一種重組豬幹擾素β1及其編碼基因和表達方法
2023-10-05 15:13:09
專利名稱：一種重組豬幹擾素β1及其編碼基因和表達方法
技術領域：
本發明屬於生物工程基因領域，涉及一種重組豬幹擾素β I及其編碼基因，以及其表達、純化和包涵體復性方法。
背景技術：
幹擾素(Interferon, IFN)是一組具有多種功能的活性蛋白質(主要是糖蛋白),是一種由單核細胞和淋巴細胞產生的細胞因子。它們在同種細胞上具有廣譜的抗病毒、影響細胞生長，以及分化、調節免疫功能等多種生物活性。根據IFN的來源即動物種類、細胞類型、誘生劑的性質和誘生條件不同，可分為α、β、Y三種。其中，幹擾素β主要由成纖維細胞產生，在體內具有增強細胞表面HLA1、II類抗原表達，提高血清新蝶吟和β2-微球蛋白水平、增強NK細胞活力和ADCC作用以及外周淋巴細胞2』，5』-寡腺昔合成酶活性。臨床已將幹擾素β應用於多發性硬化症、B型肝炎、C型肝炎等的治療中。我國是生豬生產豬大國，豬圓環病毒病、豬繁殖與呼吸症候群、豬偽狂犬病等多種豬病毒性傳染病給養豬業帶來了巨大的經濟損失。目前我國雖廣泛接種各種豬病疫苗，仍不能有效控制疾病流行。幹擾素β具有較強的抗病毒效應及免疫調節活性，與IFN-α —樣，它具有廣譜抗病毒作用，可作為幹擾素α的替代製劑，並且幹擾素β對病毒的抑制程度會因病毒的種類不同而有很大差異，例如幹擾素β比幹擾素α具有更好的抗SARS-CoV效果；幹擾素β在酸、鹼、熱的耐受性也明顯優於幹擾素Y。同時，IFN-β還可抑制成纖維細胞、上皮細胞、內皮細胞以及造血細胞的增殖，抑制和殺傷腫瘤細胞，以及對免疫系統起調節作用，因此在獸藥領域中的應用越來越廣泛。然而，幹擾素β存在明顯的種屬差異，僅依靠在活豬體內提取遠遠不能滿足市場的要求。動物用基因工程幹擾素β無藥物殘留、無副作用，很受臨床獸醫和養殖戶的青睞，但是市場上多數類似藥物依然面臨著產量不足、質量層次不齊、價格昂貴等問題。因此，本專利首先提供了一種成本低廉、質量穩定的可大量表達重組豬幹擾素βI的表達 系統和表達方法。原核表達系統是最早被採用進行研究的，這也是目前掌握最為成熟的表達系統。該項技術的主要方法是將已克隆入目的基因DNA片段的載體(一般為質粒)轉化細菌(通常選用的是大腸桿菌)，通過IPTG誘導並最終純化獲得所需的目的蛋白。其優點在於能夠在較短時間內獲得基因表達產物，而且所需的成本相對比較低廉。本專利即採用了大腸桿菌表達體系對重組豬幹擾素β I進行的異源表達，從而獲得了大量的目的蛋白。但是，由於原核表達系統的缺乏翻譯後修飾的體系，其表達的真核生物蛋白常以低活性的包涵體形式產生。而包涵體的復性是一個非常複雜的過程，不僅與復性條件和復性材料息息相關，更在很大程度上取決於蛋白質自身的性質。如果復性條件不適宜，將導致分子內二硫鍵的錯配、分子間以共價結合或疏水結合的方式形成聚合體，從而使產物沉澱析出，影響得率，並且降低重組蛋白的比活率，影響產品質量。因此，本專利所要解決的另一個技術問題是，採用適當的條件對大腸桿菌表達體系生產的重組豬幹擾素β I的包涵體進行復性，得到具有較高比活力的產物。
發明內容
