，氬氛圍氣氛下，0℃攪拌2個小時，得到化合物4/氫氧化鈉水溶液。在該化合物4/氫氧化鈉水溶液加入4M鹽酸(7mL)，用pH試紙確認pH＝3後，對化合物4/氫氧化鈉水溶液減壓濃縮，凍幹殘渣水溶液。把所得到的凍幹殘渣用HP-20(300mL，H2O-H2O∶甲醇＝1∶1-甲醇)純化，用H2O/甲醇收集析出的級分並減壓濃縮。然後，把減壓濃縮的殘渣凍幹得到化合物5呈淡黃色結晶。
所得化合物5收量為878mg(收率為96％)。此外，將得到的化合物5進行1H NMR(400MHz，CD3OD)測定時，為δ7.54-7.38(5H，m，aromatic H)，δ3.60(2H，s，NCH2*Ph)，δ3.58(2H，t，J＝6.1Hz，CH2*NCO)，δ3.34-3.24(16H，m，CH2×8，CH2*NBn，MeOCOCH2CH2*N，NCH2CH2*NHCO)，δ2.79(4H，t，CH2×2，J＝7.0Hz，COCH2*CH2NBn)，δ2.60(8H，t，CH2×4，J＝6.4Hz，MeOCOCH2*)。此外，ESI-MS(positive)m/z 624.3[(M+H)+]。
另外，在本實施例中，化合物5隻合成到4個單元的羧基，但根據需要，不水解化合物4的甲酯，再縮合乙二胺，繼續加成丙烯酸甲酯反應，在末端可以很容易地合成帶有8、16、32單元的羧基骨架結構。
其次，如下述通式(12)所示，在5當量的1-羥基苯三吡咯(式中，HOBt)以及，含有10當量的二異丙基乙胺(式中，DIPEA)的N，N-二甲基甲醯胺(DMF)中，一邊從0℃-40℃變化溫度，一邊用5當量的o-[7-偶氮苯三吡咯-1-基]-N，N，N′，N′-四甲基脲己氟磷酸鹽(式中，HATU)作為活性劑，用另一個氨基被t-丁氧基羰基(式中Boc，以下稱為Boc基)保護的亞苯基二胺衍生物(化合物6，5當量)與上述化合物5的末端羧基進行縮合，得到化合物7(收率57％)。接著，在氫氛圍下，在50℃甲醇中，使用鈀(10％的Pd-C)進行化合物7的接觸還原反應，該化合物7的仲氨基的保護基即苄基去保護得到收率為80％的化合物8。
為了獲得化合物6，具體操作如下。即，把m-亞苯基二胺(7.81g，72.2mmol)溶解在甲醇(240mL)，加入二-t-丁氧基碳酸鹽(16.5mL，71.8mol)和三乙胺(10mL，71.5mol)，在氬氛圍下，遮光0℃攪拌30分鐘，然後，在室溫下徹夜攪拌，得到m-亞苯基二胺反應溶液。減壓縮合該m-亞苯基二胺反應溶液，把殘渣用中壓二氧化矽凝膠色譜法(500g，三氯甲烷∶甲醇＝10∶1-7∶1)進行純化，得到化合物6呈黃色結晶。
所得化合物6收量為13.3g(收率為88％)。此外，所得化合物6進行1H NMR(400MHz，CDCl3)測定時，得到δ7.03(1H，dd，J＝7.8，8.1Hz，aromaticH)，δ6.54(1H，d，J＝8.1Hz，aromatic H)，δ6.36(1H，t，J＝7.8Hz，aromatic H)，δ3.67(2H，s，NH2)，δ1.51(9H，m，CH2×3 ofBOC)。此外，得到ESI-MS(positive)m/z 209.1[(M+H)+]。
還有，為了獲得化合物7，具體操作如下。即化合物5(54.8mg，87.9μmol)和1-羥基苯三吡咯(66.4mg，492μmol)在氮氛圍下，溶解在無水二甲基甲醯胺(0.9mL)中，0℃攪拌15分鐘，得到化合物5/1-羥基苯三吡咯反應溶液。在化合物5/1-羥基苯三吡咯反應溶液加入HATU(168mg，441μmol)和二異丙基乙胺(150mL，882μmol)和化合物6(98.2mg，471μmol)室溫下徹夜攪拌，再50℃攪拌5小時，得到化合物5/化合物6反應溶液。減壓濃縮該化合物5/化合物6反應溶液，把殘渣用中壓二氧化矽凝膠色譜法(80g，三氯甲烷∶甲醇＝15∶1-5∶1)進行純化，得到化合物7呈白色結晶。
所得化合物7的收量為69.2mg(收率為57％)。此外，得到的化合物7經過1H NMR(400MHz，CDCl3)測定時，得到δ7.39(4H，s，1H×4，aromatic H)，δ7.39-6.53(21H，m，aromatic H)，δ3.63(2H，s，NCH2*Ph)，δ3.15(4H，d，CH2×2，J＝6.2Hz，CH2*NHCO)，δ2.76(8H，t，CH2×4，J＝6.2Hz，MeOCOCH2CH2*N)，δ2.49(8H，t，CH2×4，J＝6.2Hz，MeOCOCH2*CH2N)，δ2.45(4H，t，CH2×2，J＝6.4Hz，CH2*NBn)，δ2.38(4H，t，CH2×2，J＝6.6Hz，NCH2CH2*NCO)，δ2.03(4H，t，CH2×2，J＝6.4Hz，NCOCH2*CH2NBn)，δ1.48(36H，s，CH3×12，Me of BOC)，此外，得到ESI-MS(positive)m/z 693.3[(M+2H)2+]。
為了獲得化合物8，具體操作如下。即在化合物7(49.8mg，36.0μmol)中加入10％Pd-C(70.2mg)甲醇懸浮液中，氫氛圍下室溫徹夜攪拌，得到化合物7反應溶液。把化合物7反應溶液用膜過濾器過濾再對濾液進行減壓濃縮，得到白色結晶的化合物8。
所得到化合物8的收量為36.8mg(收率為80％)。此外，得到的化合物8經過1H NMR(400MHz，CD3CD)的測定時，得到δ7.64(4H，s，1H×4，atomatic H)，δ7.05-6.91(12H，m，aromatic H)，δ3.40(4H，t，CH2×2，J＝5.4Hz，CH2*NHCO)，δ3.19(8H，br，CH2×4，MeOCOCH2CH2*N)，δ2.98(4H，br，CH2×2，NCH2CH2*NHCO)，δ2.89(4H，t，CH2×2，J＝5.6Hz，CH2CH2*NH)，δ2.71-2.70(4H，br，CH2×2，J＝5.6Hz，MeOCOCH2*CH2N)，δ2.36(4H，t，CH2×2，J＝5.4Hz，NHCOCH2*CH2NBn)，δ1.39(36H，s，CH3×12，Me of BOC)，此外，得到ESI-MS(positive)m/z 647.9[(M+2H)2+]。
其次，如下述通式(13)所示，在溫度50℃，三乙胺(式中，TEA)的存在下，在DMF中，去保護成為自由的化合物8，用5氟苯基(Pfp)活化得到生物素，使該生物素與化合物8的氨基縮合反應，得到化合物9(收率為63％)。然後，在0℃溫度條件下，在含有三氟乙酸(式中，TFA)的CH2Cl2中，除去化合物9的Boc基的保護，得到本發明接頭化合物作為化合物10。
為了獲得化合物9，具體操作如下。即把生物素(80.1mg，0.397mmol)、二環己基羰二亞胺(80.8mg，0.39mmol)在氬氛圍下，溶解在無水二甲基甲醯胺(1mL)中，50℃攪拌4個小時，加入5氟苯(120mg，0.65mmol)50℃徹夜攪拌，得到生物素反應溶液。在生物素反應溶液中加入化合物8(70.6mg，54.5mmol)、三乙胺(60μL，0.811mmol)50℃徹夜攪拌，得到化合物8反應溶液。減壓濃縮該化合物8反應溶液，把殘渣溶解在乙酸乙酯100ml中，用飽和食鹽水(50mL×3)洗滌後，有機相中加入硫酸鈉並乾燥。從乾燥的殘渣中濾去乾燥劑，減壓濃縮濾液，用中壓二氧化矽凝膠色譜法(25g，三氯甲烷∶甲醇＝10∶1-5∶1)進行純化，得到化合物9呈白色結晶。
所得化合物9的收量為52.3mg(收率為63％)。此外，得到的化合物9經過1H NMR(400MHz，CD3OD)測定時，得到δ7.61(2H，s，atomatic H)，δ7.57(2H，s，aromatic H)，δ7.06-6.95(12H，m，aromatic)，δ4.31(1H，dd，JB7/B6＝4.3，JB7/B3＝6.6Hz，Biotin NHCH*CH2S)，δ4.09(1H，dd，JB3/B4＝4.5，JB3/B7＝6.6Hz，Biotin NCH*CHS)，δ3.35(4H，t，CH2×2，J＝6.8Hz，CH2CH2*NCH2CH2CONHph)，δ3.19-3.17(4H，m，CH2×2，NCH2*CH2CONHCH2CH2)，δ2.98-2.93(1H，m，JB4/B3＝4.5Hz，BiotinNHCHCH*S)，δ2.78-2.72(9H，m，CH+CH2×4，JB6a/B6b＝10Hz，JB6a/B7＝4.3Hz，Biotin NHCHCH2*S，NCH2*CH2CONHph)，δ2.53-2.50(4H，br，CH2×2，CH2*CH2NCH2CH2CONHph)，δ2.44-2.40(9H，m，CH+CH2×4，JB6b/B6a＝10Hz，Biotin NHCHCH2*S，NCH2CH2CONHph)，δ2.20(2H，t，JB12/B11＝7.6Hz，BiotinCH2CH2CH2CH2*CO)，δ2.16(4H，t，CH2×2，J＝6.8Hz，CH2CH2*NCH2CH2CONHph)，δ1.55-1.51(4H，br，CH2×2，BiotinCH2*CH2CH2*CH2CO)，δ1.40(36H，s，CH3×12，Me of BOC)，δ1.28-1.24(2H，m，CH2×1，Biotin CH2CH2*CH2CH2CO)，此外，得到ESI-MS(positive)m/z761.4[(M+2H)2+]。
為了獲得化合物10，具體操作如下。即把化合物9(52.3mg，34.4μmol)溶解在二氯甲烷(1.5mL)中，加入三氟乙酸(1mL)0℃攪拌1個小時，得到化合物9/三氟乙酸反應溶液。減壓濃縮該化合物9/三氟乙酸反應溶液，把殘渣用LH20(140mL，甲醇析出)純化，得到黃色結晶的化合物10。
