人工雜交靈芝的生產及其應用的製作方法
2023-10-29 15:48:37
專利名稱：人工雜交靈芝的生產及其應用的製作方法
技術領域：
本發明涉及一種人工雜交靈芝的生產及應用，人工雜交靈芝由松杉靈芝種屬栽培種和靈芝的野外種源分離株進行原生質體融合而成，這種生物工藝育種的雜交菌株稱為「半島靈芝-創意一號」。
背景技術：
靈芝是一組藥用真菌，包括靈芝、松杉靈芝和紫芝。各物種間不能相互雜交，而且核核糖體DNA序列和線粒體的核糖體DNA基因序列也各不相同。靈芝生長的溫度範圍比松杉靈芝廣。有人發現這些藥用真菌可顯示出不同的藥效，它們的生化成分包括多糖和萜烯。天然靈芝在不同的地帶生長並固守著自己的領土。
當前的研究中，人工引進另一野生靈芝種屬的種質，運用原生質體融合技術將兩個基因組帶入同一胞漿內，從而擴大靈芝栽培品種的溫度生長範圍。生長溫度範圍的擴展能促進全年的商業產量，降低季節性氣候地區的投資成本。原生質體融合生物技術有利於引進一個或多個多基因遺傳的性狀以及未知遺傳機制的性狀，和跨越兩個生物物種間的繁殖屏障。該技術的成功仍然離不開以「適者生存」為基礎的自然選擇框架。對倖存者進行人工的精挑細選後，分離出優化的靈芝改良品種。原生質體融合蘑菇的技術雖然在實驗室已經開展起來，但其實際應用尚無報導。這就可能反映實驗室菌種的弊端，例如，不能開發營養突變體商品，和/或低質量人工雜交種，如不育、生長不良和/或結實率低，或雜交失敗。
此發明通過引進野生靈芝的種質，擴大靈芝的生長溫度範圍，以提高靈芝品種的質量，結果，人工雜交使生產靈芝的結果時間縮減了三分之一，而且繁殖出了大量的靈芝蘑菇和靈芝擔孢子。
發明內容
本發明講述了有結實能力的蘑菇雜交種的育種方法，這種雜交種可源自兩個或以上的種屬為親代。(a)兩個或以上的靈芝品種通過原生質體融合法產生雜交種；(b)篩選具有性繁殖能力的雜交種。
本發明為一個以上物種間培育出性質穩定、具有性繁殖能力的蘑菇雜交菌株提供了解決途徑。在蘑菇種植中，多個孢子可參與生成蘑菇種植的接種培養物。沒有設備和培養技術的蘑菇種植者都進行這種「多孢子」接種方法。他們採集蘑菇作為多孢子接種方法的原料。但此方法只限於種內雜交。更重要的是，此種「多孢子」栽培的產量不穩定。因此，蘑菇種植的趨勢仍然是單一栽培。將兩種或更多種的原生質體懸浮液混合起來不會阻礙原生質體融合，但優化品種的篩選成功與否會受到親代品種遺傅差異的影響。種內雜交(所有物種均相同)並不難，然而在種內雜交技術中也可採納傳統的育種方法。
具體來說，本發明為兩個蘑菇種屬間培育有結實能力的雜交種提供了一種目標驅動法，此方法包括兩個步驟(a)用松杉靈芝菌株和靈芝菌株製備原生質體融合液，(b)在存活分離菌株中篩選出具有性繁殖力的優化雜交種。
這裡的目標驅動法用於描述這樣一種情況，即用種植計劃所設定的目標來指導設計和試驗程序。目標是指要培育的人工雜交種的理想特性或改良特性。如果關係到一種以上的特性，那麼首先確定其在目標中的重要性，然後規定試驗工作中按篩選標準確定需優先使用的特性。因此，此方法為目標驅動法。
例如，本研究包含許多物種特徵，期望雜交種是具有穩定的商品開發能力的菌株；一種溫度生長範圍寬、長勢快、有結實能力的靈芝。雜交種的高低溫耐受值的擴展顯著降低了蘑菇生產的投資及經營成本(通過節能)。於是，擴展生長溫度範圍就成了最重要的目標。溫度篩選簡單易行，這種方法為識別生長溫度範圍廣的特種雜交種提供了有力的平臺，而生長迅速的雜交種的識別是通過半定量方法選出篩選培養基中的最大菌落。結實質量及其穩固的能力為下一步的挑選標準。
應用原生質體融合蘑菇的技術雖然在實驗室已經開展起來，但其實際應用尚無報導。這就可能反映出實驗室分離技術的弊端，例如，不能開發營養突變體商品，和/或低質量人工雜交種，如不育、生長不良和/結實少，或雜交失敗。