本發明的目的是克服現有技術的不足之處，通過密碼子優化的方式，提供一種可在大腸桿菌內高效表達重組豬幹擾素β 以及其基因和表達、純化、復性方法。本發明提供了一種重組豬幹擾素β 1，其胺基酸序列如SEQ ID NO 2所示。本發明提供了編碼上述所述重組豬幹擾素β I的基因，其鹼基序列如SEQ ID NO I所示。該序列是專為大腸桿菌表達系統進行密碼子優化得到的序列，相比之下能顯著提高異源基因在宿主菌中的表達效率。本發明還提供了包含了上述所述編碼重組豬幹擾素β I的基因的載體，所述的載體優選為原核表達質粒，最優選為pET21b。本發明還提供了包含有上述所述載體的大腸桿菌菌株，優選地，所述菌株選自大腸桿菌BL21 (DE3)菌株。本發明還提供了重組豬幹擾素β I在大腸桿菌表達方法，包括如下步驟該方法的步驟為1.挑取一個含有上述所述重組豬幹擾素β I的大腸桿菌菌落，接入LB培養液，培養過夜；2.取過夜培養物接入於LB培養液中，震蕩培養至對數中期(A_=l. O)；3.在培養物中加入IPTG至O. 5-1. 5mmol/L，於37°C，誘導表達l_4h後，離心處理收集含有重組豬幹擾素βI的大腸桿菌菌體沉澱。所述LB培養液中均含有氨苄青黴素50-100 μ g/mL。
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本發明還提供了重組豬幹擾素β I的包涵體純化方法，包括如下步驟1.將收集得到的上述含有誘導重組豬幹擾素β I大腸桿菌菌體沉澱，用預冷的PBS重懸，並於4°C高速離心處理；重複一次。2.吸去上清，稱菌體沉澱重量，每克(菌體溼重)加入裂解緩衝液BufTerA3-10ml，用磨光玻璃棒攪動，使菌體懸起。3.每克(菌體溼重)菌體加入3-10 μ L濃度為IOOmmoI/L的PMSF，3-100 μ L濃度為lOOmg/mL的溶菌酶，於冰上攪動。4.破碎菌體，樣品置於冰上，超聲，並於4°C高速離心處理，棄上清。5.沉澱用洗滌緩衝液Buffer B洗滌，並於4°C高速離心處理，沉澱包涵體，重複一次。6.包涵體沉澱用變性緩衝液Buffer C溶解，室溫下攪拌30_60min。7.充分混勻後室溫高速離心處理，棄沉澱，取上清，即得到重組豬幹擾素β I變性溶液。該純化方法優選步驟如下1.將收集得到的上述含有誘導重組豬幹擾素β I大腸桿菌菌體沉澱，用預冷的PBS重懸,於4°C,以12000rpm/min的轉速離心15min ;重複一次。2.吸去上清，稱菌體沉澱重量，每克(菌體溼重)加入裂解緩衝液BufferA5mL，用磨光玻璃棒攪動，使菌體懸起。3.每克(菌體溼重)菌體加入5 μ L濃度為100mmol/L的PMSF，5 μ L濃度為IOOmg/mL的溶菌酶，冰上攪動20min。4.用探針型超聲波儀破碎菌體，樣品置於冰上，超聲120次，每次5s間隔5s，循環三次，每次循環至冷卻樣品之間等待2min,等待樣品冷卻。於4°C ,以12000rpm/min的轉速離心15min,棄上清。5.沉澱用洗漆緩衝液Buffer B洗漆,於4°C,以12000rpm/min的轉速離心15min,
沉澱包涵體，重複一次。6.包涵體沉澱用變性緩衝液Buffer C溶解，室溫下攪拌30min。7.充分混勻後室溫下以12000rpm/min的轉速離心15min,棄沉澱,取上清，即得到重組豬幹擾素β I變性溶液。本發明還提供了優化後的重組豬幹擾素β I的包涵體復性方法，包括如下步驟取適量用變性緩衝液 Buffer C溶解的上述所述的重組豬幹擾素β I變性溶液，測其濃度，然後用復性緩衝液Buffer D將蛋白濃度稀釋到O. 2mg/mL, 4°C復性至24小時時，將復性後重組蛋白溶液過O. 45 μ m濾膜，即得到低濃度的重組豬幹擾素β I復性溶液。截留分子量IOKDa超濾脫鹽、濃縮，於真空冷凍乾燥機低溫真空乾燥，即獲得重組豬幹擾素β I粉末。本發明的上述所述表達、純化、復性方法是經過發明人反覆多次實驗摸索和驗證得到的用於大腸桿菌表達系統表達重組豬幹擾素β I的最為有效的方法，該方法的表達量高，且表達得到包涵體復性後活性更高。