所得化合物10的收量為50.9mg(收率為94％)。此外，得到化合物10經過1H NMR(400MHz，CD3OD)測定時，得到δ7.51(4H，s，atomatic H)，δ7.21(8H，s，aromatic H)，δ6.83-6.81(4H，m，aromatic H)，δ4.32(1H，dd，JB7/B6＝4.3，JB7/B3＝8.0Hz，Biotin NHCH*CH2S)，δ4.14(1H，dd，JB3/B4＝4.4，JB3/B7＝8.0Hz，Biotin NCH*CHS)，δ3.59-3.52(12H，m，CH2×6，NCH2*CH2CONHph，CH2*CH2NCNH2CH2CONHph)δ3.47-3.37(4H，m，CH2×2，CONCH2*CH2CONH)，δ3.35-3.33(4H，m，CH2CH2*NCH2CH2CONHPh)，δ3.02(1H，dt，JB4/B9＝4.9Hz，Biotin NHCHCH*S)，δ2.92-2.89(8H，m，CH2×4，NCH2CH2*CONHPh)，δ2.79(1H，dd，Jgem＝12.8，Jvic＝5.0Hz，Biotin NHCHCH2*S)，δ2.58(1H，d，Jgem＝12.8Hz，BiotinNHCHCH2*S)，δ2.37(2H，t，J＝7.0Hz，CONCH2CH2*CONH)，δ2.31(2H，t，J＝7.1Hz，CONCH2CH2*CONH)，δ2.21(2H，t，CH2×1，BiotinCOCH2*CH2CH2CH2)，δ1.48-1.19(6H，br，CH2×3，Biotin COCH2CH2*CH2*CH2*)，此外，得到ESI-MS(positive)m/z 1142.6[(M+Na)2+]。此外還得到[a]D22＝+0.947(c 0.972，MeOH)。
經確認得到的化合物10為ESI-MS(positive)m/z 1120.62[(M+H)+]，具有通式(13)表示的化合物10的結構。此外，通過進行NMR測定，得到的NMR測定數據也確認了具有上述化合物10表示的結構。
用實施例1得到的接頭化合物(化合物10)按照以下步驟合成通式(13)表示的配位體結構。
如下述通式(14)所示，用溶劑為水∶乙酸(AcOH)∶甲醇＝12∶1∶15(5％乙酸溶液，pH4)針對上述化合物10加入9當量的麥芽糖，室溫下，攪拌1.5天。然後，用飛行時間型質譜分析儀確定形成了4個單元的希夫鹼之後，分2次添加20當量的NaBH3CN作為還原劑，室溫下，攪拌4天，進行還原氨基反應。把得到的化合物用HP-20(ダイアイオン)純化，得到化合物11作為本發明配位體(收率為89％)。所得該化合物11其麥芽糖集合了由5個單元-7個單元形成的混合物。
(其中，R1、R2、R3、R4各自獨立地具有用H-或 表示的結構)[實施例3·配位體的合成]使用在實施例2中得到的接頭化合物(化合物10)，按照以下步驟合成包括上述通式(5)所表示的結構配位體。
如下述通式(15)所示，除了使用所述通式(8)所示的糖分子來替代麥芽糖以外，其他均與實施例2操作相同得到化合物12。
為了得到具體化合物12，實施以下操作。即，把接頭化合物10(2.4mg，2.1μmol)和，所述的通式(8)表示的糖分子(簡稱為GlcNS6S-IdoA2S-Glc，11.0mg，12.8μmol)溶解在混合溶劑(水/乙酸/甲醇＝12/1/15，0.4mL)中，室溫攪拌2個小時。向接頭化合物10/GlcNS6S-IdoA2S-Glc反應溶液)中加入氫化氰硼鈉(約3mg，40μmol)室溫下攪拌2天後，再加入氫化氰硼鈉(約2mg，40μmol)室溫下徹夜攪拌，進行還原。將還原的接頭化合物10/GlcNS6S-IdoA2S-Glc反應溶液減壓濃縮，用SephadexG-50 fine[100mL析出液0.85M食鹽水+PBS(1/1vol.)混合溶液]純化，收集濃縮經過在254nmUV吸收證實的級分，將殘渣凍幹。由此得到的凍幹的殘渣用HP-20(60mL)再次脫鹽，收集濃縮用水/甲醇＝1/1析出的級分，凍幹。由此得到的凍幹的殘渣級分用SephadexG-10(20mL)再度脫鹽，經過在254nmUV吸收證實的級分，凍幹，得到白色結晶的化合物12。
所得化合物12的收量為4.99mg(收率為42％)。此外，得到的化合物12經過1H NMR(500MHz，D2O)測定時，得到δ7.14-7.12(4H，br，aromaticH)，δ6.91-6.59(12H，br，arometic H)，δ5.36-5.34(4H，br，H-1″)，δ5.12(4H，br，H-1′)，δ4.51(4H+1H，d，J＝2.6Hz，H-5′，Botin NHCH*CH2S)，δ4.29(4H×2，d，Jgem＝9.3Hz，H-6″b，H-2′)，δ4.19(4H×3，d，Jgem＝9.3Hz，H-6″a，H-3′，Biotin NHCH*CHS)，δ4.05(4H，d，J＝2.5Hz，H-4′)，δ4.00-3.93(4H×3，m，H-5″，H-1b，H-6b)，δ3.86-3.85(4H，m，H-5)，δ3.78-3.72(4H，m，H-4)，δ3.70(4H，t，H-3″)，δ3.67-3.59(4H×2，m，H-3，H-6b)3.56-3.52(4H，br，Link PhNHCOCH2CH2NCH2CH2*)，δ3.42(4H，t，J＝6.6Hz，Link COCH2CH2*NCO)，δ3.36-3.30(4H×2+8H，m，H-2，H-4″，LinkPhNHCOCH2CH2*N)，δ3.25(4H，dd，J＝10.3，3.3Hz，H-2″)，δ3.18-3.05(1H×2，br，H-1a，Biotin NHCHCH*S)，δ2.93-2.90(4H，br，LinkPhNHCOCH2CH2NCH2*CH2)，δ2.89(1H，br，Biotin NHCHCH2*S)，δ2.82(4H，t，J＝6.6Hz，Link COCH2*CH2NCO)，δ2.72-2.70(1H，br，Biotin NHCHCH2*S)，δ2.58(8H，t，J＝6.6Hz，Link PhNHCOCH2*CH2N)，δ2.05(2H，br，BiotinCOCH2*CH2CH2CH2)，δ1.53(2H，t，J＝7.6Hz，Biotin COCH2CH2CH2CH2*)，δ1.30(2H，t，J＝6.9Hz，COCH2CH2*CH2CH2)，δ1.17(2H，t，J＝7.1Hz，Biotin COCH2CH2CH2*CH2)。
在重水(D2O)中，在500MHz下測定NMR鑑定目的物。集合化度是根據以下所述強度比計算出來的。即NMR的伊杜糖醛酸部分的1位質子和接頭結構內的芳香族質子(以16H為基準)的兩者強度比為4.1∶16，推測GlcNS6S-IdoA2S-Glc平均集合4.1個分子。GlcNS6S-IdoA2S-Glc的n個分子集合的化合物的分子量(Mw)採用化合物10的分子量1120.4加上集合1個GlcNS6S-IdoA2S-Glc分子時的分子量840.97，如式⑥所示。
Mw＝1120.4+840.97n (式⑥)n＝4代入上式⑥，得到分子量4568.4，以此為基礎計算收率如上所述求出42％。
關於實施例1得到的接頭化合物即化合物10(以後，稱作生物素接頭10)，為了進行測定SPR因糖分子集合度的不同與植物凝血素間的相互作用而合成配位體。
(4-1糖分子單元未確定的配位體的合成)用生物素接頭10集合糖分子得到配位體。生物素接頭10溶解於甲醇但對水不溶，所以，使糖集合的還原氨基反應的溶劑作為水、乙酸、甲醇的混合溶劑，在pH4的條件下進行反應。
首先，選擇葡萄糖作為集合生物素接頭10的糖分子，在下述通式(19)中，按照以下步驟合成化合物16所表示的配位體。
如下述通式(19)所示，針對實施例1得到的生物素接頭10使用8當量(每1個1-氨基為2當量，8.0mg，44μmol)的葡萄糖把兩者溶解於混合溶劑中室溫下徹夜攪拌得到生物素接頭10/葡萄糖反應溶液。反應的蹤跡用ESI-MS來測定。少量取出反應中的上述生物素接頭10/葡萄糖反應溶液用甲醇稀釋測定稀釋標樣，當確認希夫鹼基形成時，在該階段中，大部分的生物素接頭10的氨基以游離狀態存在，希夫鹼基的生成率低。這樣，依次追加上述生物素接頭10/葡萄糖反應溶液，最後使28當量的葡萄糖反應，經ESI-MS測定的結果可知，生物素接頭10以希夫鹼基的形式存在。另外，生物素接頭10中的4個殘基氨基並不都成為希夫鹼基，還有，僅3個、或2個、或1個殘基的氨基成為希夫鹼基的化合物也存在。
在該階段中，在生物素接頭10/葡萄糖反應溶液加入氫化硼鈉作為還原劑，使希夫鹼基還原。還原反應結束後，用HP-20(商品名)純化還原的生物素接頭10/葡萄糖反應溶液，得到本發明配位體的化合物16。
對所得化合物16進行ESI-MS測定的結果，可知該化合物已經集合了7個或8個葡萄糖分子。這是因為過量地加入葡萄糖的緣故，在希夫鹼基被還原而產生的仲氨基上葡萄糖進一步參加反應的緣故。從ESI-MS測定的結果來看，可知上述化合物16是一種7個或8個葡萄糖單元(分子)的配位體的混合物。另外，所得上述化合物16的收率假設為8個分子集合的化合物，為42％。以下，將該化合物16簡稱為8-Glc。
