檢測單增李斯特菌和金黃色葡萄球菌的試劑盒及其應用的製作方法

2023-10-29 16:58:27

專利名稱：檢測單增李斯特菌和金黃色葡萄球菌的試劑盒及其應用的製作方法
技術領域：
本發明涉及一種檢測試劑盒，尤其涉及一種同時檢測單增李斯特菌和金黃色葡萄球菌的雙重螢光定量PCR試劑盒，屬於單增李斯特菌和金黃色葡萄球菌的檢驗檢疫領域。
背景技術：
隨著世界經濟全球化、貿易自由化和食品國際貿易的迅速發展，食品安全已成為事關人民健康和構建和諧社會的重大戰略問題。而食源性疾病在食品安全問題中又佔據非常重要的地位。WHO將食源性疾病定義為存在於自然界中的有汙染性或毒性的因子(包括病毒、寄生蟲、細菌和農業、環境、危險化學品以及生物毒素)通過進食而進入身體引起的疾病(任玉華，田海霞.食品安全與食源性疾病[J].職業與健康，2005，21 (12)1977-1978.)。爆發的食源性疾病中多數是由致病性細菌引起(張敏，童華榮，張麗平.動 物性食品安全現狀及其對策[J].食品工業科技，2005 (5) :182-186)。其中，單增李斯特菌和金黃色葡萄球菌是比較重要的兩種食源性致病菌(劉圓圓.沙門氏菌、金黃色葡萄球菌及單增李斯特菌的同步快速檢測方法的研究[D].華南理工大學，2010，1-86)。單增李斯特菌是一種能引起人畜共患的致病菌，致死率高達30%，對於免疫缺陷病人致死率甚至高達70%。該菌在歐美日等發達國家的危害程度甚至超過沙門氏菌食物中毒。根據美國疾病控制中心的研究報告估計，美國每年有7600萬人食物中毒，約有5000人死於食物中毒，其中單增李斯特菌、出血性大腸桿菌0157:H7和多種抗生素耐藥性鼠傷寒沙門氏菌引起的食源性疾病最為突出(張蘭榮，唐一清，甄博捃，等.通州區6類食品單增李斯特菌汙染狀況及分子流行病學特徵調查研究[J].中國衛生檢驗雜誌，2007，17 (12)2306-2308)。WHO關於單增李斯特菌食品中毒報告中指出，各類產品中，新鮮肉類及肉類製品中含有單增李斯特菌的比例最高(何欣榮等，2002)。金黃色葡萄球菌是人和動物的常見病原菌，在自然界中無處不在。在美國，由金黃色葡萄球菌引起的食物中毒佔整個細菌性食物中毒33%，加拿大則更多，佔45%。中國每年發生的此類中毒事件也非常多。2003年中國食源性疾病暴發的監測資料分析顯示，在微生物食源性疾病爆發中，金黃色葡萄球菌佔9. 4%，僅次於副溶血弧菌和變形桿菌。且報導顯示，引起食源性疾病的動物類食品中以肉及肉製品最多，高達68% (劉秀梅，陳豔，樊永祥，等.2003年中國食源性疾病暴發的監測資料分析[J].衛生研究，2006，35 (2)201-204)。有鑑於此，開展食品中單增李斯特菌和金黃色葡萄球菌同步、快速檢測方法的研究具有重要意義。目前較為常用的檢測方法是傳統分離鑑定方法和普通PCR方法。但傳統的分離鑑定方法，操作繁瑣，耗時耗力，不能滿足快速檢測的需求(Churchill R L T,LeeHiHall J C. Detection of Listeriamonocytogenes and the toxin listeriolysin 0 infood. Journal of M icrobiological Methods，2006，64 (2) :141 170)。常規 PCR 法需要瓊脂糖凝膠電泳後續處理，費時費力，還增加了對環境造成汙染的可能性。迄今為止，尚缺乏一種靈敏性高、穩定性好的能夠同時檢測食品中單增李斯特菌和金黃色葡萄球菌的雙重螢光定量PCR試劑盒及檢測方法。