特別是，無人嘗試用靈芝和松杉靈芝做原生質體融合。
圖形1具體描述了此方法。更具體地說，此方法還包括篩選出的雜交種所具有的分子分類法的基因序列和DNA指紋圖特徵。以及營養和結實生長時期的形態分類學描述。
圖2具體闡明了本發明的篩選過程。
本發明還提出了在上述方法中如何選擇雜交種。具體是指雜交種的長勢迅速，並指雜交種能在較廣的溫度範圍內生長，其生長的溫度範圍為5℃至37℃。
篩選出的雜交種稱為半島靈芝菌株創意一號，按照國際認可的關於專利程序的微生物保存的布達佩斯條約中的規定，於2004年8月24日保藏，保藏編號為CGMCC No.1208。菌種為半島靈芝創意一號，分類命名為靈芝(ganoderma lucidum)保藏單位是中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(CGMCC)，地址在中國北京市海澱區中關村北-條13號，中國科學院微生物研究所，郵政編碼100080。
本發明還通過篩選的雜交菌株，培育出靈芝菇和靈芝擔孢子。
本發明還包括用篩選出的雜交菌株製備提取物、濃縮液、破壁孢子製劑、蘑菇片、菌絲體粉、多糖製劑、孢子油、萜烯製劑、茶、靈芝菇或孢子所釀的酒。
最後，本發明介紹了雜交菌株、靈芝菇或雜交菌株釋放的靈芝擔孢子的不同用途，包括飲食或藥用。
圖1兩物種間人工雜交過程中，運用目標驅動法進行菌株改良。
圖2優化品種的分離方法的篩選原則。
圖3雜交菌株的生長溫度和速度。在完全培養基中，於特定溫度下進行5天避光真菌培養，然後根據菌落半徑的增長大小測量生長速度。對5項重複實驗中的資料作平均數和標準差。在30℃的最佳溫度下，雜交菌株的生長速度是親代栽培種的二倍。與親代栽培種不同，雜交菌株在18℃和37℃時也在生長，但40℃時兩者都會死亡。雜交菌株符號，▲。親代栽培種符號，■。
圖4應用隨機引物的隨機擴譜多形性DNA標記法製作的雜交菌株和親代的DNA指紋圖。隨機引物PP4L，PS3L，PS1L，POM和UK。Lane M，GeneRulerTM100bp DNA LadderPlus，(MBI Fermentas)；H，雜交菌株；C，栽培種親代；W，野生種親代。
圖5雜交菌株核核糖體DNA基因的核苷序列(序列號1)。
圖6雜交菌株線粒體核糖體DNA基因的核苷序列(序列號2)。
圖7相差光鏡照片顯示雜交菌株的營養菌絲體在相鄰管絲細胞隔膜處產生一個鎖狀連合。具有較厚細胞壁的厚垣孢子位於末端或中間位置(在兩細胞之間)。
圖8靈芝雜交菌株的子實體(菇)。(a)杆狀原基。(b)生有中央或側莖的菌蓋具同心鮮紅色環。(c)完全成熟的蘑菇被釋放出的褐色擔孢子覆蓋而失去外表的光澤。
圖9雜交菌株的擔孢子。(a)兩個擔子的電子掃描顯微圖片，每個擔子產生四個擔孢子。(b)光鏡照片顯示雙層細胞壁的、褐色的、橢圓形的擔孢子。(c)電子掃描顯微圖片顯示某些擔孢子的細胞外壁薄弱出現「孔」狀。
下面例證能幫你更好地了解本發明。生物工藝工作者根據下面詳盡的方法和結果的討論很容易意識例證的描述闡明了本發明。
具體實施例方式松杉靈芝和靈芝通過原生質體融合法的人工雜交。
(a)兩個親本為營養菌絲體，將其培育在完全培養基(CM)肉湯中，成份包括MgSO4·7H2O，0.5；KH2PO4，0.46；K2HPO4，1；peptone，2；D-glucose，20(g/L)，避光、溫度為28℃、轉速為120rpm條件下培養，並記錄時間。採用無菌技術收穫生長活躍的菌絲體，用直徑為1毫米的鎳網過濾，並用滲透緩衝液衝洗(0.6M的蔗糖溶液)。然後，將菌絲體培養在每毫升含10毫克溶壁酶(中國廣東微生物學院)的滲透緩衝液中1至3小時，用酶將真菌細胞壁溶解掉。採用相差光鏡照像法對生成的原生質體用血球計計算數量。
