蓖麻蠶細胞核骨架結合元件的應用的製作方法

2023-10-29 11:58:02

專利名稱：蓖麻蠶細胞核骨架結合元件的應用的製作方法
技術領域：
本發明屬於分子細胞生物學，真核基因表達調控技術研究領域。具體涉及蓖麻蠶rRNA基因的一個新型的轉錄增強子元件-細胞核骨架結合元件(SAR)，該SAR元件應用於基因表達載體的構建，能提高外源基因在真核細胞中的高效、穩定表達。
真核生物的細胞核經核酸酶消化後除去游離DNA、組蛋白和其它可溶性蛋白後，殘留一個網絡狀結構，稱為核骨架或核基質。核骨架維持細胞核的形態，並形成三維空間將細胞核內成千上萬個基因的複製、轉錄、加工和運輸等生命活動組織在一定的空間內。染色質上一些特定的DNA區域能與核骨架特異結合，稱為核骨架結合區(SAR)或核基質結合區(MAR)。SAR/MAR通常位於染色質環的基部，決定染色質的高級結構，並對基因的複製和轉錄起調控作用。
國外最早由Mirkovitch J等報導了組蛋白基因簇SAR的檢測及其特性(Mirkovitch J,et al.,Cell,1984,39:223～232)，發現SAR是富含A、T的DNA序列(A+T＞70％)，長約400～1000bp，能特異地與核骨架蛋白結合。接著Cockerill和Garrard報導了免疫球蛋白κ基因的MAR(Cell,1986,44:273-282)，發現該MAR含有拓撲異構酶Ⅱ的識別位點；隨著對SAR/MAR的基礎研究不斷深入，越來越多的基因的SAR/MAR被檢測，SAR/MAR的功能引起人們廣泛的興趣，Phi-VanL等在90年報導了雞溶菌酶基因5』MAR能增強異源啟動子的轉錄活性。我們實驗室最近報導了蓖麻蠶rRNA基因簇的SAR元件(趙慕鈞等，中國科學(C輯)，1998,28(1):42～49)，該元件是由我們克隆、測序並鑑定的。本發明是將該SAR元件應用於基因表達載體的構建，以提高外源基因在真核細胞中穩定高效表達。
為此，本發明的目的是通過克隆蓖麻蠶的SAR元件，將SAR元件應用在體外組建成真核基因表達載體，由該載體攜帶外源基因轉染真核細胞，增強外源基因的穩定高效表達。
關於蓖麻蠶SAR元件克隆的構建方法是通過首先檢測並鑑定蓖麻蠶rRNA基因的核骨架結合區(SAR)，然後將該SAR插入pBluescript(pSK+)質粒的EcoRⅠ-SacⅡ位點，構建成pSK(+)-SAR克隆(見圖1)。該SAR是長約1,000bp的DNA片段，經DNA序列分析後表明，該SAR富含A、T鹼基(A+T＞70％)，含有topⅡ位點和酵母的自主複製序列(ACS)等其它重複序列和結構花式，DNA的序列組成表明該SAR是一個重要的功能元件(見圖2)。
本發明以SAR元件組建成真核基因表達載體pLu-SAR為例，結構見圖3。該載體含有SAR和報告基因蟲螢光素酶(Luciferase)基因以及一些篩選標記。該載體的構建方法是用EcoRⅠ和SacⅡ雙酶切pSK-SAR質粒(見圖1)，將SAR片段分離出來，然後用Klenow酶補平，接上BamHⅠ接頭，插入pLu質粒的BamHⅠ位點，構建成pLu-SAR表達載體(圖3)。pLu質粒含有SV40啟動子和蟲螢光素酶基因(Luc)，含有氰黴素抗性基因(AmpR)和新黴素抗性基因(NeoR)篩選標記。蟲螢光素酶基因是插入在質粒載體上的外源基因，將其導入真核細胞，通過檢測蟲螢光素酶的活力，來確定外源基因的表達高低。