為了得到化合物16，具體地進行以下操作。即，使生物素接頭10(6.0mg，5.4μmol)和葡萄糖(8.0mg，44μmol)溶解於混合溶劑(＝6/1/15，0.4mL)中室溫下徹夜攪拌後，追加葡萄糖(10mg，55μmol)，6小時後，在次追加葡萄糖(10mg，55μmol)徹夜攪拌，得到生物素接頭10/葡萄糖反應溶液。將氫化氰硼鈉(10mg，160μmol)加入該生物素接頭10/葡萄糖反應溶液中，室溫下徹夜攪拌，進行還原反應。減壓濃縮經該還原反應的生物素接頭10/葡萄糖反應溶液，把其殘渣用HP-20(70mL)純化，收集濃縮用水/甲醇＝1/1析出的級分，凍幹，得到白色結晶的化合物16。
所得化合物16的收量為5.1(收率為42％，以8個取代物為計)。此外，得到的化合物16經過1H NMR(400MHz，D2O)測定時，得到δ6.92(4H，d，J，＝7.6Hz，aromatic H)，δ6.73(4H，s，aromatic H)，δ6.50-6.45(8H，br，aromaticH)，δ4.3-4.27(1H，m，Biotin NHCH*CH2S)，δ4.05-4.02(1H，br，BiotinNHCH*CHS)，δ3.95-3.91(8H，m，H-2′)，δ3.76-3.71(8H，m，H-5′)，δ3.65-3.59(8H×2，m，H-3′，H-6′b)，δ3.58-3.45(8H×3，m，H-6′a，H-4′，H-1′b)，δ3.25(8H，dd，Jgem＝15.0，Jvic＝9.6Hz，H-1′a)，δ3.19-3.16(8H，br，LinkCH2*CH2NCH2CH2CONHPh，NHCOCH2CH2*NCO)，δ2.72-2.68(9H，br，CH2×4+1H，Link NCH2*CH2NHCOPh，Biotin NHCH2CH2*S)，δ2.54-2.49(5H，br，CH2×2+1H，Link CH2*NCH2CH2NHCOPh，Biotin NHCHCH2*S)，δ2.41(8H，br，CH2×4，Link NHCOCH2CH2*NCO)，δ2.07(2H，br，BiotinCOCH2*CH2CH2CH2)，δ2.00(4H，br，Link NHCOCH2CH2*NCO)，δ1.32(4H，br，Biotin COCH2CH2*CH2CH2*)，δ1.17-1.16(2H，br，BiotinCOCH2CH2*CH2CH2)。此外，得到ESI-MS(positive)m/z 1217.5[(M8+2H)2+]。另外，M7為，含有7分子葡萄糖的配位體的分子量，M8為，含有8分子葡萄糖的配位體的分子量。
下面，將麥芽糖集合到生物素接頭10上得到配位體。
用實施例1製得的生物素接頭10按照如下順序合成所述的通式(14)表示的結構的配位體。
如上述通式(14)所示，除了使用麥芽糖的當量(起始為9當量，再加9當量)以外，其他與上述實施例2相同進行操作，得到化合物11的本發明配位體。
製得的化合物11中的麥芽糖的集合度測定其混合物的NMR，從麥芽糖非還原末端1位質子和接頭內的芳香族質子(以16H為基準)的強度比計算。兩者的強度比為5.3∶16，推測麥芽糖平均集合5.3個分子。n個麥芽糖分子集合的化合物的分子量(Mw)採用生物素接頭10的分子量1120.4加上1個麥芽糖分子集合時的分子量326.3，如下式①所示。
Mw＝1120.4+326.3n (式①)把n＝5.3代入上式①中，得到分子量2849.8，以此為基礎，計算上述化合物11的收率，求出88％。以下，將該化合物11簡稱為5.3-Mal。
為了得到化合物11，具體操作如下。即，將生物素接頭10(3.2mg，2.9μmol)和麥芽糖(9.4mg，26μmol)溶解於混合溶劑(水/乙酸/甲醇＝6/1/15，0.2mL)中，室溫下攪拌8個小時後，再加入麥芽糖(9.3mg，26μmol)室溫下徹夜攪拌，得到生物素接頭10/麥芽糖反應溶液。在該生物素接頭10/麥芽糖反應溶液中加入氫化氰硼鈉(約5mg，80μmol)室溫下徹夜攪拌後，再加入氫化氰硼鈉(約5mg，80μmol)室溫下徹夜攪拌還原。減壓濃縮經該還原反應的生物素接頭10/麥芽糖反應溶液，把其殘渣用HP-20(70mL)純化，收集濃縮用水/甲醇＝1/1析出的級分，凍幹，得到白色結晶的化合物11。
所得化合物11的收量為7.81(收率為89％，以5.3個取代物為計)。此外，得到的化合物11經過1H NMR(500MHz，D2O)測定時，得到δ7.31-6.51(16H，br，aromatic H)，δ5.05(1H×5.3，br，H-1)，δ4.56-4.44(1H，br，Biotin NHCH*CH2S)，δ4.25-4.20(1H，br，Biotin NHCH*CHS)，δ3.92-3.91(1H×5.3，br，H-2′)，δ3.84-3.82(1H×5.3×3，br，H-5，H-5′，H-6b)，δ3.78(1H×5.3×2，dd，Jgem＝13.7，Jvic＝4.5，Hz，H-6a，H-6′b)，δ3.72-3.69(1H×5.3×3，br，J3/4＝8.2Hz，H-6a′，H-3′，H-3)，δ3.67-3.62(1H×5.3，br，H-4′)，δ3.53(1H×5.3，d，J2/1＝10.0Hz，H-2)，δ3.41(1H×5.3，t，J4/3＝9.5Hz，H-4)，δ3.37-3.36(4H，br，Link CH2*CH2NCH2CH2CONHPh)，δ3.33-3.30(4H，br，Link NHCOCH2CH2*NCO)，δ3.27-3.24(1H×5.3，br，H-1′b)，δ3.17-3.05(1H×5.3+1H，m，Jgem＝13.1，Jvic＝6.2Hz，H-1′a，Biotin NHCHCH*S)，δ2.88-2.84(9H，br，CH2×4+1H，Link NCH2*CH2NHCOPh，Biotin NHCHCH2*S)，δ2.77-2.70(1H，br，Biotin NHCHCH2*S)，δ2.60-2.65(4H，br，LinkNHCOCH2*CH2NCO)，δ2.56(8H，br，CH2×4，Link NCH2CH2*CONHPh)，δ2.20(2H，t，JB12/B11＝5.0Hz，Biotin COCH2*CH2CH2CH2)，δ2.18-2.13(4H，br，Link CH2CH2*NCH2CH2NHCOPh)，δ1.59-1.55(2H，br，BiotinCOCH2CH2*CH2CH2)，δ1.54-1.43(2H，br，Biotin COCH2CH2CH2CH2*)，δ1.28-1.27(2H，br，Biotin COCH2CH2CH2*CH2)。另外，得到ESI-MS(positive)m/z 1702.2[(M8+2H)2+]，1540.3[(M7+2H)2+]，1376.9[(M6+2H)2+]。另外M6為，含有6分子麥芽糖的配位體的分子量，M7為，含有7分子葡萄糖的配位體的分子量，M8為，含有8分子葡萄糖的配位體的分子量。
(4-2 4個糖分子單元的配位體的合成)如上述，針對生物素接頭10過量地加入集合的糖，得到超過需要的糖而集合成不均勻的集合物。因此，為了得到目的4個單元(分子)的糖分子的配位體，調製所加糖分子的當量數。其中，選擇葡萄糖、麥芽糖、乳糖3種糖作為集合化的糖分子。
首先，使用實施例1製得的生物素接頭10，按照以下步驟合成具有所述通式(16)Y表示O的結構的配位體。
如下述通式(20)所示，首先對生物素接頭10加入6當量葡萄糖，依次加入葡萄糖共計加入12當量時，除了即使還殘存未參加反應的接頭還要添加還原劑之外，其餘與上述實施例4中的(4-1)相同，進行同樣操作，得到化合物19的本發明的配位體。
R＝HO-或…(20)(相當於19) 或(相當於20) (相當於21)用HP-20同樣地純化經徹夜還原的生物素接頭10/葡萄糖反應溶液製得的產物，經過ESI-MS測定的結果，證實了該產物是由4或5個葡萄糖分子集合的化合物的混合物。葡萄糖的集合度經該產物的NMR測定，葡萄糖還原物即山梨糖醇的1位質子和接頭內的芳香族質子(以16H為基準)的強度比計算，兩者的強度比為4.2∶16，推測平均4.2個葡萄糖分子集合。n個葡萄糖分子集合的化合物的分子量(Mw)採用生物素接頭10的分子量1120.4加上1個葡萄糖分子集合時的分子量164.1，如下式②所示。
Mw＝1120.4+164.1n (式②)把n＝4.2代入上式②中，得到分子量1089.2，以此為基礎計算上述化合物19的收率為24％。收率低是由於用HP-20純化時而產生的損失的緣故。因此通過調整當量可以合成約4個葡萄糖分子集合的化合物。以下，將在末端具有4.2個山梨糖醇的山梨糖醇型的化合物19簡稱為4-Glc。
為了製得化合物19，具體操作如下。即，把生物素接頭10(4.91mg，3.11mmol)和，葡萄糖(3.45mg，19.2mmol)溶於混合溶劑(水/乙酸/甲醇＝12/1/15，0.2mL)中，室溫下，攪拌8個小時，得到生物素接頭10/葡萄糖反應溶液。進一步再該生物素接頭10/葡萄糖反應溶液裡，加入葡萄糖(1.64mg，9.1mmol)室溫徹夜攪拌後，加入氫化氰硼鈉(4mg，48mmol)，室溫徹夜攪拌，還原。將還原的生物素接頭10/葡萄糖反應溶液減壓濃縮，殘渣用HP-20(70mL)純化，收集並濃縮甲醇析出的級分，使殘渣凍結乾燥，得到白色結晶的化合物19。