發明內容
本發明的目的之一是提供一種同時檢測單增李斯特菌和金黃色葡萄球菌的雙重螢光定量PCR試劑盒；本發明的目的之二是提供一種同時檢測單增李斯特菌和金黃色葡萄球菌的雙重螢光定量PCR方法；本發明的上述目的是通過以下技術方案來實現的一種同時檢測單增李斯特菌和金黃色葡萄球菌的雙重螢光定量PCR試劑盒，包括Taq DNA聚合酶，螢光定量PCR擴增緩衝液，滅菌去離子水，一對擴增單增李斯特菌的上、下遊引物和一條檢測單增李斯特菌的TaqMan探針，一對擴增金黃色葡萄球菌的上、下遊引物和一條檢測金黃色葡萄球菌的TaqMan探針。 其中，所述的一對擴增單增李斯特菌的上、下遊引物的核苷酸序列分別為SEQ IDNo. I和SEQ ID No. 2所示，所述的一條檢測單增李斯特菌的TaqMan探針的核苷酸序列為SEQ ID No. 3所示，在SEQ ID No. 3所示探針的5'端連接有螢光報告基團，3'端連有非螢光淬滅基團；優選的，所述的螢光報告基團是FAM，所述的非螢光淬滅基團是Eclipse。所述的一對擴增金黃色葡萄球菌的上、下遊引物的核苷酸序列分別為SEQ IDNo. 4和SEQ ID No. 5所示，所述的一條檢測金黃色葡萄球菌的TaqMan探針的核苷酸序列為SEQ ID No. 6所示，在SEQ ID No. 6所示探針的5'端連接有螢光報告基團，3^端連有非螢光淬滅基團；優選的，所述的螢光報告基團是J0E，所述的非螢光淬滅基團是Eclipse。JOE的吸收發射波長與FAM的吸收發射波長不交叉，兩條探針可用Mx3005P螢光定量PCR儀同時檢測，且螢光信號互不影響。此外，兩條探針3'端選用Eclipse非螢光淬滅基團，本身不產生螢光且淬滅效率更高，大大降低了本底信號的強度。所述的螢光定量PCR擴增緩衝液中含有25mM的dNTPs和25mM的Mg2+ ；為了達到更好的檢測效果，上述試劑盒中還可含有單增李斯特菌標準質粒和金黃色葡萄球菌標準質粒作為陽性標準模板，所述的單增李斯特菌標準質粒和金黃色葡萄球菌標準質粒可以通過各種商業途徑購買得到，本領域技術人員也可按照本領域的常規技術手段製備得到單增李斯特菌標準質粒和金黃色葡萄球菌標準質粒；此外，本發明試劑盒中還可含有陰性質控標準品。基於目前尚缺乏用於食品中單增李斯特菌和金黃色葡萄球菌同步且定量的檢測方法，本發明的另一目的是提供一種同時檢測食品中單增李斯特菌和金黃色葡萄球菌的雙重螢光定量PCR方法，實現對單增李斯特菌和金黃色葡萄球菌的同步、快速、特異、定量的檢測，為食品中食源性致病菌的高通量檢測奠定基礎。本發明的另一目的是通過以下技術方案來實現的一種同時檢測食品中單增李斯特菌和金黃色葡萄球菌的雙重螢光定量PCR方法，包括以下步驟(I)提取待檢測食品的DNA; (2)在PCR擴增管中加入以下試劑建立PCR擴增體系所提取的待檢測食品的DNA，Taq DNA聚合酶，螢光定量PCR擴增緩衝液，滅菌去離子水，一對擴增單增李斯特菌的上、下遊引物和一條檢測單增李斯特菌的TaqMan探針，一對擴增金黃色葡萄球菌的上、下遊引物引物和一條檢測金黃色葡萄球菌的探針；(3)將所建立的PCR擴增體系在螢光定量PCR儀上進行PCR擴增，根據擴增曲線、標準曲線或/和Ct值對樣品中的單增李斯特菌和金黃色葡萄球菌進行定性分析和定量分析。