尤其是本發明的經優化過的重組豬幹擾素β 的基因序列，更適於大腸桿菌表達系統的表達，所表達的重組豬幹擾素β I遠高於豬幹擾素βI天然基因序列在大腸桿菌表達系統的表達量。本發明還提供了重組豬幹擾素β I在製備治療和預防豬繁殖與呼吸症候群、豬流感以及豬藍耳病疾病的藥物中的用途。在豬仔疾病治療過程中，豬幹擾素β I可以非特異性的發揮廣泛的抗病毒效應，提高機體免疫應答和增強對病毒的防禦能力。同時，豬幹擾素β I也可與其他疫苗聯合使用，減輕疫苗的不良反應，增強整體抗病毒、細菌、寄生蟲的效力。
圖1表示重組豬幹擾素β I密碼子優化前後核苷酸序列比較其中，偶數行(即「原始序列」對應的行)為豬幹擾素β I天然基因核苷酸序列，即密碼子優化前的序列；奇數行(即「優化序列」對應的行)為本發明的重組豬幹擾素β I的基因核苷酸序列，即密碼子優化後的序列。圖2-a、圖2-b為重組豬幹擾素β I密碼子優化前後在大腸桿菌表達宿主中CAI指數。其中，圖2-a表示豬幹擾素β I天然基因核苷酸序列在大腸桿菌表達宿主中CAI指數經過程序計算為O. 60 ;圖2-b表示優化後的本發明的重組豬幹擾素β I密碼子在大腸桿菌表達宿主中CAI指數經過程序計算為O. 90。圖3-a、圖3-b為豬幹擾素β I密碼子優化前後在大腸桿菌表達宿主中最優密碼子頻率分布區域圖。其中，圖3_a表示豬幹擾素β I天然基因核苷酸序列在大腸桿菌表達宿主中最優密碼子頻率分布區域圖，從圖中可以看出豬幹擾素β I天然基因核苷酸序列的低利用率密碼子出現百分比為15% ;圖3-b表示優化後的本發明的重組豬幹擾素β I密碼子在大腸桿菌表達宿主中最優密碼子頻率分布區域圖，優化後的本發明的重組豬幹擾素β I密碼子序列的低利用率密碼子出現百分比為O。圖4-a、圖4-b為重組豬幹擾素β I密碼子優化前後在大腸桿菌表達宿主中平均GC鹼基含量分布區域圖。其中，圖4_a表示豬幹擾素β I天然基因核苷酸序列在大腸桿菌表達宿主中平均GC鹼基含量為46. 45%;圖4-b表示優化後的本發明的重組豬幹擾素β I密碼子在大腸桿菌表達宿主中平均GC鹼基含量為47. 27%。圖5-a、圖5-b為重組豬幹擾素β I密碼子優化前後mRNA的二級結構預測圖。圖5-a豬幹擾素β I天然基因mRNA的二級結構預測圖，圖5_b為密碼子優化後的本發明的重組豬幹擾素β ImRNA的二級結構預測圖。圖6為重組豬幹擾素β I表達質粒構建過程圖。圖7為重組豬幹擾素β I基因PCR產物的瓊脂糖凝膠電泳圖。其中，泳道I為NdeI和XhoI酶切pET21b載體；泳道2為500bp DNA Ladder ;泳道3為兩端含有NdeI和XhoI酶切位點的重組豬幹擾素β I基因PCR產物。圖8-a、圖8-b為重組豬幹擾素β I的SDS-PAGE凝膠電泳圖及相應的免疫印跡圖。圖8-a為重組豬幹擾素β ISDS-PAGE凝膠電泳圖。其中，泳道I為(10-230kDa)寬範圍的預染的蛋白上樣Marker ;泳道2為未加入IPTG誘導的重組豬幹擾素β I大腸桿菌裂解液；泳道3為加入IPTG誘導的重組豬幹擾素β I大腸桿菌裂解液。圖8_b為重組豬幹擾素β I免疫印跡圖。其中，泳道l(10_230KDa)寬範圍的預染的蛋白上樣Marker，泳道2為未加入IPTG誘導的重組豬幹擾素β I大腸桿菌裂解液泳道3為加入IPTG誘導的重組豬幹擾素β I大腸桿菌裂解液。圖9重組豬幹擾素β I高效表達誘導條件優化的SDS-PAGE凝膠電泳圖。