所得化合物19的收量為2.77mg(收率為35％)。此外，所得化合物19經過1H NMR(500MHz，D2O)測定時，得到δ7.05-7.02(4H，m，aromatic H)，δ6.86-6.52(12H，m，aromatic H)，δ4.44(1H，dd，JB7/B8＝5.3，JB7/B3＝7.5Hz，BiotinNHCH*CH2S)，δ4.17(1H，dd，JB3/B4＝4.5，JB3/B7＝7.9Hz，Biotin NHCH*CHS)，δ3.92(4H，td，J＝8.6，4.7Hz，H-2)，δ3.80-3.73(12H，m，H-3，H-6b，5)，δ3.68-3.60(8H，m，1H×4×2，H-6a，4)，δ3.30-3.25(20H，m，1H×4+CH2×2×2，H1a，Link CH2*CH2NCH2CH2CONHPh，CONCH2*CH2CONH)，δ3.07(4H，1H×4，dd，Jgem＝13.2，Jvic＝8.2，Hz，H1b)，δ3.06-3.04(1H，m，Biotin NHCH*CHS)，δ2.86-2.83(8H，CH2×4，br，Link NHCH2*CH2CONHPb)，δ2.63-2.61(4H，2H×4，2，Link CONCH2CH2*CONH)，δ2.54-2.53(8H，br，CH2×4，LinkNCH2CH2*CONHPh)，δ2.21-2.06(6H，br，CH2×3，LinkCH2CH2*NCH2CH2CONHPb Biotin COCH2*CH2CH2CH2)，δ1.55(2H，br，CH2×1，BiotinCOCH2CH2*CH2CH2)，δ1.43-1.42(2H，br，CH2×1，Biotin COCH2CH2CH2*CH2)，δ1.30-1.23(2H，br，CH2×1，Biotin COCH2CH2CH2CH2*)。此外，ESI-MS(positive)m/z 911.4[(M+2Na)2+]。另外，[a]D22＝+0.373(c 0.0295，H2O)。
接著，用實施例1製得的生物素接頭10，按照以下步驟合成具有所述通式(17)Y表示O的結構的配位體。
如下述通式(20)所示，除了把8當量的麥芽糖換成葡萄糖以外，其餘與上述實施例4中的(4-1)相同，進行同樣操作，得到化合物20的本發明的配位體。所得化合物20在NMR中末端葡萄糖1位質子和，芳香族的強度比為4.1∶16，推測它是平均4.1個分子的麥芽糖集合的化合物。化合物20的收率計算同化合物19一樣把集合度4.1代入上述(式①)中，求得收率為69％。以下，末端具有4.1分子的α-葡萄糖的化合物20稱為4-Mal。
為了得到化合物20，以下進行具體操作。即，使生物素接頭10(25.0mg，15.8μmol)和，麥芽糖(34.3mg，95.1μmol)溶於混合溶劑(水/乙酸/甲醇＝15/1/15，0.55mL)中，室溫下，攪拌9個小時，得到生物素接頭10/麥芽糖反應溶液。再把麥芽糖(10.7mg，29.7μmol)加入到該生物素接頭10/麥芽糖反應溶液中，室溫下徹夜攪拌後，加入氫化氰硼鈉(15mg，240μmol)，室溫下徹夜攪拌，使之還原。把還原的生物素接頭10/麥芽糖反應溶液減壓濃縮，用HP-20(70mL)純化殘渣，收集並濃縮用水/甲醇＝1/1以及甲醇析出的級分，凍幹殘渣，得到白色結晶的化合物20。
所得的化合物20的收量為26.7mg(收率為70％)。此外，所得化合物20經過1H NMR(500MHz，D2O)測定時，得到δ7.06-7.01(4H，m，aromatic H)，δ6.78-6.77(4H，m，aromatic H)，δ6.70-6.66(4H，m，aromatic H)，δ6.51-6.50(4H，m，aromatic H)，δ5.04(4H，d，1H×4，Jvic＝2.7Hz，H-1)，δ4.43(1H，dd，JB7/B6＝8.0，JB7/B3＝4.9Hz，Biotin NHCH*CH2S)，δ4.19-4.17(1H，br，Biotin NHCH*CHS)，δ3.92-3.90(8H，m，CH×4×2，H-2′，5′)，δ3.83-3.80(8H，m，CH×4×2，H-5，6′a)，δ3.73(8H，dd，CH×4×2，J3/2＝5.2，J3′/2′＝5.0Hz，H-3，3′)，δ3.60(4H，dd，CH×4，J＝7.4，11.7Hz，H-4′)，δ3.53(4H，dd，CH×4，J2/3＝8.0，J2/1＝3.7Hz，H-2)，δ3.41(4H，t，CH×4，J＝9.5Hz，H-4)，δ3.30-3.22(12H，m，1H×4+CH2×2×2，H1′b，Link CH2*CH2NCH2CH2CONHPhCONCH2*CH2CONH)，δ3.14(4H，dd，1H×4，Jgem＝12.9，Jvic＝8.0Hz，H-1′a)，δ3.06(1H，m，Biotin NHCHCH*S)，δ2.84-2.83(9H，br，CH+CH2×4，Link CONCH2CH2*CONH，BiotinNHCHCH2*S)，δ2.70-2.66(5H，br，CH+CH2×4，Link CONCH2*CH2CONH，Biotin NHCH*CH2S)，δ2.62.-2.60(4H，br，CH2×2，Link CONCH2CH2*CONH)，δ2.53-2.52(8H，br，CH2×4，Link NCH2CH2*CONHPh)，δ2.20-2.04(6H，br，CH2×3，Link CH2CH2*NCH2CH2CONHPh，Biotin COCH2*CH2CH2CH2)，δ1.55(2H，br，CH2×1，Biotin COCH2CH2*CH2CH2)，δ1.43-1.42(2H，br，CH2×1，Biotin COCH2CH2CH2*CH2)，δ1.30-1.23(2H，br，CH2×1，BiotinCOCH2CH2CH2CH2*)。此外，ESI-MS(positive)m/z 817.0[(M+3H)3+]。另外，[a]D22＝+5.11(c 0.243，H2O)。Calcd for C104H165N15O48S·11.9H2OC，47.30；H7.16；N，7.96％.FoundC，47.30；H，6.88；N，7.86％。
接著，用實施例1製得的生物素接頭10，按照以下步驟合成具有所述通式(18)Y表示O的結構的配位體。
如下述通式(20)所示，除了把8當量的乳糖換成葡萄糖以外，其他與上述(4-1)相同，進行同樣操作，得到化合物21的本發明的配位體。所得化合物21在NMR中末端半乳糖1位質子和，芳香族質子的強度比為4.2∶16，推測它是平均4.2個分子的乳糖集合的化合物。此時，也可以根據上述式①的分子量進行計算，代入集合度4.2，求得分子量為2477.8，以此為基礎，進行計算，求出收率為57％。以下，末端具有4.2分子的β-半乳糖的化合物21稱為4-Lac。
為了得到化合物21，以下進行具體操作。即，使生物素接頭10(7.88mg，5.0μmol)和，乳糖(10.6mg，29.4μmol)溶於混合溶劑(水/乙酸/甲醇＝20/1/15，0.4mL)中，室溫下，攪拌10個小時，得到生物素接頭10/乳糖反應溶液。再把乳糖(3.59mg，10.0μmol)加入該生物素接頭10/乳糖反應溶液中，室溫下徹夜攪拌後，加入氫化氰硼鈉(5mg，80μmol)，室溫下徹夜攪拌，使之還原。把還原的生物素接頭10/乳糖反應溶液減壓濃縮，用HP-20(70mL)純化殘渣，收集並濃縮用水/甲醇＝1/1以及甲醇析出的級分，凍幹殘渣，得到白色結晶的化合物21。
所得化合物21的收量為7.08mg(收率為59％)。此外，所得化合物21經過1H NMR(600MHz，D2O)測定時，得到δ6.99(4H，d，J＝8.3Hz，aromatic H)，δ6.72(4H，d，J＝6.9Hz，aromatic H)，δ6.65(4H，d，J＝8.3Hz，aromatic H)，δ6.47(4H，t，J＝6.2Hz，aromatic H)，δ4.38(4H，d，1H×4，Jvic＝7.7Hz，H-1)，δ4.35(1H，m，Biotin NHCH*CH2S)，δ4.09(1H，dd，JB3/B4＝4.4，JB3B7＝7.9Hz，Biotin NHCH*CHS)，δ3.97-3.94(4H，m，CH×4，H-2′)，δ3.84-3.81(8H，m，CH×4×2，H-5，H-5′)，δ3.79(8H，d，CH×4×2，J4/3＝3.0Hz，H-4，6a)，δ3.75-3.73(12H，m，CH×4×2，H-3′，6′a，6b)，δ3.63(4H，dd，CH4，J4′/3′＝6.1Hz，H-4′，6′b)，δ3.57-3.56(4H，m，CH2×4，Link CH2*CH2NCH2CH2CONHPh)，δ3.52(4H，dd，J3/2＝10.0，J3/4＝3.5 Hz，H-3)，δ3.49(4H，t，CH2×2，J＝6.3Hz，LinkCH2CH2*NCH2CH2CONHPh)，δ3.46(4H，dd，J2/1＝7.7，J2/3＝10.0Hz，H-2)，δ3.29-3.19(12H，br，CH×4+CH2×4，Link NCH2*CH2CONHPh，H-1』b)，δ3.02-2.98(5H，m，Biotin NHCHCH*S，H-1』a)，δ2.81-2.75(9H，br，CH+CH2×4，Link NCH2*CH2CONHPh，Biotin NHCHCH2*S)，δ2.59(1H，d，Jgem＝13.2Hz，Biotin NHCHCH2*S)，δ2.48(8H，br，Link NCH2CH2*CONHPh)，δ2.13-2.03(6H，br，Link CONCH2CH2*CONH，Biotin COCH2*CH2CH2CH2)，δ1.47(2H，br，CH2×1，Biotin COCH2CH2CH2CH2*)，δ1.35(2H，br，CH2×1，BiotinCOCH2CH2CH2*CH2)，δ1.18(2H，br，CH2×1，Biotin COCH2CH2CH2*CH2)。此外，ESI-MS(positive)m/z 831.3[(M+3Na)3+]。另外，[a]D22＝-11.3(c 0.292，H2O)。Calcd for C104H165N15O48S·10.4H2OC，47.78；H7.12；N，8.04％.FoundC，47.78；H，6.95；N，8.00％。