等到釋放出足夠的原生質體後，用一個塞著玻璃棉柱的注射器將未消化的菌絲體過濾出來，在2000xg的轉速下，離心濃縮10分鐘。取原生質體的上清液，與細胞碎片分離；在6000xg的轉速下離心15分鐘，獲得濃縮的原生質體小球。兩次獲得的原生質體都重新加入滲透緩衝液中，與30％聚氧乙烯(MW 4,000；w/v)在0.01M的氯化鈣溶液中混合，避光28℃條件下放置一小時。然後，將原生質體混合液和再生培養基放入滲透型緩衝液中進行細胞壁修復，此培養基包含D-葡萄糖，4；酵母提取物，4；麥精，10；和瓊脂，15(g/L)。在避光28℃條件下培養5天後，將100個肉眼可見菌落作為純化的分離菌株取出並轉移到完全培養基中。
在兩個極端的生長溫度(18和35℃)下，將純化的分離菌株在完全培養基上培養5天，完成理想雜交種的篩選。兩個親本同時經過平行檢測。作5項重複實驗。選擇能在兩個極端溫度下存活並且生長速度超過其親代品種的雜交菌株(如圖3中的演示)。取5個篩選出的分離菌株，在蘑菇種植廠中測試有性繁殖(結實)的能力和產量，香港中文大學(CUHK)和半島創意有限公司分別重複試驗三次。香港中文大學的試驗中每分離菌株共產30袋，而在半島創意有限公司的工作坊則為大批量生產(每分離菌株種180袋)。
結實測試在高壓蒸汽滅菌的塑膠袋中進行，每個袋中包括500克的培養物，培養物中成份含有鋸屑，60；粉碎的椰子纖維，20；小麥麩，14；蔗糖，5；和石灰，1。在香港中文大學生物學學系的蘑菇養殖廠，菌絲體在避光28℃的條件下培育。而在半島創意有限公司的工作坊中，在10到33℃的室溫下培育，未對溫度加以控制。當菌種生長完全覆蓋培養物時(根據分離菌株性能通常需要25至45天)，就會被轉移到蘑菇種植廠的結實環境艙中。靈芝菇的生長條件為12小時光照和12小時避光的光周期，85％或更高的相對溼度、溫度為28℃。工作坊的結實試驗的光周期為自然光周期，溫度波動在15到33℃之間，相對溼度為80％或更高。選出一個高產、結實能力穩定的純種菌株。
(b)生物工藝雜交菌株的特徵■通過隨機擴增多態性DNA標記法標記的DNA指紋圖用液氮冷藏上述的肉湯培養基的菌絲體，從中提取和純化基因組DNA。DNA樣品的濃縮純化液經分光光度法測量，其OD260∶OD280吸收率比值應超過1.8，同時要採用溴化乙啶著色法，通過瓊脂糖膠電泳進一步檢測其濃度和純度。
下面為5對隨機引物的序列UK5』-CAATTTCAATGTTCCGGACC-3』(SEQ ID No.3)(序列號，3)3』-CAGTTGGTGGAAGGAAAGGA-5』(SEQ ID No.4)(序列號，4)PS3L5』-GAGCAGGGCAAGCGTTATAG-3』(SEQ ID No.5)(序列號，5)3』-CTATTCGAAACGCGGACAAT-5』(SEQ ID No.6)(序列號，6)PS1L5』-GAATGCGGTGCTTCCTACTG-3』(SEQ ID No.7)(序列號，7)3』-CCGACAGCTAAAGCGGGTAT-5』(SEQ ID No.8)(序列號，8)POM5』-AGCCGTATCTTTGCCTCAGA-3』(SEQ ID No.9)(序列號，9)3』-ATCGTCTCGAGCGAACAAGT-5』(SEQ ID No.10)(序列號，10)PP4L5』-GTCGAAATTCATGGCAAGGT-3』(SEQ ID No.11)(序列號，11)3』-CAGTATTGCGACGGTCTCAG-5』(SEQ ID No.12)(序列號，12)反應液中含有1x聚合酶鏈反應緩衝液II(普金埃爾莫希特斯公司)，3.5mM氯化鎂，四種核甘酸各200mM(普金埃爾莫希特斯公司)，1M引物和2.5U的TaqDNA多聚酶(寶靈曼公司)，25ng(納克)的基因組DNA(威爾斯和麥克萊倫，1990；威廉等，1990；趙等，1993，1996)。加熱程序為36個嚴格的循環周期，每個周期包括，94℃2分鐘，45℃1分鐘，72℃2分鐘，最後一個循環後72℃延遲10分鐘。