其中，泳道I為(10_230kDa)寬範圍的預染的蛋白上樣Marker ;泳道2為O. 5mmol/L IPTG誘導Ih的含重組豬幹擾素β I大腸桿菌裂解液；泳道3為O. 5mmol/L IPTG誘導2h的含重組豬幹擾素β I大腸桿菌裂解液；泳道4為O. 5mmol/L IPTG誘導3h的含重組豬幹擾素β I大腸桿菌裂解液；泳道5為O. 5mmol/L IPTG誘導4h的含重組豬幹擾素β I大腸桿菌裂解液；泳道6為lmmol/LIPTG誘導Ih的含重組豬幹擾素β I大腸桿菌裂解液；泳道7為lmmol/L IPTG誘導2h的含重組豬幹擾素β I大腸桿菌裂解液；泳道8為lmmol/L IPTG誘導3h的含重組豬幹擾素β I大腸桿菌裂解液；泳道9為lmmol/L IPTG誘導4h的含重組豬幹擾素β I大腸桿菌裂解液；泳道10為1. 5mmol/LIPTG誘導Ih的含重組豬幹擾素β I大腸桿菌裂解液；泳道11為1. 5mmol/L IPTG誘導2h的含重組豬幹擾素β I大腸桿菌裂解液；泳道12為1. 5mmol/L IPTG誘導3h的含重組豬幹擾素β I大腸桿菌裂解液；泳道13為1.5mmol/L IPTG誘導4h的含重組豬幹擾素β I大腸桿菌裂解液。圖10為復性後的重組豬幹擾素β I包涵體SDS-PAGE電泳圖其中，泳道I為(10_230kDa)寬範圍的預染的蛋白上樣Marker ;泳道2為用誘導後全菌裂解液；泳道3為Buffer B第一次清洗後重組豬幹擾素β I包涵體沉澱；泳道4為為Buffer B第二次清洗後重組豬幹擾素β I包涵體沉澱；泳道5為稀釋復性後的重組豬幹擾素M
具體實施例方式下面結合具體實施例，進一步闡述本發明，應理解，引用實施例僅用於說明本發明而不用於限制本發明的範圍。實施例1重組豬幹擾素β I基因優化設計1.密碼子優化遺傳密碼子有64種，但是絕大多數生物傾向於利用這些密碼子中的一部分。那些被最頻繁利用的稱為最佳密碼子(optimal codons)，那些不被經常利用的稱為稀有或利用率低的密碼子(rare orlow-usage codons)。實際上,常用做蛋白表達或生產的每種生物(包括大腸桿菌，酵母，哺乳動物細胞，植物細胞和昆蟲細胞)都表現出某種程度的密碼子利用的差異或偏愛。大腸桿菌、酵母和果蠅中對含最佳密碼子的基因的表達效率明顯高於含低利用率的密碼子的基因的表達效率。因此，在異源表達系統中，密碼子的偏愛性很大程度上影響了重組蛋白的表達。利用偏愛密碼子(preferred codons)並避免利用稀有的密碼子進行基因合成，這種基因的重新設計叫密碼子優化。優化過程充分考慮到蛋白表達不同階段可能遇到的多種複雜因素，如密碼子適應性、mRNA結構以及轉錄和翻譯過程中不同的順式元件。因此，本發明對豬幹擾素β I的基因設計不僅包括密碼子優化，還包括mRNA結構修正、翻譯起始位點的優化等。2.密碼子偏愛性優化密碼子偏愛性在原核基因表達中已經被證實是一個很重要的影響因素，它引起了同一密碼子在不同生物體之 間，蛋白的表達水平之間以及同一操縱子的不同部位間利用率的改變。引起這種偏愛性差異的主要原因是不同細胞內可用的tRNAs量的差異。因此優化翻譯系統最佳的方法就是保持密碼子的使用頻率與同源tRNA之間的平衡。在大腸桿菌中表達哺乳動物基因是不可預測和具有挑戰的，如在大腸桿菌中，AGG和AGA所對應的tRNA分子就很少，這種差異很明顯會影響基因的表達。3.將低利用率的密碼子替換成宿主常用密碼子通常基因中包含的密碼子在特定宿主中的利用率越低，該種蛋白的表達量也就越少，甚至當這種密碼子存在與蛋白簇間或者N末端的時候表達量會更少。