在本實施例中，合成引入乙醯基來替代生物素的接頭化合物，作為對照化合物。即，如下述通式(21)所示，使吡啶中的乙酸酐與引入生物素之前的仲胺化合物8反應並乙醯化，得到化合物14。然後，把化合物14的末端的Boc基與先前的條件相同，去保護，定量地得到接頭化合物15。以下，把該接頭化合物15簡稱為乙醯接頭15。
為了得到化合物14，具體操作如下。即，把化合物8(13.1mg，54.5μmol)溶於吡啶(0.5mL)中，然後其中加入乙酸酐(0.5mL，5.3mmol)室溫下，攪拌4個小時。減壓濃縮反應溶液，用甲苯共沸2次，用中壓二氧化矽凝膠色譜法(5g，三氯甲烷∶甲醇＝10∶1-5∶1)純化，得到黃色結晶的化合物14。
所得化合物14的收量為12.8mg(收率為95％)。此外，所得化合物14經過1H NMR(400MHz，CD3OD)測定時，得到δ7.60(4H，t，J＝6.6Hz，aromaticH)，δ7.09-6.97(12H，m，aromatic H)，δ3.32(4H，t，J＝6.6Hz，AceNCH2*CH2CONH)，δ3.19-3.17(4H，br，AceNCH2CH2CONHCH2*)，δ2.77(8H，t，J＝6.1Hz，NCH2CH2*CONHPh)，δ2.52(4H，t，J＝6.4Hz，AceNCH2CH2CONHCH2CH2*)，δ2.42(8H，d，J＝6.1Hz，NCH2*CH2CONHPh)，δ2.12(4H，t，J＝6.6Hz，AceNCH2CH2*CONH)，δ1.90(s，3H Me of Ace)，δ1.40(s，36H Me of Boc)。此外，ESI-MS(positive)m/z 688.9[(M+2H)2+]。
還有，為了得到乙醯接頭15，具體操作如下。即，把化合物14(12.8mg，9.6μmol)溶解在二氯甲烷(0.5mL)中，加入三氟乙酸(0.5mL)0℃攪拌1個小時，得到化合物14/三氟乙酸反應溶液。減壓濃縮化合物14/三氟乙酸反應溶液，把殘渣用LH-20(140mL，甲醇析出)純化，得到乙醯接頭15的黃色結晶。
所得乙醯接頭15的收量為14.9mg(收率為100％)。此外，所得乙醯接頭19經過1H NMR(400MHz，CD3OD)測定時，得到δ7.50(4H，s，aromaticH)，δ7.27-7.19(8H，m，aromatic H)，δ6.86-6.81(4H，m，aromatic H)，δ3.57-3.51(12H，br，AceNCH2CH2CONHCH2*，NCH2*CH2CONPh)，δ3.40(4H，dd，J＝6.4Hz，AceNCH2*CH2CONH)，δ3.35-3.32(4H，br，J5/4＝5.1Hz，AceNCH2CH2CONHCH2CH2*)，δ2.91(4H，t，J7/6＝6.1Hz，NCH2CH2*CONHPh)，δ1.88(s，3H，Me of Ace)。此外，ESI-MS(positive)m/z 647.8[(M+2H)2+]。
用上述製得的乙醯接頭15，集合麥芽糖得到配位體。如下述通式(22)所示，除了使27當量的麥芽糖與乙醯接頭15反應，來替代葡萄糖與生物素接頭10反應以外，與上述實施例4的(4-1)相同，進行同樣操作，得到化合物18。
所得化合物18在NMR中麥芽糖非還原末端1位質子和接頭由來的芳香族質子的強度比為7.9∶16，推測它是平均7.9個分子的麥芽糖集合的化合物。由n個麥芽糖分子集合的化合物的分子量(Mw)採用乙醯接頭15的分子量936..1加上1個分子麥芽糖集合時的分子量326.3，如下述式③所示。
Mw＝936.1+326.3n (式③)把n＝7.9代入上述(式③)中，得到分子量3562.8，以此為基礎，計算化合物18的收率為50％。以下，把該化合物18簡稱為Ace-8-Mal。
為了得到化合物18，具體操作如下。即，使乙醯接頭15(3.73mg，7.3μmol)和，麥芽糖(11.5mg，33.6μmol)溶於混合溶劑(水/乙酸/甲醇＝6/1/15，0.25mL)中，室溫下徹夜攪拌後，再加入麥芽糖(13.0mg，38.0μmol)室溫攪拌，7個小時後再加入麥芽糖(14.7mg，42.9μmol)之後，加入氫化氰硼鈉(20mg，320μmol)室溫下徹夜攪拌，得到反應溶液。向該反應溶液中再加入氫化氰硼鈉(20mg，320μmol)室溫下徹夜攪拌。再次減壓濃縮加入氫化氰硼鈉的反應溶液，將殘渣用HP-20(70mL)純化，收集濃縮用水/甲醇＝1/1析出的級分，凍幹殘渣，得到白色結晶的化合物18。
所得化合物18的收量為7.02mg(收率為50％，以8個取代物為計)。此外，所得化合物18經過1H NMR(500MHz，D2O)的測定時，得到δ7.09-7.04(4H，br，J＝7.6Hz，aromatic H)，δ6.93-6.91(4H，br，aromatic H)，δ6.65-6.58(8H，br，aromatic H)，δ5.05(1H×8，d，J1/2＝2.3Hz，H-1)，δ3.88(1H×8×2，br，H-2′，5′)，δ3.82(1H×8，br，H-6b)，δ3.74(1H×8×2，dd，Jgem＝12.4，Jvic＝5.5Hz，H-6′b，H-6a)，δ3.69(1H×8，br，J3/4＝9.4Hz，H-3)，δ3.67-3.64(1H×8×2，br，H-3′，6′a)，δ3.59-3.57(1H×8，br，H-4′)，δ3.53(1H×8，dd，J2/1＝9.9，J2/3＝3.5Hz，H-2)，δ3.41(1H×8，t，J4/3＝9.6，Hz，H-4)，δ3.30(8H，br，Link CH2*CH2NCH2CH2CONHPh，NHCOCH2CH2*NCO)，δ3.24(1H×8，br，H-1′b)，δ3.15(1H×8，br，H-1′a)，δ2.87-2.82(8H，br，Link NCH2*CH2CONHPh)，δ2.66(4H，br，J＝8.0Hz，LinkCH2*CH2NCH2CH2CONHPh)，δ2.57(8H，br，Link NCH2CH2*CONHPh)，δ2.10-2.08(4H，br，J＝7.1hz，Link NHCOCH2*CH2NCO)，δ1.88(3H，s，Me of Ace)。此外，ESI-MS(positive)m/z 1190.4[(M8+2Na+H)3+]，1081.1[(M7+2H+Na)3+]。此外，M7有7個分子麥芽糖的配位體的分子量，M8有8個分子麥芽糖的配位體的分子量。
為了比較對照，如下述通式(23)所示，使用在特許文獻2記載的末端具有2個芳香族氨基殘基的接頭化合物22(divalent type，叫做生物素接頭22)，集合2個單元(分子)的糖分子合成配位體。
同樣地與上述實施例4的(4-2)中得到的集合4個單元糖分子的配位體情形相同，用生物素接頭22合成集合2個單元(分子)的糖分子的配位體。另外，集合2個單元糖選擇葡萄糖和麥芽糖。
首先，讓生物素接頭22集合葡萄糖，得到配位體的化合物23。如下述通式(24)所示，除了使4當量的葡萄糖與生物素接頭22反應取代使葡萄糖與生物素接頭10反應以外，其他均與上述實施例4的(4-1)操作相同，得到化合物23。化合物23的集合度在化合物23的NMR測定中，由葡萄糖還原物即山梨糖醇1位質子和生物素接頭22內的芳香族質子(以8H為基準)的強度比計算。兩者的強度比為2.1∶8，推測化合物23平均有2.1個分子集合葡萄糖。n個分子集合葡萄糖的化合物的分子量(Mw)採用生物素接頭22分子量567.7加上1個分子葡萄糖集合時的分子量164.1，如式④所示。
Mw＝567.7+164.1n(式④)把n＝2.1代入上述式④中，得到分子量912.3，以此為基礎，求出化合物23的收率為73％。以下，將化合物23簡稱為2-Glc。
接著，使麥芽糖集合在生物素接頭22上，得到配位體的化合物24。如下述通式(24)所示，除了用麥芽糖代替葡萄糖以外，同樣與得到上述化合物23的操作相同，集合麥芽糖，得到化合物23。在化合物24的NMR測定中，葡萄糖1位質子和生物素接頭22內的芳香族質子(以8H為基準)的強度比計算。兩者的強度比為2.0∶8，推測化合物24平均有2.0分子集合麥芽糖。n個分子集合麥芽糖的化合物的分子量(Mw)採用生物素接頭22分子量567.7加上1個分子麥芽糖集合時的分子326.3，如式⑤所示。
Mw＝567.7+326.3n (式⑤)把n＝2.0代入上述式④中，得到分子量1207.2，以此為基礎，求出化合物24的收率為76％。以下，將化合物24簡稱為2-Mal。
R＝HO-或…(24)(相當於23) (相當於24)為了得到化合物23，具體操作如下。即，使生物素接頭22(4.14mg，7.3μmol)和，葡萄糖(3.84mg，21.3μmol)溶於混合溶劑(水/乙酸/甲醇＝6/1/15，0.25mL)中，室溫下攪拌6小時，得到生物素接頭22/葡萄糖反應溶液。向該生物素接頭22/葡萄糖反應溶液中再加入葡萄糖(1.38mg，7.66μmol)室溫下徹夜攪拌後，加入氫化氰硼鈉(6mg，96μmol)室溫下徹夜攪拌還原。將該還原的生物素接頭22/葡萄糖反應溶液減壓濃縮，將殘渣用HP-20(70mL)純化，收集濃縮用水/甲醇＝1/1析出的級分，凍幹殘渣，得到白色結晶的化合物23。