以沒有DNA的對照標準同時進行平行檢測和重複試驗以確定實驗結果的一致性和控制性。用瓊脂糖膠電泳做出DNA指紋圖，並通過凝膠成像系統捕捉圖像(BIO-RAD凝膠掃描儀，1000型)。
圖4表明，與原生質體融合法中使用的親代品種的DNA指紋圖相比，雜交菌株的DNA指紋圖有所不同。
■特殊的聚合酶鏈反應(PCR)和DNA序列真菌特異性引物ITS(核糖體內轉錄間隔區)4和ITS5用於擴增核核糖體DNA區(ITS1，5.8S和ITS2)，另一對引物用於線粒體核糖體DNA擴增，反應在PTC-100TM型熱循環儀上進行(MJ科研公司)。核引物序列如下分別為5』-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3』(序列號，13)和5』-GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG-3』(序列號，14)。線粒體引物序列如下5』CAGCAGTCAAGAATATTAGTCAATG-3』(序列號，15)and 5』-GCGGATTATCGAATTAAATAAC-3』(序列號，16)。總量為10微升的反應液包括1X反應緩衝液VI，2.5mM氯化鎂，四種核甘酸各10mM，每個引物為10pM，2U的Thermoprime plus Taq DNA聚合酶(AB基因)以及大約100納克的基因組DNA。PCR的程序包括95℃1分鐘；60℃1分鐘；70℃1分鐘，進行39個周期，最後一個循環後70℃延遲10分鐘。
PCR擴增片段將進一步用GENECLEANII KIT核酸純化系統進行純化。在加入玻璃牛奶懸浮液之前，將三份碘化鈉儲備溶液加入PCR混合液中，充分混合5分鐘，離心15秒形成玻璃牛奶/DNA化合物小球。然後，用20微升的New Wash溶液洗滌三次並真空乾燥。用8微升超純淨水重新溶解乾燥後的小球，進行離心前將混合液放置5分鐘。收集純DNA上清液進入循環，用不同的螢光染料標記擴增的DNA，此過程在DNA測序儀上進行(PE應用生物系統公司)。混合液包括2微升純DNA模板；目標基因的正向引物2微升；dRhodamine Terminator 4微升(PE應用生物系統公司)和超淨化水，總量為10微升。加熱程序如下共36個周期，95℃30秒進行DNA變性，然後退至50℃，共30s，最後在70℃時延長1分鐘。
然後，放入70％乙醇(含0.5mM的氯化鎂)沉澱DNA產物，溫度為-20℃，共2-3小時。14000xg轉速下離心15分鐘，接著用冷藏的70％乙醇洗滌離心後的小球並進行真空乾燥，然後加入12微升的模板抑制劑(PE生物系統)，將乾燥後的小球再懸浮起來。簡單離心後，收集濃縮後的樣本。然後將樣本懸浮於ABI Prism 310型基因分析儀中(PE生物系統)，用序列分析軟體3.0版進行處理(PE生物系統)。
圖5和圖6顯示的是雜交菌株的核苷酸序列。經過驗證的人工雜交菌株存放在中國香港中文大學的生物系。這種靈芝分離菌株是一種雙核體(即高等生物的雙倍體)，不是通過原生質化過程產生的單倍體，並具有鎖狀連合(圖7)。與栽培種親代品種相比，其結實時間只需一個半月，將生產周期迅速降低。雜交菌株具備正常的有性繁殖(結實)能力，還能產生擔孢子(圖8和圖9)。
以下為參考文獻1.作者不詳1998.中國藥用真菌學.北京醫科大學和中國國家醫科大學聯合出版北京.