至於如何對單增李斯特菌和金黃色葡萄球菌進行定性和定量分析，這些分析方法或手段屬於本領域的常規技術手段，為本領域技術人員所公知道。作為參考，本領域技術人員可採用以下方式進行定性分析和定量分析定性分析首先設定閾值；閾值樣本的螢光背景值和陰性對照的螢光值，手動設置的原則要大於樣本的螢光背景值和陰性對照的螢光最高值，同時要儘量選擇進入指數期的最初階段，並且儘量使回歸係數最大；也就是在擴增曲線的指數期劃一條直線，這條線就叫閾值線；例如，選擇螢光檢測模式為FAM和J0E，基線調整取3-15個循環的螢光信號設為閾值；如果PCR擴增曲線超過設定的閾值即為陽性，即說明檢測到目的菌。如果PCR擴增曲線在閾值線以下即為陰性，即說明沒有檢測到單增李斯特菌和金黃色葡萄球菌。定量分析首先建立標準曲線將陽性標準模板進行梯度稀釋後進行PCR擴增，以標準陽性模板的對數值為橫坐標，以Ct值為縱坐標建立標準曲線(Ct值PCR擴增過程中 擴增產物的螢光信號達到設定的閾值時所經過的擴增循環次數。)。 將待擴增的樣品與陽性標準模板相同的PCR擴增體系和擴增條件進行PCR擴增，在螢光定量PCR中，對整個PCR反應擴增過程進行實時監測和連續地分析擴增相關的螢光信號，隨著反應時間的進行，監測到的螢光信號的變化可以繪製成一條曲線。在PCR反應早期，產生螢光的水平不能與背景明顯地區別，而後螢光的產生進入指數期，在指數期，PCR每進行一個循環，產生的DNA拷貝數呈2倍指數方式增加，隨著反應循環數的增加，最終PCR進入平臺期，因此可以在PCR反應處於指數期的某一點上來檢測PCR產物的量，最後通過標準曲線和Ct值對檢測樣品進行定量分析。所述的螢光定量PCR擴增緩衝液中含有25mM的dNTPs和25mM的Mg2+ ；為了達到更好的分析效果，所述的擴增體系中還可加入單增李斯特菌標準質粒和金黃色葡萄球菌的標準質粒作為標準模板(陽性對照)；此外還可以在上述擴增體系中加入陰性質控標準品(例如沙門氏菌等)。其中，所述的一對擴增單增李斯特菌上、下遊引物引物的核苷酸序列分別為SEQID No. I和SEQ ID No. 2所示，所述的一條檢測單增李斯特菌的TaqMan探針的核苷酸序列為SEQ ID No. 3所示，在SEQ ID No. 3所示探針的5'端連接有螢光報告基團，3^端連有非螢光淬滅基團；優選的，所述的螢光報告基團是FAM，所述的非螢光淬滅基團是Eclipse。所述的一對擴增金黃色葡萄球菌的上、下遊引物引物的核苷酸序列分別為SEQ IDNo. 4和SEQ ID No. 5所示，所述的一條檢測金黃色葡萄球菌的TaqMan探針的核苷酸序列為SEQ ID No. 6所示，在SEQ ID No. 6所示探針的5'端連接有螢光報告基團，3^端連有非螢光淬滅基團；優選的，所述的螢光報告基團是J0E，所述的非螢光淬滅基團是Eclipse。如何確定擴增體系中各組分的用量或體積，本領域技術人員可根據經驗並視實際情況進行調配，均屬於本領域技術人員所熟練掌握的技術，各種組分的用量高低均不影響本發明的實現，作為參考，所建立的擴增體系中各組分的用量可參考以下用量所提取的待檢測食品的DNA2-6體積，Taq DNA聚合酶2_15體積，螢光定量PCR擴增緩衝液O. 1-1體積，滅菌去離子水1-10體積，擴增單增李斯特菌的上遊引物O. 1-1. O體積，擴增單增李斯特菌的下遊引物O. 