所得化合物23的收量為4.84mg(收率為74％)。此外，所得化合物23經過1H NMR(600MHz，D2O)的測定時，得到δ7.51(4H，d，J＝6.6Hz，aromaticH)，δ6.62(4H，d，J＝9.1Hz，aromatic H)，δ4.33(1H，dd，JB7/B4＝3.0，JB7/B6＝5.0hz，Biotin NHCH*CH2S)，δ3.88(2H，dd，J2/1＝4.4，J2/3＝4.9Hz，H-2)，δ3.84(1H，dd，JB3/B4＝4.4，JB3/B7＝3.7Hz，Biotin NHCH*CHS)，δ3.75(2H，dd，J3/2＝4.9，J3/4＝3.2Hz，H-3)，δ3.74-3.72(2H，m，H-6b)，δ3.72-3.69(4H，br，CH2×2，Hz，Link NCH2CH2*NHCOPh)，δ3.69-3.67(2H，m，H-5)，δ3.64(4H，t，CH2×2，J＝4.6Hz，Link NCH2*CH2NHCOPh)，δ3.60(2H，dt，J4/3＝2.5，J4/5＝7.7Hz，H-4)，δ3.53(2H，dd，J＝2.2，6.0Hz，H-6a)，δ3.33-3.29(2H，dt，Jgem＝13.7，Jvic＝4.7Hz，H-1a)，δ3.11(2H，dt，Jgem＝11.2，Jvic＝3.3Hz，H-1b)，δ2.72(1H，dd，Jgem＝12.9，Jvic＝5.0Hz，Biotin NHCHCH2*S)，δ2.57(1H，d，Jgem＝13.2，Hz，Biotin NHCHCH2*S)，δ2.55-2.53(1H，m，J＝3.3，Hz，Biotin NHCHCH*S)，δ2.14(2H，t，JB12/B11＝7.0，Hz，BiotinCOCH2*CH2CH2CH2)，δ1.22-1.10(4H，m，CH2×2 BiotinCOCHCH2*CH2CH2*)。此外，ESI-MS(positive)m/z 470.7[(M+2Na)2+]。[a]D22＝+6.61(c 0.145，H2O)。Calcd for C40H61N7O14S·6.5 H2OC，47.45；H，7.31；N，9.69％.FoundC，47.44；H，6.580；N，9.60％。
此外，為了得到化合物24，具體操作如下。即，使生物素接頭22(4.12mg，7.3μmol)和，麥芽糖(7.9mg，22.1μmol)溶於混合溶劑(水/乙酸/甲醇＝12/1/15，0.25mL)中，室溫下徹夜攪拌，得到生物素接頭22/麥芽糖反應溶液，然後，加入氫化氰硼鈉(6mg，96μmol)室溫下徹夜攪拌還原。將該還原的生物素接頭22/麥芽糖減壓濃縮，將殘渣用HP-20(70mL)純化，收集濃縮用水/甲醇＝1/1析出的級分，凍幹殘渣，得到白色結晶的化合物24。
所得化合物24的收量為6.71mg(收率為75％)。此外，所得化合物24經過1H NMR(500MHz，D2O)的測定時，得到δ7.60(4H，d，J＝4.5Hz，aromaticH)，δ6.74(4H，d，J＝8.8Hz，aromatic H)，δ5.09(2H，d，J1/2＝3.7Hz，H-1)，δ4.44(1H，dd，JB7/B6＝4.8，JB7/3＝3.1Hz，Biotin NHCH*CH2S)，δ3.95-3.93(2H，br，H-2′)，δ3.91-3.90(2H，br，H-5′)，δ3.90-3.89(2H+1H，br，Biotin NHCH*CHS，H-3′)，δ3.87-3.86(2H，br，H-5)，δ3.82(2H，d，Jgem＝12.7Hz，H-6a)，δ3.76(2H，dd，Jgem＝12.5，Jvic＝5.2Hz，H-6b)，δ3.72(4H，m，1H×2×2，Jgem＝12.1，J3/4＝9.3Hz，H-6′a，H-3)，δ3.66(4H，br，CH2×2，Link NCH2CH2*NHCOPh)，δ3.62(4H，d，Jgem＝11.8Hz，H-6′b，H-4′)δ3.58-3.54(6H，m，CH2×2+1H×2，Link NCH2CH2*NHCOPh)，δ3.42(2H，t，J4/3＝9.6Hz，H-4)，δ3.37(2H，dt，Jgem＝13.7，Jvic＝4.8Hz，H-1′b)，δ3.29(2H，td，Jgem＝7.4，Jvic＝3.0Hz，H-1′a)，δ2.83(2H，dd，Jgem＝13.0，Jvic＝5.1Hz，BiotinNHCHCH2*S)，δ2.67(2H，d，Jgem＝12.8Hz，Biotin NHCHCH2*S)，δ2.65-2.62(2H，m，Biotin NHCHCH*S)，δ2.24(2H，t，JB12/B11＝7.0Hz，BiotinCOCH2*CH2CH2CH2)，δ1.31-1.19(4H，m，CH2×2，JB11/B12＝7.0，JB9/B10＝7.4Hz，BiotinCOCH2CH2*CH2CH2*)，δ0.95-0.91(2H，m，Biotin COCH2CH2CH2*CH2)。此外，得到[a]D22＝+6.95(c 0.222，H2O)。Calcd for C52H81N7O24S·9.1 H2OC，47.13；H，7.17；N，7.09％.FoundC，45.13；H，6.63；N，7.37％。
如上所述，合成4個單元或2個單元集合糖分子的配位體。以下，用這些配位體根據SPR測定分析與蛋白質之間的相互作用。
在SPR測定中，大多數情況下，分析物與除了配位體外的分子進行非特異性相互作用。為此在實際測定的時候，觀測的是特異性相互作用和非特異性相互作用共同引起共振角度的變化。減弱非特異性相互作用來觀測察特異性相互作用在檢測上是最大的問題。本發明人認為，根據下面的方法是否能解決這個問題(稱作2通道分析法)。
本實施例中使用的進行STR測定的裝置SPR670(商品名Nippon LaserElectronics LAB)有(S)，(R)2個通道，如圖3所示，同時可以觀測到它們各自表面上的配位體和分析物之間的相互作用。例如，一個表面固定4-Mal，另一個表面固定4-Glc，與葡萄糖結合的植物凝血素即伴刀豆球蛋白A(Concanavalin A，Con A)在這2個表面上同時相同條件衝洗。Con A與4-Mal末端存在的吡喃葡萄糖結合，但很難與不具有末端的4-Glc結合。4-Mal和4-Glc除了在末端是否存在糖以外結構都相同，若與ConA之間的相互作用有差別，認為是由於存在於4-Mal末端的吡喃葡萄糖所引起的。即，所觀測到的(S)，(R)的共振角度變化之差就相當於吡喃葡萄糖與Con A之間的相互作用。
如此地，分別把2種不同的配位體固定在(S)和(R)上，觀察兩者之間的相互作用之差，應用這樣的現有技術手段，本發明人發現，除了末端有無糖之外，把具有相同結構的化合物用作配位體，由此可以檢測出糖分子和蛋白質之間的特異性作用。
(5-1導入配位體的晶片的製作)首先，為了根據SPR測定分析糖分子和蛋白質之間的相互特異作用，把配位體固定在傳感片上。即，把在實施例4中合成的配位體利用生物素-親和素之間的鍵固定在晶片上，得到導入配位體的晶片(配位體載體)。另外，使親和素固定於SPR傳感片之後，再固定配位體。
為了得到具體的引入配位體的晶片，操作如下。即，首先，將13×20×0.7mm玻璃基板蒸鍍有50nm金薄膜的日本雷射電子株式會社生產的傳感片，放入UV臭氧清洗器(商品名NL-UV253，日本レ一ザ一電子株式會社)照射20分鐘紫外線，用臭氧清潔傳感片的表面。接著，把該傳感片浸入到裝有100μM的4，4′-二硫代丁酸乙醇溶液的玻璃皿中，室溫下，緩慢地震動30分鐘(商品名Bio Dancer，New Brunswick Scientific公司)。用金-硫鍵把4-硫代丁酸固定在晶片上。用乙醇清洗該晶片3次之後，浸入到裝有160mM水溶性碳化二亞胺的水溶液1mL和13mM的N-羥基琥珀醯亞胺1，4-Dioxan溶液9mL的混合溶液的玻璃皿中，室溫下，緩慢地震蕩30分鐘。在玻璃皿中加入10mL水，室溫下震蕩5分鐘，結束活性化反應。用水清洗4次晶片風乾後，安裝在SPR670的傳感片架上。將其上的晶片用流動緩衝液衝洗，在金膜上照射雷射，此時，記錄所觀測的表面等離子體振子共振角度變化。另外，流動緩衝液為pH7.4的磷酸緩衝液(PBS)，除了衝洗樣品外，經常以5mL/min的流速用流動緩衝液衝洗晶片。此外，SPR測定都是在一定溫度(25℃)下進行的，測定用的樣品溶液全部都用針筒式濾器(Whatman(copyrighe)PURADISC(註冊商標)25TF 0.2mm PTFE Membranefilter)過濾，然後再使用。
流動衝洗晶片，共振角度變化達到一定值之後，把0.1mg/mL的NeutrAvidin(PIERCE，NeutrAvidin(註冊商標)，CA47105)乙酸鈉水溶液(10mM，pH5.5)，以5μL/min的流速，每60μL衝洗3次。在SPR中衝洗樣品後，換成流動緩衝液，把剩餘的樣品衝洗掉，共振角度變化達到一定值之後，操作如下。為了使殘存的活性酯失活(封閉反應)，用含有1.0M氨基乙醇的PBS溶液(pH8.5)以5μL/min的流速每60μL衝洗2次，得到親和素附加晶片(親和素附加物)。
接著，在各種濃度的實施例4中得到的配位體的PBS溶液以10μL/min的流速每60μL依次衝洗，上述親和素附加晶片上固定配位體，得到引入配位體的晶片(配位體載體)。另外，配位體的固定反覆進行直到無法確定SPR傳感圖應答單元的上升。
直到固定配位體的SPR傳感圖如圖4所示的一個例子。這裡，S通道(以下簡稱為(S))表示在上述實施例4(4-3)中得到的4-Mal，R通道(以下簡稱為(R))表示固定4-Glc時的傳感圖。傳感圖的橫軸表示時間，縱軸表示共振角度變化(Response(RU；Response Unit))。