2.額達斯科懷哥，J.E.和吉爾伯特森，R.L.1986.靈芝複合種的靈芝和松杉靈芝的栽培研究及性遺傳.真菌學78，694-705.
3.額達斯科懷哥，J.E.和吉爾伯特森，R.L.1988.靈芝複合種的幾個物種的擔孢子，菌褶囊狀細胞和擔子果特徵.真菌學80，493-507.
4.張，K.W.2001.病原靈芝的整體研究方法.碩士論文.香港中文大學香港.
5.張，W.M.W.，衛，W.S.，朱，P.W.K.，趙，S.W.和葉，N.P.2000.靈芝提取物激活有絲分裂原激酶並誘導大鼠PC12神經元腫瘤細胞的分化.FEBS通訊24409，1-6.
6.趙，S.W.，陳，Y.H.，羅，S.C.，張，K.T.摩爾，D.1998.鎘和錳與有益的鈣元素相比會降低食用鳳尾菇的產量和營養價值.真菌學研究102，449-457.
7.趙，S.W.，張，K.W.，羅，W.M.，歐陽，H.W.，馬，S.Y.和朱，W.L.2000a.香港靈芝對環境反應的發育可塑性.食用菌栽培與科學.vol.2.ed.範格林斯溫L.J.L.D.，pp.757-761，布魯克菲爾德實驗室A.A.鮑奇馬鹿特丹.
8.趙，S.W.，關，H.S.鄭，S.C.1993.隨意引子聚合酶鏈反應在蘑菇，主要是香菇，的分子領域研究中的應用.食用蘑菇的遺傳與種植，eds.張，S.T.，巴斯威爾，J.A.和麥爾斯，P.G.，pp.265-283.戈登和布瑞奇科學出版社.
9.趙，S.W.，羅，S.C.，程，M.L.，張，K.W.和陳，M.J.2000b.21世紀蘑菇開發的主題續性發展，廢物處理和保育.應用和普通微生物學雜誌46，269-282.
10.趙，S.W.，馬，A.M.，林，F.C.和摩爾，D.1996.聚合酶鏈反應所揭示的中國椎茸(香菇)栽培的遺傳均同質性.真菌學研究100，1393-1399.
11.趙，S.W.，王，Z.M.和摩爾，D.2000c.靈芝提取物的營養價值以及採用小鼠淋巴細胞的單細胞電泳分析系統對提取物的遺傳毒性和抗遺傳毒性進行評估.食品及化學品毒理學38，173-178.
12.漢森，L.E.和霍威爾，C.R.2002.木黴菌之間原生質體融合的生物控制效能及其他特徵.真菌學研究106，321-328.
13.紅，S.-G.；程，W.和張，H.-S.2002.多孔菌的線粒體小分子核糖體DNA的擴增及其在系統進化分析的用途.真菌學94，823-833.
14.胡，H.，安，N.S.，楊，X.，李，Y.S.和康，K.S.2002.靈芝提取物在MCF-7人類乳腺癌細胞中誘導細胞循環終止和凋亡.國際癌症雜誌102，250-253.
15.姜，J.，斯利佛瓦，V.，瓦勒徹衛科瓦，T.，哈維，K.和斯利瓦，D.2004.靈芝抑制增殖及誘導人類前列腺癌細胞PC-3凋亡.國際腫瘤學雜誌24，1093-1099.
16.關，H.S.，趙，S.W.，彭，K.M.和鄭，S.C.1992.採用聚合酶鏈反應方法進行香菇菌株分型.實驗真菌學16，163-166.
17.劉，W.C.1985杏鮑菇的種系間雜交的原生質體融合法研究.博士論文，香港中文大學香港.
18.馬，S.Y.2002.野生靈芝群體的生態和環境汙染研究.碩士論文.香港中文大學香港.
19.蒙卡佛，J.M.和利瓦登.L.1997.靈芝的種群研究.真菌類群奧斯陸.
20.蒙卡佛，J.M.，王，H.F.和許，R.S.1995.靈芝的基因發展系統與傳統的分類特徵相比較.真菌學研究99，1489-1499.
21.佩貝迪，J.F.和福克斯，H.M.1993.原生質體技術與食用蘑菇.食用蘑菇的遺傳與種植，eds.張，S.T.，布斯威爾，J.A.和麥爾斯，P.G.，pp.125-155.戈登和布瑞奇科學出版社.