在不改變胺基酸序列的前提下將低利用率的密碼子替換為宿主常用密碼子能提高功能蛋白的表達水平。任何來源的密碼子如果在宿主生物體內的利用率低於5%到10%時，就會出現表達抑制，當這些低利用率密碼子臨近或相連時，對蛋白表達的影響更大。成簇的低利用率的密碼子抑制了核糖體的運動，這是基因不能以合適水平表達的一個明顯機制。核糖體翻譯由九個密碼子組成的信使(含幾個低利用率密碼子或全部為低利用率密碼子)時的運動速度要比翻譯不含低利用率密碼子的同樣長的信使的速度慢。即使低利用率密碼子簇位於3』端，信使最後也會被核糖體「擁擠」而損害，核糖體又回到5』端。3』端低利用率密碼子簇的抑制效應可以和全部信使都由低利用率密碼子組成的抑制效應一樣大。如果低利用率密碼子簇位於5』端，其效應是起始核糖體數目的全面減少，導致蛋白合成中信使的低效率。去除低利用率的密碼子或者容易被誤讀為終止信號的密碼子能夠防止低表達或者不表達。4.表達載體和轉錄啟動子雖然密碼子偏愛在基因表達中起著重要的作用，但表達載體和轉錄啟動子的選擇同樣重要，N端核苷酸序列的蛋白表達對於低利用率密碼子和接近起始位點的密碼子AUG非常敏感。翻譯與mRNA的穩定性間也存在著相互的影響，雖然降低翻譯效率會使mRNA由於缺少了核糖體的保護而更容易被endo-RNAses分解，但目前還沒有它們之間影響的完整解釋。其他因素也可以影響蛋白表達，包括使mRNA去穩定的序列。穩定mRNA 二級結構和接近5'端的分子也對基因表達有重要的影響。利用翻譯時目的基因上遊的開放式閱讀框能夠成功提高難度基因的表達效率。發明人根據GenBank已公開的豬幹擾素β (Sus scrofa interferon,betal)的cDNA序列(GenBank登錄號NM_001003923.1)，對該基因進行密碼子優化後得到本發明的重組豬幹擾素β I基因，如SEQ ID No :1所示。下面是對重組豬幹擾素β I進行密碼子優化，優化前後各參數對比如下1.密碼子適應指數(Codon Adaptation Index, CAI)由圖2_a可知，密碼子沒有優化前，豬幹擾素β I天然基因在大腸桿菌中密碼子適應指數(CAI)為0.60。 由圖2-b可知，通過密碼子優化後，使得本發明的重組豬幹擾素β 基因在大腸桿菌中CAI指數為0. 90。通常CAI=I時被認為該基因在該表達系統中是最理想的高效表達狀態，CAI指數越低表明該基因在該宿主中表達水平越差，因此可以看出經過了密碼子優化後得到的基因序列可以提高重組豬幹擾素βI基因在大腸桿菌中的表達水平。2.最優密碼子使用頻率(Frequency of Optimal Codons, FOP)由圖3-a可知，基於大腸桿菌表達載體，密碼子沒有優化前，豬幹擾素β I天然基因序列的低利用率密碼子出現百分比為15%。這條未進行優化的基因含有串聯稀有密碼子，這些密碼子可能降低翻譯效率，甚至能夠解散翻譯裝配物。由圖3-b可知，通過密碼子優化後，本發明的重組豬幹擾素βI基因在大腸桿菌系統中出現低利用率密碼子的頻率為
O03. GC 喊基含量(GC curve)GC含量理想分布區域為30% -70%，在這個區域外的出現任何峰都會不同程度地影響轉錄和翻譯效率。由圖4-a、圖4-b的豬幹擾素β I基因的GC鹼基平均含量分布區域圖對比可知，由圖4-a中顯示豬幹擾素β I天然基因中在優化前GC鹼基平均含量為46. 45%,由圖4-b中顯示出優化後的序列消除了 GC含量在30% -70%區域外所有鹼基，最終得到優化後重組豬幹擾素β I的GC鹼基平均含量為47. 26%。3.優化前後順式作用元件情況如下