1-1. O體積，檢測單增李斯特菌的探針O. 5-1. 5體積，擴增金黃色葡萄球菌的上遊引物0.1-1. O體積，擴增金黃色葡萄球菌的下遊引物O. 1-1. O體積，檢測金黃色葡萄球菌的探針O. 5-1. 5體積；優選的，各組分的體積如下所提取的待檢測食品的DNA 4 μ L，50 X TaqDNA聚合酶12. 5 μ L，50 X螢光定量PCR擴增緩衝液O. 5 μ L，滅菌去離子水4. O μ L，擴增單增李斯特菌的上遊引物O. 5 μ L，擴增單增李斯特菌的下遊引物O. 5 μ L，檢測單增李斯特菌的探針I. O μ L，擴增金黃色葡萄球菌的上遊引物0.5 μ L，擴增金黃色葡萄球菌的下遊引物O. 5 μ L，檢測金黃色葡萄球菌的探針l.OyL;其中，所述的擴增單增李斯特菌的上、下遊引物的濃度優選為10 μ M ;所述的擴增金黃色葡萄球菌的上、下遊引物的濃度優選為10 μ Μ。步驟(3)中所述的擴增優選在以下參數條件下進行PCR擴增95°C預變性30S，95°C變性5S，56°C退火20S，72°C延伸15S，擴增40個循環。

本發明首先針對單增李斯特菌的特異毒力基因hlyA和金黃色葡萄球菌的特異毒力基因nuc分別設計特異性引物和TaqMan探針，在此基礎上，分別構建單增李斯特菌和金黃色葡萄球菌的單一螢光定量PCR檢測方法，以此來鑑定所設計的特異性引物和探針的特異性和敏感性，然後進一步建立單增李斯特菌和金黃色葡萄球菌的雙重螢光定量PCR檢測方法，製備標準曲線，分析反應的敏感性。試驗結果顯示，本發明所建立的兩條標準曲線的相關性較好，相關係數分別範圍O. 997和O. 998，且單增李斯特菌和金黃色葡萄球菌的最低檢出限分別為19. 5拷貝/ μ L和18. 7拷貝/ μ L，本發明實現了對這兩種食源性致病菌的同步、快速、定量檢測。本發明利用了多重螢光實時定量PCR的原理，兼顧了 PCR技術的高效性、探針技術的高特異性、光譜技術的高敏感性和高精確性等優點，達到了同步且定量檢測單增李斯特菌和金黃色葡萄球菌的目的，為提高食品監管效率和水平，預防食物中毒和食源性疾病的發生提供保障，同時也為提高國內生產加工環節食品安全風險監測、分析與風險預警的能力和水平奠定基礎。


圖I不同退火溫度下單增李斯特菌PCR擴增產物；M DNA分子量標準；1_10退火溫度分別為 51. 6。。、52· 2。。、53· 4°C>54. 8°C>56. 2°C>57. 7°C>59. I °C>60. 6°C>61. 8°C>62. 4°C ；11陰性對照。圖2不同退火溫度下金黃色葡萄球菌PCR擴增產物；M DNA分子量標準；1_10退火溫度分別為 51. 6 0C >52. 20C >53. 40C >54. 80C >56. 2 0C >57. 7°C >59. I °C >60. 6°C >61. 8 °C >62. 4°C ；11陰性對照。圖3重組質粒pMD18_hlyA鑑定結果；M DNA分子量標準；I重組質粒pMD18_hlyA ；2陰性對照。圖4重組質粒pMD18_nuc鑑定結果；M DNA分子量標準；1重組質粒pMD18_nuc ；2陰性對照。圖5質粒pMD18_hlyA的測序結果與原始序列比對圖。圖6質粒pMD18_nuc的測序結果與原始序列比對圖。圖7單增李斯特菌螢光定量PCR特異性分析；橫坐標擴增循環數(Cycles);縱坐標突光強度(fluorescence) (dRn)。