除了添加分析物時候以外，作為流動緩衝液的磷酸緩衝液(pH7.4，以下簡稱為PBS)不斷地以5μL/min的流速衝洗。往晶片上添加分析物結束後，自動地使PBS流動，清洗剩餘的沒有參加結合的分析物。若以5μL/min的流速60μL衝洗0.1mg/mL的NeutrAvidin乙酸鈉水溶液(10mM乙酸鈉，pH5.5)，可以觀測到共振角度的增加，即可知NeutrAvidin已經被固定在晶片上。
其後，為了封閉晶片上殘存的活性酯，將含有1.0M乙醇胺的PBS溶液以5μL/min的流速衝洗60μL。封閉後，當共振角度變化達到一定值時，和NeutrAvidin溶液衝洗之前和之後的共振角度變化量作為固定量。該傳感圖的固定量(S)為3690RU，(R)為3480RU。
接著，以10μL/min的流速分別衝洗60μL在(S)上固定4.9μM、16.3μM、49μM的4-Mal溶液，在(R)上固定0.49μM、4.9μM的M4-Glc溶液。將沒有被固定的多餘的配位體衝洗掉，當共振角度變化達到一定值時，和固定前和固定後的共振角度變化量作為固定量。另外，配位體的固定反覆進行直到即使衝洗集合物固定量也不增加的狀態為止。在該傳感圖上4-Mal的固定量為220RU，4-Glc的固定量為220RU，2種不同配位體固定程度相同可以製作導入配位體的晶片。用同樣的方法製作配位體不同的各種類型的配位體導入晶片。
(5-2配位體固定的鑑定)合成的配位體通過生物素-NeutrAvidin鍵用SP測定鑑定是否被固定在晶片上，其使用化合物18(Ace-8-Mal)，所述化合物18(Ace-8-Mal)是在比較例1(無生物素)中得到的根據乙醯接頭15使麥芽糖集合而成的。即，在與5.3-Mal條件相同，NeutrAvidin被固定的晶片上把Ace-8-Mal衝洗，其若沒有被固定時，可以證實沒有固定非特異配位體。
首先，與上述(5-1)一樣，製作已固定NeutrAvidin的親和素附加物晶片。此時的NeutrAvidin固定量，(S)為6620RU，(R)為6330RU。在晶片的(S)上，依次以10μL/min的流速分別衝洗0.61μM的Ace-8-Mal溶液、5.48的Ace-8-Mal溶液、0.61μM的5.3-Mal溶液、5.48μM的5.3-Mal溶液60μL，(R)上只繼續衝洗PBS。此時，相當於(S)和(R)之差(D)的傳感圖為圖5。另外，在同一圖裡，Ace-8-Mal表示為Ace-Mal，5.3-Mal表示為Bio-Mal。
如圖5所示，從SPR測定結果上看，含有生物素的5.3-Mal特異地被固定在晶片上，不含生物素的Ace-8-Mal完全沒有被固定。因此，用生物素接頭集合糖分子的化合物(配位體)通過生物素-親和素(NeutrAvidin)的鍵可以特異地固定在晶片上。
(5-3配位體導入晶片所含有的糖分子和植物凝血素之間的相互作用)在上述(5-1)得到的配位體導入晶片上以20μL/min的流速衝洗0.61μL各種濃度的蛋白質的PBS溶液，根據SPR測定，觀察配位體導入晶片和蛋白質之間的鍵以及解離動向。
另外，所用的蛋白質如下所述*)BSA(SIGMAALUBMUN，BOVINE)*)ConcanavalinA(伴刀豆球蛋白A，SEIKAGAKU KOGYO)*)Pee Lectin(豌豆植物凝血素，SEIKAGAKU KOGYO)*)Peanut Lectin(花生植物凝血素，SEIKAGAKU KOGYO)*)RCA120(蓖麻豆植物凝血素，SEIKAGAKU KOGYO)另外，導入上述蛋白質的配位體導入晶片，在該配位體導入晶片表面上，以60μL/min的流速衝洗60μL 10mM氫氧化鈉水溶液由此解離再生，再利用。該操作在傳感圖中衝洗達到植物凝血素之前的應答單元值(Response(RU；Response Unit))之前反覆進行1-3次。
首先，在上述(5-1)中得到的含有5.3-Mal和8-Glc的配位體導入晶片上，研究與Con A的相互作用。首先，與上述(5-1)一樣，把NeutrAvidin固定在晶片上，得到親和素附加晶片。此時NeutrAvidin的固定量(S)為5470RU，(R)為4380RU。然後，在親和素附加晶片的(S)上固定5.3-Mal，在(R)上固定8-Glc，得到配位體導入晶片。另外，配位體的固定量(S)為390RU，(R)為390RU。
在這樣製作的配位體導入晶片上以10μL/min的流速衝洗60μL0.1MconA溶液。此時，觀察到的(S)、(R)以及兩者之差的(D)共振角度變化圖示於圖6。如圖6所示，若衝洗ConA溶液，配位體導入晶片上的配位體和Con A結合，(S)、(R)的共振角度都增大了。接著，衝洗與結合無關的ConA溶液以10μL/min的流速衝洗約1000秒PBS之後，又以60μL/min的流速衝洗60μL 10mM氫氧化鈉水溶液，解離與配位體結合的Con A。觀察到隨著解離的進行共振角度急劇降低，共振角度與衝洗ConA之前的基礎線保持一致並達到一定水平時，可知Con A完全被解離了。在同一圖的(D)中，與表示結合、解離的代表性SPR傳感圖相同。即，在該體系裡可以觀測到Con A和吡喃葡萄糖之間的特異性相互作用。
進一步地，使各種濃度的Con A作用於上述配位體導入晶片SPR測定相互作用。此外，關於與BSA，及與PSA的相互作用進行SPR測定也觀測到共振角的變化。
從以上結果可知，即，如下合成的依生物素接頭集合糖分子的配位體可以固定在使親和素(NeutrAvidin)固定的晶片上。此外，還可以分析Con A和吡喃葡萄糖之間的特異性相互作用。
此外，根據利用配位體導入晶片的[2通道分析法]得出的結論是，可以消除與蛋白質之間的非特異性相互作用。還有，與ConA同樣，作為吡喃葡萄糖識別植物凝血素的PSA非特異地相互作用，可知，即使是具有糖識別能力的植物凝血素固定在晶片上的糖分子存在結合上的差異。
此外，製作本發明的4-Mal及4-Glc，和比較例的2-Mal及2-Glc所固定的配位體導入晶片，在其上，衝洗各種濃度的ConA，BSA，PSA，RCA120，PNA，SPR測定觀察共振角度變化。
關於糖分子集合程度與植物凝血素之間的相互作用而產生的差異，其結果示於表1。

KD(Ka/Kd)解離常數，Ka結合速度常數，Kd解離速度常數表1表示解離常數(KD)的數值越小分子間的結合越大。通過表1的比較可知，針對相同分析物的解離常數，4個單元的糖分子集合的體系是2個單元體系的約2/3。即，通過更多地集合糖確認了與ConA結合得更緊密。
為了更進一步地詳細地研究，如比較Con A和配位體之間的結合速度常數(Ka)、解離速度常數(Kd)可知，即，雖然兩者結合速度沒有差別，但解離速度有4個糖分子的配位體約為2個單元的1/2，她們之間的差異較大。也就是說，在具有4個單元的糖分子配位體中，結合的Con A處於很難解離的狀態。若增加集合化的糖分子數結合速度沒有發現變化，但一次結合了Con A解離之後增加再結合的機會使解離速度降低，受其影響，解離常數值變小。從該結果可以確認，本發明的接頭化合物集合糖分子因群集效應增強了與相互作用分子的結合。
接著，改變糖分子，分析半乳糖和識別半乳糖的植物凝血素之間的相互作用。該分析使用了配位體導入晶片，該配位體導入晶片是把在上述(5-1)得到的僅末端是否有半乳糖差異的4-Mal和4-Glc固定在NeutrAvidin晶片上的。使用濃度不同的RCA120，還有PNA再與上述相同進行SPR測定。此外，在4-Lac和4-Glc的配位體導入晶片上，加入各種濃度的Con A，BSA，PSA，RCA120，PNA溶液進行SPR測定，觀察共振角的變化(D)。從這些觀測結果可知，如採用集合乳糖的配位體，可以分析半乳糖和半乳糖結合的植物凝血素RCA120及PNA之間的特異性相互作用。
以上所得結果如下。
1)利用本研究合成的接頭集合糖分子製得的配位體，根據生物素-親和素(NeutrAvidin)的鍵可以將其固定在SPR傳感片上。
2)在採用被稱為「2通道分析法」的方法中，除了末端糖分子以外，對照的配位體具有相同的結構，將SPR測定中最大的問題非特異性相互作用相抵消，並可以檢測出糖和蛋白質之間的特異性作用。
3)通過使用使集合度不同的固定糖配位體的糖晶片，可以觀察到因群集效應而帶來的糖分子和植物凝血素之間的強烈結合。
如上述，本發明接頭化合物集合糖分子得到集合物(配位體導入晶片)最適合於SPR測定中的植物凝血素和糖分子之間的相互作用的分析。
(6-1親和柱的製作)利用實施例4合成的配位體製作親和柱。
按照一般製作親和柱的方法，製作並固定實施例4中得到的配位體4-Mal的親和柱。柱載體採用Amershan公司生產的Hitrap NHS-activated Hp(柱體積1mL)。其適用於在凝膠基質上通過間隔把N-羥基琥珀醯亞胺作為活性基而固定(每1mL凝膠，有10mmol的NHS基)，含有氨基化合物被固定在載體上。親和柱的製作流程概況如圖6所示。
注入到柱上的溶液使用與柱連接的1mL或5mL的注射器(商品名テルモシリンジ、伽馬射線消毒完畢的1mL，5mL)，手工操作使從柱的下端流出的溶液以每秒1滴的速度進行。此外，全部的溶液都是用針筒式濾器過濾的(Millex-GS Syringe Drive Filter Unut 0.22μm)。製備下列1-3溶液的緩衝液。
1)NeutrAvidin偶聯緩衝液(含0.5M氯化鈉的10mM乙酸鈉水溶液pH5.5)