權利要求
1.一種重組豬幹擾素β ，其胺基酸序列如SEQ ID Ν0:2所示。
2.一種編碼權利要求1中所述的重組豬幹擾素β I的基因，其鹼基序列如SEQ ID NO I所示。
3.一種載體，所述載體具有權利要求2的基因。
4.如權利要求3所述的載體，所述載體為pET21b。
5.一種大腸桿菌，所述大腸桿菌具有權利要求3的載體。
6.如權利要求5所述的大腸桿菌，所述大腸桿菌為BL21(DE3)菌株。
7.一種重組豬幹擾素β I的表達方法，包括如下步驟(1)挑取含有權利要求5或6中所述的大腸桿菌菌落，接入含抗生素的LB培養液，培養過夜；(2)取過夜培養物轉接入於含抗生素的新鮮LB培養液中，震蕩培養至對數中期A600=l. O ；(3)在培養物中加入濃度為O.5-1. 5mmol/L的IPTG，37°C，誘導表達1_4小時後，離心處理收集含有重組豬幹擾素βI的大腸桿菌菌體沉澱。
8.—種重組豬幹擾素β I的純化和復性方法，其特徵在於，包含如下步驟(1)將權利要求7中所述的含有重組豬幹擾素βI的大腸桿菌菌體沉澱，用預冷的PBS重懸，於4°C,以12000rpm/min離心15min,重複一次；(2)吸去上清，按每克(菌體溼重)加入3-10mL裂解緩衝液BufferA，攪動緩衝液使菌體懸起；(3)每克(菌體溼重)菌體加入3-10μ L濃度為100mmol/L的PMSF，3-100 μ L濃度為100mg/mL的溶菌酶，冰上攪動20min ；(4)破碎菌體細胞，4°C，12000rpm/min離心，棄上清；(5)包涵體沉澱用洗漆緩衝液BufferB洗滌，4V，12000rpm/min離心15min,棄上清。包涵體沉澱重複本步驟一次；(6)包涵體沉澱用變性緩衝液BufferC溶解，室溫攪拌30_60min ；(7)充分混勻後室溫條件下12000rpm/min離心15min,棄沉澱,取上清，即得到重組豬幹擾素βI變性溶液；(8)取適量用變性緩衝液BufferC溶解的所述的重組豬幹擾素β I變性溶液，測其濃度，然後用復性緩衝液Buffer D將蛋白濃度稀釋到0. 2mg/mL, 4°C復性至24小時時，將復性後重組蛋白溶液過0. 45 μ m濾膜，即得到重組豬幹擾素β I復性溶液。
9.如權利要求8所述的純化和復性方法，其特徵在於，所述重組豬幹擾素βI復性溶液可進一步以截留分子量IOKDa超濾濃縮、脫鹽，低溫真空乾燥，即獲得重組豬幹擾素β I粉末。
10.一種藥物組合物，其特徵在於所述藥物組合物包含由權利要求8或9的方法得到的重組豬幹擾素β I。
全文摘要
本發明提供了一種重組豬幹擾素β1及其編碼基因、表達、純化和包涵體復性方法，屬於生物基因工程領域。重組幹擾素β1作為一種非特異性廣譜抗病毒生物製劑在獸藥領域具有廣闊的藥用前景，但與大多基因工程獸藥一樣其一直存在著生產量不足、價格昂貴、藥品規格不一等問題。為獲取大量的重組豬幹擾素β1，本發明採用大腸桿菌表達系統對密碼子優化後的重組豬幹擾素β1基因進行異源表達。此外，針對原核表達體系中的豬幹擾素β1多以包涵體的形式表達的問題，本發明還提供了重組幹擾素β1包涵體純化及復性方法，使得製得的重組幹擾素β1具有較高活力，達到了產業化生產的標準。
文檔編號C12N15/63GK103059123SQ20131000769
公開日2013年4月24日 申請日期2013年1月9日 優先權日2013年1月9日
發明者馬永, 王安良, 章成昌, 徐春林, 陳晨, 王耀方 申請人:江蘇眾紅生物工程創藥研究院有限公司, 常州京森生物醫藥研究所有限公司