圖8金黃色葡萄球菌螢光定量PCR特異性分析；橫坐標擴增循環數(Cycles);縱坐標突光強度(fluorescence) (dRn)。圖9質粒pMD18_hlyA的敏感性檢測擴增曲線；質粒pMD18_hlyA從左至右的濃度依次為Io6UO5UO4UO3UO2UO1拷貝/ μ L ;橫坐標擴增循環數(Cycles);縱坐標突光強度(fluorescence)(dRn)。圖10質粒pMD18_hlyA螢光定量PCR擴增的標準曲線；橫坐標初始模板量(拷貝數)，(initial quantity) (Copies);縱坐標Ct 值(dRn)。圖11常規PCR檢測質粒pMD18_hlyA的敏感性；M DNA分子量標準；1-7質粒pMD18-hlyA 的濃度依次為106、ΙΟ5、ΙΟ4、ΙΟ3、ΙΟ2、101、10 拷貝 / yL;8 :陰性對照。

圖12質粒pMD18_nuc的敏感性檢測擴增曲線；質粒pMD18_nuc從左至右的濃度依次為106、105、104、IO3UO2UO1拷貝/ y L ;橫坐標擴增循環數(Cycles);縱坐標突光強度(fluorescence)(dRn)。圖13質粒pMD18_nuc螢光定量PCR擴增的標準曲線；橫坐標初始模板量(拷貝數)，(initial quantity) (Copies);縱坐標Ct 值(dRn)。圖14常規PCR檢測質粒pMD18-nuc的敏感性；M DNA分子量標準；1-7質粒pMD18-nuc 的濃度依次為ΙΟ6、ΙΟ5、ΙΟ4、ΙΟ3、ΙΟ2、101、10 拷貝 /μ L ；8 :陰性對照。圖15pMD18_hlyA和pMD18_nuc的敏感性檢測擴增曲線；pMD18_hlyA從左至右的濃度依次為Io6UO5UO4UO3UO2UO1拷貝/ μ L ;橫坐標擴增循環數(Cycles);縱坐標突光強度(fluorescence) (dRn)。圖16pMD18_hlyA和pMD18_nuc雙重螢光定量PCR擴增的標準曲線；橫坐標初始模板量(拷貝數)(initial quantity) (Copies);縱坐標Ct 值(dRn)。
具體實施例方式下面結合具體實施例來進一步描述本發明，本發明的優點和特點將會隨著描述而更為清楚。但這些實施例僅是範例性的，並不對本發明的範圍構成任何限制。本領域技術人員應該理解的是，在不偏離本發明的精神和範圍下可以對本發明技術方案的細節和形式進行修改或替換，但這些修改和替換均落入本發明的保護範圍內。試驗例I引物、探針的設計合成及單一螢光定量PCR方法的建立一、引物、探針的設計與合成根據GenBank發表的單增李斯特菌(LM)的溶血素O hlyA基因序列(AF253320)和金黃色葡萄球菌(SA)的耐熱核酸酶nuc基因序列(EF529607)設計引物和探針，具體序列見表I。引物和探針由寶生物工程(大連)有限公司合成。兩條TaqMan探針的標記選擇上，其中LM-P探針的5'端採用FAM標記作為螢光報告基團。另一條SA-P探針的5'端選擇與FAM的吸收發射波長不交叉的JOE作為標記。兩條探針可用Mx3005P螢光定量PCR儀同時檢測，且螢光信號互不影響。此外，兩條探針3'端選用Ecl ipse非螢光淬滅基團，本身不產生螢光，且淬滅效率更高，大大降低了本底信號的強度。表I引物和探針序列
權利要求