22.利瓦登，L.2000.新熱帶區多孔菌的研究2新熱帶區漆狀菌蓋靈芝的初步探討.真菌學92，180-191.
23.王，H.X.，吳，T.B.和趙，S.W.2004.藥用靈芝菇子實體內的獨特核糖核酸酶.生物化學與生物物理學的研究交流314，519-522.
24.王，Y.P.，索尼，K和魯德夫，E.2003.通過甘藍型油菜和海甘藍之間的不對稱體細胞雜交形成的高芥酸油菜籽的發展.遺傳學的理論及應用106，1147-1155.
25.威爾斯，J.和麥克萊倫，M.1990.用隨機引物PCR法進行基因組指紋識別.核酸研究18，7213-7218.
26.懷特，T.J.，布魯斯，T.，李，S.和泰勒，J.1990.利用系統發生學進行真菌核糖體RNA基因序列的控制與擴增.PCR協議指導方法和應用，eds河內島，M.A.，格爾凡德，D.H.，史連斯基，J.J.和懷特，T.J.，pp.315-322.學術出版社聖地牙哥.
27.威廉，J.G.K.，庫貝利克，A.R.，利瓦克，K.J.，利佛斯基，J.A.廷吉，S.V.1990.隨機引物的DNA多形性擴增作為基因標記物的優勢.核酸研究18，6531-6536.
28.彥G.C.和吳J.Y.1999.松杉靈芝提取物的抗氧和自由基清除特性.食品化學65，375-379.
29.柳，Y.B.，李，K.H.和金，B.G.2002.通過隨機複製多型性DNA標誌親和和不親和的鮑魚菇屬與靈芝屬的原生質體融合物.國際藥用蘑菇雜誌4，147-157.
30.袁，Y.，郭，X.，何，X.，張，B.和呂，S.2004.高產量、含鐵豐富的酵母菌株的育種與酵母細胞中鐵分布的研究.生物工藝學通訊26，311-315.
31.趙，J.1994可食性蘑菇原生質體融合產物的分離、識別和應用.博士論文，香港中文大學香港.
32.趙J.D.1989.中國靈芝菌科.真菌志132，1-176.J.克拉姆柏林.
序列表110趙紹惠120人工雜交靈芝的生產及其應用160162101211551212DNA213松杉靈芝和靈芝雜交菌株220
221Unsure222(1)..(551)4001tcgagttttg actgggttgt agctggcctc ccgaggcatg tgcacgccct gctcatccac 60tctacacctg tgcacttact gtgggcttca gacgtcgtga agcgggctct ttacggagct 120tgtagagcgt gtctgtgcct gcgtttacca caaactctat aaagtattag aatgtgtatt 180gcgatgtaac gcatctatgt acaactttca gcaacggatc tcttggctct cgcatcgatg 240aagaacgcag cgaaatgcga taagtaatgt gaattgcaga attcagtgaa tcatcgaatc 300tttgaacgca ccttgcgctc cttggtattc cgaggagcat gcctgtttga gtgtcatgaa 360atcttcaact tacaaacctt tgcgggtttg taggcttgga cttggaggct tgtcggccgt 420gtttcggtcg gctcctctta aatgtattag cttgattcct tgcggatcgg ctctcggtgt 480gataatgtct acgccgtgac cgtgaagcgt tttggcgagc ttctaaccgt ctcgtttgtg 540agacagcttt a 551
2102211536212DNA213松杉靈芝和靈芝雜交菌株220
221Unsure222(1)..(536)4002aattttttca aattcatgat gtcgtaaggg aaaataatga taatacctta ctatgagtgt 60cgtccaaatc tggtgccaga agactcggta agaccagaga cgcaaacgtt aatcatcata 120aacaggcgta aagggtttgt aggcagcttt tataggattc tttttaaaga taatctaaat 180tgaaagctag aatcaaaaag aggttatagt gtataacgcc tagaggaggg ctgatatccg 240tagatcctag gcagaatact cagggcgaag gccactttcc actaatgatt gacgctgaga 300tagcggagta actccgtcta aatattccat cttattagag ttcgccttaa taaacgagca 360ttggtaacaa tctagtttaa agcttaaggt ataaactaaa taatattatt tggtttgaac 420tgtcttctat ggttagagaa atcgaatcta tgtcttaaag gttttattaa ttagtatttt 480cacgagtcct tggtgaattt aagatggaca aataattata aaattaaagt aggaac 536210321120212DNA213N/A220