圖4是蟲螢光素酶活力的檢測結果。將pLu質粒轉染哺乳類細胞NIH3T3，蟲螢光素酶基因的表達很低，將其作為對照，將pLu-SAR轉染哺乳類細胞NIH3T3，發現SAR能增強蟲螢光素酶基因在真核細胞中的穩定表達約十七倍。將pAGLu作為陽性對照(pAGLu和pLu質粒由美國Kohwi-Shigematsu T.實驗室惠贈)，轉染NIH3T3細胞後，增強蟲螢光素酶基因表達七倍，與文獻報導相似(Bode J,et al.,Science,1992,255:195～197)。因此我們克隆的SAR元件應用於真核表達載體，作為一種增強子元件，提高外源基因的表達約17倍，具有很高的活性。
本發明的優點在於SAR元件在染色質結構水平調控基因的表達，利用SAR元件構建的真核表達載體pLu-SAR，將外源基因導入真核細胞並整合到染色體上，SAR能在染色體上增強啟動子活力，使基因表達增強。由於外源基因整合在染色體上，隨細胞分裂而分配到後代子細胞中，不易丟失，因此SAR增強基因表達的能力具有穩定高效的優點，特別適用於基因治療，以提高治療基因的表達。由於SAR/MAR能結合在核骨架上，有利於提高表達蛋白的水平及其穩定性，適用於真核細胞生產基因工程產品，提高質量。
本發明通過以下附圖和實施例作進一步闡述，但並不限制本發明的範圍。


圖1是蓖麻蠶SAR元件的pSK(+)-SAR克隆圖2是蓖麻蠶SAR元件的DNA序列組成圖3是真核基因表達載體pLu-SAR的圖譜圖4是蓖麻蠶SAR元件增強蟲螢光素酶相對活力的檢測結果實施例1蓖麻蠶SAR元件的檢測與克隆a．分離和製備蓖麻蠶絲腺體組織細胞核取5齡1～3天蓖麻蠶絲腺體組織3～5g，勻漿並過濾，勻漿緩衝液為Al(0.25mol/L蔗糖，10mmol/L Tris-HCl(pH8.0),5mmol/L氯化鎂)，l,500rpm離心10分鐘，收集沉澱並用Al懸浮，加入終濃度為0.5％的Triton X-100，冰浴10分鐘後，1,500rpm離心10分鐘，用Al懸浮沉澱，作2.2mol/L蔗糖密度梯度超離心，超離心條件為20,000rpm,60分鐘，沉澱物為細胞核。
b．細胞核骨架的製備經超離心分離的細胞核，用二碘水楊酸鋰鹽(LIS)緩衝液B(5mmol/LTris-HCl pH7.4,20mmol/L氯化鉀，0.125mmol/L亞精胺，0.05mmol/L精胺，0.1％毛地黃皂苷(進口分裝，上海試劑供應站)，0.1mmol/L PMSF)懸浮，然後參照Mirkovitch(Cell,1984,39:223～232)的方法製備核骨架，即用終濃度為20mmol/L二碘水揚酸鋰鹽提取核內組蛋白和其它可溶性蛋白，用1,000u/mL限制性內切酶EcoRⅠ和SacⅡ消化染色質，離心沉澱和核骨架結合的DNA。
c．蓖麻蠶SAR元件的檢測和pS(+)-SAR克隆的構建DNA經純化後走1～1.2％瓊脂糖電泳，32P-α-dATP(Amersham產品)標記rRNA基因片段作探針，雜交結果證明蓖麻蠶rRNA基因的5』EcoRⅠ-SacⅡ片段，長約1,000bp，能與核骨架結合，定義為蓖麻蠶的SAR元件。將此SAR插入pBluescript(pSK+)的EcoRⅠ-SacⅡ位點，構建pSK(+)-SAR克隆(見圖1)，SAR元件的DNA序列組成見圖2。