1.一種同時檢測單增李斯特菌和金黃色葡萄球菌的雙重螢光定量PCR試劑盒，包括Taq DNA聚合酶，螢光定量PCR擴增緩衝液，滅菌去離子水，一對擴增單增李斯特菌的上、下遊引物和一條檢測單增李斯特菌的TaqMan探針，一對擴增金黃色葡萄球菌的上、下遊引物和一條檢測金黃色葡萄球菌的TaqMan探針；其特徵在於所述的一對擴增單增李斯特菌引物的核苷酸序列分別為SEQ ID No. I和SEQ ID No. 2所示，所述的檢測單增李斯特菌的TaqMan探針的核苷酸序列為SEQ ID No. 3所示；所述的一對擴增金黃色葡萄球菌引物的核苷酸序列分別為SEQ ID No. 4和SEQ ID No. 5所示，所述的檢測金黃色葡萄球菌的TaqMan探針的核苷酸序列為SEQ ID No. 6所示。
2.按照權利要求I所述的的雙重螢光定量PCR試劑盒，其特徵在於所述的螢光定量PCR擴增緩衝液中含有dNTPs和Mg2+。
3.按照權利要求I所述的的雙重螢光定量PCR試劑盒，其特徵在於 在SEQ ID No. 3所示探針的5'端連接有螢光報告基團，3'端連有非螢光淬滅基團；優選的，所述的螢光報告基團是FAM，所述的非螢光淬滅基團是Eclipse ； 在SEQ ID No. 6所示探針的5'端連接有螢光報告基團，3'端連有非螢光淬滅基團；優選的，所述的螢光報告基團是JOE，所述的非螢光淬滅基團是Eclipse。
4.按照權利要求1-3任何一項所述的的雙重螢光定量PCR試劑盒，其特徵在於含有單增李斯特菌標準質粒和金黃色葡萄球菌標準質粒；此外，該試劑盒還含有陰性質控標準品。
5.一種同時檢測食品中單增李斯特菌和金黃色葡萄球菌的雙重螢光定量PCR方法，包括以下步驟(I)提取待檢測食品的DNA ；(2)建立PCR擴增體系所提取的待檢測食品的DNA, Taq DNA聚合酶，螢光定量PCR擴增緩衝液，滅菌去離子水，一對擴增單增李斯特菌的上、下遊引物和一條檢測單增李斯特菌的TaqMan探針，一對擴增金黃色葡萄球菌的上、下遊引物和一條檢測金黃色葡萄球菌的TaqMan探針；(3)將所建立的PCR擴增體系在螢光定量PCR儀上進行PCR擴增，根據擴增曲線、標準曲線或/和Ct值對樣品中的單增李斯特菌和金黃色葡萄球菌進行定性或定量分析；其中，所述的一對擴增單增李斯特菌的上、下遊引物的核苷酸序列分別為SEQ ID No. I和SEQ ID No. 2所示，所述的檢測單增李斯特菌的TaqMan探針的核苷酸序列為SEQ ID No. 3所示；所述的一對擴增金黃色葡萄球菌的上、下遊引物的核苷酸序列分別為SEQ ID No. 4和SEQ ID No. 5所示，所述的檢測金黃色葡萄球菌的TaqMan探針的核苷酸序列為SEQ ID No. 6所示。
6.按照權利要求5所述的雙重螢光定量PCR方法，其特徵在於所述的螢光定量PCR擴增緩衝液中含有dNTPs和Mg2+ ; 在SEQ ID No. 3所示探針的5'端連接有螢光報告基團，3'端連有非螢光淬滅基團；優選的，所述的螢光報告基團是FAM，所述的非螢光淬滅基團是Eclipse ； 在SEQ ID No. 6所示探針的5'端連接有螢光報告基團，3'端連有非螢光淬滅基團；優選的，所述的螢光報告基團是JOE，所述的非螢光淬滅基團是Eclipse。