221Unsure222(1)..(20)4003caatttcaat gttccggacc20210421120212DNA213N/A220
221Unsure222(1)..(20)4004cagttggtgg aaggaaagga20210521120212DNA213N/A220
221Unsure222(1)..(20)4005gagcagggca agcgttatag20210621120212DNA213N/A
220
221Unsure222(1)..(20)4006ctattcgaaa cgcggacaat20210721120212DNA213N/A220
221Unsure222(1)..(20)4007gaatgcggtg cttcctactg20210821120212DNA213N/A220
221Unsure222(1)..(20)4008ccgacagcta aagcgggtat20210921120
212DNA213N/A220
221Unsure222(1)..(20)4009agccgtatct ttgcctcaga202101021120212DNA213N/A220
221Unsure222(1)..(20)40010atcgtctcga gcgaacaagt202101121120212DNA213N/A220
221Unsure222(1)..(20)40011gtcgaaattc atggcaaggt20
2101221120212DNA213N/A220
221Unsure222(1)..(20)40012cagtattgcg acggtctcag202101321120212DNA213真菌220
221Unsure222(1)..(20)40013tcctccgctt attgatatgc202101421122212DNA213真菌220
221Unsure222(1)..(22)40014
ggaagtaaaa gtcgyaacaa gg 222101521125212DNA213真菌220
221Unsure222(1)..(25)40015cagcagtcaa gaatattagtcaatg 252101621122212DNA213真菌220
221Unsure222(1)..(22)40016gcggattatc gaattaaata ac 2權利要求
1一種製備可結實蘑菇雜交種的人工方法，親代為兩種或兩種以上的物種，其特徵在於，包括以下步驟a)融合製備的松杉靈芝和靈芝的原生質體，然後培養原生質體混合物成可存活的分離菌株；b)從可存活的分離菌株中篩選出可結實雜交種。
2權利要求1所述的方法，是目標驅動法，其中的設計和試驗程序都是由種植程序的目標指導的。
3權利要求1所述的方法，具體步驟列在圖1中。
4權利要求1所述的方法，進一步的特徵是，篩選出的雜交種具有分子分類法的基因序列和DNA指紋圖譜特徵，以及營養和結實生長時期的形態分類學描述。
5權利要求1所述的方法，其中雜交種的篩選過程由圖2列出。
6用權利要求1所述的方法篩選的雜交菌株。
7權利要求6的雜交菌株，其特徵在於，生長快速，生長溫度範圍廣。
8權利要求6的雜交菌株，為半島靈芝菌株創意一號，保藏編號為CGMCC No.1208。
9由權利要求6-8任一項的雜交菌株產生的靈芝菇或靈芝擔孢子。
10權利要求9的靈芝菇或靈芝擔孢子的產物，提取物、濃縮液、破壁孢子製劑、蘑菇片、菌絲體粉、多糖製劑、孢子油、萜烯製劑、茶、釀酒產物。
全文摘要
本發明涉及一種人工雜交靈芝的生產及應用，人工雜交靈芝由工藝種植的松杉靈芝種屬(栽培種)(Ganoderma tsugae)和靈芝(Ganoderma lucidum)的野外種源分離株進行原生質體融合而成，這株生物工藝育種的雜交菌株稱為「半島靈芝」，菌株號為「創意一號」。在鋸屑－椰子纖維培養基上，此雜交菌株可在一個半月內繁殖產生靈芝菇和擔孢子，在18℃和37℃都可生長，通過隨機擴增多態性DNA(random amplified polymorphic DNA markers，RAPD；隨機複製多型性DNA)標記技術，此雜交菌株顯示了其獨特的DNA指紋圖，標記中使用的隨機引物(primer，引子、引信)包括PP4L，PS3L，PS1L，POM和UK，此外其核核糖體DNA基因序列和線粒體核糖體DNA基因序列不同於親代栽培種的序列。
文檔編號A01G1/04GK1742555SQ20041007408
公開日2006年3月8日 申請日期2004年9月3日 優先權日2004年9月1日
發明者趙紹惠 申請人:趙紹惠