2)封閉緩衝液(含0.5M氯化鈉的0.5M乙醇胺水溶液pH8.3)3)洗滌緩衝液(含0.5M氯化鈉的0.1M乙酸鈉水溶液pH4.0)把N-羥基琥珀醯亞胺固定在凝膠上而形成的凝膠載體，其中填充的活性化柱(Amershan公司生產的Hitrap NHS-activated Hp)1mL，向柱子中過冷鹽酸(1mM)1mL，把填充的異丙醇除去，然後立刻，過2.0mg/mLNeutrAvidin偶聯緩衝溶液，栓塞密封，室溫下放置30分鐘。接著過封閉緩衝溶液6mL，室溫下放置30分鐘後，依次過洗滌緩衝溶液6mL、封閉緩衝溶液6mL，PBS 6mL。然後，再過1mL的0.5mg/mL配位體(4-Mal)PBS溶液，栓塞密封，室溫下放置30分鐘。然後，過PBS 5mL將多餘的配位體衝洗掉。
(6-2親和性色譜法)用上述(6-1)中的親和柱，使與配位體相互作用的蛋白質和，沒有相互作用的蛋白質分離，另外，所用的蛋白質有下列3種。
*)BSA(SIGMA ALUBMUN，BOVINE)*)Concanavalin A(ConA，SEIKAGAKU KOGYO)*)Pee Lectin(PSA，SEIKAGAKU KOGYO)從實施例5(5-3)SPR測定的結果可知，ConA強烈地與4-Mal結合，通過氫氧化鈉水溶液才能解離。此外，PSA和BSA不存在特異性的相互作用。
由上述可以推測，如將這些蛋白質的混合溶液通過親和柱，只有ConA與4-Mal結合，附著在柱上，除此以外都白白地流掉析出。被保存的ConA可能通過含有氫氧化鈉的PBS溶液通過親和柱而被析出。或者也可能以葡萄糖溶液作為結合抑制劑通過親和柱被析出。另外，該親和層析的步驟如圖7所示。
首先，過一下(6-1)製作的親和柱，也就是說，將各種蛋白質的最後濃度均調整為1mM的蛋白質混合PBS溶液1mL，栓塞密封，室溫下放置5分鐘。
然後，過5mL的PBS溶液把流出液每1mL收集(作為Mix-1.2.3.4.5)。然後作為解離劑依次每5mL過0.1mM、1.0mM、10mM、1M葡萄糖PBS溶液，每1mL收集各自的流出液(依次地作為0.1Glc-1～5，1Glc-1～5，10Glc-1～5，1000Glc-1～5)。過PBS 5mL洗滌親和柱後，過10mM的氫氧化鈉PBS溶液5mL，每1mL收集流出液(作為NaOH-1.2.3.4.5)。
(6-3·蛋白質的鑑定)根據上述(6-2)的親和層析技術，把收集的級分用紫外分光光度計測定280nm的吸光度，把被確認為吸收的級分上柱SD-PAGE，如下所述。
先製備下列溶液。再把所有的溶液用針筒式濾器過濾的(Millex-GSSyringe Drive Filter Unut 0.22μm)。
*)0.5M Tris-HCl緩衝液pH6.8*)電泳槽用緩衝溶液(ナカライテスク製造，用於電泳緩衝液)*)標樣調整用緩衝溶液(SDS 0.3mg，2-巰基乙醇0.3mL，甘油6mL，50mM Tris-HCl緩衝溶液3mL，離子交換水1mL)*)標記色素溶液(溴酚藍1mg，甘油0.1mL，離子交換水1mL)*)クマ ジ一亮藍(クマジ一ブリリアントブル一)染色溶液(ナカライテスク生產的快速染色劑CBB試劑盒使用)凍幹收集的級分1mL後，加入100μL的離子交換水再次溶解。混合20μL的該溶液和標樣調整用緩衝溶液10μL，95℃下加熱10分鐘調整標樣溶液。在填充了電泳用緩衝溶液的電泳槽裡裝上現成的凝膠(ATTOPAGEL-Compact AE-6000(SDS含12.5％))，每個泳道上滴上標記色素溶液1μL和，變性的標樣溶液10μL，以20mA的電流進行電泳。同時把Prestainedprotein maeker.Low range(ナカライテスク生產)作為標準開始電泳。電泳結束後，取下凝膠，浸入到クマジ一亮藍染色溶液中，室溫下50分鐘震蕩(New Brunswick Scientfic公司生產Bio Dancer使用)。震蕩後用離子交換水洗滌凝膠，再浸入到60℃的離子交換水中脫色。把脫色的凝膠乾燥保存。
具體地使用12.5％的丙烯醯胺凝膠(ATTO PAGEL-Compact AE-6000)實施SDS-PAGE，根據クマジ一亮藍染色。其結果如圖8。如圖8所示，在Mix-2中級分觀察到Con A、PSA、BSA 3條帶，它們被析出。在Mix-3中，BSA和PSA帶消失，只有Con A帶出現。在以後的級分裡，沒有觀察到BSA和PSA帶，在Mix-4，Mix-5，10Glc-1，NaOH-2的任一級分中，都看到了ConA帶。從這些結果來看，可清楚地了解了下面2個事實。
(1)BSA和PSA都沒有過柱。(由於過量的蛋白質原本被吸附的ConA的一部分也被析出，所以在Mix-2中都能看到3種蛋白質)。
(2)大部分的ConA與載體上的4-Mal結合併吸附在柱上，用解離劑從柱上析出。
從以上結果可知，使用4-Mal固定的親和柱，從Con A和PSA和BSA的混合溶液中只能選擇性地分離Con A。
另外，在本發明具體實施方式
中，沒有舉例說明的實施方式或實施例均作為理解本發明的技術內容，僅僅限定在上述的具體實施例不應狹義地解釋，本發明的精神和所附的權利要求書均可以作各種變換實施本發明。
工業上的利用本發明的接頭化合物如上所述，可導入4個單元以上的糖分子的部位包含4個芳香族氨基。此外，與糖分子特異地相互作用的蛋白質進行檢測或分離時所使用的蛋白質分析用的支持物可結合的部位包括生物素部位或亞氨基生物素部位。還有，所述的接頭化合物可以幾乎不受與蛋白質之間的非特異性相互作用的影響。
再者，本發明的配位替是將糖分子導入所述接頭化合物而形成的。
因此，本發明利用接頭化合物或配位體，檢測生物分子的相互作用，從而可以用於生物技術產業方面。尤其是，可以用於在利用晶片技術或親和色譜技術的領域。此外，還可以用於生物探頭或生物傳感器的領域，進一步還應用於製藥領域或診斷·檢查等的醫療技術方面。
權利要求
1.一種多用途型接頭化合物，其特徵在於，具有通式(1)表示的結構 其中，Y具有O或NH表示的結構，上述X包括由4個鏈所構成的多個部位的結構，所述4個鏈在末端具有芳香族氨基且在主鏈也可具有碳-氮鍵的烴衍生鏈。
2.如權利要求1所述的多用途型接頭化合物，其特徵在於，上述X包括通式(2)表示的結構 其中，m1，m2，n1，n2，p1，p2，p3，p4各自獨立地為1-6的整數。
3.如權利要求2所述的多用途型接頭化合物，其特徵在於，在上述通式(2)中，包括m1，m2，n1，n2，p1，p2，p3，p4均用2表示的結構。
4.一種配位體，由在權利要求1至3中任一項所述多用途型接頭化合物的芳香族氨基導入糖分子而形成的。
5.如權利要求4所述的配位體，其特徵在於，所述糖分子為單糖類、寡糖類、多糖類中的任一種。
6.一種配位體，其特徵在於，包括通式(3)所示的結構 其中，Y具有O或NH表示的結構，R1，R2，R3，R4為各自獨立地表示H-或 的結構，R6，R7，R8，R9，R10的結構選自HO-或 或者 表示的結構所構成組群的結構，其中，m1，m2，n1，n2，p1，p2，p3，p4各自獨立為1-6的整數。
7.一種配位體，其特徵在於，包括通式(4)所示的結構 其中，Y具有O或NH表示的結構，m1，m2，n1，n2，p1，p2，p3，p4各自獨立地為1-6的整數。
8.一種多用途型接頭化合物的製造方法，其特徵在於，包括以下步驟生物素類化合物和，與芳香族氨基末端用保護基團保護的4個分支鏈的化合物進行縮合反應步驟；去掉上述芳香族氨基末端的保護基的去保護步驟。
9.一種配位體的製造方法，其特徵在於，用權利要求1至3中任一項所述的多用途型接頭化合物和糖分子進行還原氨基反應。
10.一種糖分子的導入方法，該方法是把糖分子排列在支持物表面上的糖分子導入法，其特徵在於，使含有權利要求4至7中任一項所述配位體的溶液與，表面上鏈黴親和素或親和素所固定的載體接觸。
11.一種配位體的載體，其特徵在於，把權利要求4至7中任一項所述的配位體，通過生物素-親和素鍵固定在支持物表面上而形成，其中所述的鍵為生物素部位或亞氨生物素部位與鏈黴親和素或親和素之間的鍵。
12.權利要求11所述的配位體載體，其特徵在於，鏈黴親和素或親和素固定於上述支持物上。
13.如權利要求11或12所述的配位體載體，其特徵在於，將配位體載體用作表面等離子體振子共振測定用的傳感片。
14.如權利要求11或12所述的配位體載體，其特徵在於，將配位體載體用作親和層析用的親和柱。
15.一種表面等離子體振子的測定方法，該方法是使用糖分子固定在載體表面上的傳感片，檢測的糖分子相互作用的方法，其特徵在於，使用末端結構不同的導入的糖分子所構成的至少2個傳感片，上述至少2個傳感片包含第1糖分子被固定在支持物表面上形成的第1傳感片和，與上述第1糖分子末端結構不同的第2糖分子被固定在支持物表面上形成的第2傳感片，用第1傳感片得出的檢測結果和，用第2傳感片得出的檢測結果，測定兩者之差。
16.如權利要求15所述的表面等離子體振子的測定方法，其特徵在於，用權利要求1或3項所述的相同結構的接頭化合物在上述傳感片上固定糖分子。
17.如權利要求15或16所述的表面等離子體振子的測定方法，其特徵在於，在上述傳感片固定大致相同數量的糖分子。
全文摘要
多用途型接頭化合物，包括通式(1)表示的結構其中，Y具有O或NH表示的結構。上述X包括由4個鏈形成的多分支部位的構造，所述4個鏈是在末端具有芳香族氨基且在主鏈上具有碳－氮鍵的烴衍生鏈。所述多用途型接頭化合物在蛋白質分析用的支持物表面上很好地再現糖分子二維排列。此外，配位體由所述的多用途型接頭化合物導入糖分子而形成的。
文檔編號G01N33/531GK1681825SQ0382130
公開日2005年10月12日 申請日期2003年8月6日 優先權日2002年9月9日
發明者隅田泰生, 荒野明男, 林秀樹, 楠本正一, 麥可·索貝爾 申請人:獨立行政法人科學技術振興機構, 國立大學法人鹿兒島大學