7.按照權利要求5所述的雙重螢光定量PCR方法，其特徵在於 所述的定性分析包括以下步驟設定閾值；如果PCR擴增曲線超過設定的閾值即為陽性，說明待檢測樣品中檢測到單增李斯特菌或金黃色葡萄球菌；如果PCR擴增曲線在閾值線以下即為陰性，說明待檢測樣品中沒有檢測到單增李斯特菌或金黃色葡萄球菌；所述的定量分析包括以下步驟建立標準曲線將陽性標準單增李斯特菌模板或陽性標準金黃色葡萄球菌模板進行梯度稀釋後進行PCR擴增，以標準陽性模板的對數值為橫坐標，以Ct值為縱坐標分別建立單增李斯特菌或金黃色葡萄球菌的標準曲線； 按照陽性標準模板相同的PCR擴增體系和擴增條件，將待擴增的樣品進行PCR擴增，確定Ct值；通過標準曲線和所確定的Ct值對檢測樣品進行定量分析。
8.按照權利要求5所述的雙重螢光定量PCR方法，其特徵在於所述的擴增體系中加入單增李斯特菌標準質粒和金黃色葡萄球菌的標準質粒作為標準模板；此外還在所述擴增體系中加入陰性質控標準品。
9.按照權利要求5所述的雙重螢光定量PCR方法，其特徵在於所建立的擴增體系中各組分的用量為所提取的待檢測食品的DNA2-6體積，Taq DNA聚合酶2_15體積，螢光定量PCR擴增緩衝液0. 1-1體積，滅菌去離子水1-10體積，擴增單增李斯特菌的上遊引物0.1-1. 0體積，擴增單增李斯特菌的下遊引物0. 1-1. 0體積，檢測單增李斯特菌的TaqMan探針0. 5-1. 5體積，擴增金黃色葡萄球菌的上遊引物0. 1-1. 0體積，擴增金黃色葡萄球菌的下遊引物0. 1-1. 0體積，檢測金黃色葡萄球菌的TaqMan探針0. 5-1. 5體積； 優選的，各組分的用量如下所提取的待檢測食品的DNA 4 U L, Taq DNA聚合酶12.5uL,50X螢光定量PCR擴增緩衝液0. 5 ii L，滅菌去離子水4. 0 y L，擴增單增李斯特菌的上遊引物0. 5 ii L，擴增單增李斯特菌的下遊引物0. 5 ii L，檢測單增李斯特菌的TaqMan探針I. Oy L，擴增金黃色葡萄球菌的上遊引物0.5 yL，擴增金黃色葡萄球菌的下遊引物0.5 UL,檢測金黃色葡萄球菌的TaqMan探針l.OyL; 其中，所述的擴增單增李斯特菌的上、下遊引物的濃度為IOyM ;所述的擴增金黃色葡萄球菌的上、下遊引物的濃度為10 PM。
10.按照權利要求5所述的雙重螢光定量PCR方法，其特徵在於步驟(3)中所述的PCR擴增在以下參數條件下進行擴增95° C預變性30S，95° C變性5S，56° C退火20S，72° C延伸15S，40個循環。
全文摘要
本發明公開了一種同時檢測單增李斯特菌和金黃色葡萄球菌的螢光定量PCR試劑盒及其應用，該試劑盒包括TaqDNA聚合酶，螢光定量PCR擴增緩衝液，滅菌去離子水，一對擴增單增李斯特菌的引物和一條TaqMan探針，一對擴增金黃色葡萄球菌的引物和一條TaqMan探針。本發明利用多重螢光實時定量PCR的原理兼顧PCR技術的高效性、探針技術的高特異性、光譜技術的高敏感性和高精確性等優點，達到了同步且定量檢測單增李斯特菌和金黃色葡萄球菌的目的，為提高食品監管效率和水平、預防食物中毒和食源性疾病的發生提供保障。同時，本發明也為提高生產加工環節食品安全風險監測、分析與風險預警能力和水平等奠定了基礎。
文檔編號C12R1/01GK102676647SQ20121003083
公開日2012年9月19日 申請日期2012年2月13日 優先權日2012年2月13日
發明者於國萍, 張秀玲, 許巖, 趙豔麗, 邊亞娟, 邵美麗 申請人:東北農業大學