實施例2蓖麻蠶SAR元件應用於pLu-SAR真核表達載體的構建用SacⅡ和EcoRⅠ雙酶切，將SAR片段pSK(+)-SAR質粒中切下，用Klenow酶補平後，接上BamHⅠ接頭，再用BamHⅠ切出粘性末端後，插入pLu質粒的BamHⅠ位點，構建成pLu-SAR真核表達載體(見圖3)，pLu質粒由美國Kohwi-Shigematsu,T.實驗室提供，是實驗室常用的質粒，pLu質粒含有青黴素抗性基因(AmpR)和新黴素抗性基因NeoR作為篩選標記，含有SV40啟動子和作為外源基因的蟲螢光素酶報告基因(Luc)，通過測定蟲螢光素酶的活力來確定外源基因的表達高低。pLu質粒表達Luc的活力很低，因此可以作為對照。將蓖麻蠶SAR元件插入pLu質粒的BamHl位點，位於SV40啟動子的5』上遊，如果該SAR元件能夠增強基因的表達，經檢測蟲螢光素酶的活力就提高。
實施例3蓖麻蠶SAR元件增強外源基因在真核細胞中表達活性的檢測將實施例2構建的真核表達載體pLu-SAR，以及作為對照的pLu、作為陽性對照的pAGLu質粒各1.5μg，脂質轉染胺試劑(GIBCO公司產品)6μl，轉染NIH3T3細胞，轉染方法按公司提供的操作手冊進行，NIH3T3細胞數約為2.5×105/60mm平皿，在轉染48小時後用0.7mg/mL G418進行篩選，得到抗G418抗性克隆後，驗證質粒DNA已整合到染色體DNA上，然後檢測蟲螢光素酶活性。質粒DNA整合到染色體DNA上的鑑定方法是用常規方法提取細胞基因組DNA，用PCR檢測標記基因NeoR的存在，PCR條件為94℃45秒，55℃45秒，72℃1分30秒，30個循環，1％瓊脂糖電泳鑑定，出現790bpDNA擴增片段，說明質粒DNA已整合到細胞基因組DNA上。蟲螢光素酶的活性用蟲螢光素酶檢測系統(Promega公司產品)進行測定，方法見Promega公司產品說明書，LB9507螢光計數儀為EGG Berthold公司產品。測定結果如圖4所示，相對螢光強度讀數分別為3T3/pLu為2033；3T3/pAGLu為14028；3T3/pLu-SAR為33954。3T3/pAGLu細胞相對螢光強度比3T3/pLu細胞大七倍，與文獻報導相似(Bode J,et al.,Science,1992,255:195～197),3T3/pLu-SAR細胞其相對螢光強度則增強了十七倍，說明SAR應用於真核細胞表達載體有很強的增強外源基因表達的能力。
權利要求
1．一種蓖麻蠶細胞核骨架結合元件的應用，其特徵在於該元件應用於構建真核基因表達載體，增強外源基因在真核細胞中的表達。
2．如權利要求1所述的蓖麻蠶細胞核骨架結合元件的應用，其特徵在於所述真核基因表達載體是pLu-SAR,SAR位於SV40啟動子的上遊。
全文摘要
一種蓖麻蠶SAR元件長約1,000bp,能特異地與細胞核骨架結合。將該SAR元件應用於真核基因表達載體的構建,即將該SAR插入質粒pLu,構建成pLu－SAR真核基因表達載體,轉染NIH3T3細胞,使外源基因蟲螢光素酶基因在真核細胞中的表達活性比對照提高十七倍。SAR是一個很強的增強子元件,利用SAR組建真核基因表達載體,具有使外源基因穩定高效表達的優點,可進一步應用於基因工程和基因治療的載體構建。
文檔編號C12N15/79GK1223299SQ9812202
公開日1999年7月21日 申請日期1998年11月20日 優先權日1998年11月20日
發明者趙慕鈞, 吳震宇, 何明亮, 李載平 申請人:中國科學院上海生物化學研究所